Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium Ma³gorzata Ziarno Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny ywnoœci, Wydzia³ Technologii ywnoœci, Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa The significance of bile salts hydrolase activity of bacteria of Bifidobacterium genus Summary The objective of this article was to review the existing literature concerning the function and appearance of bile salts hydrolase (BSH) activity in bacteria of Bifidobacterium genus. Although bile salts hydrolase activity is common in intestinal tract, current knowledge on the influence of BSH activity on bile metabolism and cholesterol level in human organism is insufficient. BSH activity of bifidobacteria enhances production of deconjugated bile acids which are not well absorbed by the gut and are excreted. This action is contributing to the decrease of cholesterol level in human organism because cholesterol, as a precursor of bile acids, is utilized for de novo bile acids synthesis. Adres do korespondencji Ma³gorzata Ziarno, Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny ywnoœci, Wydzia³ Technologii ywnoœci, Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Nowoursynowska 159c, Warszawa; ziarno@alpha.sggw.waw.pl 2 (69) Key words: Bifidobacterium, BSH, deconjugation, bile salt hydrolase, bile salts. 1. Wstêp Rodzaj Bifidobacterium obejmuje 32 gatunki, pogrupowane na bazie cech genetycznych, metabolicznych oraz naturalnego œrodowiska wystêpowania. Bakterie z tego rodzaju s¹ g³ównym sk³adnikiem mikroflory jelitowej ludzi i zwierz¹t [1]. W uk³adzie pokarmowym cz³owieka naturalnie wystêpuje 14 gatunków tych pa³eczek, w tym m.in. B. bifidum, B. gallicum, B. breve, B. infantis, B. longum, B. lactis, B. adolescentis, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum [2-7].

2 Ma³gorzata Ziarno Stanowi¹ one g³ówn¹, a czasami jedyn¹ mikroflorê jelit niemowl¹t karmionych tylko mlekiem matki i znaczn¹ czêœci¹ mikroflory zasiedlaj¹cej jelita cz³owieka doros³ego [6,8]. Natomiast w przewodzie pokarmowym zwierz¹t i w otoczeniu ich bytowania stwierdzane s¹: B. animalis, B. pseudolongum, B. ruminale, B. boum [5]. Bakterie z rodzaju Bifidobacterium mog¹ dostawaæ siê do organizmu wraz z pokarmem lub mikrobiologicznymi preparatami farmaceutycznymi. W ywieniu ludzi lub zwierz¹t najczêœciej stosowane s¹ gatunki wyizolowane z przewodu pokarmowego [4,8-10]. Uwa a siê, e bytowanie Bifidobacterium w uk³adzie pokarmowym mo e wi¹zaæ siê ze zdolnoœci¹ do wytwarzania enzymu hydrolazy soli ó³ci, co równie decyduje o w³aœciwoœciach probiotycznych tych bakterii [1,7,9,11,12]. 2. Charakterystyka hydrolazy soli ó³ci Hydrolaza soli ó³ci nazywana równie hydrolaz¹ choliloglicyny EC (BSH, bile salts hydrolase) katalizuje hydrolizê (okreœlan¹ tak e mianem dekoniugacji) wi¹zania amidowego w kwasach ó³ciowych skoniugowanych z tauryn¹ lub glicyn¹, z uwolnieniem pierwotnych kwasów ó³ciowych oraz wolnej aminy tauryny lub aminokwasu glicyny [13-16]. Hydroliza soli kwasów ó³ciowych, skoniugowanych z tauryn¹ lub glicyn¹, jest jedn¹ z najbardziej znanych mikrobiologicznych biotransformacji soli ó³ciowych (rys. 1). Pomimo szerokiego rozpowszechnienia aktywnoœci BSH wœród bifidobakterii, jak dot¹d, tylko nieliczne z tych enzymów zosta³y wyizolowane i zbadane [17,18]. Z danych literaturowych wynika, e BSH jest enzymem wewn¹trzkomórkowym, umiejscowionym w b³onie cytoplazmatycznej [18,19]. Potwierdzaj¹ to badania, w których nie stwierdzano aktywnoœci tego enzymu w supernatantach uzyskanych z m³odych hodowli bakteryjnych. Aktywnoœæ by³a wykrywana dopiero po dezintegracji komórek i uwolnieniu ich zawartoœci do œrodowiska. W stanie natywnym enzym ma masê od 125 do 250 kda, przy czym masa cz¹steczkowa podjednostki wynosi zwykle oko³o kda. Oznacza to, e postaæ natywna enzymu jest heksamerem, jak u B. longum BB 536, tetramerem, jak u B. longum SBT 2928, lub mo e sk³adaæ siê z trzech podjednostek, jak u B. bifidum ATCC 11863, B. infantis KL 412, B. longum ATCC 15708, B. longum KL 507 i B. longum KL 515 [17-19]. Optymalne ph dla aktywnoœci wyizolowanych enzymów mieœci³o siê w zakresie 5-7 [18,19]. Wartoœæ punktu izoelektrycznego okreœlona dla enzymów wyizolowanych przez Kima i in. [17] wynosi³a: 4,45 (u B. bifidum ATCC 11863) i oko³o 4,65 (u B. infantis KL 412, B. longum ATCC 15708, B. longum KL 507 i B. longum KL 515). Optymalna temperatura dzia³ania badanych enzymów wynosi³a 40 C, zaœ w temperaturze 60 C mala³a o po³owê [18,19]. Grill i in. [19] wskazali na istotne znaczenie wolnej grupy sulfhydrylowej w centrum aktywnym enzymu. Z kolei enzym wyizolowany przez Tanakê i in. [18] by³ silnie hamowany przez inhibitory enzymów tiolowych, co sugeruje, e w jego centrum aktywnym znajdowa³a siê reszta cysteinowa. 184 PRACE PRZEGL DOWE

3 Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium Rys. 1. Hydroliza soli kwasów ó³ciowych z uwolnieniem pierwotnych kwasów chenodeoksycholowego i cholowego oraz glicyny lub tauryny [19,24,40,44]. Aktywnoœæ BSH u bakterii mlekowych, takich jak Bifidobacterium, mo na stwierdziæ metod¹ p³ytkow¹ na po ywce agarowej, np. MRS lub Rogosa SL, z dodatkiem 0,5% jednego lub kilku skoniugowanych kwasów ó³ciowych (np. taurodeoksycholowego, taurocholowego lub taurochenodeoksycholowego). Inkubacjê posiewów prowadzi siê w warunkach beztlenowych w temperaturze optymalnej dla wzrostu bakterii. Nale y pamiêtaæ, e optymalna temperatura wzrostu bakterii czêsto nie pokrywa siê z optymaln¹ temperatur¹ aktywnoœci enzymu, jednak sprzyja wytwarzaniu tej substancji przez komórki bakteryjne. Aktywnoœæ BSH objawia siê tworzeniem wokó³ kolonii bakterii otoczki (halo) wytr¹conych uwolnionych kwasów ó³ciowych lub tworzeniem bia³ych nieprzejrzystych ziarnistych kolonii [20,21]. Innym sposobem pomiaru aktywnoœci tego enzymu jest hodowla bakterii w po ywce p³ynnej z dodatkiem skoniugowanych kwasów ó³ciowych, ale przy wartoœciach ph zapobiegaj¹cych precypitacji kwasów ó³ciowych oraz póÿniejsze jakoœciowe lub iloœciowe oznaczenie wolnych kwasów ó³ciowych lub uwolnionych tauryny lub glicyny [21-23]. BIOTECHNOLOGIA 2 (69)

4 Ma³gorzata Ziarno 3. Wystêpowanie BSH u Bifidobacterium Dane literaturowe wskazuj¹ na zdolnoœæ wiêkszoœci pa³eczek Bifidobacterium, izolowanych z przewodu pokarmowego ludzi lub zwierz¹t, czyli œrodowisk bogatych w skoniugowane kwasy ó³ciowe, do hydrolizy tych soli [9,13,18,19,21,24-27]. Prawdopodobnie hydroliza soli kwasów ó³ciowych, katalizowana przez BSH, jest mechanizmem ochrony przed toksycznym dzia³aniem tych soli, obecnych w naturalnym œrodowisku bytowania Bifidobacterium [10,21,25,28-30]. Wysuwana jest równie hipoteza, e aktywnoœæ BSH u bifidobakterii mo e byæ jednym ze sposobów pozyskiwania azotu, podobnie jak stwierdzono to u bakterii z rodzaju Clostridium [14,31]. Interesuj¹ce jest to, e wiele szczepów bifidobakterii posiada aktywnoœæ BSH wy sz¹ ni ta stwierdzana u niektórych innych pa³eczek wystêpuj¹cych w przewodzie pokarmowym, w tym u Lactobacillus [19,32]. Tanaka i in. [21] na podstawie otrzymanych wyników wykazali, e prawie wszystkie badane szczepy bifidobakterii posiada³y aktywn¹ BSH, podczas gdy u innych rodzajów pa³eczek mlekowych, izolowanych z przewodu pokarmowego, ta aktywnoœæ by³a stwierdzana tylko u wybranych ich gatunków. Aktywnoœæ BSH obserwowana jest rzadziej u bifidobakterii pochodz¹cych ze œrodowisk, w których brak obecnoœci soli ó³ciowych, takich jak mleko lub roœliny [21]. Przypuszcza siê, e hydroliza soli kwasów ó³ciowych mo e byæ obron¹ przed toksycznym dzia³aniem tych soli na komórkê bakteryjn¹. Oddzia³ywanie ó³ci na powierzchniê komórek bakteryjnych mo e spowodowaæ zmiany w metabolizmie i budowie œciany komórkowej, w tym indukowaæ zmiany w profilu lipidowym b³ony komórkowej [24,33-35]. Takie zmiany zaobserwowano nie tylko u Bifidobacterium, ale równie u Lactobacillus, u których obecnoœæ soli ó³ciowych w œrodowisku bytowania bakterii wp³ywa³a na przepuszczalnoœæ b³ony komórkowej oraz interakcje miêdzy b³on¹ i œrodowiskiem bytowania komórki [36,37]. Niektórzy badacze uwa aj¹ jednak, e kwasy ó³ciowe, uwolnione przez BSH, s¹ nawet bardziej toksyczne dla komórek bakteryjnych ni ich formy skoniugowane z tauryn¹ lub glicyn¹ [17,21, 28-30,38,39]. Szczepy poszczególnych gatunków Bifidobacterium mog¹ wykazywaæ ró nice miêdzy sob¹ pod wzglêdem aktywnoœci BSH [10,21,25,26,32,40]. Wyniki uzyskiwane przez badaczy zale ¹ nie tylko od zastosowanych gatunków z rodzaju Bifidobacterium, ale równie od warunków inkubacji, rodzaju i stê enia u ytych soli ó³ciowych oraz procedury badawczej. Poziom aktywnoœci enzymu BSH Bifidobacterium wzrasta w logarytmicznej fazie wzrostu. Natomiast w fazie stacjonarnej, obserwuje siê tylko nieznaczny wzrost tej aktywnoœci lub jej brak [19,38]. Najczêœciej obserwuje siê zjawisko wiêkszej aktywnoœci BSH wobec soli ó³ciowych zawieraj¹cych glicynê ni wobec kwasów ó³ciowych skoniugowanych z tauryn¹ [17-19,25]. Mo e to byæ potwierdzeniem przypuszczenia, e aktywnoœæ BSH jest mechanizmem obrony komórek bakterii przed niekorzystnymi warunkami œrodowiska, gdy kwasy ó³ciowe 186 PRACE PRZEGL DOWE

5 Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium skoniugowane z glicyn¹ dominuj¹ w solach ó³ciowych. Zjawisko wybiórczej dekoniugacji soli ó³ciowych mo na wyt³umaczyæ równie w inny sposób. Substraty reakcji katalizowanych przez BSH musz¹ byæ dostarczane do wnêtrza komórki, gdy jest to enzym wewn¹trzkomórkowy. Poniewa kwasy skoniugowane z glicyn¹ s¹ s³abymi kwasami (np. pk kwasu glikodeoksycholowego wynosi oko³o 3,8, a kwasu taurodeoksycholowego oko³o 1), zatem przy wartoœciach ph równych wartoœci pk kwasy te znajduj¹ siê prawie w 50% w postaci niezjonizowanej i w 50% w formie zjonizowanej. Natomiast przy wartoœciach ph wy szych od wartoœci pka staj¹ siê donorami protonów i przechodz¹ w formê zjonizowan¹ (anionow¹). Wiadomo, e formy niezjonizowane s³abych elektrolitów ³atwiej ulegaj¹ dyfuzji biernej przez b³ony komórkowe ni formy zjonizowane. Prawdopodobnie dlatego w warunkach wysokiej kwasowoœci kwasy sprzê one z glicyn¹ maj¹ u³atwiony transport do wnêtrza komórek bakteryjnych [23,41,42]. Interesuj¹cego spostrze enia dokonali Grill i in. [19,25] badaj¹c tempo hydrolizy soli kwasów ó³ciowych trihydroksylowych (taurocholowego i glikocholowego) i dihydroksylowych (taurodeoksycholowego, glikodeoksycholowego, taurochenodeoksycholowego i glikochenodeoksycholowego) przez bifidobakterie. Wykazali, e skoniugowane kwasy dihydroksylowe by³y szybciej dekoniugowane ni skoniugowane kwasy trihydroksylowe. Pomimo powszechnej wœród bifidobakterii aktywnoœci BSH, w danych literaturowych podaje siê liczne przyk³ady niskiej opornoœci tych pa³eczek na stosunkowo wysokie stê enia soli ó³ciowych [25,29,43,44]. Badania opornoœci bakterii na sole ó³ciowe mog¹ byæ realizowane na dwa sposoby: okreœlaj¹c stopieñ prze ycia lub stopieñ rozwoju bakterii podczas hodowli w po ywce zawieraj¹cej dodatek soli ó³ciowych. Lankaputhra i Shah [40] przetrzymuj¹c szczepy Bifidobacterium w roztworach soli ó³ciowych o stê eniu 0-1,5% przez czas do 3 godzin wykazali, e ich prze ywalnoœæ zale a³a m.in. od rodzaju szczepu oraz stê enia i czasu dzia³ania soli ó³ciowych na komórki bakteryjne. Zavaglia i in. [7] stwierdzili, e spoœród izolatów bifidobakterii pobranych od niemowl¹t jedynie 25% by³o opornych na 0,5% stê enie ó³ci. Równie Kociubinski i in. [26] zaobserwowali, e wiêkszoœæ badanych przez nich szczepów Bifidobacterium by³a wra liwa na zastosowane stê enia ó³ci. Byæ mo e jest to potwierdzeniem hipotezy, e kwasy ó³ciowe, uwolnione podczas hydrolizy, silniej hamuj¹ rozwój bifidobakterii, ni ich formy skoniugowane z glicyn¹ lub tauryn¹. Dekoniugacja kwasów ó³ciowych i ich akumulacja w œrodowisku rozwoju bakterii wykazuj¹cych aktywnoœæ BSH, mo e prowadziæ do zahamowania wzrostu tych bakterii. Z kolei inni badacze stwierdzili, e niektóre bifidobakterie s¹ zdolne do prze ycia w obecnoœci soli ó³ciowych o stê eniu nawet wy szym ni spotykane w uk³adzie pokarmowym [10]. BIOTECHNOLOGIA 2 (69)

6 Ma³gorzata Ziarno 4. Wp³yw aktywnoœci BSH na przemiany ó³ci Pierwotne kwasy ó³ciowe s¹ syntetyzowane w w¹trobie z cholesterolu i nastêpnie wi¹zane (koniugowane) z glicyn¹ lub tauryn¹. W po³¹czeniu z jonami sodu lub potasu kwasy ó³ciowe tworz¹ ³atwo rozpuszczalne sole ó³ciowe. ó³æ, oprócz skoniugowanych i wolnych kwasów ó³ciowych, barwników ó³ciowych (g³ównie bilirubiny), bia³ek i soli nieorganicznych zawiera równie cholesterol, fosfolipidy (g³ównie lecytynê) i inne lipidy [16,45-47]. Wydzielana z w¹troby odp³ywa do jelita (dwunastnicy), gdzie ma za zadanie braæ udzia³ w trawieniu pokarmów (w celu u³atwienia absorpcji t³uszczu pokarmowego, cholesterolu, hydrofobowych witamin i innych sk³adników rozpuszczalnych w t³uszczach) oraz zobojêtniaæ kwaœn¹ miazgê pokarmow¹ opuszczaj¹c¹ o³¹dek [45,47]. Oko³o 97% soli ó³ciowych jest reabsorbowana w jelicie cienkim i zwracana do w¹troby przez y³ê wrotn¹. Niewielka frakcja soli ó³ciowych (oko³o mg), która nie zosta³a zaabsorbowana, przechodzi do jelita grubego, gdzie ulega degradacji bakteryjnej i dalej wydaleniu z organizmu [46]. Pod wp³ywem hydrolazy soli ó³ciowych, kwasy taurocholowy i glikocholowy, obecne w solach ó³ciowych, s¹ hydrolizowane do kwasu cholowego i odpowiednio tauryny lub glicyny. Natomiast kwasy taurochenodeoksycholowy i glikochenodeoksycholowy s¹ hydrolizowane do kwasu chenodeoksycholowego i odpowiednio tauryny lub glicyny [18,19,25,29,42,46]. Po hydrolizie w³aœciwoœci fizykochemiczne kwasów ó³ciowych zmieniaj¹ siê, m.in. obni a siê ich rozpuszczalnoœæ w wodzie, szczególnie przy niskich wartoœciach ph oraz pogarszaj¹ siê ich zdolnoœci emulguj¹ce [16,22,41,42,45,46]. W wielu badaniach wykazano, e hydroliza soli ó³ciowych wzmaga wydalanie uwolnionych kwasów ó³ciowych z uk³adu pokarmowego, gdy s¹ one gorzej absorbowane w jelicie cienkim ni formy zwi¹zane i szybciej wydalane z organizmu [6,46,48,49]. Taka sama iloœæ kwasów ó³ciowych, jaka zostaje tracona z ka³em, jest syntetyzowana w w¹trobie z cholesterolu (co przedstawiono na rysunkach 2i3,ale ze wzglêdu na wieloetapowoœæ syntezy kwasów ó³ciowych zamieszczone rysunki s¹ pewnym uproszczeniem). Nadmierna hydroliza soli kwasów ó³ciowych mo e tak e mieæ efekt patogenny lub prowadziæ do z³ego wch³aniania lipidów i witamin rozpuszczalnych w t³uszczach [12]. Ponadto, BSH wraz z 7-alfa-dehydroksylaz¹ mog¹ odgrywaæ istotn¹ rolê w tworzeniu kamieni ó³ciowych, a podwy szone stê enie soli wtórnych kwasów ó³ciowych (SBS, secondary bile salts) w jelicie cienkim prawdopodobnie podnosi ryzyko raka jelit [12,16,21,41,50-53]. Podczas przekszta³cania kwasów pierwotnych we wtórne, zachodz¹ dwie reakcje: dekoniugacja (od³¹czenie tauryny lub glicyny) oraz 7-alfa-dehydroksylacja (od³¹czenie grupy OH w pozycji 7). W uk³adzie pokarmowym najwa niejszymi wtórnymi kwasami ó³ciowymi s¹ kwasy deoksycholowy i litocholowy, powstaj¹ce przez usuniêcie grupy 7-alfa-hydroksylowej z pierwotnych kwasów ó³ciowych, odpowiednio cholowego i chenodeoksycholowego, co schematycznie przedstawiono na rysunku PRACE PRZEGL DOWE

7 Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium Rys. 2. Synteza pierwotnych kwasów ó³ciowych z cholesterolu oraz ich koniugacja z glicyn¹ lub tauryn¹ [1,2,44]. BIOTECHNOLOGIA 2 (69)

8 Ma³gorzata Ziarno Rys. 3. Inny mo liwy mechanizm syntezy pierwotnych kwasów ó³ciowych z cholesterolu [1,2,44]. Rys. 4. Przekszta³cenie pierwotnych kwasów ó³ciowych do wtórnych [1,44]. 190 PRACE PRZEGL DOWE

9 Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium Wtórne kwasy ó³ciowe, podobnie jak pierwotne kwasy ó³ciowe, s¹ koniugowane z glicyn¹ lub tauryn¹ [41,50]. Poniewa ó³æ zawiera znaczne iloœci jonów sodowych i potasowych, a jej ph jest alkaliczne, kwasy te tworz¹ z wymienionymi jonami sole, odpowiednio deoksycholan i litocholan. Chocia aktywnoœæ 7-alfa-dehydroksylazy zosta³a stwierdzona u niektórych gatunków nale ¹cych do rodzajów Eubacterium i Clostridium, to przypisuje siê j¹ wiêkszoœci mikroorganizmom jelitowym, w tym pa³eczkom mlekowym i bifidobakteriom [52,54-56]. Badania nad zwi¹zkiem miêdzy aktywnoœci¹ BSH i 7-alfa-dehydroksylacj¹ oraz nad zdolnoœci¹ pa³eczek mlekowych, w tym Bifidobacterium do 7-alfa-dehydroksylacji trwaj¹ od dawna. W danych piœmiennictwa zawarte s¹ liczne dowody naukowe na to, e bakterie z rodzaju Bifidobacterium nie przyczyniaj¹ siê bezpoœrednio do przekszta³cania pierwotnych kwasów ó³ciowych we wtórne kwasy ó³ciowe [46,51,53]. Z piœmiennictwa wynika, e pa³eczki z rodzaju Bifidobacterium mog¹ wrêcz przyczyniaæ siê do ochrony organizmu gospodarza przed powstawaniem toksycznych wtórnych kwasów ó³ciowych. Kurdi i in. [39] wykazali, e 9 szczepów Bifidobacterium akumulowa³o kwas cholowy w komórkach, zaœ mechanizm akumulacji opiera³ siê na dyfuzji biernej kwasu przez b³onê komórkow¹. Podobne zjawisko zaobserwowano u pa³eczek Lactobacillus. Boever i wsp. [48] stwierdzili, e szczep L. reuteri wi¹za³ cz¹steczki uwolnionych przez BSH kwasów ó³ciowych do swoich komórek, przez co by³y one mniej biodostêpne dla pozosta³ej mikroflory jelitowej. Bakterie mlekowe, w tym bifidobakterie nie metabolizuj¹ kwasu cholowego, jednak ich zdolnoœæ do akumulacji tego kwasu w warunkach in vivo, jak siê wydaje, jest istotnym zagadnieniem w odniesieniu do biotransformacji kwasów ó³ciowych w organizmie cz³owieka [39]. 5. Wp³yw aktywnoœci BSH na poziom cholesterolu Obserwowany w ostatnich latach wzrost zainteresowania hydroliz¹ soli kwasów ó³ciowych przez bakterie kwasu mlekowego zwi¹zany jest równie z mo liwoœci¹ wykorzystania tego zjawiska do obni ania poziomu cholesterolu we krwi ludzi z hipercholesterolemi¹ lub zapobieganiem hipercholesterolemii u osób zdrowych [9, 37,38,57-60]. Proponowane s¹ trzy mechanizmy wp³ywu aktywnoœci BSH na poziom cholesterolu w organizmie. Pierwszy mechanizm sugeruje, e zwiêkszenie tempa hydrolizy soli ó³ciowych przyczynia siê do wiêkszego wydalania uwolnionych kwasów ó³ciowych z przewodu pokarmowego, co stymuluje syntezê nowych kwasów ó³ciowych z dostêpnego cholesterolu, a to z kolei prowadzi do obni enia jego poziomu w organizmie [46,49]. Drugi mo liwy mechanizm t³umacz¹cy efekt obni ania poziomu cholesterolu w organizmie, to zmniejszanie iloœci cholesterolu pokarmowego absorbowanego przez organizm z pokarmu [12,49]. Trzecia mo liwoœæ wp³ywu aktywnoœci BSH na obni anie poziomu cholesterolu, to wywo³anie jego wytr¹cenia BIOTECHNOLOGIA 2 (69)

10 Ma³gorzata Ziarno z uwolnionymi kwasami ó³ciowymi w niskim ph œrodowiska [15,26,60,61]. Inni badacze sugeruj¹, e usuwanie cholesterolu w warunkach in vitro z pod³o a hodowlanego przez bifidobakterie jest powodowane nie tylko jego wytr¹ceniem wraz ze zhydrolizowanymi kwasami ó³ciowymi. Mo liwa jest tak e adsorpcja cz¹steczek cholesterolu (okreœlana w piœmiennictwie mianem asymilacji cholesterolu) do powierzchni komórek bakteryjnych [38,59]. W celu oznaczenia warunków asymilacji cholesterolu, Tahri i in. [60] hodowali ró ne szczepy Bifidobacterium w obecnoœci cholesterolu i kwasów ó³ciowych. Stwierdzili, e w ph poni ej 6 szczep B. breve ATCC asymilowa³ cholesterol w iloœci do 51% pocz¹tkowego stê enia, gdy by³ hodowany w obecnoœci kwasu taurocholowego (skoniugowanego kwasu ó³ciowego) oraz w iloœci oko³o 13% pocz¹tkowego stê enia, gdy by³ hodowany w obecnoœci kwasu cholowego (zdekoniugowanego kwasu ó³ciowego). Ponadto zauwa yli, e bifidobakterie nie posiadaj¹ce aktywnoœci BSH (np. szczepy z gatunków B. asteroides, B. indicum, B. coryneforme) wykaza³y zdolnoœæ do asymilacji cholesterolu podobn¹ do stwierdzanej u bifidobakterii posiadaj¹cych aktywnoœæ BSH, ale hodowanych w warunkach bez dodatku soli kwasów ó³ciowych [59]. W badaniach wskazuje siê, e jednym z warunków wymaganych do asymilacji cholesterolu jest to, aby komórki bifidobakterii by³y ywe, poniewa nie stwierdzono asymilacji u komórek nie wykazuj¹cych rozwoju [59]. Interesuj¹cy jest, jak siê wydaje, wp³yw rodzaju kwasów ó³ciowych na asymilacjê cholesterolu przez bakterie. Okazuje siê, e bifidobakterie asymiluj¹ wiêcej cholesterolu w obecnoœci soli kwasów ó³ciowych trihydroksylowych (taurocholowego lub glikocholowego) ni soli kwasów dihydroksylowych (taurodeoksycholowego, glikodeoksycholowego, taurochenodeoksycholowego lub glikochenodeoksycholowego) [60]. Wynika z tego, e nie ma korelacji miêdzy asymilacj¹ cholesterolu i wydajnoœci¹ hydrolizy soli kwasów ó³ciowych, gdy sole kwasów ó³ciowych dihydroksylowych s¹ szybciej hydrolizowane ni sole kwasów trihydroksylowych [24,25]. 6. Czynniki genetyczne aktywnoœci BSH W literaturze dostêpne s¹ nieliczne przyk³ady badañ dotycz¹cych kodowania BSH u bifidobakterii [17,18,27]. Pierwszy zsekwencjonowano i zbadano gen koduj¹cy BSH (bsh) u szczepu B. longum SBT 2928 [18]. Tanaka i in. [18] stwierdzili, e bsh jest czêœci¹ operonu zawieraj¹cego co najmniej dwa geny: bsh i glne. Gen glne koduje enzym GlnE (adenylylotransferazê modyfikuj¹c¹ syntetazê glutaminow¹), który przenosi reszty adenylylowe z ATP na syntetazê glutaminow¹ i jest czêœci¹ kaskadowej regulacji azotowej u E. coli, prawdopodobnie u Haemophilus influenzae oraz ró nych gatunków bakterii z rodzajów Mycobacterium i Pseudomonas [62,63]. Region operonu miêdzy bsh i glne jest krótki i brak mu silnego sygna³u koñcz¹cego, co sugeruje, e transkrypcja obydwu genów zachodzi pod kontrol¹ wspólnego promotora poprzedzaj¹cego gen bsh. Poniewa brak funkcjonalnych zwi¹zków miêdzy enzy- 192 PRACE PRZEGL DOWE

11 Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium mami BSH i GlnE, dlatego powi¹zanie bsh i glne w jednym operonie mo e byæ zaskoczeniem. Jednoczeœnie, sprzê enie bsh z genem kaskadowej regulacji azotowej przypomina hipotezê, e hydroliza soli ó³ciowych ma u³atwiæ pozyskiwanie azotu przez komórki bakteryjne [18,54,64]. Taka genetyczna organizacja jest inna od stwierdzonej dotychczas u bakterii z rodzaju Lactobacillus. UL. plantarum bsh jest genem monocistronowym. Natomiast cbshb wykryty u L. johnsonii oraz u L. acidophilus KS-13 jest genem policistronowym, gdy poprzedzaj¹ go dwa geny koduj¹ce system transportu kwasów ó³ciowych (cbst1 i cbst2) [65,66]. Podobnych sekwencji nie stwierdzono w przypadku genu bsh kodowanego u Clostridium perfringens [67]. Z kolei Shuhaimi i in. [27] badaj¹c gen koduj¹cy BSH u B. longum BB 536 stwierdzili jego podobieñstwo do genu wystêpuj¹cego u bakterii z rodzaju Lactobacillus na poziomie 42%. Trwaj¹ dalsze badania nad molekularn¹ charakterystyk¹ genów koduj¹cych u bifidobakterii enzymy BSH typu A, B, C [17]. 7. Podsumowanie Wiedza o aktywnoœci BSH u bakterii z rodzaju Bifidobacterium mo e u³atwiæ poznanie ich oddzia³ywania na organizm cz³owieka lub zwierz¹t. Jest to szczególnie istotne w odniesieniu do bifidobakterii obecnych w fermentowanych produktach spo ywczych czy biopreparatach farmaceutycznych spo ywanych przez ludzi lub zwierzêta. Szczegó³owe informacje na temat aktywnoœci BSH u bifidobakterii mog¹ byæ w przysz³oœci wykorzystane do badania zdolnoœci bakterii z rodzaju Bifidobacterium do zasiedlania uk³adu pokarmowego. Mog¹ równie pomóc w opracowaniu metod regulowania poziomu cholesterolu u ludzi z hipercholesterolemi¹ lub zapobiegania powstawaniu kamieni ó³ciowych. Nie mniej wa ne jest dok³adne poznanie genotypu bifidobakterii, sposobu kodowania BSH i stabilnoœci tej cechy u konkretnych szczepów. Do zdobycia pe³nej informacji o aktywnoœci BSH u bifidobakterii potrzebne s¹ podstawowe szczegó³owe badania in vitro i in vivo z tego zakresu. Literatura 1. O Sullivan D. J., Kullen M. J., (1998), Int. Dairy J., 8(5-6), Biavati B., Castagnoli P., Trovatelli L. D., (1986), Microbiologica, 9 (1), Holzapfel W. H., Haberer P., Snel J., Schillinger U., Huis in t Veld J. H. J., (1998), Int. J. Food Microbiol., 41, Mitsuoka T., (1996), Asia Pacific J. Clin. Nutr., 5(1), Romond M. B., Romond C., Izard D., (1992), Les Bifidobacterium, in: Les groupes microbiens d intérêtlaitier, Eds. Hermier J., Lenoir J., Weber F. CEPIL, Pary, Tannock G. W., (1995), Int. Dairy J., 5(8), Zavaglia A. G., Kociubinski G., Perez P., de Antoni G., (1998), J. Food Prot., 7, Socha J., Stolarczyk A., Socha P., (2002), Pediatria Wspó³czesna, Gastroenterologia, Hepatologia i ywienie Dziecka, 4 (1), Gomes A. M. P., Malcata F. X., (1999), Trends Food Sci. Technol., 10, 139. BIOTECHNOLOGIA 2 (69)

12 Ma³gorzata Ziarno 10. Ibrahim S. A., Bezkorovainy A., (1993), J. Sci. Food Agric., 62, Kailasapathy K., Chin J., (2000), Immun. Cell Biol., 78, Marteau, P., Gerhardt M. F., Myara A., Bouvier E., Trivin F., Rambaud J. C., (1995), Microb. Ecol. Health Dis., 8, Ferrari A., Pacini N., Canzi E., (1980), J. Appl. Bacteriol., 49, Gopal-Srivastava R., Hylemon P. B., (1988), J. Lipid Res., 29, Klaver F. A. M., Meer R. V., van der, (1993), Appl. Environ. Microbiol., 59, Macdonald I. A., Bokkenheuser V. D., Winter J., McLernon A. M., Mosbach E. H., (1983), J. Lipid Res., 24, Kim G. B., Yi S.-H., Lee B. H., (2004), J. Dairy Sci., 87, Tanaka H., Hashiba H., Kok J., Mierau I., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, Grill J.P., Schneider F., Crociani J., Ballongue J., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, Dashkevicz M. P., Feighner S. D., (1989), Appl. Environ. Microbiol., 55, Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T., Mireau I., (1999), J. Dairy Sci., 82, Corzo G., Gilliland S. E., (1999), J. Dairy Sci., 82, Grill J. P., Cayuela C., Antoine J. M., Schneider F., (2000), J. Appl. Microbiol., 89, Dambekodi P. C., Gilliland S. E., (1998), J. Dairy Sci., 81, Grill J. P., Manginot-Durr C., Schneider F., Ballongue J., (1995), Curr. Microbiol., 31 (1), Kociubinski G., Pérez P., de Antoni G., (1999), J. Food Prot., 8, Shuhaimi M., Ali A. M., Saleh N. M., Yazid A. M., (2001), Biotechnol. Lett., 23, Clark P. A., Cotton L. N., Martin J. H., (1993), Cult. Dairy Prod., J. 9, Clark P. A., Martin J. H., (1994), Cult. Dairy Prod., J. 29, Gunn J. S., (2000), Microbes Infect., 2, Eldere van J., Celis P., de Pauw G., Lesaffre E., Eyssen H., (1996), Appl. Environ. Microbiol., 62, Marteau P., Minekus M., Havenaar R., Huis in t Veld J. H. J., (1997), J. Dairy Sci., 80, Perez P. F., Minnaard Y., Disalvo E. A., de Antoni G. L., (1998), Appl. Environ. Microbiol., 64, Perrin S., Grill J.,P., Schneider F., (2000), J. Appl. Microbiol., 88, Zavaglia A. G., Kociubinski G., Perez P., Disalvo E., de Antoni G., (2002), J. Appl. Microbiol., 93, Taranto M. P., Murga M. L. F., Lorca G., Valdez G. F., (2003), J. Appl. Microbiol., 95, Usman B., Hosono A., (1999), Milchwissenchaft., 54, Gopal A., Shah N. P. Roginski H., (1996), Milchwissenschaft., 51, Kurdi P., Tanaka H., van Veen H. W., Asano K., Tomita F., Yokota A., (2003), Microbiol., 149, Lankaputhra W. E. V., Shah N. P., (1995), Cult. Dairy Prod. J., 30, Batta A. K., Salen G., Arora R., (1990), J. Biol. Chem., 265, Fini A., Roda A., (1987), J. Lipid Res., 28, Charteris W. P., Kelly P. M., Morelli L., Collins J. K., (1998), J. Appl. Microbiol., 84, Chung H. S., Kim Y. B., Chun S. L., Ji G. E., (1999), Int. J. Food Microbiol., 47, Batta A. K., Salen G., (1999), J. Chromatogr. B., 723, Chikai T., Nakao H., Uchida K., (1987), Lipids, 22, Hofmann A. F., Roda A., (1984), J. Lipid Res., 25, Boever de P., Wouters R., Verschaeve L., Berckmans P., Schoeters G., Verstraete W., (2000), Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, Hosono A., Otani H., Yasui H., Watanuki M., (2002), Anim. Sci. J., 73, Cheah P. Y., (1990), Nutr. Cancer, 14, Hirano S., Nakama R., Tamaki M., Masuda N., Oda H., (1981), Appl. Environ. Microbiol., 47, Masuda N., Oda H., Hirano S., Masuda M., Tanaka H., (1984), Appl. Environ. Microbiol., 47, Takahashi T., Morotomi M., (1994), J. Dairy Sci., 77, Huijghebaert S. M., Mertens J. A., Eyssen H. J., (1982), Appl. Environ. Microbiol., 43, Hylemon P. B., Cacciapuoti A. F., White B. A., Whitehead T. R., Fricke R. J., (1980), Am. J. Clin. Nutr., 33, PRACE PRZEGL DOWE

13 Znaczenie aktywnoœci hydrolazy soli ó³ci u bakterii z rodzaju Bifidobacterium 56. Stellwag E. J., Hylemon P. B., (1979), J. Lipid Res., 20, Gilliland S. E., (1990), FEMS Microbiol. Rev., 87, Hosono A., Tono-oka T., (1995), Milchwissenschaft., 50, Tahri K., Grill J. P., Schneider F., (1996), Curr. Microbiol., 33, Tahri K., Grill J. P., Schneider F., (1997), Curr. Microbiol., 34, Rasic J. L., Vujicic I. F., Skrinjar M., Vulic M., (1992), Biotechnol. Lett., 14, Heeswijk van W. C., Rabenberg M., Westerhoff H. V., Kahn D., (1993), Mol. Microbiol., 9, Magasanik B., (1993), J. Cell. Biochem., 51, Eldere van J., Robben J., de Pauw G., Merckx R., Eyssen H., (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54, Christiaens H., Leer R. J., Pouwels P. H., (1992), Appl. Environ. Microbiol., 58, Elkins C. A., Moser S. A., Savage D. C., (2001), Microbiology, 147, Coleman J. P., Hudson L. L., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, Agellon L. B., Torchia E. C., (2000), Bioch. Bioph. Acta, 1486, BIOTECHNOLOGIA 2 (69)