%DGDQDFHFKDELRFKHPLF]QD & 8 D 1 ) * / * & ' $ 3 / $ 3 $ $

Transkrypt

1 PRZGL Nr 4 PIMIOL 200; 9:9 6 Zachorowanie na zgorzel gazow¹ 9 l bieta Wojdat, Krzysztof Kwiatek, enryk Zdrojewski 2, Lidia Krupa 2 ZACOROWANI NA ZGORZL GAZOW OPIS IAGNOZOWANIA PRZYPAKU Zak³ad igieny Œrodków ywienia Zwierz¹t, Pañstwowy Instytut Weterynaryjny Pañstwowy Instytut Badawczy, Kierownik: Krzysztof Kwiatek 2 Oddzia³ Chirurgiczny, 6 Szpital Wojskowy w êblinie, Ordynator: enryk Zdrojewski W pracy opisano przypadek zgorzeli gazowej po amputacji koñczyny dolnej u 69-letniego mê czyzny cierpi¹cego na cukrzycê. o diagnostyki zastosowano szybk¹ metodê opart¹ o technikê PCR, która umo liwi³a wykrycie genów odpowiedzialnych za kodowanie toksyn produkowanych przez drobnoustroje z gatunku Clostridium perfringens. S³owa kluczowe: Clostridium perfringens, zgorzel gazowa, multipleks PCR Key words: Clostridium perfringens, gas gangrene, multiplex PCR WSTÊP Beztlenowe laseczki Clostridium perfringens stanowi¹ grupê drobnoustrojów powszechnie wystêpuj¹c¹ w glebie oraz przewodzie pokarmowym ludzi i zwierz¹t (,2). Clostridium perfringens typ A jest czynnikiem etiologicznym zgorzeli gazowej u ludzi i zwierz¹t oraz martwiczego zapalenia jelit i toksemii pochodzenia jelitowego u zwierz¹t, a produkowana przez niego toksyna alfa (a) o w³aœciwoœciach lecytynazy oraz hemolizyny odpowiada za chorobotwórczoœæ tego drobnoustroju. W wyniku zaka enia rany tym drobnoustrojem (lub jego sporami) dochodzi do zniszczenia tkanki, jej niedokrwienia i niedotlenienia. Okres od zaka enia rany laseczkami zgorzeli gazowej do wyst¹pienia pierwszych objawów, jakimi s¹ silny ból i obrzêk rany, waha siê od kilku do kilkudziesiêciu godzin. Natê- enie miejscowego bólu i póÿniejszych objawów zale y od tego, czy zaka eniu uleg³a tylko skóra i tkanka podskórna czy równie tkanka miêœniowa. Z rany s¹czy siê wydzielina o barwie od przezroczystej do krwistobrunatnej. Objawy towarzysz¹ce to silny i twardy obrzêk tkanek otaczaj¹cych ranê, bêd¹cy wynikiem wyniszczaj¹cego dzia³ania toksyny kappa (kolagenazy). W tkankach otaczaj¹cych ranê dochodzi ponadto do zakrzepów w drobnych naczyniach krwionoœnych. Przy uciskaniu zaka onej rany wyczuwa siê trzeszczenie banieczek gazu wytwarzanego przez C. perfringens. Po kilku godzinach od wyst¹-

2 Wojdat, K Kwiatek i inni 60 Nr 4 pienia pierwszych objawów obserwuje siê bardzo czêsto wysok¹ gor¹czkê, wymioty, bóle brzucha, krwist¹ biegunkê. Niniejsza praca jest opisem przypadku klinicznego zgorzeli gazowej u cz³owieka, od którego wyizolowano C. perfringens oraz okreœlono jego cechy fenotypowe i genotypowe. MATRIA I MTOY istoria choroby. Pacjent w wieku 69 lat, by³ leczony od kilku lat z powodu cukrzycy insulinozale nej. Martwica palców I i II stopy lewej z odczynem zapalnym po³owy œródstopia by³a wskazaniem do przeprowadzenia zabiegu amputacji koñczyny dolnej na wysokoœci stawu Choparta. Po piêciu miesi¹cach od amputacji pojawi³y siê nastêpuj¹ce objawy: ból, stany podgor¹czkowe, obrzêk w okolicy stawu skokowego siêgaj¹cy na podudzie. Zastosowana terapia antybiotykami, lekami przeciwbólowymi i poprawiaj¹cymi ukrwienie nie przynios³a poprawy, co zdecydowa³o o amputacji koñczyny na wysokoœci podudzia (makroskopowa granica stanu zapalnego). Po pocz¹tkowej poprawie stanu pacjenta, czwartego dnia zaobserwowano znaczne pogorszenie stanu amputowanej koñczyny, czemu towarzyszy³ obrzêk kikuta i stawu kolanowego oraz wyczuwalne trzeszczenia pod skór¹. W wyniku wstrz¹su septycznego pacjent zmar³. Materia³ do badañ stanowi³y wymazy pobrane z rany pooperacyjnej kikuta koñczyny dolnej i z kolana. Izolowanie i identyfikacja szczepów Clostridium perfringens. Pobrane wymazy z rany pooperacyjnej posiano do zregenerowanego (00 C 0 min.) bulionu Wrzoska. Po 24-godzinnej inkubacji w warunkach beztlenowych (AnaeroGen, Oxoid) w temperaturze 7 C próbki, próbówki w których stwierdzono zmêtnienie po ywki i obecnoœæ gazu w probówce urhama by³y przesiewane na po ywki agarowe: Willis-obbs a i na agar z krwi¹ barani¹. Posiewy inkubowano w warunkach beztlenowych i tlenowych (kontrola tlenowa) w temperaturze 7 C przez 24 h. Kolonie podejrzane o przynale noœæ do Clostridium perfringens (wywo³uj¹ce hemolizê na agarze z krwi¹ barani¹ i daj¹ce reakcjê Naglera na agarze Willis-obbs) by³y oczyszczane, a nastêpnie poddane testom biochemicznym (Rapid I 2 A, BioMérieux) oraz testowi na antybiotykowra liwoœæ (ATB ANA, BioMérieux). etekcjê genów koduj¹cych toksyny g³ówne i enterotoksynê przez wyizolowane szczepy Clostridium perfringens przeprowadzono z zastosowaniem reakcji multipleks PCR (). obrane odpowiednio primery umo liwia³y amplifikacjê genów: alfa (cpa), beta (cpb), beta2 (cpb2), epsilon (etx), jota (iap) oraz enterotoksyny (cpe), potencjalnie obecnych u badanych szczepów. Rozmiar otrzymanych produktów by³ porównywany z markerem O Gene Ruler 00bp NA (Fermentas). WYNIKI Na podstawie badania mikroskopowego wyizolowane szczepy zakwalifikowano do laseczek Gram-dodatnich. Badanie cech biochemicznych wyizolowanych szczepów potwierdzi³o ich przynale noœæ do gatunku Clostridium perfringens (tab. I). Badanie antybiotykowra liwoœci wykaza³o opornoœæ szczepów na oksycylinê oraz wra liwoœæ na penicylinê, amoksycylina+kwas klawulanowy, piperacylina+tazobactam, tikarcylina+kwas klawulanowy, cefoksitin, cefotetan, imipenemê, klindamycynê, chloramfenikol, amoksycylinê, amoksycylina+kwas klawulanowy, tikarcylinê i metronidazol. Przy u yciu techniki PCR

3 Zachorowanie na zgorzel gazow¹ Nr 4 6 Tabela I. Table I. Wyniki badañ cech biochemicznych wyizolowanych szczepów Clostridium perfringens Biochemical reactions results of Clostridium perfringens isolates X ] F ] S UV ( + %GQFFKLRFKPLF]Q ( 0 ),7, UJ UR K X U \ U \ 7 O O\ & & ) LV + U 6 amplifikowano gen o d³ugoœci 900 par zasad (cpa) odpowiedzialny za kodowanie toksyny alfa (CPA) u wyizolowanych szczepów, co pozwoli³o na zakwalifikowanie izolatów do typu A Clostridium perfringens, odpowiedzialnego za wywo³ywanie zgorzeli gazowej (ryc. ). W przeprowadzonej reakcji multipleks PCR nie otrzymano innych genów odpowiedzialnych za kodowanie pozosta³ych toksyn g³ównych i enterotoksyny u tego gatunku drobnoustrojów (beta cpb, beta2 cpb2, epsilon etx, iota iap, enterotoksyna cpe). 0 S S Ryc.. Fig.. Obraz elektroforetyczny produktów amplifikacji multipleks PCR wyizolowanych szczepów Clostridium perfringens. Œcie ka M O Gene Ruler 00 bp NA marker (Fermentas), œcie ki, 2,, 4,, 6 wyizolowane szczepy C. perfringens typ A; œcie ka 7 kontrola ujemna, œcie ka kontrola dodatnia Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR products of Clostridium perfringens. Lane M O Gene Ruler 00 bp NA marker (Fermentas), lanes, 2,, 4, and 6 C. perfringens isolates type A; lanes 7 negative control, lanes positive control

4 Wojdat, K Kwiatek i inni 62 Nr 4 POSUMOWANI Leczenie zgorzeli gazowej wymaga natychmiastowej interwencji chirurgicznej, polegaj¹cej na opracowaniu rany oraz parenteralnej terapii antybiotykowej (zalecane antybiotyki z grupy b-laktamowych) oraz leczeniu tlenem hiperbarycznym (4). Istnieje opinia, e po ka dym g³êbszym zranieniu nale y profilaktycznie podaæ antybiotyki. W opisywanym przypadku, w¹tpliwym wydaje siê fakt, eby Clostridium perfringens by³ pierwotnym czynnikiem zaka enia. Przebieg historii choroby wskazuje na wtórne zaka enie tym drobnoustrojem, co by³o notowane przez innych autorów (). odatkowym czynnikiem utrudniaj¹cym proces gojenia rany jest niew¹tpliwie cukrzyca, na któr¹ cierpia³ pacjent (6). Okreœlenie typu toksycznego w obrêbie gatunku Clostridium perfringens z zastosowaniem surowic diagnostycznych daje czêsto wyniki fa³szywie ujemne, czego powodem mo e byæ zmienna ekspresja genów koduj¹cych toksyny w warunkach in vivo i in vitro. Sytuacjê tê utrudnia fakt, e drobnoustrój produkuje enterotoksynê odpowiedzialn¹ za zatrucia pokarmowe (w iloœci pozwalaj¹cej na wykrycie) w trakcie sporulacji, do której wymaga specyficznych warunków, co z kolei poddaje w w¹tpliwoœæ stosowanie próby biologicznej w celu okreœlenia chorobotwórczoœci Clostridium perfringens. Metody biologii molekularnej pozwalaj¹ na stwierdzenie obecnoœci genów koduj¹cych poszczególne toksyny przez badany szczep Clostridium perfringens. Zastosowana metoda umo liwia jednoczesn¹ amplifikacjê potencjalnie obecnych genów koduj¹cych toksyny g³ówne (alfa, beta, beta2, epsilon, iota) i enterotoksynê w trakcie jednej reakcji, co znacz¹co skraca czas identyfikacji poszczególnych typów toksycznych Clostridium perfringens. Jednoczeœnie metoda ta jest wiarygodna i czu³a, co sprawia e mo e byæ stosowana do rutynowej diagnostyki przypadków, gdzie C. perfringens jest brany pod uwagê wœród czynników etiologicznych. Wojdat, K Kwiatek, Zdrojewski, L Krupa GAS GANGRN CAS IAGNOSIS SUMMARY Anaerobic spore-forming bacteria from species Clostridium perfringens is commonly present in soil and in the intestines of men and animals. Clostridium perfringens type A are responsible for gas gangrene men and animals. This paper describes gas gangrene case after limb amputation at 69-year-old man, treated for diabetes since several years. Used multiplex PCR generated amplification product 900 bp size (cpa) responsible for coding alpha toxin (CPA) present at Clostridium perfringens type A. PIŒMINNICTWO. Augustynowicz. Molekularne podstawy patogennego dzia³ania Clostridium perfringens. Post Mikrobiol 999;: Lorea P, Beaten Y, Chahidi N, i in. A severe complication of muscle transfer: clostridial myonecrosis. Annales de chirurgie plastique esthétique 2004; 49:2-.

5 Zachorowanie na zgorzel gazow¹ Nr 4 6. Baums C G. iagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates. Vet Microbiol 2004;00: Fielden P M, Martinovic, lls A L. yperbaric oxygen therapy in the treatment of orbital gas gangrene. J American Association for Pediatric Ophthalmology and Strabismus 2002;6: Finkelstein B, Kamble R, Ferdinando, i in. Autoamputation of the foot caused by untreated gas gangrene: A case report. J Foot & Ankle Surgery 200;6: Gliemroth J, eise S, Missler U. A 69-year-old man with diabetes and ascending paraplegia. Lancet 996;74:6. Otrzymano: r. Adres autorów: lek. wet. l bieta Wojdat Zak³ad igieny Œrodków ywienia Zwierz¹t, Pañstwowy Instytut Weterynaryjny Pañstwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 7, Pu³awy tel. () elawoj@piwet.pulawy.pl