Jądro komórkowe. Chromatyna. Replikacja DNA. Cykl komórkowy i jego regulacja. Mitoza. Apoptoza i nekroza.

Transkrypt

1 Jądro komórkowe. Chromatyna. Replikacja DNA. Cykl komórkowy i jego regulacja. Mitoza. Apoptoza i nekroza.

2 Otoczka jądrowa jest stabilizowana przez 2 sieci filamentów pośrednich: blaszka włóknista=jądrowa (lamina fibrosa) to zorganizowana sieć filamentów pośrednich lamin znajdująca się pod otoczką jądrową słabiej zorganizowana sieć filamentów otacza jądro od zewnątrz W suchej masie jądra 1/3 = DNA, 1/3 = RNA, 1/3 = białka

3 włókienko podjednostka pierścieniowa podjednostka perynuklearna cytozol błona zewnętrzna otoczki jądrowej otoczka jądrowa podjednostka szczebelka podjednostka pierścienia wewnętrznego blaszka jądrowa koszyk jądrowy błona wewnętrzna otoczki jądrowej jądro Kompleks porowy tworzy bramkę, przez którą cząsteczki wchodzą lub wychodzą z jądra. Każdy kompleks składa się z dużej liczby różnych podjednostek białkowych. źródło: B. Alberts i in. Podstawy biologii komórki. 2007

4 kształt jądra jest okrągły lub owalny wiele komórek dojrzałych lub niesprawnych czynnościowo ma jądra o kształcie odbiegającym od regularnego pewna liczba komórek w tkankach ulega zwyrodnieniu degradacji i obumiera kształt i wygląd jąder takich komórek przybierać może postać: piknozy małe, zbite, silnie wybarwione jądra, okrągłe lub owalne kariolizy jądro ulega trawieniu i przybiera postać cienia jądra karioreksis pofragmentowanie jądra

5 Jakie związki są transportowane do i z jądra? Z jądra (EKSPORT) mrna, trna i podjednostki rybosomów rrna przyłączony do białek (prawie kompletne podjednostki rybosomów) białka krążące między jądrem a cytoplazmą Niezbędne czynniki: eksportyna 1; - białko RanGTP; oraz NES: jądrowy sygnał eksportowy (nuclear export signal) Do jądra (IMPORT) białka (strukturalne, enzymatyczne, regulatorowe) nukleotydy i inne małe cząsteczki Niezbędne czynniki: importyna a i b; NLS: jądrowy sygnał lokalizacyjny (nuclear localization sequence) w obrębie transportowanego białka

6 Rola jąderka w powstawaniu rybosomów Transkrypcja genów rrna Łączenie rrna z białkami Składanie małych i dużych podjednostek rybosomów i ich eksport poza jąderko (następnie zachodzi transport podjednostek przez pory jądrowe i składanie rybosomów w cytoplazmie)

7 Jąderko nieobłoniona struktura jądra, miejsce syntezy prekursorów rybosomów Składniki jąderka: Włóknisty rdzeń Ziarnista kora prekursory podjednostek rybosomów wakuole jąderkowe chromatyna związana z jąderkiem rdna (powtarzające się sekwencje kodujące pre-rrna - 45S), leży w okolicy wtórnych przewężeń chromosomów 13,14,15, 21,22 są to tzw. chromosomy jąderkotwórcze, ten rejon to tzw. organizator jąderka Białka: nukleolina jest fosforylowana przez kinazę fazy M, fibrylaryna SKŁADNIKI JĄDERKA Junqueira Basic Histol 10th ed

8 Chromatyna to barwiąca się zasadochłonnie substancja wewnątrzjądrowa Zbudowana z DNA/RNA oraz związanych z nimi białek: dla DNA są to histony i białka niehistonowe dla RNA są to białka podjednostek rybosomów ORAZ białka chroniące mrna przed degradacją W suchej masie jądra 1/3 = DNA, 1/3 = RNA, 1/3 = białka Skomplikowana budowa umożliwia silne upakowanie DNA E

9 Heterochromatyna nie ulega dekondensacji (z wyjątkiem okresu replikacji DNA). Genetyczna determinacja heterochromatyny polega na występowaniu w niej satelitarnego DNA, który nigdy nie ulega transkrypcji. Jest nieaktywna. Euchromatyna ulega całkowicie dekondensacji, jest aktywna transkrypcyjnie. Heterochromatyna fakultatywna fragmenty chromatyny mogą występować zarówno w postaci heterochromatynowej jak i euchromatynowej. Heterochromatyna konstytutywna część heterochromatyny pozostaje heterochromatyczna we wszystkich tkankach i stadiach rozwoju komórki.

10 nić DNA Organizacja DNA w chromatynie (2 nm) nukleosom = DNA+histony (11 nm) wyizolowana nić Podstawowe włókno chromatyny = solenoid (30 nm) Pętle (forma rozproszona chromosomu) Domeny (forma rozproszona chromosomu) chromosom metafazalny razy krótszy niż rozciągnięta cząsteczka B. Alberts i in. Podstawy biologii komórki. 2007

11 NUKLEOSOMY - podstawowe jednostki składowe chromatyny- podstawowy poziom upakowania DNA w chromatynie HISTON H1 wiąże się z DNA łącznikowym łączącym kolejne oktamery OKTAMER HISTONÓW RDZENIOWYCH (H2A, H2B, H3, H4) 2 5,5nm DNA CZĄSTKI RDZENIOWEJ DNA ŁĄCZNIKOWY 11nm HISTONY - małe białka zasadowe (dodatnio naładowane), silnie zakonserwowane w ewolucji, zbudowane z domeny globularnej i N-końcowego elastycznego, naładowanego dodatnio ogonka źródło: J. Kawiak i in. Podstawy cytofizjaologii. 1997

12 Włókno 30 nm (solenoid) Podstawowe włókno chromatyny, widoczne w nienaruszonym jądrze komórkowym w ME. Junqueira, Basic Histology, 10th ed

13 Pętle DNA obejmują kz Rola białek niehistonowych DNA związane jest z białkami w specyficznych miejscach: regionach przyczepu rusztowania (scaffold attachment regions, SARs) Fluorescent-labeled probes hybridized to interphase chromosomes demonstrate chromatin loops and permit their measurement. Molec Cell Biol ed.7, Lodish et al.

14 Organizacja DNA w chromatynie krótki region dwuniciowej helisy DNA chromatyna w formie sznura koralików nukleosom=dna+histony nukleosomy upakowane we włókna chromatyny Podstawowe włókno chromatyny=solenoid fragment chromosomu w formie rozproszonej fragment chromosomu w formie skondensowanej chromosom mitotyczny razy krótszy niż rozciągnięta cząsteczka centromer B. Alberts i in. Podstawy biologii komórki. 2007

15 Pojedyncza liniowa cząsteczka DNA związana z białkami, a często także z mrna. Chromosom Chromosomy stają się widoczne jedynie podczas mitozy lub mejozy, gdy ich chromatyna ulega kondensacji. Molecular Biology of the Cell, 4th ed.

16 Nukleotyd = deoksyryboza + zasada azotowa + 5' fosforan 4 rodzaje zasad w DNA: adenina (A) guanina (G) cytozyna (C) tymina (T) fosforan elementy konstrukcyjne DNA cukier fosforan cukru 3 zasada dwuniciowy DNA 5 nukleotyd nić DNA 5 3 dwuniciowa helisa DNA 3 5 Polarność nici: końce 5'-PO 4 i 3'-OH Kolejność nukleotydów determinuje sekwencję aminokwasów w polipeptydzie rdzeń cukrowofosforanowy Każdy fosforan niesie ładunek ujemny dlatego cały DNA jest silnie naładowaną cząsteczką o charakterze polarnym 5 3 pary zasad połączone wiązaniami wodorowymi 5 grupa 5 -fosforanowa 3 grupa 3 -hydroksylowa źródło: B. Alberts i in. Podstawy biologii komórki. 2007

17 REPLIKACJA To proces, w którym podwójna nić DNA ulega skopiowaniu. Proces ten zachodzi podczas interfazy (w fazie S). Replikacja jest semikonserwatywna (półzachowawcza) - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna nowa. Replikacja jest dwukierunkowa tzn. przebiega jednocześnie na dwóch niciach. Nowe łańcuchy syntetyzowane są zawsze w kierunku od 5 do 3. Wydłużanie nici wiodącej odbywa się w sposób ciągły, zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych.

18 REPLIKACJA- ENZYMY I ICH FUNKCJE topoizomeraza rozplata strukturę podwójnej helisy DNA; helikaza - rozrywa wiązania wodorowe między nićmi matrycowego DNA; prymaza syntetyzuje startery RNA; polimeraza DNA jest odpowiedzialna za poprawną syntezę nowych nici; białka wiążące jednoniciowy DNA przeciwdziałają ponownemu połączeniu się rozplecionych łańcuchów; nukleaza DNA usuwa startery; ligaza DNA- łączy fragmenty Okazaki, katalizuje tworzenie się wiązania fosfodiestrowego między grupą 3 -OH, a grupą 5 - fosforanową. Proces ten wymaga nakładu energii, zgromadzonej głównie w ATP; naprawcza polimeraza dobudowuje DNA w miejscu usuniętych starterów.

19 REPLIKACJA - ETAPY REPLIKACJA 1.Inicjacja (rozpoczęcie), 2.Elongacja (wydłużanie łańcucha DNA), 3.Terminacja (zakończenie)

20 Gen - definicja podstawowa: sekwencja DNA kodująca białko lub RNA Niektóre wirusy mają genomy w postaci RNA, a nie DNA. Produkty niektórych genów nie są białkami, lecz RNA (trna, rrna). Pewne sekwencje DNA nie kodujące produktów genów (regiony niekodujące) są niezbędne do wytworzenia produktu genu (RNA lub białka). Definicja molekularna: Pełna sekwencja kwasu nukleinowego niezbędna do syntezy funkcjonalnego polipeptydu lub funkcjonalnego RNA E

21 Mitoza. Proliferacja = podziały komórek. Cykl komórkowy to szereg procesów zachodzących pomiędzy powstaniem komórki, a jej podziałem; Interfaza - niewidoczne chromosomy: faza G1, S i G2; ok. 18 h Mitoza - chromosomy skondensowane, ok. 1h Profaza 40 minut, metafaza 4-6 minut, anafaza 2 min, telofaza 10 minut Mitoza: kariokineza + cytokineza. Podczas mitozy transkrypcja i translacja prawie całkowicie zanikają

22 2 różne mechanizmy separacji w trakcie mitozy: chromosomów i cytoplazmy

23 PROFAZA - wejście w mitozę wywołane jest aktywnością kinazy fazy M Kondensacja chromatyny w chromosomy od solenoidu - 30 nm, do chromatydy w metafazie - grubość 0.7 µm, zachodzi m.in. dzięki fosforylacji histonu H1 i defosforylacji histonu H3. Rozpad otoczki jądrowej i jąderka zachodzi wskutek fosforylacji lamin blaszki jądrowej oraz nukleoliny przez kinazę fazy M. Reorganizacja ER i AG. Rozluźnienie kontaktów komórki z otoczeniem.

24 Rola ufosforylowania lamin w przebiegu mitozy Kinaza fazy M Fuzja fragmentów otoczki jądrowej Fosforylacja lamin Defosforylacja lamin Mol Biol of the Cell, 4 ed E

25 Inne kluczowe procesy w profazie przebudowa cytoszkieletu, w tym powstanie wrzeciona podziałowego i zmiany układu sieci filamentów aktynowych powstanie kinetochoru z kompleksów białkowych połączenie końców plus MT z kinetochorami: brak połączenia MT wrzeciona nawet z 1 chromosomem blokuje podział komórki w metafazie. prostopadłe ułożenie chromosomów do długiej osi wrzeciona

26 Wrzeciono podziałowe zbudowane jest z MT Końce MT wrzeciona skierowane do centrosomów są minus a do środka plus, ale depolimeryzacja MT podczas anafazy zachodzi na obydwu z nich. kinetochorowe - łączą kinetochor z centrosomem ramienne - łączą ramiona chromosomów biegunowe - nie przyłączają się do chromosomów lecz w środku wrzeciona łączą się z MT drugiego bieguna astralne - odchodzą promieniście od centrosomu do błony komórkowej, pomagają w ustawieniu aparatu mitotycznego oraz kurczliwego pierścienia podczas cytokinezy

27 Struktura chromosomu mitotycznego wyznaczona jest m.in. przez interakcje białek SMC (structural maintainance of chromosomes) i białek non-smc. SMC mają domeny wiążące się z DNA i ATP (ATPazy). Należą do nich KONDENSYNY I KOHEZYNY. Kondensyny występują na całej długości chromosomu, a kohezyny tylko w określonych miejscach w tym w centromerze i telomerach

28 METAFAZA - połączenie końców plus MT z kinetochorami - prostopadłe ułożenie chromosomów do długiej osi wrzeciona kariokinetycznego - chromosomy leżą na równiku komórki, przemieszczanie cytoplazmy na bieguny komórki - brak połączenia MT wrzeciona nawet z jednym chromosomem blokuje podział komórki w metafazie

29 Zreplikowany chromosom to 2 siostrzane chromatydy połączone w centromerze. Chromatydy przylegają do siebie do czasu anafazy dzięki kohezynom. Do centromerowego DNA przylegają specjalne białka, do których przyłączone są inne białka stanowiące MTOC na chromosomie. Tworzą one płytkę - KINETOCHOR. Centromer określany jest też jako pierwotne (główne) przewężenie chromosomu Centromer to rejon heterochromatyny zawierający dużą liczbę powtarzających się sekwencji DNA. KINETOCHOR to wyspecjalizowany kompleks białek formowany w centromerach (po 1 na każdą chromatydę). Umożliwia mechaniczne oddziaływanie mikrotubul wrzeciona z chromosomem.

30 Przyłączanie się MT do kinetochoru Strzałka czerwona kierunek wzrostu MT kierunek ruchu chromosomu: profaza-metafaza

31 Proteaza separaza rozkładająca kohezyny jest hamowana przez białko sekurynę. Aktywność APC (kompleks anafazowy aktywowany przez MPF) prowadzi do degradacji sekuryny. Aktywuje to separazę, która degraduje kohezyny. W efekcie chromatydy mogą już ulec rozdzieleniu. metafaza anafaza kohezyny centrosom

32 Anafaza Podział centromerów z udziałem cyklosomu czyli kompleksu anafazowego. Jednoczesne oddalanie się chromosomów, 2.5 μm/min wskutek ślizgania się MT względem siebie i depolimeryzacji MT kinetochorowych na końcach minus

33 METAFAZA chromosomy leżą na równiku komórki Przesuwanie się chromosomów wzdłuż mikrotubul prowadzi do ich ułożenia się w równiku komórki pomiędzy biegunami wrzeciona. ANAFAZA Kinetochorowe miejsce przyczepu w parzystych chromosomach rozdziela się i chromosomy przesuwają się do przeciwległych biegunów wrzeciona. W późnej anafazie mikrotubule wrzeciona wydłużają się, powodując wydłużenie komórki i dalsze rozdzielanie biegunów wrzeciona.

34 W anafazie w kinetochorze może dochodzić jednocześnie do degradacji końców MT kinetochorowych i do aktywacji dyneiny i kinezyny, co pociąga chromosomy do centrosomu bieguna komórki.

35 O ruchach chromosomów podczas mitozy decydują białka motoryczne, kinezyny i dyneiny, które oddziałują z MT (A) lub sama depolimeryzacja MT wymusza ruch chromosomu (B) Katastrofiny degradują MT

36 TELOFAZA dekondensacja chromosomów odtworzenie otoczki jądrowej zachodzi dzięki defosforylacji lamin odtworzenie jąderka dzięki syntezie rrna przez chromosomy jąderkotwórcze zanik wrzeciona: tubulina służy do polimeryzacji MT cytoszkieletu

37 Cytokineza - podział cytoplazmy w telofazie powstaje pierścień kurczliwy, aktynowomiozynowy, który łączy się z białkami błony komórkowej skurcz pierścienia rozpoczynają GTPazy i fosfataza lekkich łańcuchów miozyny zwężenie cytoplazmy - ciałko środkowe - zmiana struktury lipidowej błony doprowadza do zatrzymania skurczu pierścienia zanikanie mostka cytoplazmatycznego rozdziela komórki niezbędne jest dobudowywanie błony komórkowej z udziałem pęcherzyków pochodzących z AG

38 PODZIAŁ ORGANELLI KOMÓRKOWYCH Mitochondria ulegają podziałowi i dziedziczone są niezależnie podczas separacji cytoplazmy ER - reorganizacja mikrotubul w trakcie mitozy uwalnia ER z połączenia z błoną jądrową prowadząc do fragmentacji ER Aparat Golgiego - prawdopodobnie także ulega fragmentacji, choć w niektórych komórkach łączy się przejściowo z ER i odtwarza się dopiero w telofazie

39 4 FAZY CYKLU KOMÓRKOWEGO REPLIKACJA + PODZIAŁ = CYKL KOMÓRKOWY FAZA M FAZA G 2 punkt kontrolny G 2 czy komórka przejdzie do mitozy? G 2 mitoza (podział jądra) cytokineza (podział cytoplazmy) M FAZA S (replikacja jądrowego DNA) wstęp podziału komórkowego S INTERFAZA G 1 punkt kontrolny G 1 czy komórka przejdzie do fazy S? FAZA G 1 Cykl komórkowy jest ściśle regulowanym mechanizmem powielenia materiału genetycznego i uzyskania komórek potomnych. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

40 FAZA G 1 FAZA S FAZA G 2 FAZA M komórka przygotowuje się do replikacji DNA komórka jest diploidalna 2n = 46 chromosomów jeśli komórka się nie dzieli, to może wyjść z cyklu i wejść w fazę G 0 najdłuższa faza (nawet około 25 godzin) replikacja DNA (synthesis phase) powstają 2 chromatydy siostrzane, połączone ze sobą centromerami zwykle 6-8 godzin komórka przygotowuje się do segregacji chromosomów i podziału (do mitozy) m.in. rozpoczyna się kondensacja chromosomów i syntetyzowane są tubuliny wrzeciona kariokinetycznego w komórce znajdują się po 4 kopie każdego chromosomu 4n = 46 chromosomów ale 92 chromatydy) mitoza segregacja chromosomów i podział jądra (kariokineza) podział komórki (cytokineza) powstanie 2 komórek potomnych najkrótsza faza (trwa około 1 godziny w komórkach ssaków)

41 PUNKT KRYTYCZNY R I PUNKTY KONTROLNE W FAZIE G 2 I M punkt kontrolny G 2 G 2 punkt kontrolny M M mitoza punkt kontrolny G 2 odpowiednia wielkość komórki replikacja zaszła poprawnie działanie czynnika MPF (cyklinab +Cdk1) prowadzi do aktywacji mechanizmów mitozy punkt kontrolny M G 1 prawidłowe ustawienie wrzeciona mitotycznego prowadzi do zakończenia kariokinezy i przejścia do cytokinezy synteza DNA S punkt krytyczny R odpowiednia wielkość komórki odpowiednie środowisko zewnętrzne odpowiednie czynniki wzrostowe - aktywacja mechanizmów replikacyjnych Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

42 CZYNNIKI KONTROLUJĄCE CYKL KOMÓRKOWY Cykliny, kinazy zależne od cyklin (CDK) Czynniki wzrostowe Inhibitory wzrostu Produkty niektórych genów głównie genów hamujących nowotworzenie (tumor supressor genes) np. p53 Protoonkogeny (c-onc) - geny obecne w prawidłowej komórce, zdolne do wyzwolenia procesu transformacji nowotworowej. Uwarunkowana mutacją zmiana ich ekspresji sprawia, że przekształca się w onkogeny (v-onc geny bezpośrednio aktywujące transformację nowotworową komórki). Kodują cykliny i kinazy cyklinozależne, kinazy i czynniki kontrolujące proces apoptozy.

43 UKŁAD KONTROLI CYKLU KOMÓRKOWEGO Cykliczne aktywowanie i hamowanie kluczowych białek i kompleksów białkowych rozpoczynających albo regulujących replikację DNA, mitozę i cytokinezę. Fosforylacja (kinazy białkowe) i defosforylacja (fosfatazy białkowe) - sposób zmiany aktywności białek w układzie kontroli cyklu komórkowego. Kinazy białkowe enzymy katalizujące przeniesienie grupy fosforanowej z ATP na odpowiednia resztę aminokwasową białka docelowego. Za włączenie i wyłączenie kinaz odpowiada drugi zestaw białek układu kontroli CYKLINY Kinazy układu kontroli cyklu komórkowego to kinzy białkowe zależne od cyklin lub Cdk (cyklin dependent protein kinases).

44 Przebieg cyklu komórkowego warunkują kinazy białkowe zależne od cyklin (Cdk). Kinaza zależna od cykliny (Cdk) jest enzymem katalizującym fosforylację białek, natomiast cyklina jest białkiem regulatorowym koniecznym do aktywności tego enzymu. Aktywny kompleks fosforyluje kluczowe białka w komórce potrzebne do włączenia określonych etapów cyklu komórkowego. Cyklina pomaga także skierować Cdk do białek docelowych. cyklina Cykliny: brak aktywności enzymatycznej podjednostka regulatorowa stężenie zmienia się w cyklu Cdk (kinazy zależne od cyklin): aktywowane przez cykliny podjednostka katalityczna - aktywność kinazy ich stężenie nie zmienia się w cyklu, ale aktywność tak kinaza zależna od cykliny (Cdk) Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

45 Wzrost i spadek aktywności M Cdk (cykliny fazy M) podczas cyklu komórkowego Stężenie cykliny fazy M stale rośnie podczas interfazy, osiągając maksymalny poziom w mitozie i szybko spada pod koniec mitozy. Podczas gdy aktywność M-Cdk rośnie i opada podczas każdej mitozy, stężenie Cdk nie zmienia się podczas cyklu. mitoza interfaza mitoza interfaza stężenie cykliny fazy M aktywność M-Cdk (MPF) Nagły spadek stężenia cykliny fazy M w mitozie jest spowodowany zniszczeniem cykliny w układzie proteolitycznym zależnym od ubikwityny. Ubikwitynacja znakuje cząsteczki cyklin przeznaczone do rozpadu w proteosomach. Rozpad cyklin inaktywuje Cdk. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

46 MPF = Mitosis Promoting Factor = M-Cdk główny regulator wejścia komórek do fazy M składa się z dwóch polipeptydów: - podjednostki katalitycznej (mitotyczna Cdk); konieczna do aktywności MPF - podjednostki regulatorowej (cyklina fazy M); jest konieczna do kinazowej aktywności MPF aktywność MPF oscyluje w każdym cyklu komórkowym: zwiększa się gwałtownie tuż przed rozpoczęciem mitozy i zmniejsza szybko do zera pod koniec mitozy

47 Zaktywowany M-Cdk wymaga fosforylacji i defosforylacji pewnych miejsc fosforan hamujący nieaktywna fosfataza aktywująca aktywna fosfataza aktywująca DODATNIE SPRZĘŻENIE ZWROTNE Gdy M-Cdk zostanie zaktywowany, fosforyluje i tym samym aktywuje dalsze cząsteczki fosfatazy, które aktywują więcej cząsteczek M-Cdk. Zaktywowany M-Cdk również hamuje kinazę hamującą i tym samym zwiększa aktywację M-Cdk. Zaktywowany M-Cdk pośrednio aktywuje więcej M-Cdk tak, że aktywacja M-Cdk zachodzi wybuchowo. nieaktywny M-Cdk fosforan aktywujący aktywny M-Cdk DODATNIE SPRZĘŻENIE ZWROTNE powoduje nagły wzrost aktywności M-Cdk wprowadzając szybko komórkę w fazę M Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

48 włączenie mitozy Połączenie różnych Cdk z cyklinami uruchamia różne zdarzenia w komórce cyklina mitotyczna M-Cdk Kompleks fazy M (MPF): (maturation promoting factor) aktywuje proces mitozy Cdk mitotyczna nieaktywna Cdk nieaktywna Cdk S-Cdk S-Cdk cyklina fazy S Kompleks fazy S: inicjuje replikację DNA i pomaga zablokować ponowną replikację włączenie replikacji DNA Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

49 DNA aktywacja kinaz białkowych, które fosforylują p53 DEGRADACJA p53 W PROTEOSOMACH Uszkodzenie DNA zatrzymuje cykl w G 1 stabilne i aktywne p53 aktywne p53 łączy się z regulatorowym regionem genu p21 transkrypcja translacja gen p21 Gdy DNA zostanie uszkodzony białko p53 jest stabilizowane i aktywowane. Dlaczego? bo p53 jest fosforylowane przez swoiste kinazy białkowe aktywowane w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Aktywowane białko p53 gromadzi się i stymuluje transkrypcję genu kodującego inhibitor Cdk, białko p21. Białko p21 łączy się z G 1 /S-Cdk oraz S-Cdk inaktywując je, co zatrzymuje cykl w G 1. p21 mrna p21 (białko hamujące Cdk) Molecular Biology of the Cell, 4th Edition G 1 /S-Cdk i S-Cdk AKTYWNY NIEAKTYWNY G 1 /S-Cdk i S-Cdk w kompleksie z p21

50 NAJWAŻNIEJSZE GENY SUPRESOROWE ZWIĄZANE Z KONTROLĄ CYKLU KOMÓRKOWEGO Białko p53 to czynnik transkrypcyjny o własnościach supresora nowotworowego Mutacje w genie kodującym białko p53 są obserwowane w dużym odsetku nowotworów i korelują z ciężkimi rokowaniami. Efekt przeciwnowotworowy białka p53 jest związany z jego proapoptotyczną aktywnością. Dziedziczne mutacje w genie p53 są przyczyną zespołu chorobowego Li- Fraumeni (rzadki, uwarunkowany genetycznie zespół, związany z mutacją w genie TP53, którego brak lub uszkodzenie powoduje zwiększoną podatność (zachorowanie przed 45. rokiem życia) na choroby nowotworowe.

51 NAJWAŻNIEJSZE GENY SUPRESOROWE ZWIĄZANE Z KONTROLĄ CYKLU KOMÓRKOWEGO RB (prb, Rb) białko kodowane przez gen supresorowy RB1. Gen RB1 jest zmutowany w wielu typach nowotworów człowieka. Nazwa białka RB pochodzi od siatkówczaka (retinoblastoma), nowotworu spowodowanego mutacjami w obydwu allelach kodującego białko genu RB1. Białko RB w komórkach jest obecne zazwyczaj jako fosfoproteina, i jest substratem reakcji fosforylacji przeprowadzanej przez liczne białka enzymatyczne z rodziny kinaz. Funkcją białka RB jest zapobieganie podziałowi komórki przez zatrzymanie cyklu komórkowego.

52 Układ kontroli cyklu może zatrzymać cykl w różnych punktach kontrolnych G 1 S G 2 M T niesprzyjające otoczenie komórki T uszkodzony DNA (p53) T nie ukończona replikacja DNA T uszkodzony DNA bądź nie ukończona replikacja DNA T chromosomy nieprawidłowo przyłączone do wrzeciona mitotyczngo T - punkty w cyklu, gdzie układ kontrolny stosować hamulec zatrzymujący cykl w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, nieukończone procesy wewnątrzkomórkowe albo niesprzyjające otoczenie komórki. Punkt kontrolny w fazie M sprawdza, czy wszystkie chromosomy są doczepione do wrzeciona podziałowego, zanim rozpocznie się anafaza, podczas której chromosomy potomne rozdzielają się i przesuną do przeciwległych biegunów wrzeciona. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

53 APOPTOZA MARTWICA Rodzaj śmierci zaprogramowana spontaniczna Kształt komórki obkurczenie obrzmienie, pęcznienie i liza Kształt organelli bez zmian pęcznienie Błona komórkowa Rodzaj odpowiedzi immunologicznej tworzenie ciałek apoptotycznych fagocytoza bez stanu zapalnego i nacieku komórek dezintegracja wyraźny stan zapalny z napływem makrofagów Zmiany w jądrze Fragmentacja DNA chromatyna skondensowana w pobliżu błony jądrowej zorganizowana, DNA pocięte na fragmenty o długości pz karioliza, pylenoliza lub karioneksja gwałtowna, przypadkowa Rozbicie DNA przez endonukleazy enzymy lizosomalne Synteza białek wymagana zahamowana Biochemia procesu proces enzymatyczny aktywacja kaspaz, nukleaz zakłócona równowaga jonowa (napływ jonów Ca 2+ ) Zapotrzebowanie na energię wymagane niewymagane Elektroforeza w żelu agarozowym tworzenie drabinki DNA tworzenie smugi DNA 53

54 NEKROZA zmiany w morfologii mitochondriów rozpad błony cytoplazmatycznej APOPTOZA funkcjonalne mitochondria brak zmian w strukturze chromatyny funkcjonalna błona cytoplazmatyczna fragmenty DNA zmiany w strukturze jądra ciałka apoptotyczne 54

55 Zewnętrzpochodna i wewnętrzpochodna droga inicjacji apoptozy Mayer and Oberbauer, 2003

56 Regulują przeżywanie komórek i ich śmierć przez apoptozę. Dokonuje się to przez uwalnianie z mitochondriów cytochromu c. Naturalna rola cytochromu c polega na udziale w przenoszeniu elektronów pomiędzy białkami wewnętrznej błony mitochondrialnej. Cytochrom c uwolniony z mitochondriów do cytozolu aktywuje kaspazy (proteinazy rozkładające białka komórki). Prowadzi to, do fragmentacji i śmierci komórki przez apoptozę. mitochondrium cytochrom c w przestrzeni międzybłonowej kanał tworzony przez BAX lub BAK białko adaptorowe uwolnienie cytochromu c i związanie z adaptorem agregacja adaptorów i wiązanie prokaspaz nieaktywne prokaspazy aktywacja prokaspaz aktywowane kaspazy kaskada kaspaz APOPTOZA Apoptoza jest regulowana wewnątrzkomórkowymi białkami rodziny BCL-2, które są białkami kanałowymi dla cząsteczek cytochromu c w zewnętrznej błonie mitochondrialnej. Białka BCL-2 i BCL-X hamują, a białka BAX i BAK powodują uwalnianie cytochromu c z mitochondriów 56 źródło: B. Alberts i in. Podstawy biologii komórki. 2007

57 Zewnętrzna droga inicjacji apoptozy receptor Fas Fas ligand (FasL lub CD178) na powierzchni limfocytów Tc aktywuje Fas death receptor (CD95, z grupy receptorów TNF) na powierzchni docelowej komórki Zarówno ligand jak i receptor są homotrimerami, zawierającymi domeny death (DD) Cytozolowe części białek tworzących receptor Fas łączą się z białkami adaptorowymi FADD (Fas associated death domain) poprzez domeny death należące do Fas i FADD Białka FADD posiadają także domeny efektorowe death (DED) Po związaniu się z receptorem, białka FADD poprzez domeny efektorowe death wiążą się z analogicznymi domenami efektorowymi death aktywatora prokaspazy 8 (ew. 10) tworząc kompleks DISC (death inducing signaling complex) Po związaniu przez FADD prokaspazy 8 następuje jej autoaktywacja, wytworzenie kaspazy 8, która zapoczątkowuje kaskadę kaspaz, prowadzącą do apoptozy Ten rodzaj inicjacji apoptozy odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu układu immunologicznego Cell and Molecular Biology ( Lippincott Wiliams & Wilkins 2010)

58 aktywacja prokaspazy miejsca cięcia NH 2 aktywna kaspaza X duża jednostka mała aktywacja cięciem podjednostka Kaskada proteaz wewnątrzkomórkowych bierze udział w apoptozie COOH nieaktywna prokaspaza Y nieaktywny fragment białkowy aktywna kaspaza kaskada kaspaz jedna cząsteczka aktywnej kaspazy X proteoliza białka cytozolowego wiele cząsteczek aktywnej kaspazy Y proteoliza białek blaszki jądrowej wiele cząsteczek aktywnej kaspazy Z 58 Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

59 Apoptoza programowana śmierć komórki jest prowadzona przez rodzinę proteaz (enzymów rozcinających inne białka) - KASPAZ KASPAZY są syntezowane jako nieaktywne prekursory PROKASPAZY, które same są aktywowane proteolitycznie w odpowiedzi na sygnały indukujące apoptozę. Prawidłowa regulacja procesu apoptozy prowadzi do homeostazy komórkowej w skali całego organizmu. Zaburzenie takiej regulacji prowadzi do chorób wynikających ze: zbyt dużej liczby komórek (apoptoza za rzadko) nowotwory, zakażenia wirusowe zbyt małej liczby komórek (apoptoza za często) - zakażenia wirusowe prowadzące do niszczenia limfocytów T, zwyrodnienia układu nerwowego, choroby wątroby 59 Molecular Biology of the Cell, 4th Edition