Czas. Stomatol., 2010, 63, 7, 405-413 2010 Polish Dental Society http://www.czas.stomat.net Odsetek limfocytów CCR6+CD8+ w krwi obwodowej oraz ich zdolność chemotaktyczna u pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia doniesienie wstępne * The percentage of CCR6+CD8+ lymphocytes in blood and their chemotactic properties in patients with chronic periodontitis preliminary report Marta Cześnikiewicz-Guzik 1, Witold Jurczyński 2, Anna Kłosińska 1, Bartłomiej W. Loster 1 1 Katedra Ortodoncji i Zakład Stomatologii Zintegrowanej ISWL UJCM, p.o. Kierownika: dr hab. B. W. Loster; 2 Pracownia Profilaktyki i Higieny Stomatologicznej ISWL UJCM, p.o. Kierownika: dr n. med. W. Jurczyński Summary Aim of the study: To investigate the percentage of CCR6 positive lymphocytes in the blood of patients with periodontitis, and to compare the proportion of these cells and their chemotactic abilities to the proportion and migration of CCR6+ cells of the healthy controls. Materials and methods: The study group comprised 45 individuals aged between 18 and 90 years. PBMC obtained from patients blood was analized by flow cytometry. Chemotactic abilities of lymphocyte subpopulations were analyzed utilizing Boyden chambers. Results: A decrease of the percentage of CD8+CCR6+ in the blood of patients with diagnosed periodontitis has been demonstrated. However, there was no change in the proportion of CD4+CCR6+ subset. Conclusion: Presented results indicate the impairment of the immunological system in patients suffering from periodontal diseases leading to the dysfunction of CD8+CCR6+ lymphocytes in blood. Streszczenie Cel pracy: określenie odsetka limfocytów CCR6+ we krwi obwodowej pacjentów cierpiących na chorobę przyzębia i porównanie ich proporcji oraz zdolności chemotaktycznych z subpopulacją CCR6+ limfocytów pochodzących z krwi osób niechorujących na przewlekłe zapalenie przyzębia. Materiał i metody: badanie objęło grupę 45 osób w wieku od 18 do 90 lat. Z krwi pacjentów izolowano PBMC i poddawano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Zdolności chemotaktyczne subpopulacji limfocytów były analizowane w komorach Boydena. Wyniki: wykazano obniżenie odsetka limfocytów CD8+CCR6+ we krwi chorych z rozpoznaną przewlekłą chorobą przyzębia. Nie zaobserwowano natomiast zmiany w proporcji limfocytów CD4+C- CR6+ we krwi tych pacjentów. Wnioski: prezentowane badania wskazują na upośledzenie działania układu immunologicznego u pacjentów periodontologicznych prowadzącą do dysfunkcji limfocytów CD8+CCR6+ we krwi obwodowej. KEYWORDS: chronic periodontitis, lymphocytes, CCR6, chemotaxis, CCL20 HASŁA INDEKSOWE: przewlekłe zapalenie przyzębia, limfocyty, CCR6, chemotaksja, CCL20 *Źródło finansowania: grant KBN K/PBW/0000497. 405
M. Cześnikiewicz-Guzik i in. Czas. Stomatol., Wstęp Pomimo wielu lat badań nad genezą przewlekłego zapalenia przyzębia oraz znacznego postępu w tej dziedzinie, nadal zrozumienie patofizjologii tej choroby niewystarczająco przekłada się na praktykę kliniczną. Termin choroba przyzębia obejmuje schorzenia zapalne aparatu zawieszeniowego zęba. Możemy podzielić je na zapalenie dziąseł (gingivitis), które przebiega bez utraty przyczepu dziąsłowego oraz zapalenie przyzębia (periodontitis), które charakteryzuje się utratą tkanek mocujących ząb; to jest utratą przyczepu łącznotkankowego, resorpcją kości oraz tworzeniem kieszeni przyzębnych [8]. Choroba przyzębia jest schorzeniem, do którego przyczynia się wiele czynników, takich jak: higiena jamy ustnej, palenie tytoniu, przyjmowane leki, dieta, stres, wrodzone defekty układu odpornościowego (np. polimorfizm genowy IL-1), wiek, płeć, schorzenia ogólnoustrojowe (infekcje wirusowe, cukrzyca, alergie), nieprawidłowa technika szczotkowania zębów oraz żrące substancje chemiczne [1, 7, 12-17]. Jednak podstawowym czynnikiem patogenetycznym tego schorzenia jest flora bakteryjna, rezydująca w biofilmie na powierzchni zębów i w kieszeniach dziąsłowych. Gatunki chorobotwórczych bakterii zostały już dobrze poznane, do najbardziej patogennych zaliczamy: Porphyromonas gingivalis, Aggregatebacter actinomycetemcomitans (s. Actinobacillus actinomycetemcomitans), Bacterioides forsythus (s. Tannerella forsythiensis), Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Treponema denticola, Streptococcus intermedia, Prevotela nigrescens, Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens [3, 11]. Za przejście zapalenia dziąseł w zapalenie przyzębia obarcza się odpowiedzialnością występowanie bakterii markerowych zapalenia przyzębia, tj: Aggregatebacter actinomycetemcomitans, (s. Actinobacillus actinomycetemcomitans) oraz tak zawanego kompleksu czerwonego BANA Porphyromonas gingivalis, (s. Tannarella forsythensis), Bacterioides forsythus, Treponema denticola. Bakterie patogenne znajdujące się w biofilmie poddziąsłowym nie tylko inicjują i podtrzymują stan zapalny w tkankach przyzębia, ale również same degradują struktury tkanki łącznej i kostnej, a do najważniejszych z nich należy grupa metaloproteinaz macierzy (MMP), które związane są z katalitycznym działaniem jonów cynku. Wartym podkreślenia jest fakt, że indukowany przez te bakterie stan zapalny nie dotyczy tylko przyzębia, ale całego organizmu, co przyczynia się do rozwoju wielu chorób ogólnoustrojowych, tj.: nadciśnienia tętniczego, miażdżycy, zakrzepicy naczyń krwionośnych, zapalenia wsierdzia [18, 19]. Badania kliniczne nie potwierdzają występowania bezpośredniej zależności między patogennymi mikroorganizmami, a objawami choroby przyzębia. Nie u każdego pacjenta, u którego stwierdzono obecność powyższych patogenów, rozwija się choroba przyzębia. Również u pacjentów, którzy już zapadli na chorobę przyzębia może rozwinąć się jej lżejsza lub bardziej zaawansowana postać. Dzieje się tak dlatego, że choroba przyzębia to nie tylko choroba infekcyjna, ale choroba wynikająca z interakcji układu odpornościowego gospodarza z patogennymi bakteriami rezydującymi w biofilmie [9, 10]. Wynik tej wzajemnej interakcji jest widoczny jako kliniczny obraz stanu tkanki przyzębia pacjenta. Uświadomienie faktu, że choroba przyzębia nie jest procesem miejscowym, lecz wynika z ogólnego stanu układu odpornościowego pacjenta jest bardzo ważne zarówno w postępowaniu terapeutycznym jak i postrzeganiu tej choroby w kontekście całego organizmu. Stan układu immunologicznego oraz upośledzenie czynności jego poszczególnych kom- 406
2010, 63, 7 Limfocyty CCR6+CD8+ w krwi obwodowej ponent może osłabiać obronę tkanek przyzębia przed inwazją patogennych bakterii i ułatwiać rozwój choroby. Zostało już udowodnione, że kluczową chemokiną dla obrony śluzówkowej jest chemokina CCL 20 zwana rówież MIP-3 alfa (ang. macrophage inflammatory protein 3 alpha), która w obliczu inwazji bakterii przywołuje na miejsce zapalenia komórki układu immunologicznego posiadające na swojej powierzchni receptor CCR6. CCL20 jest nie tylko, jak to może wynikać z jej nazwy, produkowana przez makrofagi, lecz jest również wydzielana bardzo obficie przez tkanki przyzębia dotknięte przewlekłym zapaleniem. Zespół profesora T. Matsuo udowodnił, że głównym jej producentem są dziąsłowe fibroblasty (ang. human gingival fibroblasts - HGF), które produkują również wiele innych mediatorów zapalenia, jak: prostaglandyny (PGE 2 ), interleukiny IL-1β, IL-6, IL-8, czynnik martwicy nowotworów TNF-α i interferon γ (INF-γ)[5, 19]. Komórki wykazujące ekspresję CCR6 na swojej powierzchni to głównie limfocyty pamięci, ale również w niewielkim odsetku niedojrzałe komórki dendrytyczne, limfocyty B i neutrofile po stymulacji cytokinami [2]. Cel pracy Celem pracy było oznaczenie odsetka limfocytów CCR6+, a także zbadanie i porównanie zdolności chemotaktycznych limfocytów w krwi pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia oraz u osób zdrowych. Materiał i metody Badaniem objęto 45 osób w wieku od 18 do 90 lat (23 osoby grupy kontrolnej oraz 22 chorych z rozpoznanym przewlekłym zapaleniem przyzębia), w ramach projektu DENTOTENS we współpracy z Emory Dental Clinic Uniwersytetu Emory, Atlanta, USA. Od wszystkich pacjentów uzyskano świadomą zgodę na udział w badaniu oraz zgodę lokalnej komisji etycznej. Pacjenci byli ogólnie zdrowi i nie wykazywali cech żadnych przewlekłych schorzeń zapalnych oprócz przewleklego zapalenia przyzębia u pacjentów z grupy cierpiących na periodontopatie. Kryteria wykluczające: to zawał serca, nadciśnienie tętnicze, alergie, astma oskrzelowa, przebyta choroba nowotworowa do 5 lat wstecz, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie nerek, jaskra oraz choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy. Oznaczenia cytometryczne Leukocyty jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) były izolowane za pomocą gradientu Ficollu z krwi pobieranej na EDTA. Następnie komórki liczono i 100 000 komórek odwirowywano w probówce i dodawano 50 μl buforu cytometrycznego (FACS buffer: PBS z 1% BSA- bovine serum albumin, 0,1% NaN3). Do sporządzonej zawiesiny komórkowej dodano zoptymalizowaną objętość każdego z zaplanowanych przeciwciał, ustaloną na podstawie doświadczeń opatymalizacyjnych (ang. titration measurments), w zakresie od 0,5 do 2,5 μl i wstrząśnięto probówką. Do barwienia używano następującego panelu przeciwciał w cytometrii wielokolorowej: CD3/CCR6/CD4/CD8. Próbki były następnie inkubowane przez 30 min w temperaturze 4 C w ciemności. Po tym czasie barwione komórki płukano 1 ml buforu cytometrycznego i odwirowywano przez 5 min w temp 4 C z szybkością 2500 RPM. Płukanie powtórzono, zaś komórki zawieszano w 200 μl buforu cytometrycznego i poddano analizie w cytometrze przepływowym FACs Canto II, BD Biosciences. 407
M. Cześnikiewicz-Guzik i in. Czas. Stomatol., Badania zdolności chemotaktycznych Za pomocą zestawów do izolacji limfocytów T CD4+ i CD8+ (Miltenyi Biotech, USA) oraz systemu zautomatyzowanej separacji magnetycznej (Automax, Miltenyi Biotech, USA) dokonano izolacji limfocytów CD4 oraz CD8 od wybranych pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia oraz osób ze zdrowym przyzębiem z grupy kontrolnej i badano ich zdolność do chemotaksji w kierunku CCL20. Aby określić zdolność komórek do chemotaksji zastosowano doświadczenia w komorach Boydena (R&D systems) o wielkości porów 5 µm. Po pobraniu krwi od pacjentów (n=4) i osób grupy kontrolnej (n=4), wyizolowana frakcja leukocytów została poddana analizie cytometrycznej, aby określić wyjściowe proporcje komórek CD4 i CD8 oraz odsetek limfocytów CCR6+ w obrębie tych subpopulacji. Za pomocą przeciwciał połączonych z magnetycznymi kuleczkami, wyizolowano z frakcji leukocytów limfocyty CD4 i CD8, które zostały następnie umieszczone w odpowiednim stężeniu w komorze Boydena. W dolnym przedziale komory Boydena znajdowało się medium komórkowe ze stężeniem 5ng/ml chemokiny CCL20 (R&D Systems). Po dwóch godzinach komórki, które przemigrowały do dolnej części komory Boydena pod wpływem gradientu stężenia chemokiny CCL20, zostały poddane analizie cytometrią przepływową. Analiza statystyczna Analiza statystyczna wykonywana była za pomocą programu SPSS for Win v. 7.0. W ramach analizy wstępnej dla wszystkich danych empirycznych wyznaczano dystrybuanty empiryczne i typowe statystyki opisowe. Zbadano rozkłady wszystkich zmiennych ilościowych ciągłych. Założenie normalności rozkładów weryfikowano testem Shapiro-Wilka. W ramach estymacji wyznaczano wartości średniej arytmetycznej, medianę, wariancję, odchylenie standardowe oraz błąd standardowy średnich (SEM) rozpatrywanych cech. Z kolei, w ramach weryfikacji hipotez przyjęto hipotezę podstawową o równości średnich arytmetycznych oraz hipotezę alternatywną o statystycznie istotnej różnicy między średnimi. Do weryfikacji hipotez o równości średnich arytmetycznych zastosowano następujące testy: test F-Fishera do zbadania równości wariancji, test T-Studenta dla zmiennych niezwiązanych, przy założeniu normalności rozkładu. Poziom znamienności ustalono na poziomie p = 0,05. Wyniki Odsetek limfocytów CCR6+ w subpopulacji CD4+ i CD8+ Stwierdzono, że odsetek limfocytów CCR6+ w obrębie subpopulacji limfocytów CD4 kształtował się na podobnym poziomie zarówno u pacjentów z periodontopatią jaki i ludzi zdrowych. Natomiast zaobserwowano znamienne statystycznie obniżenie odsetka limfocytów CCR6+ u chorych cierpiących na zapalenie przyzębia w obrębie subpopulacji limfocytów CD8 cytotoksycznych (ryc. 1). Obniżeniu liczby komórek CCR6+ w obrębie limfocytów CD8+ u pacjentów z chorobą przyzębia nie towarzyszyło zmniejszenie się ekspresji liczby cząsteczek na powierzchni pojedynczego limfocytu CD8. Zdolności chemotaktyczne limfocytów CCR6+ Obraz limfocytów CD4 i CD8 u pacjentów z chorobą przyzębia i osób z grupy kontrolnej nie różnił się poza faktem opisywanym poprzednio, że odsetek limfocytów CD8+CCR6+ u pacjentów z chorobą przyzębia był mniejszy od proporcji tej frakcji komórek u osób zdrowych (ryc. 2). 408
2010, 63, 7 Limfocyty CCR6+CD8+ w krwi obwodowej cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia. Natomiast w przypadku limfocytów cytotoksycznych CD8+, było widoczne znaczne upośledzenie chemotaksji komórek pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia w porównaniu z możliwościami chemotaktycznymi komórek CD8+CCR6+ osób ze zdrowym przyzębiem. Ryc. 1. Proporcja limfocytów CCR6+ w subpopulacji CD4+ (panel A. p=0.14) i CD8+ (panel B. p=0.0003) w grupie kontrolnej (n=23) ze zdrowym przyzębiem i u pacjentów (n=22) cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia. Zdolność migracji komórek CD4+CCR6+ była podobna zarówno w przypadku osób ze zdrowym przyzębiem, jak i u pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia. Natomiast w przypadku limfocytów cytotoksycznych CD8+, stwierdzono znaczne upośledzenie chemotaksji komórek pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia (ryc. 3), w porównaniu z możliwościami chemotaksyjnymi komórek CD8+CCR6+ osób ze zdrowym przyzębiem. Wykonane badania wykazały: brak różnicy proporcji limfocytów CD4+ CCR6+ we krwi pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia i we krwi zdrowych osób, zmniejszenie odsetka limfocytów CD8+CCR6+ we krwi pacjentów z przewlekłą periodontopatią w porównaniu z grupą kontrolną, obniżenie liczby komórek CCR6+ w obrębie limfocytów CD8+ u pacjentów z chorobą przyzębia bez zmniejszenia ekspresji liczby cząsteczek na powierzchni pojedyńczego limfocytu CD8, podobną zdolność migracji komórek CD4+CCR6+ zarówno w przypadku osób ze zdrowym przyzębiem jak i u pacjentów Dyskusja Przewlekłe zapalenie przyzębia jest chorobą o podłożu immunologicznym ze złożonymi mechanizmami molekularnymi. Poznanie tych mechanizmów może zmienić praktykę kliniczną. Stąd istotne jest podejmowanie badań mających na celu wyjaśnienie mechanizmów immunologicznych prowadzących do rozwoju oraz modyfikujących przebieg zapalenia przyzębia. Chemokina CCL20 (MIP-3 alfa), jest bardzo ważnym elementem odporności śluzówkowej i powierzchni skóry, ponieważ jest istotnym elementem regulacji migracji i rekrutacji limfocytów T i komórek dendrytycznych do miejsca zapalenia, zaś jej ekspresję wykazują komórki błony śluzowej i keratynocyty skóry. Podstawowym receptorem dla tej chemokiny jest cząsteczka CCR6, która należy do rodziny receptorów CC chemokin sprzężonych z białkami G, występująca na powierzchni niedojrzałych komórek dendrytycznych, limfocytów B i T. Wśród limfocytów T, CCR6 jest obecny na powierzchni komórek efektorowych pamięci, czyli komórek antygenowo wyspecjalizowanych, gotowych do walki z zapaleniem. Dlatego produkcja chemokiny CCL20 przez komórki nabłonka i przywoływanie przez to limfocytów T jest istotnym elementem obronnośći śluzówkowej, polegającej na inicjowaniu i nawigowaniu odpowiedzią immunologiczną prowadzącą do unicestwienia czynnika 409
M. Cześnikiewicz-Guzik i in. Czas. Stomatol., Ryc. 2. Przykład analizy PBMC pochodzącego od pacjenta cierpiącego na przewlekłe zapalenie przyzębia i od pacjenta grupy kontrolnej za pomocą cytometrii przepływowej. Ryc. 3. Wykazanie upośledzenia zdolności chemotaktycznych subpopulacji limfocytów CD8 u pacjenta cierpiącego na przewlekłe zapalenie przyzębia w teście chemotaksji wykonanym w komorze Boydena z zastosowaniem 5 ng CCL20 przez 2 godziny. 410
2010, 63, 7 Limfocyty CCR6+CD8+ w krwi obwodowej urazowego, jak np. bakterii, wdzierających się w głąb tkanek przyzębia po zniszczeniu przyczepu nabłonkowego. W niniejszych badaniach podjęto próbę sprawdzenia działania odporności śluzówkowej u pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia. Z doświadczenia klinicznego wiadomo, że pacjenci rozwijają różnorodne formy zapalenia przyzębia. U niektórych, śladowe ilości płytki nazębnej powodują znaczne zniszczenie aparatu zawieszeniowego zęba, u innych nawet duże zaniedbania higieniczne nie powodują przez długi czas rozprzestrzenienia się zakażenia w głąb tkanek przyzębia. Te obserwacje kliniczne skłaniają do postawienia hipotezy twierdzącej, że różnica w czynności układu immunologicznego pozwala jednym na skuteczną obronę tkanek przed inwazją bakterii w głąb przyzębia, zaś u innych pacjentów przyczynia się do szybkiego postępu choroby. Niniejsza praca wykazała, że pacjenci cierpiący na przewlekłe zapalenie przyzębia wykazują pewne upośledzenie w działaniu odporności śluzówkowej wyrażonej zmniejszeniem proporcji frakcji komórek CD8+CCR6+ we krwi obwodowej. Ponadto, badając zdolności chemotaktyczne limfocytów CD8+CCR6+ zaobserwowano znacznie upośledzoną aktywność migracji w stronę gradientu stężenia chemokiny CCL20. Powyższe obserwacje nie dotyczyły subpopulacji limfocytów CD4+CCR6+, która wykazywała podobne proporcje procentowe jak u ludzi zdrowych oraz sprawnie migrowała w odpowiedzi na czynnik chemotaktyczny chemokiny CCL20. Efektorowe limfocyty CCR6+ są bardzo ważnym elementem obronnym przyzębia w przewlekłym zapaleniu. Honda i wsp. [4] wykazali w swoich badaniach ekspresję różnych markerów zapalenia w tkankach chorego przyzębia: IL-17, CCR4, IL-12, Il-19 oraz właśnie CCR6. Rola limfocytów CCR6 jest również wykazana w przebiegu chorób zapalnych błony śluzowej jak np. chorobie Crohna [6]. Nigdy dotychczas nie została zbadana obwodowa pula limfocytów CCR6+ zawarta we krwi pacjentów, która jest swoistym rezerwuarem tych komórek dla miejsc stanów zapalnych. Fakt zmniejszonej procentowej liczby komórek CCR6 w subpopulacji CD8 może być istotnym elementem upośledzenia działania układu immunologicznego pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia. Może być wreszcie tylko pewną małą częścią patofizjologii tego układu u chorych cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia, a dalsze elementy tej patologii muszą zostać dopiero odkryte, co zachęca do kolejnych badań na temat ogólnoustrojowej kondycji układu immunologicznego pacjentów ze schorzeniami przyzębia. W przyszłości zrozumienie tych aspektów niewątpliwie przyniesie nowe sposoby leczenia, zorientowane nie tylko na mechaniczne usuwanie płytki bakteryjnej i ziarniny zapalnej oraz farmakologiczne leczenie przeciwbakteryjne, lecz przede wszystkim skierowana na zahamowanie rozwoju mechanizmów zapalnych. Podsumowanie Zaobserwowane defekty czynności układu immunologicznego pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie przyzębia, wyrażające się spadkiem odsetka limfocytów CD8+CCR6+ we krwi oraz upośledzeniem ich zdolności chemotaktycznych, mogą tłumaczyć zwiększoną podatność na rozwój choroby przyzębia. Piśmiennictwo 1. Al-Zahrani M S, Bissada N F, Borawski E A: Diet and periodontitis. J Int Acad Periodontol 2005, 7, 1: 21-26. 411
M. Cześnikiewicz-Guzik i in. Czas. Stomatol., 2. Dieu M C,Vanbervliet B, Vicari A, Bridon J M, Oldham E, Ait-Yahia S, Briere F, Zlotnik A, Lebecque S, Caux C: Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites. J Exp Med 1998. 188, 2: 373- -386. 3. Haffajee A D, Socransky S S: Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol 2000, 1994, 5: 78-111. 4. Honda T, Aoki Y, Takahashi N, Maekawa T, Nakajima T, Ito H, Tabeta K, Okui T, Kajita K, Domon H, Yamazaki K: Elevated expression of IL-17 and IL-12 genes in chronic inflammatory periodontal disease. Clin Chim Acta 2008, 395, 1-2: 137-141. 5. Hosokawa Y, Hosokawa I, Ozaki K, Nakae H, Matsuo T: Increase of CCL20 expression by human gingival fibroblasts upon stimulation with cytokines and bacterial endotoxin. Clin Exp Immunol 2005, 142, 2: 285-291. 6. Nishimura M, Kuboi Y, Muramoto K, Kawano T, Imai T: Chemokines as novel therapeutic targets for inflammatory bowel disease. Ann N Y Acad Sci 2009, 1173: 350-356. 7. Radwan-Oczko M, Boratyńska M, Ziętek M, Zoledziewska M, Jonkisz A: The relationship of transforming growth factor-beta1 gene polymorphism, its plasma level, and gingival overgrowth in renal transplant recipients receiving different immunosuppressive regimens. J Periodontol 2006, 77, 5: 865-873. 8. Wolf H, Rateitschak E, Rateitschak K: Wprowadzenie. Red Z Jańczuk w Periodontologia. Wydawnictwo Czelej, Lublin 2006, str. 1-5. 9. Serhan C N: Controlling the resolution of acute inflammation: a new genus of dual anti- -inflammatory and proresolving mediators. J Periodontol 2008, 79, 8 Suppl: 1520-1526. 10. Serhan C N, Chiang N, Van Dyke T E: Resolving inflammation: dual anti-inflammatory and pro-resolution lipid mediators. Nat Rev Immunol 2008, 8, 5: 349-361. 11. Socransky S S, Haffajee A D: Implications of periodontal microbiology for the treatment of periodontal infections. Compend Suppl 1994, 18: 684-685, 688-693; quiz S714-717. 12. Thorstensson H, Kuylenstierna J,. Hugoson A: Medical status and complications in relation to periodontal disease experience in insulin-dependent diabetics. J Clin Periodontol 1996, 23, 3 Pt 1: 194-202. 13. Van Dyke T E: Control of inflammation and periodontitis. Periodontol 2000, 2007, 45: 158-166. 14. Van Dyke T E, Sheilesh D: Risk factors for periodontitis. J Int Acad Periodontol 2005, 7, 1: 3-7. 15. Van Dyke, T E, Taubman M A, Ebersole J L, Haffajee A D, Socransky S S, Smith D J, Genco R J: The Papillon-Lefevre syndrome: Neutrophil dysfunction with severe periodontal disease. Clin Immunol Immunopathol 1984, 31, 3: 419-429. 16. Van Dyke T E, Wilson-Burrows C, Offenbacher S, Henson P: Association of an abnormality of neutrophil chemotaxis in human periodontal disease with a cell surface protein. Infect Immun 1987, 55, 9: 2262-2267. 17. Walker S J, Van Dyke T E, Rich S, Kornman, K S, di Giovine F S, Hart T C: Genetic polymorphisms of the IL-1alpha and IL-1beta genes in african-american ljp patients and an african-american control population. J Periodontol 2000, 71, 5: 723-728. 18. Wożakowska-Kapłon B F, K, Opolski G, Górska R: Współczesne poglądy na profilaktykę zapalenia wsierdzia przed zabiegami stomatologicznymi. Czas Stomatol 2009, 62, 7: 562-566. 19. Ziętek, M: Choroby przyzębia a aterotromboza. Czas Stomatol 2009, 62, 7: 562-566. Adres autorów: 31-155 Kraków, ul. Montelupich 4 Tel.: 12 4245402 Fax: 12 4245404 e-mail: maczesni@yahoo.co.uk Paper received 24 May 2010 Accepted 15 September 2010 412