Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej, problemy i zagadnienia

Transkrypt

1 Tom XXVIII ROŚLINY OLEISTE OILSEED CROPS 2007 Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Studium Doktoranckie Wydziału Biologii Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej, problemy i zagadnienia Yellow rapeseed current research over the world, main issues and problems Słowa kluczowe: rzepak (Brassica napus L.), żółtonasienność, okrywa nasienna, fenylopropanoidy, resynteza, allosyndeza, mieszańce, selekcja, jakość canola, markery molekularne, sprzężenie genetyczne, QTL loci cech ilościowych Wzrastające zapotrzebowanie gospodarki światowej na rzepak oraz korzystne cechy jego form żółtonasiennych zwiększona zawartość tłuszczu i białek, zmniejszona zawartość włókna w nasionach uzasadnia prowadzone na coraz większą skalę badania, których zadaniem jest wyprowadzenie nowych wciąż ulepszanych odmian żółtonasiennego rzepaku oraz poznanie podłoża fizjologicznego i genetycznego tej cechy. Wiadomo już, że żółtonasienność jest wynikiem zaburzeń w metabolizmie fenylopropanoidów, co skutkuje spadkiem udziału w masie nasion barwników, skoncentrowanych głównie w okrywie nasiennej oraz elementów budowy ścian komórkowych stanowiących o grubości okrywy nasiennej. Gospodarka związków fenolowych inna u form żółtonasiennych ma znaczący wpływ, zarówno dodatni jak i ujemny, na cały metabolizm roślinny. Dodatkowo przyczynia się do obniżenia wartości agrotechnicznych nasion, jednakże w stopniu bardzo zmiennym, co stwarza pole do dalszej hodowli selekcyjnej. Dużo informacji na temat podłoża genetycznego cechy dostarczyły badania porównawcze nad transparentnym fenotypem okrywy nasiennej rośliny modelowej Arabidopsis thaliana. Genom allotetraploidalnego rzepaku jest jednakże o wiele bardziej skomplikowany. Co więcej nie odnotowano występowania naturalnych źródeł żółtonasienności w obrębie gatunku. Niemniej jednak wysoka homologia, czy wręcz identyczność poszczególnych genomów, stwarza możliwość resyntezy rzepaku wydającego żółte nasiona z innych żółtonasiennych gatunków z rodzaju Brassica. Proste podejścia nie zawsze jednak gwarantują stabilność i wysoki stopień odziedziczalności cechy. Krytyczna wydaje się być obecność genów żółtonasienności na obu podwójnych genomach przynajmniej jednego recesywnego homozygotycznego genu ze szlaku syntezy pigmentu wyłączającego ten szlak na każdym genomie. Dlatego też pojawiła się idea dość skomplikowanych krzyżowań żółtonasiennych allotetraploidalnych gorczyc oraz diploidalnych form kapustnych. Ponieważ u większości gatunków, a nawet odmian, źródła żółtonasienności mogą być odmienne, istnieje zagrożenie ich niekompatybilności źródeł uzupełnianie się genomów pod względem genów szlaku syntezy fenoli. Radą na to zjawisko może być transfer genów żółtonasienności między wysoce homologicznymi genomami A i C, tak by posiadały one te same allele, poprzez stworzenie warunków do zajścia procesu allosyndezy.

2 126 Innymi, rzadziej stosowanymi podejściami są mutageneza radiacyjna i wykorzystanie mutantów w dalszej hodowli oraz wykorzystanie w przypadku ich wcześniejszego zidentyfikowania pojedynczych naturalnych, często heterozygotycznych, mutantów rzepaku. Uzyskane linie są często poddawane dalszym krzyżowaniom z innymi żółtonasiennymi (gatunkami, liniami) celem ustabilizowania i poprawienia cechy oraz z czranonasiennym rzepakiem o wysokiej wartości cech użytkowych, by takowe przenieść do hodowanych linii. Oprócz przeważającej większości roślin, które tracą w ten sposób korzystne cechy, udaje się uzyskać i takie o pożądanym genotypie (fenotypie). Każdorazowo, czy to na poziomie genomowym, czy genowym, niezmiernie ważne jest zachowanie odpowiedniego balansu genetycznego. W przeciwnym wypadku dochodzi do rozmaitych zaburzeń i w konsekwencji obniżenia wydajności roślin. Przedstawione wyniki świadczą nie tylko o niejednorodności genetycznych źródeł żółtego koloru nasion, ale także o ilościowym i addytywnym charakterze tej cechy. Poszczególne żółtonasienne linie posiadają różnogenowy (jedno- dwu-, trój- lub więcej) jej determinację. Na ogół istnieje jeden, kilka loci silnie ją determinujących oraz geny o mniejszym znaczeniu. Najlepszym sposobem poznania tych genów i ich alleli wydaje się być znalezienie odpowiednich markerów genetycznych, sprzężonych z fenotypową cechą koloru nasion, dla możliwie jak największej ilości linii. W tym celu tworzy się mapy genetyczne na podstawie tzw. populacji mapujących roślin potomnych w stosunku do wysoce homozygotycznych linii różniących się kolorem nasion. Trwają również prace mające na celu zmapowanie genów odpowiedzialnych za negatywne cechy związane z żółtonasiennością. Znajomość takich różnorodnych markerów znacząco skróci procedurę hodowlaną ulepszonych linii rzepaku żółtonasiennego poprzez zastosowanie selekcji wspomaganej markerami genetycznymi (MAS marker assisted selection) pomoże stworzyć model przewidywania cech tworzonych mieszańców międzygatunkowych oraz pozwoli na wskazanie źródła żółtonasienności. Dlatego rozmaite zespoły badawcze za kolejny krok po uzyskaniu linii żółtych, uznają właśnie ich mapowanie. Od czasu pierwszego podejścia Somersa (1999) wykorzystując wszelkie dostępne techniki znaleziono już dość dużo odmiennych markerów molekularnych koloru nasion pomimo to trwają prace nad uzyskaniem następnych. Ze względu na to, że genomy Cruciferace i A. thaliana są dość podobne, bardzo przydatnych narzędzi ku temu dostarcza również genomika porównawcza. Key words: yellowseedness, rapeseed (Brassica napus L.), seed coat, fibre reduction, phenylpropanoids, resinthesis, allosyndesis, hybrids, breeding selection, canola quality, molecular markers, genetic coupling, quantitative traits loci QTL, The increasing demand of world industry for oilseed rape and profitable traits of its yellowseed forms encreased fat and protein content and reduced fibre in seeds gives grounds for the advancement of research aimed at obtaining new, continually improving lines of yellowseed rape and study physiological and genetic background of this trait. It is already known that yellowseedness results from disturbances in metabolism of phenylpropanoids which consequently leads to changes in seeds weight: decreased participation of pigments concentrated mainly in seed coat and the elements of construction of cell wall responsible for the thickness of the coat. The management of phenylpropanoids, different in yellowseeded plants, has important, both positive and negative impact on the whole plant s metabolism. In addition, it contributes to devaluation of agrotechnical value of seeds, however to a very variable degree, what makes further selectional breeding possible. Comparative investigations on the transparent testa phenotype of the model plant Arabidopsis thaliana provided a lot of information of the genetic background of the trait. The allotetraploidic genome of rapeseed is, however, more complicated. Moreover, the occurence of natural sources of yellowseeded rape has not been observed. But high homology or even identity of particular genomes allows for resynthesis of yellowseeded rape from the other yellowseeded Brassica species. Simple approaches do not always guarantee the stability and high inheritance of the trait. The presence of yellowseedness genes on both doubled genomes seems to be critical at least of one homozygotic recessive gene from the enzymatic pathway of pigment synthesis, which switches off the pathway

3 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej from each genomes. Hence the idea of complicated crosses of yellowseeded allotetraploidic mustards and diploidic cabbages has appeared. Because in majority of species, or even varietes, the sources of yellowseedness may differ, there is a danger of incompatibility of sources the supplementation of genomes in respect to lacking genes of phenol synthesis. This problem may be solved by transfer of yellowseedness genes between high homological A and C genomes, in order to posses the same allelles, through facilitation of adequate conditions for this process. Other, more rare approaches include radiation mutagenesis and further use of mutants in breeding, and if identified earlier the use of single, natural, often heterozygotic mutants of rapeseed. Obtained lines are often submited to further crossings with other yellowseeded lines or species in order to stabilize and improve the trait. They may be also crossed with blackseeded rape which has high usable value traits to transfer the good traits to yellowseeded lines. Besides the majority of plants which in this way lose the advantageous traits, sometimes it is possible to obtain plants with desirable genotype (phenotype). The most important is to keep balance on each gene or genomic stage. If not, various disturbances will take place, cousing decreases in plants efficiency. The presented results prove not only genetic dishomogeneity of the sources of yellow colour of the seeds, but also about the quantitative and additive character of this trait heterogenic (mono-, di-, tri-, or more genic) its determination. There is often one or few loci that have strong impact on the trait and more genes with lesser influence. The best way to get to know these genes and their allelles seems to be discovering of suitable genetic markers coupling with phenotypic trait of seeds colour for the largest possible number of lines. To this end genetic maps are created on the basis of mapping populations the offsprings of plants of high homozygotic lines differenciated by seed colour. At present the studies are conducted to discover genes responsible for negative traits connected with yellowseedness. The knowledge of such markers will significantly shorten breeding procedures of improved lines of yellowseeded rape by means of selection supported by genetic markers (MAS marker assisted selection) It can also help to create a model of prediction of traits for newly obtained hybrids from breeding and can allow to indicate the sources of yellowseedness. For this reasons, many scientific research groups recognize the mapping of the yellowseeded lines as a next step. Since Somers first attempt in 1999, many various molecular markers for the colour of seeds have been found, and further works have been continued to discover other markers. Because the genomes of Cruciferace and A. thaliana are quite similar, the comparative genomic can also provide usefull tools for this work Podłoże cechy żółtonasienności i jej konsekwencje The base yellowseedness and the consequence of the trait Rośliny oleiste są po zbożach najważniejszym źródłem energii wykorzystywanym w żywieniu zwierząt, a także człowieka. Mają również coraz większe znaczenie przemysłowe, zwłaszcza w produkcji biopaliw. W Polsce oraz w Europie najważniejszą tego typu rośliną jest rzepak (Brassica napus L.), a w szczególności jego odmiany ozime. Nasiona tej rośliny charakteryzują się wysoką zawartością tłuszczu oraz białek zapasowych o korzystnym zestawie aminokwasów. Dlatego też rzepak jest niezwykle atrakcyjnym obiektem dla wielu zespołów badawczych na całym świecie. W ostatnich 35 latach dokonał się olbrzymi postęp w udoskonalaniu rzepaku, jego przyczyną były: odkrycie nowych źródeł genetycznych, praktyczne

4 128 wykorzystanie genetyki oraz metod analizy instrumentalnej (Krzymański 2000). Dotychczasowe zabiegi hodowlane oraz molekularno-biologiczne pozwoliły znacznie podwyższyć plenność odmian, obniżyć zawartość w nasionach rzepaku takich substancji antyżywieniowych jak kwas erukowy i glukozynolany (rzepak podwójnie ulepszony double low), uzyskać odmiany o zmienionym składzie i proporcji pożądanych kwasów tłuszczowych oraz o zwiększonej zawartości substancji czynnych, np. tokoferoli. Kolejnym ważnym krokiem jest uzyskanie tzw. rzepaku żółtonasiennego (ang. yellow seeded), który w porównaniu z tradycyjnymi odmianami charakteryzuje się znacznie lepszą wartością paszową. Prace badawcze i hodowlane związane z tym problemem zakrojone są na bardzo szeroką skalę. Na czym polega niezwykłość rzepaku wydającego żółte nasiona? Badania biochemiczne wykazały zwiększoną zawartość białek i tłuszczu oraz zmniejszoną zawartością niestrawnego włókna w nasionach w porównaniu do rzepaku czarnonasiennego. Jednocześnie jednak odnotowano obniżenie plenności i wielkości nasion oraz dużą niestabilność cechy żółtonasienności. Według badań przeprowadzonych w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych w Poznaniu na otrzymanych liniach żółtonasiennych i standardowej odmianie czarnonasiennej Lisek, a także według innych ośrodków badawczych zawartość tłuszczu i białka w nasionach może zwiększyć się nawet odpowiednio o 8% (z 45,8 do 54,2%) i 5% (z 17,1 do 22,4%), a średnio zwiększa się o 5,1 i 2,3% masy 1000 nasion (Piotrowska i Krzymański 2003, Potapov i Osipova 2003, Rashid i Rakow 1999). Porównanie składu cukrowego wskazało również na większe walory śruty żółtonasiennej (Ochodzki i Piotrowska 2006). Znamienny jest jednak wyraźny wpływ temperatury na zawartość i profile składu oleju pozyskiwanego z żółtych nasion. Szczególnie widoczna jest podwyższona zawartość nienasyconych kwasów osiemnasto-węglowych w warunkach wyższej temperatury (Burbulis i Kott 2005). Efekt żółtych nasion jest wynikiem ich znacznie cieńszej okrywy nasiennej, będącej rezultatem obniżenia zawartości włókien, co z kolei czyni ją transparentną, a żółty zarodek widocznym. Zarówno kolor nasion, jak i zawartość niestrawnego włókna powiązane są z biochemią fenylopropanoidów, które są prekursorami lub komponentami takich związków jak flawonoidy, (poli)stylbeny, kumaryny, taniny oraz oczywiście ważnych składników ścian komórkowych lignin, suberyny i kutyny. Czarny kolor okrywy nasiennej jest wynikiem obecności polifenoli, głównie polimerów leukocyjanidyn, należących do grupy flawonoidów (Rahman i Joersbo 2001). Łupina nasienna składa się z kilku warstw: epidermalnej pokrytej nabłonkiem, pod którą znajduje się ściśnięta warstwa podepidermalna, warstwy komórek palisadowych, zbitej warstwy pigmentowej i pojedynczej warstwy aleuronowej. Barwniki są zawarte głównie w dwóch warstwach: palisadowej i pigmentowej, które wraz z przezroczystą, cienką epidermą pochodzą z integumentu zalążka, a więc tkanki matecznej. Znacząca ilość włókna skoncentrowana jest

5 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej w warstwie palisadowej, która w przypadku żółtych nasion jest zredukowana od około połowy do dwóch trzecich swej naturalnej grubości, odpowiada to adekwatnemu zmniejszeniu zawartości polifenoli i lignin (Rahman i Joersbo 2001) w całym nasieniu oznaczanym na poziomie od 3,5 do nawet 20% względem masy 1000 nasion (Piotrowska i Krzymański 2005). Obie warstwy są natomiast ubogie pod względem zawartości białek i tłuszczu, więc ich redukcja nie powoduje spadku zawartości tych ostatnich, obserwuje się efekt wręcz odwrotny. Trzecia warstwa to pozostałość bielma jest tkanką zarodkową, dość bogatą w białko. Li, Chen, Wang i Duan (2003) donoszą również o zaobserwowanych różnicach między tradycyjnymi odmianami rzepaku a uzyskanymi przez nich liniami żółtonasiennymi w całkowitej zawartości celulozy (niższej w nasionach żółtych), fenyloalaniny, tyrozyny; barwników: chlorofilu, karotenoidów i melanin. Zmienia się także zawartość wtórnych metabolitów: kumaryny, kofeiny i innych oraz aktywności takich enzymów jak: oksydaza polifenolowa (PPO), liaza amoniofenyloalaninowa (PAL), tyrozynaza, peroksydaza (POD) oraz kilku dehydrogenaz, hydrolaz i ligaz związanych z syntezą rozmaitych barwników (Li i Chen 2005). Synteza pigmentów u roślin odbywa się głównie poprzez tzw. szlak szikimofenyloalaninowy, w którym kluczową rolę grają właśnie PAL, PPO i POD. Pierwszy przeprowadza deaminację fenyloalaniny do kwasu fenyloakrylowego prekursora polifenoli. Z tych następnie PPO produkuje hinony (kolor brązowy), które polimeryzując tworzą melaninę. POD jest odpowiedzialna za oksydację różnych substancji. Aktywność PAL jest znacząco wyższa u czarno- niż u żółtonasiennych form rzepaku, toteż enzym ten uważany jest za kluczowy w procesie syntezy barwników, natomiast jego niska aktywność jest skorelowana z większą możliwością syntezy białka (większa dostępność fenyloalaniny). Synteza rożnych barwników przebiega dalej odmiennymi drogami, ale w trakcie procesu rozwoju nasion aktywność PPO i POD w okrywie nasiennej jest wyraźnie wyższa w nasionach, które będą czarne. Inhibitory tych enzymów: polivinylopirolidon PVP i redukujący Vc znoszą efekt obecności melaniny (Liang i Li 2003). Ci sami autorzy stwierdzili również obecność czterech wspólnych izoenzymów PPO i dodatkowych trzech izoenzymów w czarnych nasionach, dwa wspólne i jeden dodatkowy POD oraz znaczące około dziesięciodniowe opóźnienie w szczycie aktywności PAL w procesie rozwoju żółtych nasion. Badacze rośliny powszechnie uważanej za modelową rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) bliskiego krewnego rzepaku, o znacznie prostszym genomie opisują żółtonasienność u niej jako tzw. transparent testa phenotype i zidentyfikowali kolejne geny kodujące enzymy ze szlaku syntezy flawonoidów, których wyłączenie (mutageneza insercyjna) powodowało pojawienie się tego fenotypu. Są to syntaza chalkonowa (CHS, określana mianem genu TT4), izomeraza chalkonowa (CHI/CFI, TT5), dihydroflawonolowa 4-reduktaza (DFR, TT3), 3 i 3 hydroksylazy flawa-

6 130 nonowe (F3H: TT6 i TT7), a oprócz nich geny odpowiedzialne również za rozwój okrywy nasiennej (TT1) czy włośników (TTG). Przeszukiwanie bibliotek BAC i sekwencjonowanie odpowiednich fragmentów pozwoliło stwierdzić zwielokrotnioną (nawet w stosunku 15 : 1) obecność homologów TT1, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7 w genomie Brassica napus (Lotz i Snowdon 2007). Pewna grupa flawonoidów protoantocyjanidyny (skondensowane taniny), szeroko obecne w okrywie nasiennej, bardzo negatywnie wpływają na jakość paszy produkowanej z rzepaku. Dlatego obniżenie zawartości włókna w nasionach rzepaku ma duże znaczenie ekonomiczne. Oprócz zwiększenia zawartości substancji odżywczych przyczynia się do ich lepszej strawności i efektywniejszej przyswajalności np. przy skarmianiu zwierząt śrutą rzepakową. Jednocześnie te same flawonoidy spełniają ważną rolę w obronie nasion (jak i całych roślin) przed patogenami i szkodnikami oraz uczestniczą w wielu fizjologicznych procesach, takich jak dojrzewanie, spoczynek, żywotność nasion, wigor i ochrona roślin przed promieniowaniem UV. W związku z obniżoną grubością okrywy nasiennej żółte nasiona rzepaku charakteryzują się zmniejszoną odpornością mechaniczną, co utrudnia ich przechowywanie, zmniejszoną odpornością na patogeny grzybowe i środki agrochemiczne oraz przyspieszonym kiełkowaniem (Neubert i Lühs 2007, Ochodzki i Piotrowska 2007). Powoduje to obniżenie plonowania w porównaniu z czarnonasiennymi odmianami rzepaku do poziomu około 70 80%. Wydaje się, że odporność na grzyby można poprawić przez zwykłe chemiczne zaprawienie nasion. Natomiast takie cechy jak zawartość białka, tłuszczu, włókna, zawartość glukozynolanów i innych związków antyżywieniowych, plon z hektara oraz masa 1000 nasion wykazują dość dużą zmienność i potencjał hodowlany. Wraz z rozjaśnieniem zabarwienia okrywy nasiennej wzrasta zawartość tłuszczu i białka w nasionach, a maleje włókna (Ochodzki, Piotrowska 2002). Źródła żółtonasienności w hodowli rzepaku The sources of yellowseedness in rapeseed breeding Zmienność genetyczna wśród rzepaku jest bardzo ograniczona, głównie na skutek poczynionych zabiegów hodowlanych (Krzymański 2000). Żółtonasienność nie występuje naturalnie w obrębie gatunku B. napus, co często wymusza wyprowadzanie rzepaku żółtonasiennego z innych gatunków z rodzaju Brassica. Cechę tę obserwowano wraz ze wszystkimi pozytywnymi i negatywnymi konsekwencjami u innych uprawianych i dziko rosnących gatunków z rodzaju Brassica. Przykładami mogą tu być żółtonasienny rzepik (Brassica rapa L.) uprawiany w Chinach (Jiang i Niu 2007) oraz żółtonasienne formy allotetraploidalnych Brassica (Rahman 2001). Wiadomo, że w obrębie omawianego rodzaju występują trzy homologiczne

7 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej genomy, określane literami A, B i C, o wysokiej kolinearności (Lydiate i Sharpe 1999). Wydaje się jednak, że wszystkie wywodzą się od jednego, prymitywnego, pięcio- lub sześciochromosomowego genomu (Quiros 1999), który poprzez zwiększenie swojej ploidalności i różne modyfikacje dał początek nowym obecnie znanym genomom. Rzepak jest natomiast allotetraploidem o genomie AACC, ze skomplikowaną genezą zakładającą kilka niezależnych hybrydyzacji Brassica rapa (AA) i Brassica oleracea (CC). Oba gatunki posiadają dużą zmienność genetyczną, która może być wykorzystana do tworzenia zróżnicowania genetycznego B. napus (Krzymański 2000). To wszystko czyni atrakcyjną możliwość resyntezy żółtonasiennego rzepaku z innych żółtonasiennych roślin z rodzaju Brasica, jednak jednocześnie opisana wyżej wielka plejotropowość cechy, w połączeniu ze skomplikowaną poliploidalną konstrukcją genomów Brassica, wielopoziomową kontrolą ekspresji genów, dużym wpływem efektu matecznego (Neubert i Lühs 2003) i istotnym jakościowo stopniem interakcji genotyp środowisko (Adamska i Szała 2001), stopniuje ilościowo tę cechę, co powoduje niestabilność jej ekspresji i odziedziczalności. Powszechnie stosowane są następujące podejścia: 1) hodowla mieszańców z krzyżowania B. rapa B. oleracea, 2) B. napus B. juncea, 3) B. napus B. rapa, 4) B. napus B. carinata, 5) B. rapa B. oleracea var. aceaphala, 6) krzyżowanie międzyodmianowe w obrębie B. napus, 7) mutageneza radiacyjna B. napus. Metody te charakteryzują się różną skutecznością, a uzyskiwane kolejne generacje roślin nie zawsze utrzymują zdolność do wydawania żółtych nasion; ekspresja żółtonasienności jest modyfikowana przez czynniki środowiska głównie temperaturę (Rahman 2001). Jednak tymi metodami do roku 2003 udało się wyprowadzić ponad sto żółtonasiennych linii. Niektóre interesujące osiągnięcia zostały opisane poniżej. Krzyżowanie, wydawałoby się najprostsze i najbardziej bezpośrednie pomiędzy żółtonasiennymi B. rapa (AA) i B. oleracea (CC) ukazało badaczom (Stringam 1980, Bechyne 1989, Chen i Heneen 1992, Brismar 2001, Rahman 2001 i in.) jak trudno jest uzyskać stabilne linie żółtonasiennego rzepaku. Jing wen i Tu (2007) skrzyżowali 3 odmiany B. rapa ssp. oleifera i 5 różnych odmian B. oleracea var. acephala, i hodowali uzyskane rośliny z zastosowaniem kultur makrospor, zarodków i kolchicyny. Konkluzja autorów mówiła o możliwości istnienia dwóch odrębnych dróg syntezy pigmentu jednej kodowanej w genomie A, drugiej w C, w połączeniu z dużą polimorficznością obu genomów u różnych odmian krzyżowanych roślin oraz częściowym efektem matecznym (Jing Wen i Tu 2007). Inni badacze zapatrują się na tę kwestię w inny sposób.

8 132 Także w Polsce w celu uzyskania żółtonasiennego rzepaku skrzyżowano żółtonasienne gatunki B. juncea Coss. (AABB, 2n = 36) i B. carinata Braun (BBCC, 2n = 34) otrzymane ze Szwecji Svalöv (obecnie Svalöv-Weibull). Spośród otrzymanych roślin F 1 wytypowano 4 rośliny o mieszańcowości potwierdzonej cytogenetycznie (ABBC, 2n = 35), do dalszej hodowli. Według statystyki (nie uwzględniającej różnic w możliwościach parowania się chromosomów z poszczególnych genomów) autorzy (Jönsson i Bengtsson 1970) w pokoleniu F 2 oczekiwali następującej segregacji: 4AABB : 4 ABBB : 4AABC : 10ABBC : 4ABCC : 1AACC : 1BBBB : 4BBBC, a więc jednej rośliny żółtonasiennego rzepaku na 31 innych (Barcikowska i Maćkowiak 1997). Otrzymana zmienność przewyższyła prostą segregację mendlowską. Rośliny wydawały nasiona w ponad 40 różnych rodzajach zabarwienia, czy kombinacjach zabarwienia i nacieków bądź nakrapiania. Te o morfologii najbardziej przypominającej rzepak poddano badaniom cytologicznym mitotycznych płytek metafazowych. Liczba chromosomów określana na tej podstawie mieściła się w granicach 2n = 32 i 2n = 35; nie zidentyfikowano pośród nich form właściwych B. napus (2n = 38). Obserwacje mejozy (pyłek) ujawniły natomiast liczne aberracje: multii uniwalenty, chromosomy opóźniające lub pozostające poza biegunami. Powstałe mieszańce cechowały zbyt znaczne zaburzenia równowagi genomowej, nie było też mowy o stabilności koloru nasion (Barcikowska Maćkowiak 1997). Ciekawą koncepcję, na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia, zaproponowali Kanadyjczycy krzyżując żółtonasienne formy dwóch gatunków gorczyc: B. juncea odmiana ZYR-6 i B. carinata PGRC/E z B. napus odm. Westar jako rodzicem żeńskim, w celu przeniesienia genów odpowiedzialnych za cechę żółtonasienności z genomu A B. juncea i genomu C B. carinata do genomów A i C rzepaku. Następnie powstałe mieszańce F 1 (A y BAC) i (BC y AC) były znowu krzyżowane z B. napus, aby wyeliminować genom B i poprawić ich niską płodność. Tak powstałe potomstwo F 1, było selekcjonowane pod względem morfologii B. napus (A (y) CAC) i (C (y) AAC, gdzie (y) oznacza 50% szansy obecności genomu z genami żółtonasienności), a następnie samozapylane. Dla populacji wywodzących się od B. juncea w tym pokoleniu F 2 można było spodziewać się następujących genotypów: AACC, AA y CC i A y A y CC, a dla B. carinata: AACC, AAC y C i AAC y C y. Autorzy (Rashid i Rakow 1994) od początku zakładali, że dla otrzymania pożądanego fenotypu B. napus konieczna jest obecność obu żółtonasiennych genomów: A y i C y w postaci homozygotycznej (A y A y C y C y ), kolejnym więc etapem było krzyżowanie między sobą prowadzonych dotąd osobno linii pochodzących od B. carinata i B. juncea (oba gatunki roślin użyto zarówno jako formę rodzicielską męską, jak i żeńską), by w tym pokoleniu uzyskać rośliny, z których przynajmniej część będzie posiadała genotyp AA y CC y, a następnie poprzez chów wsobny podwójne recesywne homozygoty (A y A y C y C y ).

9 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej Rośliny uzyskane z pierwszego międzygatunkowego krzyżowania i samozapylania wydawały tylko czarne nasiona i charakteryzowały się (szczególnie te pierwsze) obniżoną płodnością. Rośliny mieszańcowe pomiędzy liniami wyprowadzonymi od B. carinata i B. juncea odznaczały się dużą płodnością i dobrą jakością nasion oraz morfologią typową dla B. napus. Finalnie z 20 rodzin (tworzonych przez 4858 rośliny) na ostatnim etapie, osiem zawierało tylko rośliny wydające czarne nasiona, sześć czarne i żółtobrązowe oraz sześć czarne, żółtobrązowe i żółte (każda pojedyncza roślina wydaje jednakowe nasiona). Ogółem udało się autorom uzyskać 91 roślin czysto żółtonasiennych i 1025 roślin wydających nasiona żółtobrązowe (Rashid i Rakow 1994), co czyni ten schemat dość efektywnym. Autorzy postulują obecność co najmniej jednego recesywnego genu żółtonasienności w każdym z genomów. Mogą to być komplementarne zmutowane allele genu, którego produkt stanowi któryś z kluczowych enzymów szlaku syntezy pigmentu. Żółtobrązowe nasiona najprawdopodobniej pochodzą od roślin, które zawierają jeden genom C z kodominującym nie zmutowanym allelem (A y A y C y C). Czarne nasiona powstawały zawsze, gdy jeden lub żaden z rodziców z linii pochodzących od B. carinata lub B. juncea, w istocie nie posiadał już zestawu chromosomów z genem(ami) żółtonasienności, a tylko chromosomy pochodzące od B. napus odm. Westar. Naukowcy duńscy z kolei przestudiowali możliwość wyprowadzenia żółtonasiennego rzepaku w wyniku trzech różnych podejść, które zakładały krzyżowania między czterema gatunkami: żółtonasiennym B. rapa var. yellow sarson, dzikim B. oleracea, żółtonasiennym B. carinata i czarnonasiennym B. napus. Pierwsze podejście zakładało najpierw uzyskanie mieszańców międzygatunkowych o genomie A y BC z (B. carinata B. rapa; z obecność genów żółtonasienności z B. carinata różnych od y z B. rapa), które następnie skrzyżowano z B. napus. Potomne rośliny były samozapylane przez kolejnych siedem generacji. W ostatniej pojawiły się takie, które wydawały żółtobrązowe nasiona (autorzy chcieli doprowadzić do rekombinacyjnego przepływu genów żółtonasienności pomiędzy genomami A i C w procesie allosyndezy) o przypuszczalnym genomie AAC y* C y* (* rekombinacja). Linię tę nazwano No. 06 i skrzyżowano z linią No. 01 pochodzącą od mieszańca B. oleracea B. rapa, po podwojeniu jego chromosomów kolchicyną (A y A y CC). W ten sposób otrzymane rośliny F 1 (AA y CC y* ) i ich potomstwo, poddawane kolejnym samozapyleniom i selekcji nasion dały początek czysto żółtonasiennej linii A y A y C y* C y* (Rahman 2001), krzyżowanej dalej z konwencjonalnym B. napus w celu wyprowadzenia odmian żółtonasiennych podwójnie ulepszonych. W drugim podejściu z mieszańca A y BC z uzyskano trójgenomowy diploid (wydawał nasiona brązowe). Aby pozbyć się genomów BB przeprowadzono krzyżowanie No. 01 trójgenomowy diploid. Potomstwo o genomie A y A y BCC z poddawane było samozapyleniom. Niestety efektem tych zabiegów były rośliny

10 134 o przewidywanym genomie A y A y C z C z, lecz wydające co najwyżej nasiona brązowe (Rahman 2001). Celem trzeciej metody było stworzenie żółtonasiennego genomu C z C z B. oleracea poprzez skrzyżowanie dzikiej formy tej ostatniej z żółtonasiennym B. carinata. Rośliny F 1 (BCC z ) były samozapylane lub poddane krzyżowaniu wstecznemu wstecznej z B. oleracea. Udało się uzyskać żółtonasienny B. oleracea, ale próba resyntezy żółtonasiennego B. napus poprzez krzyżowanie go z B. rapa var. yellow sarson zawiodła (Rahman 2001). Wszystkie opisane krzyżowania były przeprowadzane wzajemnie. Co ciekawe, lepszy efekt wyższą płodność uzyskiwano, gdy w pierwszej metodzie B. rapa był użyty jako rodzic żeński (Rahman 2001). Niepowodzenia w podejściach nr 2 i 3 jednoznacznie wskazują na niekompatybilność źródeł żółtonasienności na genomach A i C, które poprzez kompensację genów znoszą wzajemnie swój efekt. W uwieńczonej sukcesem metodzie pierwszej rzepak posiadał na genomach AA i CC te same geny żółtonasienności, pochodzące od B. rapa var. yellow sarson. Badania nad amfihaploidami Brassica: AB, AC, BC i dwugenomowymi triploidami: AAC ACC, BBC, BCC, AAB i ABB wykazały, że w mejozie koniugują z reguły chromosomy z homologicznych genomów, jednak w genomach A i C dochodzi często do allosyndezy homologicznych chromosomów, a w 50% przypadków mikrosporogenezy dwugenomowych triploidów AAC i ACC tworzą się triwalenty (Rahman 2001). Dzięki temu ponadto dochodzi do eliminacji genomu B u mieszańców (choć nie zawsze). Autor uważa, że żółtonasienność użytej odmiany B. rapa zależy od recesywnych dwóch niezależnych genów w stanie homozygotycznym. Natomiast u B. carinata żółty kolor nasion występuje tylko przy obecności dominującego genu represora syntezy barwnika. Para recesywnych genów z B. rapa zachowuje się epistatycznie wobec czynnego genu represora B. carinata, jednak hipostatycznie do barwy brązowej nasion. Wyjaśnia to brązowy kolor nasion trójgenomowego diploida i niemożność otrzymania żółtonasiennego potomstwa w przeprowadzonych kombinacjach (tamże). Na Akademii Rolniczej w Poznaniu przeprowadzono natomiast krzyżowanie między męskosterylnym (MS) lub płodnym B. napus (var. oleifera, komponent mateczny) z czterema różnymi żółto- i brązowonasiennymi gatunkami Brassica. Były to: 1. B. rapa ssp. żółtonasienny trilocularis, 2. B. rapa ssp. brązowonasienny pekinensis, 3. B. hirta (gorczyca biała 2n = SS = 24), 4. B. carinata (gorczyca etiopska). Kompletnie nieudana okazała się trzecia kombinacja. W pozostałych przypadkach uzyskano, w zależności od użytego rodzaju B. napus, mieszańce męskosterylne lub męskopłodne. Autorzy odkryli jednak, że podczas mikrosporogenezy właściwy podział chromosomów był często zaburzony. Niemniej jednak uzyskanie

11 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej płodnych międzygatunkowych mieszańców dało nadzieję na przeprowadzenie badań w kierunku introgresji rozmaitych cech pomiędzy tymi gatunkami (Wojciechowski i Springer 2007). Żółtonasienne linie rzepaku ozimego otrzymano w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych IHAR w Poznaniu. Powstały one w wyniku skrzyżowania naturalnego mutanta, znalezionego w materiałach hodowlanych rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego, o jaśniejszej okrywie nasiennej, z linią jarą pochodzącą z krzyżowania B. napus B. rapa, otrzymaną z Kanady, a pochodzącą ze Szwecji z badań przeprowadzonych przez Olssona. W wyniku chowu wsobnego, selekcji oraz krzyżowania z najlepszymi rodami ciemnonasienego rzepaku ozimego wyprowadzono linie żółtonasienne o różnej zdolności kombinacyjnej (Piotrowska, Krótka 2000). Uzyskane formy charakteryzowały się zmniejszoną plennością i zimotrwałością oraz przejawiały skłonność do porastania nasion w łuszczynach, ale równocześnie wysoką zawartością kwasów tłuszczowych i białek, a niską glukozynolanów oraz nie gorszą niż odmiany czarnonasienne podatnością na szkodniki (Piotrowska i Krzymański 2003). By przerwać sprzężenia niekorzystnych cech i ustabilizować żółty kolor nasion prowadzona jest dalsza hodowla. Krzyżowanie uzyskanych linii DH żółtonasiennych i DH czarnonasiennych dało podstawę (segregacja koloru nasion) do wyciągnięcia wniosków, iż o kolorze nasion decyduje genotyp rośliny matecznej, a odpowiedzialne za nią są dwie pary alleli ze zjawiskiem epistazy (Piotrowska i Krótka 2004). Liu Z. i in. (2007) postanowili wyprowadzić żółtonasienny rzepak krzyżując wyodrębnioną żółtonasienną rasę B. juncea Sichuan Yellow, charakteryzującą się jednak wysoką zawartością substancji antyżywieniowych, czarnonasienny chiński B. napus 1047 o specyficznym połysku i kanadyjską jarą linię B. napus odm. Stellar o nakrapianych nasionach. Najpierw rośliny Sichuan Yellow zapylono pyłkiem pochodzącym od odmiany Stellar. Uzyskane potomstwo było w znacznej mierze sterylne, jednak po zapyleniu go pyłkiem linii 1047 udało się uzyskać nasiona, z których wyselekcjonowano 46 połyskujących roślin (BC 1 F 1 ). Te następnie po samozapyleniu wydały 178 połyskujących i 172 woskowate rośliny (BC 1 F 2 ), w każdej z tych grup była obecna jedna roślina wydająca żółte nasiona. Jednak tylko linia wyprowadzona z rośliny woskowatej okazała się w miarę stabilna pod względem tej cechy w następnym pokoleniu BC 1 F 3. Z nasion o najjaśniejszej barwie i najkorzystniejszych cechach żywieniowych poprzez samozapylanie roślin wyprowadzono następne pokolenia. Jednak zaledwie jedna linia zawierała rośliny żółtonasienne (Liu i Guan 2007) Wcześniejsze badania wykazały, iż żółty kolor nasion B. juncea jest kontrolowany przez dwa niezależne geny, będące w stanie recesywnym w obydwóch genomach B. juncea (A i B). Dlatego w F 1 powstały mieszańce o składzie genomów: A y B y A m C m (gdzie m mottled ang. cętkowany). Dalsza hodowla pozwoliła wyeliminować genom B oraz uzyskać rozmaite kombinacje genomów:

12 136 A y, A m, A, C m i C. Z uwagi na duże możliwości allosyndezy (tworzenia allosynaps) pomiędzy odpowiadającymi sobie chromosomami z tych genomów, oczywista wydaje się duża różnorodność odcieni i zmienność barwy nasion w kolejnych pokoleniach, a zarazem możliwe jest uzyskanie linii czysto żółtonasiennej. Uzyskana w wyniku tych badań linia wg autorów odznaczała się pożądaną jakością nasion, lecz wymagała poprawy cech agronomicznych. Bechyne (1999) uzyskał żółtonasienny rzepak poprzez skrzyżowanie B. rapa (o żółtych nasionach, dodatkowo charakteryzującą się zwiększoną ilością pąków na pędzie czteroklapowe łuszczyny) z żółtonasienym B. napus uzyskanym z wcześniejszego krzyżowania B. oleracea (CC) o ciemnożółtych nasionach z B. rapa yellow sarson (AA). Celem drugiego krzyżowania było ewentualne przeniesienie genów żółtonasienności i wielopąkowości z genomów A B. rapa do genomów A i C B. napus. Wszystkie rośliny z pokolenia F 1 posiadały morfologię B. napus i wydawały ciemne nasiona. Spośród 1772 roślin F 2 (samozapylanie) 6 odznaczało się pożądanym charakterem, co oznacza, że taki transfer choć jest skomplikowany, to jednak możliwy. Bochkaryova i Gorlov wykorzystali naturalne mutanty VIR k-4984 o nasionach z żółtym plamkami. Selekcja roślin poddawanych samozapylaniu nie dawała znaczących efektów. Pojawiły się one po naświetleniu nasion promieniami X. Po otrzymaniu silnych dawek nasiona nie kiełkowały. W pozostałych przypadkach morfologia roślin nie ulegała zmianom, natomiast w wariancie 100-kradowym udało się uzyskać rośliny wydające nasiona o różnym odcieniu żółtości: ok. 32% roślin żółtonasiennych i ponad 10% roślin oliwkowonasiennych (Bochkaryova i Gorlov 1999). Kolejne lata hodowli pozwoliły na pozyskanie linii, w których brązowe nasiona stanowiły domieszkę rzędu 6% plonów. Ci sami badacze użyli żółtonasienną bezerukową B. juncea Zem-1 jako rodzica żeńskiego, by skrzyżować ją z linią, która została otrzymana poprzez napromieniowanie nasion k-4984 dawką 50 kradów (nasiona ciemnożółte). Rośliny F 1 charakteryzowały się słabym wzrostem i wydawały brązowe nasiona z żółtym nakrapianiem. Były jednak płodne. W następnych pokoleniach, uzyskanych w wyniku samozapylania, wyselekcjonowano linie wydające żółte nasiona z 20% domieszką brązowych (Bochkaryova i Gorlov 1999). Na przestrzeni lat w Rosji starano się również wyprowadzić żółtonasienny rzepak poprzez rozmaite wzajemne kombinacje czarnonosiennego, B. napus form ozimych var. Andor, Regent, SibNIIK 198 z żółtymi B. rapa (cv. Vostochnaya, Candle, Tobin), B. juncea (linia 13H-11, linia 21), Sinapsis alba (linie 13H-162, 24) i różnymi jarymi odmianami rzepaku (Agat, Regent Salut). Udało się wyselekcjonować 6 perspektywicznych linii rzepaku żółtonasiennego (Potapov i Osipova 2003).

13 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej W 2004 r. grupa litewskich naukowców opublikowała pracę, w której poinformowali o nowym źródle żółtonasiennego rzepaku otrzymanym w wyniku krzyżowania między dwiema czarnonasiennymi, podwójnie ulepszonymi jarymi odmianami Star i Bolero. Wynikiem tego krzyżowania już w pierwszym pokoleniu było sześć żółtonasiennych linii DH i co najważniejsze w typie Canola. Linie te i ich potomstwo (samozapylanie) charakteryzowały się większą intensywnością żółtej barwy nasion w wyższych temperaturach, a w niższych nawet barwą brązową (Burbulis i Kott 2004). Można przypuszczać, że autorzy skrzyżowali dwie heterozygoty, recesywne pod względem tego samego genu (dwóch, maksymalnie trzech), którego produkt ekspresji uczestniczy w szlaku syntezy fenoli. Możliwe jest, że mutacja czyni go lub jego promotor wrażliwym na temperaturę. Dotyczyć to może zarówno genów szlaku syntezy fenoli, jak i ich elementów regulatorowych. Podobnym osiągnięciem w 1999 r. mogli się pochwalić Wu i Shi otrzymali oni żółtonasiennego mutanta (933044) w pokoleniu F 8 z krzyżowania czarnonasiennych, niskoerukowych linii Huayou i 3Marnoo (Wu i Shi 1999). Także Zaman (1988) wyhodował brązowo-żółtawonasienny rzepak z krzyżowania (B. carinata B. rapa) B. napus oraz B. napus B. rapa. A Tang i in. (1997) uzyskali częściowo żółtonasienny rzepak krzyżując: (B. rapa B. oleracea) B. napus, B. napus B. juncea, B. napus B. rapa oraz poprzez napromieniowanie nasion i krzyżowania międzyodmianowe w obrębie gatunku B. napus (Rahman 2001). Najbardziej efektywnymi, pod względem wyniku, witalności i produktywności roślin, schematami introgresji żółtonasienności są te, które zachowują balans genetyczny i genetyczną integralność cechy. Ważna jest obecność genów odpowiedzialnych za tę cechę na wszystkich genomach. Źródła odmienne mogą się jednak wzajemnie kompensować, czego wynikiem jest regresja do czarnonasienności u roślin potomnych. Natomiast zaburzenia w ogólnym balansie genetycznym w zresyntetyzowanych liniach B. napus powodują słaby wzrost, plonowanie, zredukowaną płodność i wagę nasion, a w konsekwencji mniejszą zdolność do produkcji oleju (Rashid i Rakow 1999). Trwają także intensywne prace nad ulepszaniem już uzyskanych linii rzepaku żółtonasiennego, a także resyntezy nowych linii z już istniejących żółtonasiennych. Hodowla polega przeważnie na wprowadzeniu cechy jakościowej do wybranych genotypów rzepaku o określonej wartości gospodarczej. Jeśli materiał wyjściowy posiada wiele cech niekorzystnych, konieczne jest krzyżowanie wielokrotne w celu ich usunięcia (Krzymański 2000). Według doniesień z Chin udało się tam skutecznie poprawić cechę żółtonasienności u B. napus o nasionach żółto-brązowych, w wyniku skrzyżowania B. carinata (Dodolla) odmiany czysto żółtonasiennej. Wyprowadzono żółtonasienną linię B. napus I1045,

14 138 z pewnymi cechami odmiany Dodolla takimi jak zawartość tłuszczu, zdolność do rozgałęziania się i ułożenie pąków (Qi i Fu 1999). Meng i Shi by przenieść geny odpowiedzialne za żółty kolor nasion z obu genomów A i C do odpowiednich genomów rzepaku, również tak jak Rashid stworzyli heksaploidalny Brassica (AABBCC) poprzez wzajemne krzyżowanie odpowiednich B. rapa (9 odmian) i B. carinata (3 odmiany). Otrzymano 27 chromosomowych mieszańców, które następnie zapylono pyłkiem częściowo żółtych lub brązowych, niestabilnych odmian B. napus. Mieszańce na tym etapie (AABCC) z cytoplazmą B. carinata lub z B. rapa były zdolne do samozapylenia i wydawały nasiona brązowego koloru. Eliminacja genomu B w kolejnych pokoleniach (samozapylanie) sprawiła, że morfologia otrzymanych roślin była taka jak u B. napus. Badania cytologiczne i testy izoenzymatyczne pokazały wyraźnie, iż ich tło genetyczne pochodzi od B. rapa, B. carinata i B. napus. (Meng i Shi 1998). Autorzy przychylają się do zdania Rashida i innych badaczy, o dwóch homologicznych zestawach genów, po jednym na genomach A i C u B. napus, które dla otrzymania żółtych nasion koniecznie muszą być homozygotyczne i recesywne, w jednym bądź dwóch kluczowych genach na ścieżce syntezy barwników. Także by poprawić kolor swej najlepszej linii rzepaku żółtonasiennego: YN , wywodzącej się z żółtonasiennych B. carinata i B. rapa yellow sarson, Raney i Rakow skrzyżowali ją z brązowożółtonasiennym B. oleracea (linia ) i żółtonasiennym B. rapa (odmiana Parkland w typie canola). Uzyskane z przeprowadzonych krzyżowań potomstwo było krzyżowane ze sobą lub wstecznie z YN Po kilku generacjach i selekcji w kierunku poprawy żółtonasienności i niskiego poziomu glukozynolanów alkenowych udało się uzyskać satysfakcjonujące linie Rsyn (Raney i Rakow 1999). Były one potem krzyżowane z wysoko odporną odmianą Shiralee i wysoko oleistymi liniami N89-17 and N Inna linia żółtonasiennego rzepaku (YN ) została skrzyżowana jako rodzic męski z czterema różnymi czarnonasiennymi odmianami rzepaku typu canola (Magnum, Dunkeld, Range i Ebony). Uzyskane rośliny potomne były krzyżowane między sobą, by stworzyć wysoce heterozygotyczną populację. W pokoleniu F 6 udało się uzyskać rośliny wydające zdecydowanie żółte nasiona, wysoko plonujące, o dużej zawartości oleju i białka oraz o podwyższonej odporności na niektóre choroby (Relf-Eckstein i Rakow 1999). Dość niską frekwencję roślin żółtonasiennych w kolejnych pokoleniach autorzy tłumaczą recesywnością trzech genów odpowiedzialnych za tę cechę u YN (Relf-Eckstein i Rakow 1999). Ci sami badacze zastosowali również inne podejście. Otóż w wyniku wielu krzyżowań odmian czarnonasiennych wyselekcjonowali ozimą linię summer annual, z której rośliny wydawały nasiona o barwie czarnej, bardzo wysokiej jakości, pożądanych cechach agronomicznych (liczba rozgałęzień, czas kwitnienia itp.) i wysokiej odporności na rozmaite czynniki biotyczne i abiotyczne. Rzepak z tej linii użyto jako rodzica żeńskiego do krzyżowania z otrzymaną wcześniej popu-

15 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej lacją żółtonasienną Rsyn2. Uzyskane rośliny o charakterze żółtonasiennego B. napus krzyżowano następnie z brązowożółtonasiennym B. oleracea oraz wstecznie z rodzicem B. napus. W ten sposób uzyskano Rsyn2 w typie canola (badania opublikowane w 1999). Potomstwo F 1 mieszańcowe względem ulepszonego czarnonasiennego rzepaku summer annual z Rsyn2 było poddane samozapyleniu, a uzyskane rośliny F 2 krzyżowane między sobą w jedenastu różnych krzyżowaniach. Hodowla selekcyjna była jednak prowadzona aż do szóstego pokolenia, licząc od wspomnianych jedenastu podejść (Relf-Eckstein i Rakow 2007). Zdaniem autorów żółty kolor nasion z Rsyn2 został z powodzeniem wprowadzony do ulepszonej linii summer annual ozimego rzepaku. Udało się uzyskać nową linię żółtonasiennego rzepaku, o bardzo dobrych właściwościach, do kolejnych etapów udoskonalania tej rośliny. Inną metodą ulepszania otrzymanych już linii żółtonasiennych jest transformacja za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Baetzel i Friedt (1999) skrzyżowali natomiast swoją podwójnie ulepszoną żółtonasienną linię T z liniami wysokoerukowymi (HEAR) w celu uzyskania rzepaku wydającego nasiona o dobrej jakości i z dużą zawartością kwasu erukowego (wartość przemysłowa). Cel osiągnęli za pomocą metody linii podwójnie haploidalnych (DH). Badania biochemiczne wykazały, że żółtonasienne linie rzepaku wyhodowane przez Rahmana do 2001 r. także charakteryzowały się dość dużą zawartością substancji antyżywieniowych. Dlatego autor postanowił je skrzyżować z dwoma jarymi czarnonasiennymi odmianami rzepaku Polo lub Dakini. Z pokolenia F 1 metodą kultur mikrospor wyprodukowano linie DH, z których najlepsze pod względem koloru nasion oraz zawartości GLS i kwasu erukowego były powtórnie skrzyżowane z Polo lub Dakini, a ich potomstwo poddano selekcji (Rahman i Joersbo 2001). Segregacja roślin potwierdziła przypuszczenia, że w liniach uzyskanych przez Rahmana za żółty kolor nasion odpowiadają trzy lub cztery recesywne geny. Markery i mapy uwarunkowania genetycznego Markers and mapping of genetic backgrounds Aby lepiej poznać kombinacje genetycznych i środowiskowych czynników, mających wpływ na kolor nasion rzepaku, Lühs, Baetzel i Friedt (2000) skrzyżowali różne czarnonasienne, wysokoerukowe linie rzepaku z podwójnie ulepszoną żółtonasienną linią DH. Odnosząc się do większości przypadków linii potomnych, autorzy zaproponowali następujący model determinacji genetycznej: kolor czarny lub brązowy są wynikiem epistatycznego oddziaływania dominujących alleli trech genów, żółty obecności trzech form recesywnych, brązowy obecnością mniej niż trzech alleli dominujących. W tych badaniach wyprowadzone linie DH (z wspom-

16 140 nianych mieszańców) segregowały wobec schematu czarne : brązowe : żółte jak 1 : 6 : 1. Kolor nasion był więc wyraźnie dziedziczony jako cecha addytywna. W związku z introgresją cechy żółtonasienności do rzepaku, zwiększyła się również różnorodność cech żywieniowych nasion. Szczególnie istotna jest szczegółowa znajomość zawartości i składu glukozynolanów mierzona spektroskopowo (Michalski 2003). Na obecnym etapie badań uzyskane linie stara się poddać dalszej hodowli w kierunku zmniejszenia zawartości substancji antyżywieniowych oraz przełamania negatywnej korelacji pomiędzy ilością białek i tłuszczów oraz poprawienia rozmaitych cech agrotechnicznych. Dlatego opracowanie markerów molekularnych, pozwalających na identyfikację alleli odpowiedzialnych za żółty kolor nasion, wydaje się być bardzo ważne dla uproszczenia hodowli (np. kierowane zapylenie), tym bardziej, jeśli weźmiemy pod uwagę wpływ czynników środowiska na ostateczny fenotyp hodowanych linii rzepaku. Najlepszym narzędziem umożliwiającym identyfikację i charakterystykę poligenów jest mapowanie genetyczne z wykorzystaniem właśnie markerów molekularnych. Mapa pozwala ustalić kolejność i rozmieszczenie markerów na chromosomach oraz stopień ich sprzężenia. Markerami stosowanymi najczęściej są RFLP, RAPD, SSR i AFLP. Na ogół oznacza się w ten sposób jeden lub kilka loci silnie determinujących daną cechę oraz geny o niewielkim znaczeniu, rozrzucone na różnych chromosomach. Identyfikacja głównych genów stwarza możliwości polepszania wartości użytkowej odmiany przez wzbogacenie jej puli genowej nowymi korzystnymi allelami i wyselekcjonowania rekombinantów wykazujących korzystne transgresje. Wszelkie doskonalenie roślin użytkowych z wykorzystaniem markerów molekularnych zalicza się do hodowli molekularnej. Od kiedy Somers i in. (1999) opisali kilka markerów RAPD identyfikujących jeden z głównych genów odpowiedzialnych za kolor nasion rzepaku (fragment o długości 600 bp dla żółtego koloru nasion), chwilowo zarzucono temat innych markerów (Burbulis i Kott 2004). Wykorzystali oni linie DH otrzymane metodą kultur mikrosporowych z krzyżowania odmian rzepaku Apollo YN (żółtonasienna), które segregowały pod względem koloru wydawanych nasion. Analiza zbiorczych prób segregantów (BSA) z wykorzystaniem dziesięciu najlepszych linii żółtych i dziesięciu czarnych pozwoliła uzyskać kilka markerów RAPD które identyfikowały allele jednego bimodalnego genu określających roślinę albo jako żółto-, albo czarnonasienną. Gen nazwano Pigment 1. W podejściu drugim autorzy wykorzystali dziesięć najlepszych żółtonasiennych linii i dziesięć linii o nasionach żółtobrązowych, co z kolei spowodowało identyfikację następnych dwóch QTL o częściowym wpływie na kolor nasion (Somers i Rakow 1999). By uzyskać pełny żółty kolor nasion konieczna jest homozygotyczna obecność wszystkich trzech alleli genów w formie recesywnej. Jednak w kolejnych badaniach nad nowo wyprowadzanymi liniami żółtonasiennymi markery Somersa nie

17 Rzepak żółtonasienny aktualny stan badań w skali światowej zawsze okazywały się przydatne. Zasugerowało to, że żółtonasienność materiału z różnych źródeł ma dość różnorodne podłoże genetyczne i różne loci mogą kontrolować kolor nasion. Większość naukowców uważa, że w liniach badanych przez nich występują trzy recesywne geny znajdujące się na różnych loci (Tang, Shirazdegan), inni jednak otrzymują wyniki odmienne. Wyjaśnienie mechanizmów genetycznej kontroli żółtego koloru nasion rzepaku jest jednym z głównych celów niemieckiego programu GARS (Genome analysis in rapeseed). By zidentyfikować loci dla odpowiednich genów Badani i Snowdon (2003) stworzyli dwie populacje mapujące dla dwóch odmiennych źródeł żółtonasienności. Pierwsza pochodziła od żółtonasiennego B. napus skrzyżowanego z czarnonasienną linią DH K26-96; z tego krzyżowania uzyskano następnie 110 roślin DH. Drugą populację tworzyło 179 roślin F 2 uzyskanych poprzez skrzyżowanie czarnonasiennego Express 617 z żółtonasienną linią 1012/98. W obu przypadkach do stworzenia map genomowych i identyfikacji QTL dla koloru nasion użyte zostały markery AFLP (28 kombinacji) i SSR (spośród powszechnie dostępnych). Proporcje segregacji koloru zawsze wskazywały na trzy recesywne, homozygotyczne allele warunkujące żółty kolor nasion, jednakże nie równocenne. Wykryto jeden QTL o dużym efekcie i dwa o mniejszym. Dzięki markerom AFLP zidentyfikowano 211 polimorficznych loci w populacji linii DH i 245 z drugiej populacji, w większości kodominujących. Markery SSR pozwoliły zwiększyć gęstość uzyskanych w ten sposób map, dodając odpowiednio 35 i 51 polimorficznych loci. Udało się oznaczyć siedem grup sprzężeń chromosomów, za pomocą niewielkiej, jak się okazało, liczby wspólnych dla obu grup markerów, pozostałe 12 za pomocą markerów referencyjnych. Cztery wspólne markery pozwoliły umiejscowić drugi co do wpływu na kolor nasion QTL na tym samym chromosomie w obu źródłach żółtonasienności, natomiast QTL o największym efekcie został wykryty za pomocą markerów referencyjnych na innych chromosomach obu źródeł (Badani i Snowdon 2003). Odziedziczalność koloru nasion rzepaku była badana także przez Rahmana i in. (2007), w uzyskanych pokoleniach F 1, F 2, F 3 roślin otrzymanych przez skrzyżowanie pięciu czarnonasiennych odmian (Sentry, MilleniUM03, Holly-276, Allons i DH-126) z trzema liniami żółtymi (SRYS-1, -2 i -3). Wsobnie skrzyżowano także rośliny z F 1 rodzicami żółtonasiennymi. Nasiona roślin potomnych posiadały szerokie spektrum odcieni, ich segregacja zarówno w F 2 (wszystkie pozostałe nasiona do żółtych jak 63 : 1), jak i BC 1 S 1 potomstwo wsobne (7 : 1) wskazywała na trójgenowy sposób kontroli z dominującymi allelami czarnonasienności. Zidentyfikowane zostały dwa z nich. Do mapowania genów sprzężonych z kolorem nasion została użyta metoda SRAP (polimorfizm amplifikowanych pokrewnych sekwencji) czterysta par primerów. Jeden marker SRAP (SA12BG18388B) z chromosomu 19 i genomu C wykazał ścisłe sprzężenie z czarnym zabarwieniem