13 Stres oksydacyjny jako stres wtórny towarzyszący uszkodzeniom mechanicznym na przykładzie rzodkiewnika Arabidopsis thaliana L.

Transkrypt

1 13 Stres oksydacyjny jako stres wtórny towarzyszący uszkodzeniom mechanicznym na przykładzie rzodkiewnika Arabidopsis thaliana L. Edyta Łukaszuk / Magdalena Ignaczewska / Iwona Ciereszko Uniwersytet w Białymstoku, Wydział Biologiczno-Chemiczny Instytut Biologii, Zakład Fizjologii Roślin ul. Świerkowa 20b, Białystok edytaluk@uwb.edu.pl Streszczenie Zranienie powstające na powierzchni rośliny, jest często wynikiem działania silnego wiatru, deszczu lub gradobicia. Mechaniczne uszkodzenia roślin powstają także na skutek zabiegów rolniczych, zgryzania przez zwierzęta i larwy owadów. Wymienione czynniki stresowe, zarówno biotyczne, jak i abiotyczne mogą generować pojawienie się stresów wtórnych, takich jak stres oksydacyjny, czy stres deficytu wody. W przedstawionych badaniach zaobserwowano, że zranienie liści rzodkiewnika Arabidopsis thaliana L. prowadzi do pojawienia się symptomów stresu oksydacyjnego podwyższonego stężenia H 2 O 2 i peroksydacji lipidów. Zaobserwowano nagromadzenie H 2 O 2 w miejscu uszkodzenia tkanek, a także w wiązkach przewodzących. Dane te świadczą o roli H 2 O 2 w lokalnej i systemicznej reakcji na zranienie. Właściwości oksydoredukcyjne H 2 O 2 sprawiają, że w roślinach może on pełnić zarówno funkcję bakterio- jak i grzybobójczą, jak też sygnałową. Słowa kluczowe: zranienie, reaktywne formy tlenu, rzodkiewnik, reakcje na stres Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów 155

2 13.1. Wstęp Oddziaływanie środowiska na rośliny ma bardzo złożony charakter. Oddziaływanie to może być stresogenne, powodując między innymi podwyższoną syntezę reaktywnych form tlenu (RFT). Zranienie jest to czynnik stresowy pochodzenia abiotycznego lub biotycznego, często występujący w środowisku naturalnym. Uszkodzenia roślin spowodowane są przez zgryzanie zwierząt i larwy owadów, człowieka (przeważnie w wyniku zabiegów rolniczych związanych ze zbiorami oraz przechowywaniem roślin), a także na skutek gradobicia, silnego deszczu czy wiatru (Łukaszuk, Ciereszko 2012). U roślin wyróżnić można odporność bierną (przedinfekcyjną) uwarunkowaną cechami anatomiczno-morfologicznymi i chemicznymi, oraz odporność czynną (poinfekcyjną). Odporność czynna obejmuje zarówno reakcje wczesne, inicjowane bardzo szybko (od momentu zranienia), jak i reakcje późne, obserwowane po kilku godzinach, a nawet kilku dniach po infekcji. Odpowiedź czynna może mieć charakter lokalny lub systemiczny. Odpowiedź lokalna występuje w miejscu zranienia i związana jest z wytwarzaniem barier fizycznych, np. zgrubień ściany komórkowej i chemicznych, np. syntezą alkaloidów. Zaobserwowano istotną rolę fenoli w reakcji lokalnej na zranienie w korzeniach marchwi (Daucus carota L.) (Jacobo-Velazquez i in. 2011). Związki fenolowe, np. taniny, salicylany chronią rośliny przed zgryzaniem, mają działanie odstraszające, a niektóre mają działanie silnie toksyczne dla owadów i ssaków. Odpowiedź systemiczna ma miejsce w tkankach i organach, które bezpośrednio nie zostały uszkodzone. Uruchomienie tej odpowiedzi wymaga działania fitohormonów głównie kwasu jasmonowego (JA), abscysynowego (ABA), etylenu oraz regulatorów wzrostu, np. kwasu salicylowego (SA) i traumatynowego (Koo, Howe 2009; Piotrowska, Bajguz 2011) oraz RFT i jonów wapnia (Leon i in. 2001; Łukaszuk, Ciereszko 2012). Związki te biorą udział w szlaku sygnalizacji o zranieniu, aktywując kinazy MAP (ang. Mitogen-Activated Protein Kinases), prowadzą do zmiany ekspresji genów i podjęcia procesów naprawczych poprzez syntezę białek obronnych PR (ang. Pathogenesis Related), inhibitorów proteinaz, defensyn oraz aktywują alternatywne szlaki metaboliczne (Bowles 1990; Leon i in. 2001). Jedną z pierwszych reakcji rośliny na zranienie jest synteza RFT (Bruce, Pickett 2007). O ile niewielkie ilości RFT są niezbędne do prawidłowego przebiegu wielu reakcji, to ich podwyższone stężenie powoduje na przykład uszkodzenia oksydacyjne białek i peroksydację lipidów, które skutkują zmianami struktury i funkcji białek i błon. Zmiana równowagi oksydoredukcyjnej prowadzi do powstania stresu oksydacyjnego, rozumianego jako brak równowagi pomiędzy wytwarzaniem reaktywnych form tlenu a ich detoksykacją przez odpowiednie systemy antyoksy- 156

3 dacyjne (Pietras i in. 1997; Bartosz 2013). Stres oksydacyjny jest najczęściej występującym stresem wtórnym towarzyszącym innym stresom pierwotnym, na przykład suszy, chłodu, przegrzania, metalom ciężkim. RFT powstają w wyniku aktywności enzymów peroksydazy, oksydazy NADPH i fosfolipazy (Pietras i in. 1997; Ramel i in. 2009). W wyniku zadziałania czynnika stresowego, następuje podwyższenie intensywności oddychania mitochondrialnego i wzrost aktywności oksydazy NADPH w błonie komórkowej. Powoduje to syntezę anionorodnika ponadtlenkowego (O 2 ), który następnie jest przekształcany do O 2 i H 2 O 2 przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD) (Chen i in. 2012; Bartosz 2013). Ze względu na wysoki potencjał oksydoredukcyjny, RFT mogą pełnić funkcje bakterio- i grzybobójcze. Wysokie stężenie RFT może nawet powodować śmierć komórek wytwarzających RFT wraz z komórkami patogenu, zapobiegając i ograniczając tym samym rozprzestrzenianie się infekcji w tzw. reakcji nadwrażliwości (Pietras i in. 1997, Rentel i in. 2004). RFT mogą uczestniczyć także pośrednio w regulacji ekspresji genów, wpływając na aktywację czynników transkrypcyjnych, na przykład: HSF (ang. Heat Shock Factor), EREBP (ang. Ethylene-Responsive Element Binding Protein), AP-1 (ang. Activator Protein 1) (Mittler 2002; Dietz i in. 2010). Uruchamiana w ten sposób odpowiedź rośliny na działanie czynnika stresowego prowadzi do wymiatania wolnych rodników, syntezy białek HSP (ang. Heat-Shock Proteins) i zahamowania fotosyntezy (Mittler 2002). Po mechanicznym uszkodzeniu liści różnych gatunków roślin zaobserwowano, że intensywna synteza H 2 O 2 następuje w czasie 60 minut od momentu działania stresora, a wysokie stężenie utrzymuje się przez 6 godzin (Orozco-Cardenas, Ryan 1999). Nie tylko zranienie powoduje taką odpowiedź; obserwuje się ją również po podaniu związków stricte związanych z odpowiedzią roślin na zranienie, takich jak: systemina, oligogalakturonidy, jasmonian metylu czy chitosan. Związki te sprzężone są ze szlakiem oktadekainowym i odpowiedzią systemiczną na zranienie (Leon i in. 2001). Przeprowadzone badania miały na celu rozpoznanie symptomów stresu oksydacyjnego w liściach rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana L.), w wyniku zadziałania czynnika stresowego uszkodzenia mechanicznego liści rozetowych Materiał i metody badań Materiałem badawczym były rozety liściowe rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) ekotyp Columbia (Ryc. 13.1a). Rośliny przez 6 tygodni rosły na podłożu stałym (ziemi torfowej) w pomieszczeniu fitotronowym 157

4 w kontrolowanych warunkach (temp. dzień/noc: 25 o C/20 o C, fotoperiod 10 h, PAR 100 μmol m -2 s -1, względna wilgotność powietrza 65%). Po 6 tygodniach połowę liści w rozecie nacięto nożyczkami tak, aby przeciąć główną wiązkę przewodzącą (Ryc. 13.1B). Do doświadczeń pobierane były całe rozety liściowe (w tym liście nacinane i nienacinane), jedynie do histochemicznego wybarwiania liści na obecność H 2 O 2 pobierane były pojedyncze liście zranione i niezranione (jako kontrola). Doświadczenia przeprowadzono w 2. i 24. godziny po zranieniu (oznaczane jako 2 Z i 24 Z). Rozety z nienacinanymi liśćmi stanowiły kontrolę (K) dla roślin poddanych zranieniu. Badania pilotażowe nie wykazały istotnych zmian w rozetach kontrolnych (nienacinanych) w czasie 24 godzin, dlatego tę samą kontrolę stosowano w stosunku do roślin 2 Z i 24 Z. Badano wpływ stresu zranienia na podstawowe parametry wzrostowe i zawartość chlorofili, karotenoidów (metoda według Wellburn 1994). Badano zawartość antocyjanów, przedstawiając dane jako ilość jednostek absorbancji U μg -1 białka; 1U ilość białka wskazująca absorbancję 1 przy 600 nm (metoda według Kubo i in. 1999). Analizowano następujące wskaźniki stresu oksydacyjnego: zawartość H 2 O 2 i produktów reakcji z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) (według metody opisanej przez Velikova i in. 2000), zawartość grup tiolowych (SH) (według metody opisanej przez Tripathi, Gaur 2004). Dokonano również oznaczenia lokalizacji H 2 O 2 metodą histochemiczną z 3,3-diaminobenzydyną (DAB) (według metody opisanej przez Thordal-Christensen i in. 1997). Rycina Ogólny pokrój 6-tygodniowej kontrolnej rozety liściowej rzodkiewnika (A), fragment 6-tygodniowej rozety rzodkiewnika z naciętymi liśćmi (B). Skala 1 cm Fot. E. Łukaszuk. 158

5 13.3. Wyniki i dyskusja W rezultacie przeprowadzonych badań nie zaobserwowano znaczącego wpływu zranienia na zmianę parametrów wzrostowych, zawartość wody i ogólną zawartość chlorofili i karotenoidów (Tab. 13.1). Po 24 godzinach od zranienia liści rozetowych, nastąpił wzrost zawartości antocyjanów. Antocyjany w roślinach pełnią rolę antyoksydantów, działając jako zmiatacze wolnych rodników ograniczających negatywne skutki działania RFT na komórkę. Tabela Parametry wzrostowe i zawartość barwników: chlorofili, karotenoidów i antocyjanów w liściach rozetowych rzodkiewnika w 6. tygodniu wzrostu Parametr K 2 Z 24 Z Średnica rozety liściowej [cm] 6,1 ± 0,6 6,2 ± 0,6 6,0 ± 0,7 Świeża masa [g] 0,43 ± 0,08 0,39 ± 0,1 0,34 ± 0,08 Sucha masa [g] 0,04 ± 0,006 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,03 Zawartość wody [%] Zawartość chlorofilu a+b [mg g -1 św.m.] 1,76 ± 0,21 1,87 ± 0,19 1,86 ± 0,32 Zawartość karotenoidów [mg g -1 św.m.] 0,31 ± 0,04 0,28 ± 0,05 0,28 ± 0,02 Zawartość antocyjanów [U μg -1 białka] 14 ± 4,7 16 ± 3,8 20 ± 4,6 Oznaczenia: K rośliny nieuszkadzane, 2 Z i 24 Z rośliny, odpowiednio: po 2 i 24 godzinach po zranieniu. Wyniki średnie z 5 powtórzeń ±SD. Źródło: badania własne. W wyniku zranienia, w zranionych rozetach liściowych rzodkiewnika wzrosło stężenie H 2 O 2 (Ryc. 13.2). Zaobserwowano, że 24 godziny po zranieniu, stężenie H 2 O 2 w rozetach liściowych jest niemal dwukrotnie wyższe w porównaniu do roślin kontrolnych, i wynosi 0,77 μmol H 2 O 2 g -1 św. m. Wyniki badań uzyskane na uszkodzonych siewkach pomidora (Lycopersicon esculentum Mill.) wykazały wzrost stężenia H 2 O 2 w niezranionych liściach rosnących powyżej miejsca uszkodzenia, co sugeruje udział H 2 O 2 w odpowiedzi systemicznej (Orozco-Cardenas, Ryan 1999). Podobną reakcję systemiczną zaobserwowano po 4. godzinach od momentu zranienia w liściach kukurydzy (Zea mays L.), grochu (Pisum sativum L.), bawełny (Gossypium hirsutum L.) i ziemniaka (Solanum tuberosum L), podczas gdy u ogórka (Cucumis sativus L.) zanotowano jedynie lokalne podwyższenie stężenia H 2 O 2 (Orozco-Cardenas, Ryan 1999). Wzrost stężenia H 2 O 2 w zranionych liściach dyni (Cucurbita pepo L.) następował do 60 minutach od zranienia; po tym czasie obser- 159

6 wowano obniżenie zawartości H 2 O 2 (Stoilkova i in. 2009). Podwyższone stężenie H 2 O 2 może wynikać z aktywacji oksydazy NADPH, prowadzącej do kumulacji O 2, a następnie H 2 O 2. Nagromadzony H 2 O 2 łatwo wchodzi w reakcje redoks z innymi związkami, prowadząc do utleniania białek, peroksydacji lipidów i uszkodzenia kwasów nukleinowych. Rycina Stężenie H 2 O 2 w rozetach liściowych rzodkiewnika w 6. tygodniu wzrostu Oznaczenia: K rośliny nieranione, 2 Z i 24 Z rośliny 2. i 24. godziny po zranieniu. Wyniki średnie ±SD. Źródło: opracowanie własne. Badania histochemiczne z wykorzystaniem liści rozetowych rzodkiewnika wskazują na zwiększenie zawartości H 2 O 2, przede wszystkim w miejscu nacięcia liści i w głównej wiązce przewodzącej liści u roślin zranionych (Ryc. 13.3). Jak podają dane literaturowe, barwny produkt reakcji H 2 O 2 z DAB pojawia się przy stężeniu H 2 O 2 wynoszącym 0,1 μm, jednak wyraźne zabarwienie tkanek zaobserwować można przy stężeniu 1-10 μm (Thordal-Christensen i in. 1997). Zatem, o ile stężenie H 2 O 2 w ranionych rozetach liściowych było na poziomie 0,6-0,8 μmol H 2 O 2 g -1 św. m, to wyraźnie widać, że w miejscu zranienia liścia oraz w wiązce przewodzącej, stężenie to było zdecydowanie wyższe. 160

7 miejsce zranienia Rycina Identyfikacja histochemiczna H 2 O 2 w liściach rzodkiewnika podczas stresu zranienia (A), liść 24. godziny po zranieniu (B D) Oznaczenia: K rośliny kontrolne, 2 Z i 24 Z rośliny 2 i 24 godziny po zranieniu. Ciemne zabarwienie świadczy o zwiększonej zawartości H 2 O 2. Źródło: opracowanie własne. Jednym z najbardziej znanych biologicznych, łańcuchowych procesów wolnorodnikowych jest peroksydacja lipidów (Puzanowska-Tarasiewicz i in. 2008). Jest to ciąg reakcji, które mogą potęgować stres oksydacyjny zapoczątkowany przez wolne rodniki bądź RFT. Proces ten polega na utlenieniu nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, w których powstają nadtlenki tych związków (Kulbacka i in. 2009). Przeprowadzone badania wskazują na zwiększenie zawartości barwnych produktów peroksydacji z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), zwłaszcza 2 godziny po nacięciu liści (Ryc. 13.4). Zaobserwowano, że o ile w roślinach kontrolnych zawartość TBARS wynosiła 2,8 μmol g -1 św. m., to w wyniku uszkodzenia mechanicznego zawartość TBARS wzrosła dwukrotnie. Badania przeprowadzone na dyni wskazują na postępującą peroksydację lipidów nawet 7 dni po uszkodzeniu liści (Stoilkova i in. 2009). Zawartość dialdehydu malonowego (MDA) 24 godziny po zranieniu zwiększyła się prawie o połowę w porównaniu do kontroli, natomiast 7 dni po zadziałaniu stresora, wzrosła ponad dwukrotnie. Efektem uszkodzenia mechanicznego pędów ryżu (Oryza sativa L.) 161

8 była znaczna peroksydacja lipidów, obserwowana już 30 minut po zranieniu zawartość MDA wzrosła siedmiokrotnie (Kim i in. 2014). Peroksydacja lipidów prowadzi do modyfikacji właściwości fizycznych błon komórkowych, na przykład zwiększenia przepuszczalności błon dla jonów H + i innych polarnych substancji, zmniejszenia potencjałów elektrycznych po obydwu stronach błony oraz przerwania integralności błon (Kulbacka i in. 2009). Peroksydacja lipidów powoduje także zahamowanie aktywności enzymów błonowych i białek transportowych. Rycina Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w rozetach liściowych rzodkiewnika w 6. tygodniu wzrostu OZNACZENIA: K rośliny nie ranione, 2 Z i 24 Z rośliny 2 i 24 godziny po zranieniu. Wyniki średnie ±SD Źródło: opracowanie własne. Końcowe produkty peroksydacji lipidów mogą reagować z grupami tiolowymi białek oraz z resztami aminokwasów, na przykład lizylowymi, histydylowymi, arginylowymi, tyrozylowymi (Puzanowska-Tarasiewicz i in. 2008). Uszkodzenia oksydacyjne grup -SH prowadzą do utraty aktywności biologicznej białka, zaburzenia transporterów i enzymów oraz zakłócenia równowagi wapniowej w komórce (Kulbacka i in. 2009). U rzodkiewnika nie wykazano znaczących różnic w zawartości grup tiolowych pomiędzy roślinami ranionymi a nieranionymi (Ryc. 13.5); być może należałoby zbadać zawartość -SH po dłuższym czasie od momentu uszkodzenia liści. Substancją chroniącą grupy tiolowe przed utlenieniem jest glutation. Chroni on komórki przed oksydacyjnymi uszkodzeniami grup -SH białek poprzez etiolację rodników tiolowych. W warunkach stresu oksydacyjnego, stężenie disulfidu glutationu ulega znacznemu podwyższeniu. Jest to wynik reakcji grup tiolowych glutationu z RFT, a także aktywności peroksydazy glutationowej (Potters i in. 2010). 162

9 Rycina Zawartość grup tiolowych w rozetach liściowych rzodkiewnika w 6 tygodniu wzrostu OZNACZENIA: K rośliny nie ranione, 2 Z i 24 Z rośliny 2 i 24 godziny po zranieniu. Wyniki średnie ±SD Źródło: badania własne. Roślina w naturalnym środowisku narażona jest na działanie szeregu czynników stresowych, które mogą generować stresy wtórne, w tym stres oksydacyjny. Współwystępowanie stresów może wyzwalać zupełnie nową reakcję rośliny, niż gdyby te czynniki oddziaływały oddzielnie (Mittler 2006; Bruce, Pickett 2007). Odpowiedź roślin na działanie czynników środowiskowych, w tym również stresowych, składa się z podobnych elementów zaangażowane są kinazy MAP, fitohormony (np. etylen, jasmoniany, kwas abscysynowy), czynniki transkrypcyjne, jony wapnia i RFT (Bowles 1990; Leon i in. 2001). Szlaki aktywowane przez te związki mogą w efekcie prowadzić do różnorodnych reakcji. Przeprowadzone badania wskazują na pojawienie się wtórnego stresu oksydacyjnego, towarzyszącego mechanicznemu uszkodzeniu rozet liściowych rzodkiewnika. W reakcjach krótkoterminowych na zranienie zaobserwowano zwiększenie zawartości H 2 O 2 i wzmożoną peroksydację lipidów, która jest powszechnie uznanym wyznacznikiem stresu oksydacyjnego. Podwyższona zawartość H 2 O 2 w wiązkach przewodzących, wskazuje na rolę sygnalizacyjną tego związku i udział w odpowiedzi systemicznej. Z jednej strony stres oksydacyjny przyczynia się do podjęcia przez roślinę procesów naprawczych i obronnych, z drugiej może prowadzić do powstania licznych uszkodzeń, zwłaszcza po dłuższym działaniu. 163

10 Podziękowania Praca powstała w czasie realizacji projektu badawczego młodych pracowników naukowych Wydziału Biologiczno-Chemicznego Uniwersytetu w Białymstoku, sfinansowanych z dotacji celowej na prowadzenie badań naukowych lub prac rozwojowych oraz zadań z nimi związanych, służących rozwojowi młodych naukowców oraz uczestników studiów doktoranckich w roku 2014 (BMN-154). Literatura Bartosz G Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa. Bowles D Signals in the wounded plant. Nature, 343: Bruce T. J. A., Pickett J. A Plant defence signalling induced by biotic attacks. Curr. Opin. Plant Biol., 10: Chen S., Yin C., Strasser R. J., Govindjee, Yang C., Qiang S Reactive oxygen species from chloroplasts contribute to 3-acetyl-5-isopropyltetramic acid-induced leaf necrosis of Arabidopsis thaliana. Plant Phys. Biochem., 52: Dietz K-J., Vogel M. O., Viehhauser A AP2/EREBP transcription factors are part of gene regulatory networks and integrate metabolic, hormonal and environmental signals in stress acclimation and retrograde signalling. Protoplasma, 245:3-14. Jacobo-Velazquez D. A., Martínez-Hernandez G. B., Rodríguez S., Cao C-M., Cisneros- Zevallos L Plants as biofactories: physiological role of reactive oxygen species on the accumulation of phenolic antioxidants in carrot tissue under wounding and hyperoxia stress. J. Agric. Food Chem., 59: Kim Y-H., Khan A. L., Waqas M., Jeong H-J., Kim D-H., Shin J. S., Kim J-G., Yeon M-H., Lee I-J Regulation of jasmonic acid biosynthesis by silicon application during physical injury to Oryza sativa L. J. Plant Res., 127: Koo A. J. K., Howe G. A The wound hormone jasmonate. Phytochem., 70: Kubo A., Aono M., Nakajima N., Saji H., Tanaka K., Konodo N Differential responses in activity of antioxidant enzymes to different environmental stresses in Arabidopsis thaliana. J. Plant Res., 112: Kulbacka J., Saczko J., Chwiłkowska A Stres oksydacyjny w procesach uszkodzenia komórek. Pol. Merk. Lek. XXVII, 157: Leon J., Rojo E., Sanchez-Serrano J Wound signalling in plants. J. Exp. Bot., 52 (354): 1-9. Łukaszuk E., Ciereszko I Plant responses to wounding stress, [W:] Łaska B. (ed.), Biological diversity from cell to ecosystem. Polish Botanical Society, Białystok,

11 Mittler R Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci., 7(9): Mittler R Abiotic stress, the field environment and stress combination. Trends Plant Sci., 11(1): Orozco-Cardenas M., Ryan C. A Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway. Proc. Natl. Acad. Sci., 96: Pietras T., Małolepsza U., Witusik A Udział nadtlenku wodoru i reaktywnych postaci tlenu wytwarzanych przez oksydazę NADPH w odporności roślin przeciwko patogenom. Wiad. Bot., 41: Piotrowska A., Bajguz A Conjugates of abscisic acid, brassinosteroids, ethylene, gibberellins and jasmonates. Phytochemistry, 72: Potters G., Horemans N., Jansen M. A. K The cellular redox state in plant stress biology a charging concept. Plant Phys. Biochem., 48: Puzanowska-Tarasiewicz H., Starczewska B., Kuźmicka L Reaktywne formy tlenu. Bromat. Chem. Toksykol., XLI, 4: Ramel F., Sulmon C., Bogard M., Couee I., Gouesbet G Differential patterns of reactive oxygen species and antioxidative mechanisms during atrazine injury and sucroseinduced tolerance in Arabidopsis thaliana plantlets. BMC Plant Biology, 9:28 Rentel M. C., Lecourieux D., Ouaked F., Usher S. L., Petersen L., Okamoto H., Knight H., Peck S. C., Grierson C. S., Hirt H., Knight M. R OXI1 kinase is necessary for oxidative burst-mediated signalling in Arabidopsis. Nature, 427: Stoilkova G., Paunova S., Popova L A survey of wound-induced changes in Cucurbita pepo leaves. Biotechonol Biotechnologic Equip., 23: Thordal-Christensen H., Zhang Z., Wei Y., Collinge D. B Subcellular localization of H 2 O 2 in plants, H 2 O 2 accumulation in papillae and hypersensitive response during barley-powdery mildew interaction. Plant J., 11: Tripathi B. N., Gaur J. P Relationship between cooper- and zinc-induced oxidative stress and proline accumulation in Scenedesmus sp. Planta, 219: Velikova V., Yordanov I., Edreva A Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants. Protective role of exogenous polyamines. Plant Sci., 151: Wellburn A. R The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. J. Plant Physiol. 144: