Kontrolowany rozród jazia - poradnik hodowcy. Autor: Sławomir Krejszeff. Recenzenci: Mirosław Cieśla Dariusz Kucharczyk

Transkrypt

1

2 Kontrolowany rozród jazia - poradnik hodowcy Autor: Sławomir Krejszeff Recenzenci: Mirosław Cieśla Dariusz Kucharczyk Projekt okładki: Szymon Czarnowski Roman Kujawa Fotografie: Roman Kujawa Sławomir Krejszeff Daniel Żarski Adam Karbowiak ISBN: Pozycja powstała w ramach projektu Innowacje w akwakulturze ryb ze szczególnym uwzględnieniem biotechniki rozrodu ryb Program Operacyjny RYBY (OR OR /09/10/11). Skład: Sławomir Karetko Druk i oprawa: Białystok, ul. Zwycięstwa 10 tel biuro@partnerpoligrafia.pl

3 Spis treści Wstęp...4 Pozyskiwanie i transport tarlaków...6 Warunki przetrzymywania tarlaków...8 Anestezja...10 Preparaty hormonalne...12 Ocena stadium dojrzałości oocytów...14 Stymulacja spermacji...16 Stymulacja owulacji...18 Pozyskiwanie gamet...20 Zapłodnienie i pozbawianie jaj kleistości...22 Inkubacja jaj i klucie zarodków...24 Warunki inkubacji jaj...26 Notatki...28 Literatura...30 Receptury

4 Wstęp Rys. 1. Jaź (Leuciscus idus) Jaź w Polsce był jednym z pierwszych gatunków karpiowatych ryb reofilnych, który stał się obiektem zainteresowania naukowców zajmujących się akwakulturą. Do dziś opracowanych zostało wiele metod stymulacji finalnego dojrzewania oocytów i spermacji. Poznany został przebieg rozwoju embrionalnego i larwalnego. Opracowano również efektywne metody wychowu materiału zarybieniowego, nie tylko w warunkach hodowli stawowej, lecz także w recyrkulowanych systemach akwakulturowych. Uzyskana wiedza została przeniesiona na inne karpiowate ryby reofilne, znacznie przyczyniając się do ochrony dziko żyjących populacji zagrożonych gatunków. Wiedza ta została również przekazana praktykom, którzy z powodzeniem zajmują się hodowlą tego gatunku. Przyczyniło się to do wzrostu rentowności gospodarstw rybackich i pozwoliło na prowa- 4

5 dzenie intensywnych zarybień, przez co możliwe było utrzymanie liczebności dziko żyjących populacji tego gatunku na właściwym poziomie. Kontrolowany rozród ryb jest zabiegiem zootechnicznym, dzięki któremu doprowadza się do uzyskania potomstwa w warunkach sztucznych. Realizacja tego przedsięwzięcia wymaga wykonania szeregu czynności, które należy uznać za części składowe szeroko pojętego kontrolowanego rozrodu ryb. Cały proces rozpoczyna się od pozyskania tarlaków. Następnie ryby są transportowane do wylęgarni, w której muszą być przetrzymywane w warunkach sztucznych, najlepiej w recyrkulowanych systemach akwakulturowych, umożliwiających zapewnienie optymalnych warunków środowiskowych. Aby wywołać spermację i owulację, ryby należy poddać stymulacji fototermalnej i hormonalnej. Uzyskane jaja należy zapłodnić, pozbawić kleistości, a następnie przeprowadzić ich inkubację. Wszystkie zabiegi na tarlakach należy przeprowadzać, nie narażając ich na uszczerbek na zdrowiu, co jest możliwe wyłącznie w stanie znieczulenia ogólnego. Niniejszy poradnik jest zbiorem szeregu szczegółowych procedur, które należy wykonać w trakcie kontrolowanego rozrodu jazia. Są one efektem kilkuletnich badań, doświadczeń i wiedzy zdobytej przez autora i jego współpracowników, w tym również podczas realizacji projektu Innowacje w akwakulturze ryb ze szczególnym uwzględnieniem biotechniki rozrodu ryb (akronim: InnovaFish) współfinansowanego przez Unię Europejską. Przedstawione procedury należy traktować jako propozycje, które można modyfikować, dostosowując je do specyfiki konkretnego gospodarstwa rybackiego. Pomocna w tym zakresie powinna być wiedza zdobyta przez innych badaczy. Dlatego gorąco zachęcam do zapoznania się z wiedzą zawartą w publikacjach naukowych przedstawionych w ostatnim rozdziale. 5

6 Pozyskiwanie i transport tarlaków Tarlaki jazia można pozyskiwać z dwóch źródeł, tj. wód otwartych i hodowli stawowych typu karpiowego. Odłów tarlaków ze środowiska naturalnego można prowadzić od drugiej połowy marca do początku kwietnia. W przypadku hodowli stawowych zaleca się pozyskiwać tarlaki również wczesną wiosną. Najlepiej, gdy średnia dobowa temperatura wody osiągnie 9,0-11,0 C. W dni słoneczne należy ją mierzyć około godziny lub około godziny 23.00, natomiast w dni pochmurne rano godzinę później (Guziur 11). Jako fenologiczny wskaźnik tarła jazia można traktować początek kwitnienia knieci błotnej, pełnię kwitnienia podbiału oraz pojawienie się liści u olchy (Witkowski i in. 17). Liczba tarlaków jazia, jaką można bezpiecznie transportować, zależy głównie od temperatury wody i czasu trwania transportu. Zbiorniki do przewozu powinny być wykonane z materiałów niewywierających szkodliwego wpływu na żywe ryby. Tarlaki należy umieszczać w zbiornikach do ½ wypełnionych wodą. Po załadunku zbiorniki transportowe należy uzupełnić do ¾ pojemności. W zależności od rodzaju zastosowanej metody transportu dobiera się masę ryb w przeliczeniu na jednostkę objętości wody lub ilość wody na jednostkę masy ryb. Masa ryb lub objętość wykorzystanej wody zależy również od tego, czy woda jest napowietrzana lub natleniana (tabela 1, 2 i 3). Tarlaki przeznaczone do transportu muszą być odpite. Przewóz powinien nastąpić bezpośrednio po załadunku. W przypadku stwierdzenia oznak osłabienia ryb należy przeprowadzić wymianę połowy objętości wody, równocześnie spuszczając dotychczasową i dolewając świeżą. Gdy różnica temperatur wody podczas rozładunku pomiędzy zbiornikiem przewozowym a zbiornikiem zarybianym wynosi więcej niż 2,0 C, należy ją stopniowo wyrównywać (BN-74/ ). 6

7 Tabela 1. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg tarlaków jazia przy przewozie w zbiornikach bez napowietrzania (wg BN-74/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] do 4 do do 6 8,0 12,0 18, ,0 15,0 20, ,0 18,0 24,0 Tabela 2. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg tarlaków jazia przy przewozie w zbiornikach z napowietrzaniem (wg BN-74/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] do 4 do do 6 4,0 5,0 7, ,0 6,0 8, ,0 7,0 9,0 Tabela 3. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg tarlaków jazia przy przewozie w rękawach foliowych wypełnionych wodą i tlenem w stosunku 1:1 (wg BN-74/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] do 4 do do 6 2,0 2,5 3, ,5 3,0 4, ,0 3,5 4,5 7

8 Warunki przetrzymywania tarlaków Do przetrzymywania tarlaków jazia należy stosować recyrkulowane systemy akwakulturowe (tzw. obiegi tarlakowe) pracujące w częściowo otwartym obiegu wody. Każdy taki system składa się z min. 2 basenów tarlakowych o pojemności min. 0,6 m 3, górnego zbiornika retencyjnego o pojemności min. 1,0 m 3 oraz dolnego zbiornika retencyjnego o pojemności min. 0,6 m 3. Woda zasilająca każdy taki system doprowadzana jest do górnego zbiornika retencyjnego. Zgromadzona w górnym zbiorniku retencyjnym woda grawitacyjnie zasila baseny tarlakowe. Woda odpływająca z basenów tarlakowych magazynowania jest w dolnym zbiorniku retencyjnym, skąd podawana jest za pomocą pompy do górnego zbiornika retencyjnego, przepływając przez filtr zewnętrzny i sterylizator UV. Nadmiar wody z dolnego i górnego zbiornika retencyjnego oprowadzany jest za pomocą odpływu wody z systemu oraz przelewu awaryjnego. Górny zbiornik retencyjny wyposażony jest w termoregulator i wymiennik ciepła. Baseny tarlakowe wyposażone są w urządzenia napowietrzające/natleniające. Termoregulator powinien zapewnić regulację temperatury wody w zakresie przynajmniej od 5,0 do 25,0 C z dokładnością do ± 0,1 C. Urządzenia napowietrzające/natleniające powinny zapewnić stałe natlenienie wody na poziomie min. 80,0%. System wyposażony jest również w oświetlenie sterowane zegarem. Wyposażenie pomocnicze systemu stanowi stół manipulacyjny, kasar oraz min. dwie kastry (o pojemności litrów) służące jako zbiornik do anestezji oraz odpijalnik. Po przetransportowaniu na wylęgarnię tarlaki jazia powinno się przetrzymywać w tym samym obiegu tarlakowym w temperaturze 10,0 C. Po rozpoznaniu płci i rozpoczęciu stymulacji hormonalnej samce i samice należy przetrzymywać w oddzielnych obiegach tarlakowych. Każdy basen tarlakowy powinien być oświetlony przez 12 godzin na dobę. 8

9 Rys. 2. Uproszczony schemat recyrkulowanego systemu akwakulturowego służącego do krótkookresowego przetrzymywania tarlaków jazia (wg Żarski, Krejszeff 2011, zmodyfikowany): 1 dopływ wody do systemu; 2 zasilanie w wodę basenów tarlakowych; 3 odpływ wody z basenów tarlakowych; 4 filtr zewnętrzny; 5 sterylizator UV; 6 przelew awaryjny; 7 odpływ wody z systemu; 8 termoregulator; 9 grzałka lub inny wymiennik ciepła; 10 butla z tlenem; 11 rozpylacze (dyfuzory) gazów; 12 oświetlenie; 13 baseny tarlakowe; 14 górny zbiornik retencyjny; 15 dolny zbiornik retencyjny; 16 stelaż Rys. 3. Obieg tarlakowy będący na wyposażeniu Centrum Akwakultury i Inżynierii Ekologicznej w Olsztynie 9

10 Anestezja Każdą manipulację na tarlakach jazia, tj. pobieranie próbek oocytów za pomocą katetera, określanie masy ciała, przeprowadzanie iniekcji hormonalnych, pozyskiwanie gamet itp., należy prowadzić po uprzednim wprowadzeniu ryb w stan znieczulenia ogólnego. Anestetyk najlepiej jest podawać drogą oddechową przez imersję (w kąpieli). W tym celu rybę należy umieścić w wodzie z rozpuszczonym preparatem i przetrzymać do czasu osiągnięcia znieczulenia ogólnego. Podczas wprowadzania tarlaków jazia w stan znieczulenia ogólnego należy zastosować stężenie anestetyku pozwalające maksymalnie skrócić czas upływający od momentu umieszczenia ryb w roztworze do momentu osiągnięcia znieczulenia ogólnego, tym samym skracając okres, w którego trakcie ryby mogą się zranić podczas szamotania. Czas ten nie może być jednak zbyt krótki, gdyż zbyt wysokie stężenie anestetyku może doprowadzić do zatrzymania ruchów oddechowych i śnięcia ryb. Skuteczne stężenie anestetyku będzie zależeć między innymi od kondycji i rozmiaru ryb oraz temperatury wody. Wprowadzenie w stan znieczulenia ogólnego osobników większych będzie wymagało przeprowadzenia kąpieli w roztworze o wyższym stężeniu. Wzrost temperatury wody będzie skutkował koniecznością zmniejszenia dawki, ponieważ zwiększy wrażliwość ryb na anestetyk. Dobór stężenia anestetyku należy oprzeć na wytycznych, według których efektywne stężenie to takie, w którym w stan znieczulenia ogólnego tarlaki są wprowadzane w czasie do 3 minut oraz wybudzają się z niego po 15-minutowej ekspozycji, w czasie nie 10

11 dłuższym niż 10 minut. Dodatkowym kryterium jest brak śmiertelności wywołanej przeprowadzoną manipulacją (Gilderhus 10). Obecnie brak jest w Polsce preparatów znieczulających zarejestrowanych jako produkty lecznicze do stosowana u ryb. W takiej sytuacji polskie prawo zezwala na stosowanie preparatu leczniczego dopuszczonego do obrotu w innych państwach członkowskich Unii Europejskiej (Gomułka 2008). Takim preparatem jest np. Finquel, który produkuje się na bazie estru metylosulfonowego kwasu 3-aminobenzoesowego (MS-222, TMS). W przypadku jazia należy go stosować w stężeniu 0,10-0,15 g substancji czynnej na 1 l wody. Jednorazowo należy usypiać po 3-5 osobników. Po przeprowadzeniu manipulacji tarlaki należy umieścić w odpijalniku i dopiero gdy się wybudzą, przenieść je z powrotem do basenu tarlakowego. Rys. 4. Tarlaki jazia w trakcie zabiegów manipulacyjnych (usypiania, ważenia, znakowania i pobierania ikry) 11

12 Preparaty hormonalne Pierwsze próby hormonalnej stymulacji rozrodu jazia podjęto, stosując homogenaty przysadek mózgowych karpia (Witkowski i in. 17). Pomimo wielu wad, spośród których największą jest brak możliwości standaryzacji ilości zawartych gonadotropin, terapie hormonalne przy ich zastosowaniu cechowały się wysoką skutecznością. Wraz z rozwojem biotechniki kontrolowanego rozrodu ryb przysadki mózgowe zaczęto zastępować ssaczymi lub łososiowymi analogami gonadoliberyn (GnRHa) w połączeniu z antagonistami dopaminy, podejmując tym samym pierwsze próby stworzenia wystandaryzowanych preparatów. Tak jak w przypadku preparatów znieczulających, brak jest w Polsce preparatów hormonalnych zarejestrowanych jako produkty lecznicze do stosowana u ryb. Niestety, takie same regulacje występują również w pozostałych państwach członkowskich Unii Europejskiej. W takiej sytuacji polskie prawo dopuszcza do stosowania w rozrodzie ryb preparaty zarejestrowane jako produkty lecznicze do stosowana u innych zwierząt lub u ludzi (Gomułka 2008). Brak preparatu hormonalnego zarejestrowanego jako produkt leczniczy do stosowana u ryb będzie zmuszał hodowców do sięgnięcia po preparaty zarejestrowane jako produkty lecznicze do stosowana u innych zwierząt lub u ludzi aż do momentu, gdy któryś z testowanych obecnie preparatów hormonalnych zostanie zarejestrowany jako produkt leczniczy do stosowania u ryb na terenie któregoś z państw członkowskich Unii Europejskiej (np. Ovopel). Możliwe jest również dopuszczenie do sprzedaży preparatów zarejestrowanych poza Unią Europejską (np. Ovaprimu). Do sporządzania zawiesin lub roztworów z produktów leczniczych do stosowana u innych zwierząt lub u ludzi najlepiej jest 12

13 użyć płynu fizjologicznego (0,9% roztworu NaCl). Przy ich przygotowywaniu duże znaczenie ma zachowanie odpowiednich proporcji pomiędzy objętością rozcieńczalnika a ilością aktywnego składnika. Ze względów praktycznych przygotowane do iniekcji zawiesiny i roztwory powinny w 1 ml zawierać ilość aktywnego składnika przeznaczoną do podania w przeliczeniu na 1 kg masy ciała tarlaka. W przypadku samców jazia przygotowane zawiesiny i roztwory lub gotowe preparaty należy podawać w jednej iniekcji, a w przypadku samic należy je podawać w dwóch iniekcjach: wstępnej i wywołującej. Obie iniekcje powinny różnić się ilością podanego aktywnego składnika. Zaleca się, żeby jego ilość w pierwszej iniekcji nie przekraczała 10-20% ilości podanej w drugiej iniekcji. Odstęp czasu pomiędzy obiema iniekcjami powinien wynosić od 12 do 24 godzin. Niemałe znaczenie w rozrodzie jazia ma również stymulacja finalnego dojrzewania oocytów i spermacji warunkami środowiskowymi. Wymagane jest oświetlenie basenów tarlakowych przez 12 godzin na dobę oraz postępujący w tym czasie wzrost temperatury wody. Dlatego w przypadku samców po wykonaniu iniekcji zaleca się podniesienie temperatury wody z 10,0 do 12,0 C. W przypadku samic po wykonaniu pierwszej iniekcji zaleca się podniesienie temperatury wody z 10,0 do 12,0 C, a po wykonaniu drugiej iniekcji z 12,0 do 14,0 C. Zmian temperatury wody należy dokonywać w tempie nie większym niż 1 C na godzinę. Skuteczność zastosowanej terapii hormonalnej w znacznej mierze zależy od prawidłowej oceny stopnia dojrzałości oocytów. Niemałe znaczenie ma również kondycja i stan zdrowotny ryb, dlatego przeznaczone do rozrodu ryby powinny zostać poddane wstępnej selekcji. 13

14 Ocena stadium dojrzałości oocytów Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk i zbiornik do anestezji kateter CH06 strzykawka płyn Serra szalki Petriego mikroskop stereoskopowy odpijalnik Uwagi Stymulację finalnego dojrzewania oocytów należy prowadzić w temperaturze 10,0 C i 12-godzinnym oświetleniu basenów tarlakowych. Hormonalnej stymulacji należy poddawać samice, których oocyty znajdują się w 2/3-3. stadium dojrzałości. Przygotować roztwór anestetyku i odpijalnik. Samicę wyłowić z basenu tarlakowego i wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Do otworu płciowego wprowadzić podłączony do strzykawki kateter na głębokość nie większą niż położenie nasady płetwy brzusznej. Odciągnąć tłoczek strzykawki i zassać próbkę oocytów (około 50 szt.). Samicę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu tarlakowego. Oocyty umieścić na szalce Petriego i zalać płynem Serra. Po około 2-3 minutach każdą próbkę umieścić pod mikroskopem stereoskopowym w celu określenia stadium dojrzałości. Samice, których oocyty znajdują się w 2/3-3. stadium dojrzałości, należy poddać procedurze hormonalnej stymulacji. Samice, których oocyty znajdują się w 1-2. stadium dojrzałości, należy poddać fototermalnej stymulacji finalnego dojrzewania oocytów. Kolejnych przeglądów należy dokonywać w 3-dniowych odstępach. Stymulację finalnego dojrzewania oocytów prowadzić w temperaturze 10,0 C i 12-godzinnym (w ciągu doby) oświetleniu basenów tarlakowych. 14

15 Rys. 5. Pobór i ocena stadium dojrzałości oocytów Stadia dojrzałości oocytów a stadium 1: jądro w centrum oocytu b stadium 2: jądro przesunięte, ale nie za połowę promienia oocytu c stadium 3: jądro przesunięte za połowę promienia oocytu d stadium 4: jądro przesunięte bezpośrednio do zona radiata Rys. 6. Czterostopniowa skala stadiów dojrzałości oocytów (wg Brzuska, Bieniarz 1977) 15

16 Stymulacja spermacji Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk i zbiornik do anestezji waga igły 0,7 x 40 mm strzykawki o pojemności 2 ml preparat hormonalny homogenizator lub moździerz odpijalnik Uwagi Hormonalną stymulację samców należy przeprowadzić od 60 do 84 godzin przed spodziewaną owulacją samic. Podczas hormonalnej stymulacji spermacji temperatura wody w obiegu tarlakowym powinna wynosić 12 C, a baseny tarlakowe powinny być oświetlone przez 12 godzin na dobę. Procedurę hormonalnej stymulacji spermacji rozpocząć od 60 do 84 godzin przed spodziewaną owulacją samic. Przygotować preparat hormonalny. Przygotować roztwór anestetyku. Przygotować odpijalnik. Samca wyłowić z basenu tarlakowego i wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Określić masę ryby z dokładnością do 10 g. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Przeprowadzić dootrzewnowo iniekcję pod nasadę płetwy brzusznej. Samca umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu tarlakowego. Temperaturę wody w obiegu tarlakowym podnieść z 10,0 do 12,0 C. Zmian temperatury wody należy dokonywać w tempie nie większym niż 1 C na godzinę. Przez cały okres hormonalnej stymulacji spermacji temperatura wody w obiegu tarlakowym powinna wynosić 12,0 C, a baseny tarlakowe powinny być oświetlone przez 12 godzin na dobę. 16

17 Tabela 4. Zalecane warianty hormonalnej stymulacji spermacji u jazia 1 2 Wariant stymulacji hormonalnej Dawka mgnrha 20 µg kg -1 metoklopramid 10 mg kg -1 sgnrha 10 µg kg -1 domperidon 5 mg kg -1 Optymalny czas pozyskania nasienia (po iniekcji) h mgnrha ssaczy analog gonadoliberny (GnRH) [(D-Ala6, Pro9-Net)-mGnRH sgnrha łososiowy analog gonadoliberyny (GnRH) [(D-Arg6, Pro9-Net) sgnrh] Rys. 7. Przygotowywanie preparatów hormonalnych do iniekcji 17

18 Stymulacja owulacji Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk i zbiornik do anestezji waga igły 0,7 x 40 mm strzykawki o pojemności 2 ml preparat hormonalny homogenizator lub moździerz odpijalnik Uwagi Hormonalną stymulację owulacji jazia należy przeprowadzić dwukrotnie. Odstęp czasu pomiędzy iniekcjami powinien wynosić od 12 do 24 godzin. Temperaturę wody po I iniekcji należy podnieść do 12,0 C, a po II - do 14,0 C. Przygotować preparat hormonalny, roztwór anestetyku i odpijalnik. Samicę wyłowić z basenu tarlakowego i wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Określić masę ryby z dokładnością do 10 g. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Przeprowadzić dootrzewnowo pod nasadę płetwy brzusznej I iniekcję. Samicę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu tarlakowego. Temperaturę wody w obiegu tarlakowym podnieść z 10,0 do 12,0 C. Po godzinach od I iniekcji samicę ponownie wyłowić z basenu tarlakowego i wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Określić masę ryby z dokładnością do 10 g. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Przeprowadzić dootrzewnowo pod nasadę płetwy brzusznej II iniekcję. Samicę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu tarlakowego. Temperaturę wody w obiegu tarlakowym podnieść z 12,0 do 14,0 C. Zmian temperatury wody należy dokonywać w tempie nie większym niż 1 C na godzinę. Przez cały okres hormonalnej stymulacji owulacji baseny tarlakowe powinny być oświetlone 12 godzin na dobę. 18

19 Tabela 5. Zalecane warianty hormonalnej stymulacji owulacji u jazia Wariant stymulacji hormonalnej I iniekcja Dawka II iniekcja Spodziewany czas owulacji 1 2 mgnrha 4 µg 20 µg metoklopramid 2 mg 10 mg sgnrha 2 µg 10 µg domperidon 1 mg 5 mg h mgnrha ssaczy analog gonadoliberny (GnRH) [(D-Ala6, Pro9-Net)-mGnRH sgnrha łososiowy analog gonadoliberyny (GnRH) [(D-Arg6, Pro9-Net) sgnrh] Rys. 8. Hormonalna stymulacja samicy jazia 19

20 Pozyskiwanie gamet Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk i zbiornik do anestezji ręczniki tetrowe strzykawki o pojemności 2 ml szczelnie zamykany pojemnik odpijalnik Uwagi Nasienie należy przetrzymywać w lodówce w temperaturze 4 C nie dłużej niż 10 godzin. Ikrę przetrzymywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 10 C nie dłużej niż 10 godzin. Przygotować roztwór anestetyku. Przygotować odpijalnik. Po godzinach od iniekcji wyłowić samca z basenu tarlakowego i wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Osuszyć powłoki brzuszne i pozyskać nasienie do strzykawki. Pozyskane nasienie umieścić w lodówce i przetrzymywać w temperaturze 4,0 C nie dłużej niż 10 godzin (w strzykawce lub probówce Eppendorfa). Samca umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu tarlakowego. Po 36 godzinach od II iniekcji samicę wyłowić z basenu tarlakowego i wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Osuszyć powłoki brzuszne. Ikrę pozyskać do suchego pojemnika i pozostawić pod szczelnym przykryciem nie dłużej niż 10 godzin, w temperaturze 10,0 C. Samicę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu tarlakowego. 20

21 Rys. 9. Pozyskiwanie i krótkoterminowe przetrzymywanie nasienia Rys. 10. Pozyskiwanie i krótkoterminowe przetrzymywanie jaj 21

22 Zapłodnienie i pozbawianie jaj kleistości Wymagane odczynniki i akcesoria plastikowe łyżki plastikowa miska woda wylęgarnicza płyn Woynarovicha roztwór taniny aparaty wylęgarnicze Uwagi Do zapłodnienia należy użyć nasienia stanowiącego mieszaninę nasienia pozyskanego od minimum 3 samców. Ze względów praktycznych płyn Woynarovicha oraz roztwór taniny powinno się sporządzać w przeliczeniu na 10 l wody. Sporządzić płyn Woynarovicha. Sporządzić roztwór taniny. Odważoną porcję ikry zmieszać z odmierzoną porcją nasienia. Na każde 100 g ikry dodać 1 ml nasienia stanowiącego mieszaninę nasienia pozyskanego od minimum 3 samców. Do zmieszanych gamet dodać niewielką ilość wody wylęgarniczej (z obiegu wylęgarniczego) i przeprowadzić zapłodnienie. W trakcie zapłodnienia ikrę intensywnie mieszać plastikową łyżką przez mniej więcej 1 minutę. Po przeprowadzeniu zapłodnienia zastosować kąpiel zapłodnionych jaj w roztworze Woynarovicha. Do zapłodnionych jaj dodać roztwór w ilości około 10-20% objętości jaj i nieprzerwanie mieszać plastikową łyżką. W kilku-kilkunastominutowych interwałach dodawać kolejne porcje płynu, równocześnie pozbywając się części roztworu. Po mniej więcej 1,0-1,5 godzinie należy zlać roztwór i przeprowadzić dwukrotną kąpiel jaj (2 x 15 s) w roztworze taniny o stężeniu 5,0-8,0 g/l, przepłukując je między kąpielami czystą wodą. Po przepłukaniu w czystej wodzie obsadzić jaja na aparacie wylęgarniczym. 22

23 Rys. 11. Przygotowywanie płynu Woynarovicha i roztworu taniny Rys. 12. Zapłodnienie, pozbawianie kleistości i obsadzanie jaj na aparacie wylęgarniczym 23

24 Inkubacja jaj i klucie zarodków Wymagane odczynniki i akcesoria lewar gumowy wężyk o średnicy min. 10 mm zakończony szklaną rurką szalka Petriego miska basen odbieralnikowy Uwagi Inkubację jaj jazia należy prowadzić w temperaturze 15,0-16,0 C. Przed przystąpieniem do masowego klucia zarodków należy przeprowadzić test klucia na szalce Petriego. Inkubację jaj jazia należy prowadzić w temperaturze 15,0-16,0 C. W celu przyśpieszenia klucia zarodków należy podnieść temperaturę wody o kilka stopni, jednak nie wyżej niż 23,0 C. W celu opóźnienia klucia należy obniżyć temperaturę wody o kilka stopni, jednak nie niżej niż do 9,5 C. Oszacowania czasu trwania inkubacji dokonać przy pomocy danych zestawionych na rys. 13. W dniu przewidywanego momentu wyklucia należy pobrać około 50 jaj, umieścić na szalce Petriego i odstawić na mniej więcej 30 minut. Jeśli liczba wyklutych larw na szalce będzie większa niż 50%, należy rozpocząć masowe klucie, jeśli mniejsza odczekać min. 12 godzin. Gdy rozpoznanie gotowości larw do klucia będzie pozytywne, należy zamknąć dopływ wody do aparatu inkubacyjnego. Po 30 minutach od zamknięcia dopływu zlewarować ikrę do miski, którą następnie należy w całości wypełnić wodą. Zawartość miski delikatnie zamieszać, tak aby ikra wraz z wyklutymi larwami zebrały się w centrum miski. Zlać osłonki poza miskę, uważając, żeby nie usuwać wyklutych larw. Czynność powtarzać do momentu, gdy na dnie miski pozostanie czysty wylęg. Wyklute larwy umieścić w basenie odbieralnikowym. 24

25 Rys. 13. Zależność pomiędzy temperaturą wody a przebiegiem inkubacji ikry jazia (wg Kupren i in. 2008b, zmodyfikowane) Rys. 14. Inkubacja jaj i klucie zarodków jazia 25

26 Warunki inkubacji jaj Inkubację jaj jazia należy prowadzić w systemach akwakulturowych (tzw. obiegach wylęgarniczych) pracujących w częściowo otwartym obiegu wody, wyposażonych w aparaty inkubacyjne typu Weissa (lub inne o pionowym, odwróconym przepływie wody). Każdy tego typu system składa się z górnego zbiornika retencyjnego, dolnego zbiornika retencyjnego, zestawu aparatów inkubacyjnych oraz odbieralnika. Woda zasilająca każdy taki system doprowadzana jest do górnego zbiornika retencyjnego. Zgromadzona w górnym zbiorniku retencyjnym woda grawitacyjnie zasila aparaty inkubacyjne. Każdy aparat inkubacyjny zaopatrzony jest w zawór pozwalający na płynną regulację ilości przepływającej przez niego wody. Woda odpływająca z aparatów inkubacyjnych przepływa przez odbieralnik oraz filtr mechaniczny i jest retencjonowana w dolnym zbiorniku retencyjnym. Woda zgromadzona w dolnym zbiorniku retencyjnym podawana jest za pomocą pompy do górnego zbiornika retencyjnego, przepływając przez filtr zewnętrzny i sterylizator UV. Nadmiar wody z dolnego i górnego zbiornika retencyjnego oprowadzany jest za pomocą odpływu wody z systemu oraz przelewu awaryjnego. Górny zbiornik retencyjny wyposażony jest w termoregulator, wymiennik ciepła i urządzenie napowietrzające/natleniające. Termoregulator powinien zapewnić regulację temperatury wody w zakresie przynajmniej od 5,0 do 25,0 C z dokładnością do ± 0,1 C. Urządzenie napowietrzające/natleniające powinno zapewnić stałe natlenienie wody na poziomie min. 80,0%. System wyposażony jest również w oświetlenie sterowane zegarem. Wyposażenie pomocnicze systemu stanowią stół manipulacyjny, miski do klucia larw, kasarki obszyte tiulem lub gazą młyńską oraz gumowe węże zakończone szklanymi rurkami służące do lewarowania jaj. 26

27 Rys. 15. Uproszczony schemat recyrkulowanego systemu akwakulturowego do inkubacji jaj (wg Żarski, Krejszeff 2011, zmodyfikowany): 1 dopływ wody do systemu; 2 zasilanie w wodę aparatów inkubacyjnych; 3 aparaty inkubacyjne; 4 odpływ wody z odbieralnika larw; 5 filtr mechaniczny; 6 filtr zewnętrzny; 7 sterylizator UV; 8 przelew awaryjny; 9 odpływ wody z systemu; 10 termoregulator; 11 grzałka lub inny wymiennik ciepła; 12 oświetlenie; 13 odbieralnik larw; 14 górny zbiornik retencyjny; 15 dolny zbiornik retencyjny; 16 stelaż Rys. 16. Obieg wylęgarniczy będący na wyposażeniu Centrum Akwakultury i Inżynierii Ekologicznej w Olsztynie 27

28 Notatki.. 28

29 29

30 Literatura Bavister B.D A consistently successful procedure for in vitro fertilization of golden hamster eggs. Gamete Res. 23: Berka R The transport of live fish. A review. FAO, Rome. Bieniarz K., Epler P. 11. Rozród ryb. Lettra, Kraków. Billard R., Gatty J.L., Hollebecq M.G., Marcel J., Saad A Biology of gametes, eggs and embryos. Str W: Aquaculture of Cyprinids. Billard R., Marcel J. (red.), INRA, Paryż. Brooks S., Tyler C.R., Sumptem J.P. (17): Egg quality in fish: what makes a good egg? Rev Fish Biol Fisher, 7: Brzuska E., Bieniarz K Metoda przyżyciowego określania dojrzałości płciowej samic karpia w związku z iniekcjami homogenatu przysadki mózgowej karpia. IRŚ, Olsztyn. Brzuska E The in vivo method of estimating the stages of oocytes maturation in carp Cyprinus carpio L. Acta Hydrobipl. 21: Cejko B.I., Kowalski R.K., Kucharczyk D., Targońska K., Krejszeff S., Żarski D., Glogowski J Influence of the length of time after hormonal stimulation on selected parameters of milt of ide Leuciscus idus L. Aquacult. Res. 41: Cejko B.I., Kucharczyk D., Targońska K., Żarski D., Sarosiek B., Kowalski R.K., Glogowski J Influence of temperature on the effectiveness of the hormonal stimulation of male ide, Leuciscus idus (L.). Arch. Pol. Fish. 18: Cejko B.I., Kowalski R.K., Targońska K., Żarski D., Kucharczyk D., Glogowski J Str W: Effect of antioxidants on the ide (Leuciscus idus) milt short term storage. W: Mediterranean Aquaculture Aquaculture Europe the annual meeting of the European Aquaculture Society, October 2011, Rhodos, Greece. Cieśla M., Ostaszewska T. 17. Optymalizacja dawki przysadki mózgowej karpia do sztucznego rozrodu samic jazia (Leuciscus idus L.). Rocz. Nauk. PZW 10: Cieśla M., Wojda R., Śliwiński J. 17. Wyniki sztucznego tarła jazi (Leuciscus idus L.), pochodzących z wód otwartych, wychowanych w stawach karpiowych. Rocz. Nauk. PZW 10:

31 Coward K., Bromage N.R., Hibbitt O., Parrington J Gamete physiology, fertilization and egg activation in teleost Fish. Rev. Fish Biol. Fisheries 12: Froese R Relationships between body weight and loading densities in fish transport using the plastic bag method. Aquacult. Res. 19: Gilderhus P.A. 10. Benzocaine as fish anesthetic: efficacy and safety for spawning-phase salmon. Prog. Fish-Cult. 52: Gilderhus P.A., Marking L.L Comparative efficacy of 16 anesthetic chemicals on rainbow trout. N. Am. J. Aquacult. 7: Gomułka P Anestetyki w hodowli ryb jesiotrowatych. Str W: Demska-Zakęś K. (red.) Innowacyjne techniki oceny biologicznej i ochrony cennych gatunków ryb hodowlanych i raków. IRS, Olsztyn. Guziur J. 11. Rybactwo w małych zbiornikach śródlądowych. PWRL, Warszawa. Hamackova J., Kouril J. 18. Spawning of ide (Leuciscus idus L.) induced by means of carp pituitary gland. Czech J. Anim. Sci. 43: 398. Hamačkova J., Lepicoa A., Kozak P., Stupka Z., Kouřil J., Lepic P The efficacy of various anaesthetics in tench (Tinca tinca L.) related to water temperature. Vet. Med.-Czech 49: Jamróz M., Hakuć-Błażowska A., Kucharczyk D., Kwiatkowski M., Targońska K., Żarski D., Mamcarz A. 2008a. Wpływ stosowania preparatu Ovaprim na efekty pozasezonowego oraz sezonowego rozrodu jazia (Leuciscus leuciscus) w warunkach kontrolowanych. Str W: Zakęś Z., Wolnicki J., Demska-Zakęś K., Kamiński R., Ulikowski D. (red.) Biotechnologia w akwakulturze. IRS, Olsztyn. Jamróz M., Kucharczyk D., Hakuć-Błażowska A., Krejszeff S., Kujawa R., Kupren K., Kwiatkowski M., Targońska K., Żarski D., Cejko B.I., Glogowski J. 2008b. Comparing the effectiveness of Ovopel, Ovaprim, and LH-RH analogue used in the controlled reproduction of ide, Leuciscus idus (L.). Arch. Pol. Fish. 16: Kokurewicz B Warunki termiczne a rozród i rozwój niektórych gatunków ryb. IRS, Olsztyn. Kouril J., Hamackova J. 18. Hormonally induced artificial propagation of ide Leuciscus idus L. by means of carp pituitary. EAS, Special Publication 26:

32 Kowalski R.K., Sarosiek B., Kucharczyk D., Targońska K., Glogowski J Zmiany parametrów ruchu plemników jazia (Leuciscus idus) i jelca (Leuciscus leuciscus) w zależności od czasu po aktywacji. Str W: Zakęś Z., Demska-Zakęś K., Wolnicki J. (red.) Rozród, podchów, profilaktyka ryb karpiowatych i innych gatunków. IRS, Olsztyn. Kozłowski B. 14. Praktyka hormonalnej stymulacji rozrodu ryb karpiowatych. IRS, Olsztyn. Krejszeff S., Targońska K., Żarski D., Kucharczyk D Domestication affects spawning of the ide (Leuciscus idus) preliminary study. Aquaculture 295: Krejszeff S., Żarski D., Bernáth G., Palińska-Żarska K., Kupren K., Kucharczyk D. The effect of temperature on short-term storage of ide Leuciscus idus (L.) eggs. 4th International Workshop on the Biology of Fish Gametes September 2013, Faro, Portugal. Kucharczyk D Rozród kontrolowany i androgeneza wybranych gatunków ryb karpiowatych. UWM, Olsztyn. Kucharczyk D., Szabo T. 18. Ovopel nowy preparat hormonalny do stymulacji rozrodu ryb karpiowatych. Str W: Jakucewicz H., Wojda R. (red.) Karpiowate ryby reofilne. PZW, Warszawa. Kucharczyk D., Kujawa R., Mamcarz A., Wyszomirska E., Ulikowski D. 19. Artificial spawning of ide (Leuciscus idus L.) under controlled conditions. EJPAU, Fisheries, 2: #05. Kucharczyk D., Król R., Kujawa R., Mamcarz A., Wyszomirska E., Szczerbowski A., Łuczyński M.J Out of season spawning of ide (Leuciscus idus L.) under controlled conditions. EAS, Special Publication 28: Kucharczyk D., Mamcarz A., Kujawa R., Targońska K., Krejszeff S An experimental hatchery unit for incubation eggs of cold- and warm- -water freshwater fish species. EAS, Special Publication 35: Kucharczyk D., Borejko A., Targońska K., Rożek W., Chwaluczyk R., Kowalski R., Glogowski J Wpływ Ovaprimu na efekty rozrodu jazia (Leuciscus idus). Str W: Wolnicki J., Zakęś Z., Kamiński R. (red.) Rozród, podchów, profilaktyka ryb jeziorowych i innych gatunków. IRS, Olsztyn. Kucharczyk D., Targońska K., Żarski D., Kujawa R., Mamcarz A A review of the reproduction biotechnology for fish from the genus Leuciscus. Arch. Pol. Fish. 16:

33 Kujawa R., Kucharczyk D Przyczyny i skutki przedwczesnego wykluwania się ryb karpiowatych na przykładzie jazia (Leuciscus idus L.). Str W: Okoniewski Z., Brzuska E. (red.) Wylęgarnia IRS, Olsztyn. Kujawa R., Kucharczyk D. 16. Przyżyciowe pobieranie oocytów ryb karpiowatych i okoniowatych za pomocą katetera. Komun. Ryb. 4: Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A., Skrzypczak A. 18. Biotechnology of reproduction and breeding of ide (Leuciscus idus L.). Czech J. Anim. Sci. 43: Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A. 19. A model system for keeping spawners of wild and domestic fish before artificial spawning. Aquacult. Eng. 20: Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A Urządzenie do wykluwania karpiowatych ryb reofilnych. Str W: Okoniewski Z. (red.) Wylęgarnia IRS, Olsztyn. Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A Problemy związane z rozrodem reofilnych ryb karpiowatych w warunkach kontrolowanych. Str W: Zakęś Z., Demska-Zakęś K., Wolnicki J. (red.) Rozród, podchów, profilaktyka ryb karpiowatych i innych gatunków. IRS, Olsztyn. Kupren K Termiczne uwarunkowania rozwoju embrionalnego ryb z rodzaju Leuciscus. Rozprawa doktorska. Wydział Ochrony Środowiska i Rybactwa. UWM Olsztyn. Kupren K., Mamcarz A., Kucharczyk D., Prusińska M. 2008a. Changes in morphometric parameters in selected early stages of three fish species from the genus Leuciscus (Teleostei, Cyprinidae). Arch. Pol. Fish. 16: Kupren K., Mamcarz A., Kucharczyk D., Prusińska M., Krejszeff S. 2008b. Influence of water temperature on eggs incubation time and embryonic development of fish from genus Leuciscus. Pol. J. Natur. Sc. 23: Łuczyński M Wykluwanie się ryb. Fizjologia Ryb. Zeszyt 1. ART, Olsztyn. Marking L.L., Meyer F.P Are better anesthetics needed in fisheries? Fisheries 10:

34 Myszkowski L., Kamiński R., Wolnicki J Response of juvenile tench Tinca tinca (L.) to the anaesthetic 2-phenoxyethanol. J. Appl. Ichthyol.19: McCarter N. 12. Sedation of grass carp and silver carp with 2-phenoxyethanol during spawning. Prog. Fish Cult. 54: Norma branżowa. BN-74/ Ryby hodowlane. Materiał zarybieniowy jazia. Wydawnictwa Normalizacyjne, Warszawa. Rechulicz J Incubation temperature effects on the development of hatching gland in ide, Leuciscus idus (L.). EJPAU, Fisheries 4: #2. Rechulicz J., Ostaszewska T., Wojda R Water temperature effects on incubation of ide (Leuciscus idus L.) eggs and selected parameters of the larvae. Acta Sci. Pol., Piscaria 1: Rodríguez-Gutiérrez M., Esquivel Herrera A. 15. Evaluation of the repeated use of xylocaine as anesthetic for the handling of breeding carp (Cyprinus carpio). Aquaculture 129: Sarosiek B., Cejko B.I., Glogowski J., Targońska K., Żarski D., Kowalski R.K., Kucharczyk D Spermatozoa motility and short-term sperm storage of colourful orfe (Leuciscus idus aberr orfus). Ital. J. Anim. Sci. 11: e270-e274. Targońska-Dietrich K., Zielazny T., Kucharczyk D., Mamcarz A., Kujawa R Out-of-season spawning of cultured ide (Leuciscus idus L.) under controlled conditions. EJPAU, Fisheries 7: #02. Targońska K., Żarski D., Krejszeff S., Kucharczyk D Influence of age of wild ide Leuciscus idus (L.) female on spawning effectiveness under controlled conditions. Ital. J. Anim. Sci. 11: Witkowski A., Cieśla M., Napora K. 17. Jaź. IRS, Olsztyn. Woynarovich E., Horváth L The artificial propagation of warm-water finfishes a manual for extension. FAO Technical Paper No Yamamoto T. 1962: Physiology of fertilization in fish ova. Int. Rev. Cytol. 12: Zohar Y., Mylonas C.C Endocrine manipulations of spawning in cultured fish: from hormones to genes. Aquaculture 197: Żarski D Lin rybactwo i akwakultura. Katedra Rybactwa Jeziorowego i Rzecznego, Olsztyn. 34

35 Receptury Płyn Serra alkohol etylowy 96% (6 części) formaldehyd 70% (3 części) lodowaty kwas octowy (1 część) Płyn Woynarovicha 30 g chlorku sodu 40 g mocznika 10 l wody wylęgarniczej 35

36