Kontrolowany rozród lina - poradnik hodowcy. Autorzy: Daniel Żarski Sławomir Krejszeff. Recenzent: prof. dr hab. Dariusz Kucharczyk

Transkrypt

1

2 Kontrolowany rozród lina - poradnik hodowcy Autorzy: Daniel Żarski Sławomir Krejszeff Recenzent: prof. dr hab. Dariusz Kucharczyk Projekt okładki: Szymon Czarnowski Sławomir Krejszeff Fotografie na okładce: Roman J. Kujawa ISBN: Pozycja powstała w ramach projektu Innowacje w akwakulturze ryb ze szczególnym uwzględnieniem biotechniki rozrodu ryb Program Operacyjny RYBY (OR OR /09/10/11). Korekta: Agnieszka Szamreta Skład: Sławomir Karetko Druk i oprawa: Białystok, ul. Zwycięstwa 10 tel biuro@partnerpoligrafia.pl

3 Spis treści Wstęp...4 Zasady stosowania preparatów hormonalnych...7 Pozyskiwanie i transport tarlaków...8 Warunki przetrzymywania tarlaków...10 Warunki inkubacji ikry...12 Anestezja...14 Ocena stadium dojrzałości oocytów...16 Ocena stadium dojrzałości oocytów w praktyce...20 Stymulacja spermacji...22 Stymulacja owulacji...24 Pozyskiwanie nasienia...26 Pozyskiwanie jaj...28 Zapłodnienie i pozbawianie jaj kleistości...30 Klucie zarodków...32 Notatki...35 Pozycje literatury obejmujące tematykę kontrolowanego rozrodu, rozrodu lina, akwakultury lina oraz innych gatunków ryb...37 Receptury

4 Wstęp Lin, Tinca tinca L., jest jednym z najważniejszych gatunków ryb słodkowodnych naszej strefy klimatycznej. Od lat należy do najbardziej cenionych spośród gatunków ryb karpiowatych i ma bardzo duże znaczenie komercyjne. Jako ryba preferująca wody stojące i żyzne jest istotnym elementem ichtiofauny jezior, bardzo chętnie poławianym przez wędkarzy, jak również stanowi niezwykle istotną składową hodowli ryb w stawach ziemnych. Jednakże niskie tempo wzrostu w warunkach naturalnej termiki jezior oraz stawów zniechęciło hodowców do prowadzenia intensywnej hodowli tego gatunku, który wciąż stanowi jedynie dodatkowy element produkcji akwakulturowej. Obecnie na terenie Polski nie są prowadzone żadne regularne hodowle lina mogące zaspokoić zapotrzebowanie rynku. Tym samym ryby pochodzące z produkcji akwakulturowej wciąż ustępują miejsca na sklepowych półkach linom pozyskanym ze środowiska naturalnego. Bardzo duże znaczenie gospodarcze lina oraz niewielka produkcja akwakulturowa tego gatunku doprowadziła w ostatnich latach do wzmożonej aktywności naukowej mającej na celu określenie możliwie najbardziej optymalnych parametrów produkcji tego gatunku. W efekcie opracowano szereg procedur rozrodczych oraz podchowowych, jak również elementów biotechnologicznych (głównie manipulacji genomowych) potencjalnie umożliwiających zwiększenie tempa wzrostu i tym samym efektywności produkcji. Rozpatrywano również możliwości intensywnej produkcji lina w recyrkulowanych obiegach akwakulturowych RAS (ang. Recirculating Aquaculture Systems). Dotychczas uzyskiwane wyniki wciąż jednoznacznie wskazują na zbyt niską potencjalną opłacalność intensywnej akwakultury lina. Relatywnie efektywna produkcja stawowa wskazuje na realne możliwości zwiększenia produkcji i tym samym podaży na rynek ryby konsumpcyjnej pochodzącej z akwakultury. Aby to osiągnąć, należy możliwie skutecznie skrócić okres produkcji narybku. Efekt ten może zostać osiągnięty, gdy pierwszy okres produkcji zostanie przeprowadzony w sposób intensywny, po czym wysokiej jakości formy juwenilne stanowiłyby materiał obsadowy do stawów ziemnych na samym początku sezonu wzrostowego. Pozwoliłoby to zrekompensować niską efektywność wychowu larw w warunkach stawowych. Obecnie produkcja linów w stawach ziemnych oparta jest na materiale uzyskanym w wyniku tarła spontanicznego (niekontrolowanego) bezpośrednio w stawach. Do tarła dochodzi w większości przypadków na przełomie maja i czerwca lub też w czerwcu, czyli w zasadzie już w trakcie sezonu 4

5 produkcyjnego. Innym źródłem linów w stawach typu karpiowego są ryby napływające wraz z doprowadzaną do stawów wodą. Wszystko to sprawia, że jak dotąd hodowcy mają bardzo znikomy wpływ na liczebność larw i narybku tego gatunku, nie mają również możliwości kontroli poszczególnych etapów produkcji ani jakości ryb będących później przedmiotem produkcji. Istnieje jednak bardzo duże prawdopodobieństwo, że obsadzenie stawów wysokiej jakości larwami lina wyprodukowanymi w wyniku kontrolowanego rozrodu umożliwi istotne zwiększenie wielkości produkcji i stanowi niezwykle ważny pierwszy krok do kontroli procesu produkcji tego gatunku. Dopiero tego typu praktyka daje możliwości przeprowadzenia wstępnej selekcji hodowlanej mającej na celu, w dalszej perspektywie, doprowadzenie do uzyskiwania wylęgu lina poza sezonem rozrodczym i potencjalnie obsadzanie stawów wysokiej jakości narybkiem w momencie rozpoczęcia sezonu hodowlanego, a tym samym uzyskiwanie ryb o wielkości handlowej ( g) przynajmniej rok wcześniej, niż powszechnie jest to odnotowywane. Kontrolowany rozród ryb jest pierwszym i jednym z najważniejszych etapów intensywnej produkcji ryb. Efektywność tego etapu bezpośrednio warunkuje zarówno ilość, jak i jakość uzyskanego wylęgu, tym samym determinując skuteczność dalszych etapów produkcji. Kontrolowany rozród jest niczym innym niż całym zespołem zabiegów umożliwiających uzyskanie wysokiej jakości larw od dojrzałych płciowo ryb. Dotyczy to zarówno aspektów związanych z pozyskaniem tarlaków, manipulacjami na rybach, prowadzeniem zabiegów stymulacji finalnego dojrzewania oocytów i owulacji, jak i inkubacji rozwijających się embrionów do momentu wyklucia. Warto w tym miejscu podkreślić szczególne znaczenie przeprowadzania stymulacji hormonalnej (jako zabiegu stymulacji finalnego dojrzewania oocytów i owulacji), która w praktyce kontrolowanego rozrodu może być prowadzona na dwu z trzech poziomów osi podwzgórzowo-przysadkowo-gonadowej regulującej procesy rozrodcze u ryb. Jedną z najstarszych metod jest podawanie rybom egzogennych gonadotropin (jak przykładowo ekstrakt z przysadki mózgowej karpia), które, działając na poziomie gonad, bezpośrednio doprowadzają do stymulacji procesu finalnego dojrzewania oocytów i owulacji. W innym przypadku stymulacja przebiega na poziomie przysadki mózgowej wówczas za pomocą podawania gonadoliberyn (lub też ich analogów) doprowadza się do sekrecji z przysadki mózgowej endogennych gonadotropin, które w dalszej kolejności powodują procesy finalnego dojrzewania oocytów i owulacji. W przypadku ryb karpiowatych podawanie gonadoliberyn stwarza konieczność prowadzenia dodatkowej terapii mającej na celu blokadę receptorów dopaminowych (za pomocą preparatów zwanych antagonistami dopaminy). 5

6 Wynika to z tego, że podawanie czystych gonadoliberyn wywołuje w efekcie negatywne sprzężenie zwrotne polegające na intensywnym wydzielaniu dopaminy, która z kolei powoduje hamowanie produkcji endogennych gonadotropin. W przypadku lina stymulację hormonalną prowadzono dotychczas z wykorzystaniem ekstraktu z przysadki mózgowej karpia, jak również z wykorzystaniem analogów gonadoliberyny podawanych wraz z antagonistami dopaminy. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że u tego gatunku to właśnie ta druga grupa preparatów hormonalnych jest najczęściej rekomendowana. Obecnie, pomimo wielu starań nie ma jednej efektywnej i powtarzalnej procedury rozrodu pozasezonowego lina, a dotychczas opisywane metody kontrolowanego rozrodu w trakcie sezonu rozrodczego wskazywały na bardzo dużą zmienność efektywności tych procedur. Proponowana w ramach niniejszego poradnika procedura rozrodu lina w warunkach kontrolowanych jest wynikiem kilkuletniego doświadczenia i intensywnych prac dążących do relatywnej standaryzacji tego procesu. Należy jednak w tym miejscu podkreślić, że nie jest to jedyna metoda umożliwiająca pozyskiwanie larw w warunkach kontrolowanych. W związku z tym zaleca się, aby do opisywanych poniżej metod podchodzić z dużą dozą krytycyzmu, weryfikować każdy etap z perspektywy własnych doświadczeń, jak również konfrontować z dotychczas opublikowanymi danymi, które można odnaleźć w publikacjach zestawionych w ostatnim rozdziale niniejszego poradnika. Na szczególną uwagę zasługuje monografia zatytułowana Lin rybactwo i akwakultura, wydana w ramach projektu Innowacje w akwakulturze ryb ze szczególnym uwzględnieniem biotechniki rozrodu ryb (akronim: InnovaFish). Jest to pozycja nieodpłatna, dostępna również w formie elektronicznej pod adresem 6

7 Zasady stosowania preparatów hormonalnych Jak wspomniano we wstępie, w przypadku rozrodu lina w badaniach naukowych stosowano dotychczas dwie grupy preparatów hormonalnych działających na dwóch różnych poziomach (gonad oraz przysadki mózgowej). W związku z tym, że na dzień r. przepisy Unii Europejskiej (dyrektywa 2001/82/WE oraz Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 27 listopada 2008 r., Dz.U 2008 Nr 217, poz. 1388) nie zezwalają na stosowanie u zwierząt żadnych preparatów niezarejestrowanych jako produkty lecznicze, należy zwrócić uwagę, że niedopuszczalne jest stosowanie w akwakulturze ekstraktu z przysadki mózgowej karpia (ani innych gatunków ryb), gdyż nie jest to produkt leczniczy w rozumieniu wyżej wymienionych przepisów. W związku z tym zabrania się stosowania tego typu preparatów hormonalnych w rozrodzie lina oraz innych gatunków ryb. W celu stymulacji finalnego dojrzewania oocytów oraz owulacji zaleca się stosowanie preparatów zawierających gonadoliberyny (lub ich analogi), o ile są one zawarte w preparatach zarejestrowanych w Unii Europejskiej. Poniższy protokół uwzględnia użycie takich właśnie preparatów, których stosowanie musi zostać wspomożone jednoczesnym podawaniem związków będących antagonistami dopaminy (np. metoklopramidu lub domperidonu). Należy podkreślić, że metokolopramid oraz domperidon są składnikami zarejestrowanych preparatów leczniczych, dostępnymi nierzadko w postaci czystej, najczęściej wydawanymi na receptę. 7

8 Pozyskiwanie i transport tarlaków Do celów kontrolowanego rozrodu tarlaki pozyskiwane są zazwyczaj z dwóch źródeł, tj. ze stawów lub środowiska naturalnego. W przypadku pozyskiwania tarlaków przed sezonem rozrodczym (np. z zimochowów lub ze środowiska naturalnego) odłowione ryby najlepiej umieścić w stawach ziemnych w zagęszczeniu do 400 kg/ha. W tym czasie tarlaki można karmić granulatem (maks. 3% biomasy na dobę). Procedurę kontrolowanego rozrodu najlepiej rozpocząć, biorąc pod uwagę stopień dojrzałości samic (szerzej omówiony w części Ocena stadium dojrzałości oocytów ). Liczba ryb, jaką można bezpiecznie przewozić, zależy od temperatury wody oraz czasu trwania transportu. Zbiorniki do przewozu ryb powinny być wykonane z materiałów niewywierających szkodliwego wpływu na żywe ryby, a wszelkie elementy mogące mieć kontakt z rybami lub wodą powinny być zdezynfekowane. Konstrukcja zbiorników (oraz urządzeń napowietrzających) powinna uniemożliwiać uszkodzenie ciała ryb. Niezwykle istotne jest, aby równomiernie napowietrzać całą objętość wody. Napowietrzanie (średnica pęcherzyków < 2,0 mm) powinno być nie mniejsze niż 1,5-2,0 m 3 /h/m 3 wody. Szczegółowe parametry transportu (masa/objętość wody), w zależności od temperatury i sposobu wzbogacania wody w tlen (napowietrznie lub natlenianie), zostały zestawione w tab. 1, 2 i 3. Tarlaki przeznaczone do transportu muszą być odpite. Przewóz ryb powinien nastąpić bezpośrednio po załadunku. Gdy różnica temperatur wody pomiędzy zbiornikiem przewozowym a zbiornikiem zarybianym wynosi więcej niż 4 C, należy ją stopniowo wyrównywać (BN-83/ ). 8

9 Tabela 1. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg tarlaków przy przewozie w zbiornikach bez napowietrzania (wg BN-83/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] do Tabela 2. Zapotrzebowanie wody w litrach na 1 kg tarlaków przy przewozie w zbiornikach z napowietrzaniem (wg BN-83/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] do Tabela 3. Liczba tarlaków lina (w kg), którą można bezpiecznie transportować w 1 m 3 wody w zbiornikach z natlenianiem. Czas trwania transportu waha się w przedziale od 5 do 20 godzin (wg Berka 1986) Masa ciała [g] Temperatura wody [ C]

10 Warunki przetrzymywania tarlaków Do celów kontrolowanego rozrodu tarlaki lina najlepiej jest przetrzymywać w systemach akwakulturowych pracujących w zamkniętym lub częściowo otwartym obiegu wody. Zasadniczo konstrukcja takiego systemu jest dowolna, pod warunkiem że spełni on kilka podstawowych wymogów: powinien się składać z minimum 2 basenów tarlakowych o objętości od 0,6 do 1,0 m 3 wykonanych z materiału niewywierającego szkodliwego wpływu na żywe ryby, konstrukcja basenów tarlakowych powinna umożliwiać łatwe osuszanie, dezynfekcję oraz uniemożliwiać uszkodzenia ryb przez zanurzone elementy (tj. pompy, dyfuzory napowietrzające itp.), objętość wody przepływająca w ciągu jednej godziny przez basen tarlakowy powinna być równa objętości basenu, w przypadku recyrkulacji wody należy zapewnić efektywną sterylizację UV, w obu basenach tarlakowych musi być możliwe zapewnienie stałej temperatury wody w zakresie C (przy pomocy precyzyjnego termoregulatora o dokładności ± 0,1 C), oba baseny tarlakowe powinny być zaopatrzone w urządzenia natleniające (napowietrzające) i powinno się zapewnić stałe natlenienie na poziomie powyżej 80%, baseny tarlakowe powinny być wyposażone w oświetlenie jarzeniowe podłączone do zegara sterującego jego pracą. Dodatkowe wyposażenie umożliwiające sprawną pracę powinno obejmować stół manipulacyjny, minimum dwie wanienki manipulacyjne ( l każda) z możliwością ich napowietrzania, a także kasar. 10

11 Rys. 1. Uproszczony schemat obiegu tarlakowego służącego do krótkookresowego przetrzymywania tarlaków lina: 1 dopływ wody; 2 odpływ z górnego zbiornika retencyjnego do basenów z rybami; 3 odpływ z basenów z rybami do dolnego zbiornika retencyjnego; 4 filtr zewnętrzny (mechaniczny), przez który woda z basenu z rybami jest odprowadzana do górnego zbiornika retencyjnego; 5 sterylizator UV; 6 przelew awaryjny nadmiaru wody ze zbiornika górnego do dolnego zbiornika retencyjnego; 7 odpływ wody z systemu; 8 termoregulator; 9 grzałka, spirala chłodząca lub inny wymiennik ciepła; 10 butla z tlenem; 11 rozpylacz (dyfuzor) gazów; 12 oświetlenie; 13 baseny tarlakowe; 14 zbiornik górny retencyjny; 15 zbiornik dolny retencyjny; 16 stelaż pod zbiornik górny retencyjny 11

12 Warunki inkubacji ikry Inkubację ikry lina, podobnie jak innych ryb karpiowatych, prowadzi się w słojach inkubacyjnych typu Weissa (rys. 2, 3) po uprzednim pozbawieniu jej kleistości. Przepływ wody przez słoje inkubacyjne powinien być ustawiony w taki sposób, aby jaja były delikatnie mieszane i jednocześnie nie były wypłukiwane z aparatów inkubacyjnych. Okres inkubacji zależy przede wszystkim od temperatury wody oraz metody pozbawiania jaj kleistości. Za optymalną temperaturę inkubacji należy uznać zakres pomiędzy C, a nasycenie wody tlenem nie powinno przekraczać dolnej granicy 80%. Do celów inkubacji zaleca się stosowanie obiegów recyrkulacyjnych, w których woda jest oczyszczana mechanicznie i dodatkowo natleniana. Ponieważ inkubacja ikry trwa zaledwie kilka dni, nie ma konieczności stosowania filtracji biologicznej. W takim przypadku konieczne jest jednak prowadzenie filtracji mechanicznej wody (np. za pomocą filtra zewnętrznego) oraz usuwanie nierozwijających się jaj. Niezbędne jest również zapewnienie skutecznej dezynfekcji (najlepiej za pomocą sterylizatorów UV), która ma wspomagać profilaktykę mającą na celu niedopuszczenie do nadmiernej infekcji grzybiczej oraz pierwotniaczej. W przypadku wystąpienia jakiejkolwiek infekcji ewentualne procedury lecznicze należy skonsultować z właściwym lekarzem weterynarii, a zabiegi lecznicze wykonywać pod jego nadzorem. 12

13 Rys. 2. Uproszczony schemat obiegu do inkubacji i wstępnego podchowu larw: 1 dopływ wody; 2 odpływ z górnego zbiornika retencyjnego do odbieralnika/ podchowalnika larw; 3 słoje inkubacyjne Weissa; 4 odpływ z odbieralnika/podchowalnika larw; 5 filtr mechaniczny; 6 filtr zewnętrzny (mechaniczno-biologiczny), przez który woda z dolnego zbiornika retencyjnego jest doprowadzana do górnego zbiornika retencyjnego; 7 sterylizator UV; 8 przelew awaryjny nadmiaru wody ze zbiornika górnego do dolnego zbiornika retencyjnego; 9 odpływ wody z systemu; 10 termoregulator; 11 grzałka, spirala chłodząca lub inny wymiennik ciepła; 12 oświetlenie; 13 odbieralnik/podchowalnik larw; 14 zbiornik górny retencyjny; 15 zbiornik dolny retencyjny; 16 stelaż pod zbiornik górny retencyjny Rys. 3. Ikra lina na początku inkubacji (po lewej) oraz po ok. 20 h inkubacji (po prawej) w słojach typu Weissa 13

14 Anestezja Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk dwie wanienki o pojemności od 50 do 100 l podbierak napowietrzanie Uwagi Poniższa procedura obejmuje zasady przeprowadzania anestezji, która powinna poprzedzać wszelkie czynności uwzględniające manipulacje na tarlakach związane z kontrolowanym rozrodem. W jednej z wanienek rozpuścić anestetyk (zaleca się stosowanie MS-222 w dawce pomiędzy 100 a 150 mg l -1 ), zwracając uwagę na jego całkowite rozpuszczenie się w wodzie o takiej samej temperaturze, jaka panuje w basenie z rybami. Do drugiej wanienki (tzw. odpijalnika) wlać czystą wodę (o takiej samej temperaturze), w której należy umieścić napowietrzacz. Za pomocą podbieraka delikatnie przenieść rybę z basenu do wanienki z anestetykiem. Po tym, jak ryba osiągnie stan znieczulenia ogólnego (nie wykazuje reakcji po delikatnym uciśnięciu trzonu płetwy ogonowej), należy ją delikatnie odłowić i wykonać niezbędne manipulacje (rys. 5). Należy uważać, aby w trakcie manipulacji nie dopuścić do uszkodzenia ciała ryby, nadmiernego osuszenia powłok ciała (zwłaszcza nadmiernego usunięcia śluzu). Wszelkie manipulacje należy wykonać w ciągu maksymalnie 15 min od momentu osiągnięcia przez rybę stanu znieczulenia ogólnego. Po manipulacji rybę umieścić w odpijalniku. Po odzyskaniu przez rybę równowagi (całkowite wybudzenie, rys. 4) należy ją delikatnie przenieść do docelowego basenu. 14

15 Rys. 4. Ryby w stanie znieczulenia ogólnego (po lewej) oraz po odzyskaniu równowagi (po wybudzeniu po prawej) Rys. 5. Sprawdzanie osiągnięcia przez rybę stanu znieczulenia ogólnego 15

16 Ocena stadium dojrzałości oocytów Efektywność hormonalnego stymulowania owulacji ściśle zależy od stopnia dojrzałości oocytów. W przypadku ryb karpiowatych powszechnie stosuje się czterostopniowy system oceny dojrzałości gonad, w przypadku którego kryterium stanowi położenie jądra w oocycie (np. Brzuska 1979). Obejmuje on cztery stadia: stadium I jądro w centrum oocytu, stadium II wczesne stadium jądra migrującego (poniżej połowy średnicy oocytu), stadium III późne stadium jądra migrującego (powyżej połowy średnicy oocytu), stadium IV jądro położone peryferyjnie (bezpośrednio przy obrzeżu oocytu). Poszczególne stadia przedstawione są schematycznie na rys. 7. Lin jest rybą, która odbywa tarło porcyjne. W związku z tym należy zdawać sobie sprawę, że w pobranej próbce oocytów znajdować się będą oocyty w różnym stadium dojrzałości. Z perspektywy kontrolowanego rozrodu w ocenie stopnia dojrzałości bierze się pod uwagę dwa główne parametry: odsetek tzw. największych oocytów, a także stopień dojrzałości (według podanej powyżej skali) największych oocytów. W zasadzie wartość tego pierwszego parametru zależy od tego, w którym momencie sezonu rozrodczego znajduje się samica (do której porcji tarła samica będzie przystępować). Jest to ważne przy ocenie przydatności samic pochodzących ze środowiska naturalnego, a odławianych już w trakcie sezonu tarłowego. W takim przypadku do dalszych procedur rozrodczych najlepiej jest przeznaczyć ryby, u których stwierdzono, że największe oocyty stanowią ponad 30% wszystkich oocytów (za Targońska i in. 2012). Jednakże gdy hodowca dysponuje tarlakami lina wyhodowanymi w stawach ziemnych (bądź też odłowionych przed sezonem rozrodczym ze środowiska naturalnego i umieszczonych w stawach ziemnych), zaleca się w połowie maja rozpocząć procedurę kontroli stopnia dojrzałości oocytów, co związane jest z postępowaniem zgodnym z poniższym schematem (rys. 6). 16

17 Odłowić 10 samic, pobrać próbkę oocytów i poddać procesowi klaryfikacji w płynie Serra, a następnie ocenić stopień dojrzałości największych oocytów dla każdej samicy według skali przedstawionej na rys. 7. TAK Czy ponad połowa samic posiada oocyty w II lub III stopniu dojrzałości oocytów? NIE Odłowić wszystkie ryby ze stawu i przenieść do wylęgarni w celu przeprowadzenia kontrolowanego rozrodu. Odczekać 7 dni. Rys. 6. Schemat postępowania z samicami lina przetrzymywanymi w stawie ziemnym przed sezonem rozrodczym mający na celu określenie najlepszego momentu rozpoczęcia procedury kontrolowanego rozrodu lina 17

18 Rys. 7. Stadia dojrzałości opracowane dla ryb karpiowatych. Cyfry rzymskie odpowiadają poszczególnym stadiom (za Brzuska i Bieniarz 1977) 18

19 Rys. 8. Przykładowy obraz oocytów lina po klaryfikacji w płynie Serra. Łatwo można zauważyć różnej wielkości oocyty. Przy ocenie dojrzałości poszczególnych samic należy uwzględniać tylko największe komórki (wskazane strzałką) oraz pominąć oocyty uszkodzone w procesie cewnikowania (oznaczone gwiazdką) 19

20 Ocena stadium dojrzałości oocytów w praktyce Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk kateter (cewnik do karmienia niemowląt o rozmiarze CH06) strzykawka płyn Serra szalki Petriego mikroskop stereoskopowy Skład płynu Serra: 70% alkohol etylowy: 6 części 36-38% formaldehyd: 3 częsci Kwas octowy lodowaty: 1 część Samicę wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Do otworu płciowego wprowadzić podłączony do strzykawki kateter na głębokość nie większą niż połowa długości pomiędzy końcem płetwy piersiowej i nasadą płetwy brzusznej (rys. 9). Odciągnąć tłoczek strzykawki i zassać niewielką próbkę oocytów (około szt.). Samicę umieścić w odpijalniku. Oocyty umieścić na szalce Petriego (rys. 10 po lewej) i zalać niewielką ilością płynu Serra. Po mniej więcej 5 minutach każdą próbkę należy umieścić pod mikroskopem stereoskopowym w celu określenia stadium dojrzałości (rys. 10 po prawej). Samice, których największe oocyty znajdują się w II/III-IV stadium dojrzałości, należy poddać procedurze stymulacji hormonalnej. Samice, których największe oocyty znajdują się w I-II stadium dojrzałości, należy poddać fototermalnej stymulacji finalnego dojrzewania oocytów (20 C, fotoperiod 14L:10D), a kolejnych przeglądów samic należy dokonywać w 2-dniowych odstępach czasu. 20

21 Rys. 9. Pobór oocytów za pomocą katetera Rys. 10. Zalewanie pobranych oocytów płynem Serra (po lewej) oraz ewaluacja stopnia dojrzałości za pomocą mikroskopu stereoskopowego podłączonego do komputera (po prawej) 21

22 Stymulacja spermacji Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk waga igły 0,7 x 40 mm strzykawki o pojemności 1 ml płyn fizjologiczny ręczny homogenizator lub moździerz ręcznik tetrowy preparat hormonalny Uwagi Od lina, w trakcie sezonu rozrodczego, można pobrać nasienie bez stymulacji hormonalnej, jednakże wówczas ilość nasienia jest niewielka, a jego jakość może być bardzo niska. Ważne, aby na tym etapie rozdzielić samce od samic na podstawie morfologii płetw brzusznych (rys. 11). Stymulację spermacji należy przeprowadzić, gdy temperatura wody (po stopniowym jej podnoszeniu) osiągnie 21 C. Składniki preparatu hormonalnego (jeśli nie są dostępne w formie płynnej) należy skrupulatnie rozetrzeć/rozpuścić w płynie fizjologicznym w homogenizatorze lub moździerzu w taki sposób, aby całkowita dawka preparatu w przeliczeniu na 1 kg masy ciała ryby była zawarta w 1 ml płynu (zawiesiny). Samca wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Określić masę ryby z dokładnością do 10 g. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym na wilgotnym ręczniku. Przeprowadzić iniekcję dootrzewnową pod płetwę brzuszną (dawkę preparatu hormonalnego należy dostosować do masy ciała ryby, tak aby nie przekroczyć dawki podanej w tab. 4. Rybę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu. Po iniekcji temperaturę wody utrzymywać na poziomie 21 C. W trakcie całego procesu stymulowania spermacji należy utrzymywać stały fotoperiod na poziomie 14 godzin oświetlenia (14L:10D). 22

23 Tab. 4. Zalecane warianty hormonalnej stymulacji spermacji u lina Wariant stymulacji hormonalnej 1 2 Dawka mgnrha 20 µg kg -1 metoklopramid 10 mg kg -1 sgnrha 10 µg kg -1 domperidon 5 mg kg -1 Optymalny czas pozyskania nasienia (po iniekcji) 24 h Rys. 11. Dymorfizm płciowy lina. Samica (zdjęcie u góry), samiec (zdjęcie u dołu) 23

24 Stymulacja owulacji Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk waga igły 0,7 x 40 mm strzykawki o pojemności 1 ml płyn fizjologiczny ręczny homogenizator lub moździerz preparat hormonalny ręcznik tetrowy Uwagi Zalecane warianty stymulacji hormonalnej zostały przedstawione w tab. 5. Maksymalny czas od momentu pozyskania tarlaków do momentu rozpoczęcia procedury rozrodu powinien być krótszy niż 4 dni. Pierwszą iniekcję przeprowadzić, gdy temperatura wody zostanie stopniowo podniesiona do 21 C. W tym czasie fotoperiod powinien wynosić 12 h (12L:12D). Składniki preparatu hormonalnego (jeśli nie są dostępne w formie płynnej) należy skrupulatnie rozetrzeć/rozpuścić w płynie fizjologicznym w homogenizatorze lub moździerzu w taki sposób, aby całkowita dawka preparatu w przeliczeniu na 1 kg masy ciała ryby była zawarta w 1 ml płynu (zawiesiny). Samicę wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Określić masę ryby z dokładnością do 10 g. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym na wilgotnym ręczniku. Przeprowadzić iniekcję dootrzewnową pod płetwę brzuszną (dawkę preparatu hormonalnego należy dostosować do masy ciała ryby, tak aby nie przekroczyć dawki podanej w tab. 5. Rybę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu. Po pierwszej iniekcji temperaturę wody podnieść do 23 C, a fotoperiod wydłużyć do 14 h (14L:10D). Procedurę powtórzyć po 12 h w trakcie przeprowadzania drugiej iniekcji, uwzględniając dawki preparatów podane w tab. 5 dla drugiej iniekcji. Temperaturę wody pomiędzy drugą iniekcją a owulacją utrzymywać na poziomie 23 C. 24

25 Tab. 5. Szczegóły dawkowania poszczególnych preparatów (w dwu oddzielnych wariantach do wyboru) służących stymulacji owulacji u lina Wariant stymulacji Dawka preparatu hormonalnej I iniekcja I iniekcja II iniekcja 1 mgnrha 4 µg kg µg kg -1 metoklopramid 2 mg kg mg kg -1 2 sgnrha 2 µg kg µg kg -1 domperidon 1 mg kg -1 5 mg kg -1 Interwał pomiędzy iniekcjami Spodziewany czas owulacji 12 h h Rys. 12. Określanie masy ciała samicy (po lewej) oraz wykonywanie dootrzewnowej iniekcji hormonalnej (po prawej) 25

26 Pozyskiwanie nasienia Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk ręczniki tetrowe (lub podobne) strzykawki o pojemności 10 ml płyn inaktywujący plemniki Uwagi W przypadku niedysponowania płynem inaktywującym plemniki nasienie należy użyć do zapłodnienia w ciągu 10 minut od jego poboru, gdyż nasienie lina prawie zawsze jest mocno zanieczyszczone moczem, który aktywuje plemniki. Alternatywnie nasienie można pobierać bezpośrednio na ikrę. Skład płynu inaktywującego plemniki: 180 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 1,4 mm CaCl 2, 2,4 mm NaHCO 3 z dodatkiem 1,36 mm CaCl 2 2H 2 O (mm wyraża mmol l -1 ) Samca wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym. Osuszyć powłoki brzuszne. Do strzykawki pobrać 4 ml płynu inaktywującego plemniki. Do strzykawki zawierającej płyn inaktywujący pobrać 2 ml nasienia za pomocą delikatnego masażu powłok brzusznych. Rybę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu. Rozcieńczone płynem inaktywującym nasienie należy przechowywać w temperaturze 4 C. Rozcieńczone płynem inaktywującym nasienie należy użyć w czasie do 5 h od momentu pobrania. 26

27 Rys. 13. Pobór nasienia do strzykawki Rys. 14. Pobór nasienia bezpośrednio na ikrę 27

28 Pozyskiwanie jaj Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk ręczniki tetrowe sucha miska z możliwością szczelnego zakrycia Uwagi W zależności od tego, w jakim momencie sezonu rozrodczego znajduje się samica (do której z kolei porcji tarła miałaby podchodzić samica), należy się spodziewać ilości ikry w przedziale od 1 do 10% masy ciała samicy. Samicę wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego. Rybę ułożyć na stole manipulacyjnym na lekko zwilżonym ręczniku. Delikatnie osuszyć powłoki brzuszne oraz płetwy brzuszne, piersiowe, płetwę odbytową oraz płetwę ogonową (uważać, aby nie usunąć śluzu). Lekko wilgotny ręcznik owinąć wokół głowy samicy w taki sposób, aby nie dopuścić do wydostania się wody spod pokryw skrzelowych w trakcie pozyskania ikry (rys. 16). Stosując delikatny masaż powłok brzusznych (ruchem posuwistym w kierunku od głowy ku otworowi płciowemu), ikrę pozyskać do suchej miski. Po pobraniu ikry samicę umieścić w odpijalniku. Po wybudzeniu rybę przenieść z powrotem do basenu. Ikrę natychmiast szczelnie przykryć do momentu poboru ikry od kolejnej samicy. Pozyskaną ikrę należy przetrzymywać pod przykryciem nie więcej niż 1 h w temperaturze poniżej 17 C. 28

29 Rys. 15. Osuszanie powłok ciała samicy lina Rys. 16. Pobór ikry od samicy lina 29

30 Zapłodnienie i pozbawianie jaj kleistości Wymagane odczynniki i akcesoria plastikowe łyżki płyn zapładniający woda destylowana płyn Wojnarowicha tanina aparaty wylęgarnicze Uwagi Jako płynu zapładniającego można użyć czystej wody wylęgarniczej (pochodzącej z urządzenia do inkubacji) bądź odchlorowanej wody kranowej. W przypadku wątpliwości co do jakości powyżej wymienionych płynów należy sporządzić płyn na bazie wody destylowanej o osmolarności nie przekraczającej 50 mosm kg -1 i zbuforowanej do ph 8. Skład płynu Woynarovicha: 3 g mocznika oraz 4 g NaCl na każdy 1 l wody destylowanej Odważoną porcję ikry wymieszać z odmierzoną porcją nasienia. Na każde 100 g ikry należy przeznaczyć przynajmniej 3 ml czystego nasienia pobranego od co najmniej 3 samców (w przypadku rozcieńczania nasienia należy zmierzyć ilość nasienia, tak aby dawkowanie uwzględniało czyste nasienie). Do zmieszanych gamet w przeciągu 30 s dodać niewielką ilość płynu zapładniającego i przeprowadzić zapłodnienie, intensywnie mieszając przez minutę. Do zapłodnionych jaj dodać roztwór Woynarovicha w ilości około 10-20% objętości jaj i nieprzerwanie mieszać plastikową łyżką. Następnie, w kilku- lub kilkunastominutowych odstępach dodawać kolejne porcje płynu (każdorazowo zwiększając objętość o ok %), równocześnie pozbywając się części (maksymalnie do 50%) roztworu. Następnie jaja należy przepłukać roztworem taniny o stężeniu 5-8 g l -1. (na każde ml jaj potrzeba około 0,2-0,5 l roztworu) przez ok 3-5 s. Po przepłukaniu jaj czystą wodą kąpiel w taninie należy powtórzyć. Po ponownie przepłukaniu jaj w czystej wodzie ikrę można umieścić w aparacie wylęgarniczym. Temperatura inkubacji powinna zawierać się w przedziale C. 30

31 Rys. 17. Zapładnianie ikry lina z zastosowaniem czystej wody wylęgarniczej Rys. 18. Kąpiel ikry lina w płynie Woynarovicha przy użyciu automatycznego urządzenia do pozbawiania ikry kleistości 31

32 Klucie zarodków Wymagane odczynniki i akcesoria obieg larwalny / basen odbieralnikowy miska szalka Petriego wężyk gumowy ( ok. 5 mm, dł. ok. 60cm) wraz z rurką szklaną (dł. ok. 30 cm) o podobnej średnicy Uwagi Poniższa procedura jest propozycją alternatywną, w przypadku gdy hodowca nie dysponuje zestawem inkubacyjnym wyposażonym w odbieralniki dla larw Rozpoznanie momentu gotowości larw do wymuszonego klucia Na kilka godzin przed przewidywanym momentem wyklucia (wstępnego oszacowania można dokonać przy pomocy danych zestawionych na rys. 19) należy pobrać około 50 jaj (najlepiej za pomocą wężyka gumowego połączonego z rurką szklaną) i umieścić na szalce Petriego. Szalkę z ikrą odstawić na mniej więcej 30 minut. Po 30 min określić odsetek wyklutych na szalce larw. Jeśli liczba wyklutych larw na szalce będzie większa niż 50%, należy rozpocząć masowe klucie, jeśli mniejsza kolejne rozpoznanie należy wykonać nie wcześniej niż po 4-6 h. Wymuszone klucie W momencie gdy rozpoznanie gotowości larw do klucia będzie pozytywne, należy zamknąć dopływ wody do aparatu inkubacyjnego oraz odebrać (zlewarować) około 15% wody ze słoja (uważając, aby nie usunąć razem z wodą klujących się larw lub ikry). Po 30 min należy zlewarować ikrę do miski, którą następnie należy w całości wypełnić wodą. Następnie zawartością miski należy delikatnie zamieszać, tak aby ikra wraz z wyklutymi larwami zebrały się w centrum pojemnika. Odpowiednie rozpoznanie momentu klucia sprawia, że podczas mieszania osłonki unoszą się w toni wody, podczas gdy wyklute larwy zbierają się w centrum miski przy dnie (rys. 20). Następnie należy odlewać osłonki poza miskę, uważając, aby nie usuwać wyklutych larw (rys. 20, 21). Czynność powtarzać do momentu, gdy na dnie miski pozostanie czysty wylęg (rys. 22). 32

33 Czas inkubacji (h) y = 0,9735x 2-52,393x + 719,05 R² = 0, Temperatura ( C) Rys. 19. Zależność pomiędzy temperaturą a czasem inkubacji na podstawie danych uzyskanych przez Geldhauser (15) oraz Korzelecką-Orkisz i in. (2009) Rys. 20. Zlewanie nadmiaru wody wraz z osłonkami znad świeżo wyklutych larw podczas wymuszonego klucia. Na powierzchni, obok unoszących się w toni osłonek jajowych widoczna jest piana będąca efektem nagromadzenia się chorionazy (enzymu wyklucia) 33

34 Rys. 21. Zlewanie osłonek jajowych znad świeżo wyklutych larw lina podczas wymuszanego klucia Rys. 22. Umieszczanie świeżo wyklutych (w trakcie wymuszonego klucia ) larw lina w basenie podchowowym 34

35 Notatki.. 35

36 Notatki.. 36

37 Pozycje literatury obejmujące tematykę kontrolowanego rozrodu, rozrodu lina, akwakultury lina oraz innych gatunków ryb Berka R The transport of live fish. A review. FAO, Rome. Bieniarz K., Epler P. 11. Rozród ryb. Lettra, Kraków. Billard R., Gatty J.L., Hollebecq M.G., Marcel J., Saad A Biology of gametes, eggs and embryos. Str W: Aquaculture of Cyprinids. Billard R., Marcel J. (red.), INRA, Paryż. Brzuska E., Bieniarz K Metoda przyżyciowego określania stadium dojrzałości samic karpia w związku z iniekcjami homogenatu przysadki mózgowej karpia. IRŚ, Zakł. Upowsz. Post. 105, 28 p. Brzuska E The in vivo method of estimating the stages of oocytes maturation in carp Cyprinus carpio L. Acta Hydrobiol. 21: Caille N., Rodina M., Kocour M., Gela D., Flajšhans M., Linhart O Quantity, motility and fertility of tench Tinca tinca (L.) sperm in relation to LHRH analogue and carp pituitary treatments. Aquacult. Int. 14: Carral J.M., Celada J.D., Sáez-Royuela M., Rodríguez R., Aguilera A., Melendre P Effects of four egg desticking procedures on hatching rate and further survival and growth of larvae in the tench (Tinca tinca L.). Aquacult. Res. 37: Cejko B.I., Żarski D., Targońska K., Krejszeff S., Kucharczyk D., Glogowski J Osmolality of seminal plasma as an indicator of milt contamination with urine based on the example of the tench Tinca tinca (L.). Pol. J. Nat. Sci. 25: Celada J.D., Carral J.M., Rodriguez R., Saez-Royuela M., Aguilera A., Melendre P., Martin J Tench (Tinca tinca L.) larvae rearing under controlled conditions: density and basic supply of Artemia nauplii as the sole food. Aquacult. Int. 15: Coward K., Bromage N.R., Hibbitt O., Parrington J Gamete physiology, fertilization and egg activation in teleost Fish. Rev. Fish Biol. Fish 12: Gela D., Linhart O., Flajšhans M., Rodina M Egg incubation time and hatching success in tench Tinca tinca (L.) related to the procedure of egg stickiness elimination. J. Appl. Ichthyol. 19: Gela D., Flajšhans M., Kocour M., Rodina M., Linhart O Tench (Tinca tinca) broodstock management in breeding station under conditions of pond culture: a review. Aquacult. Int. 14: Geldhauser F. 15. Some aspects of embryonic and larval development of tench (Tinca tinca (L.)). Pol. Arch. Hydrobiol. 42: Gomułka P Anestetyki w hodowli ryb jesiotrowatych. Str W: Innowacyjne techniki oceny biologicznej i ochrony cennych gatunków ryb hodowlanych i raków. Demska-Zakęś K. (red.). IRŚ, Olsztyn. 37

38 Kamler E., Stachowiak J. 12. Egg size and reproductive effort in tench (Tinca tinca (L.)) females from heated waters. Pol. Arch. Hydrobiol. 39: Kokurewicz B The effect of temperature on embryonic development of Tinca tinca (L.) and Rutilus rutilus (L.). Zool. Pol. 20: Korwin-Kossakowski M. 18. Porównanie przebiegu wykluwania u larw karpia (Cyprinus carpio L.) i lina (Tinca tinca L.). Str W: Waluga J. (red.) Wylęgarnia Korzelecka-Orkisz A., Bonisławska M., Pawlos D., Szulc J., Winnicki A., Formicki K Morphophysiological aspects of the embryonic development of tench (Tinca tinca (L.). EJPAU html. Kouřil J., Barth T., Hamáčkowá J., Flegel M Induced ovulation in tench (Tinca tinca L.) by various LH-RH synthetic analogues: effect of site of administration and temperature. Aquaculture 54: Kouřil J., Mraz J., Hamáčkowá J., Barth, T Hormonal induction of tench (Tinca tinca L.) ovulation with the same treatments over two consecutive reproductive seasons. Cybium 32: 61. Kouřil J., Svoboda M., Hamáčková J., Kaláb P., Kolářová J., Lepičová A., Sedova M., Savina L., Moreno Rendón P., Svobodová Z., Barth T., Vykusová B Repeated administration of different hormonal preparations for artificial propagation and their effects on reproduction, survival and blood biochemistry profiles of female tench (Tinca tinca L.). Czech. J. Anim. Sci. 52: Kozłowski B. 14. Praktyka hormonalnej stymulacji rozrodu ryb karpiowatych. Broszura IRŚ, Olsztyn, nr 162. Kucharczyk D., Kujawa R., Mamcarz A., Targońska K., Krejszeff S., Wyszomirska E Artificial spawning of common tench (Tinca tinca L.) collected from wild populations. Pol. J. Nat. Sci. 22: Kujawa R., Kucharczyk D. 16. Przyżyciowe pobieranie oocytów ryb karpiowatych i okoniowatych za pomocą katetera. Komun. Ryb. 4: Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A. 19. A model system for keeping spawners of wild and domestic fish before artificial spawning. Aquacult. Eng. 20: Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A The effect of tannin concentration and egg unsticking time on the hatching success of tench Tinca tinca (L.) larvae. Rev. Fish Biol. Fish. 20: Kujawa R., Kucharczyk D., Mamcarz A., Żarski D., Targońska K Artificial spawning of common tench Tinca tinca (Linnaeus, 1758), obtained from wild and domestic stocks. Aquacult. Int.19: Linhart O., Peter R.E., Rothbard S., Zohar Y., Kvasnička P. 15. Spermiation of common tenth (Tinca tinca L.) stimulated with injection or implantation of GnRH analogues and injection of carp pituitary extract. Aquacult. 129: Linhart O., Billard R. 15. Biology of gametes and artificial reproduction in common tench (Tinca tinca L.). Review. Pol. Arch. Hydrobiol. 42:

39 Linhart O., Gela D., Flajšhans M., Duda P., Rodina M., Novák V Alcalase enzyme treatment for elimination of egg stickiness in tench, Tinca tinca L. Aquaculture 191: Linhart O., Gela D., Flajšhans M., Rodina M. 2003a. Proteolytic enzyme treatment: an improved method for elimination of egg stickiness in tench, Tinca tinca L., in aquaculture. J. Appl. Ichthyol. 19: Linhart O., Rodina M., Gela D., Flajšhans M., Kocour M. 2003b. Enzyme treatment for elimination of egg stickiness in tench (Tinca tinca L.), European catfish (Silurus glanis L.) and common carp (Cyprinus carpio L.). Fish Physiol. Biochem.28: Linhart O., Rodina M., Kocour M., Gela D., 2006a. Insemination, fertilization and gamete management in tench, Tinca tinca (L.). Aquacult. Int. 14: Linhart O., Rodina M., Flajšhans M., Marodiev N., Nebesarova J., Gala G., Kocour M. 2006b. Studies on sperm of diploid and triploid tench, Tinca tinca (L.). Aquacult. Int. 14: Łuczyński M Wykluwanie się ryb. Fizjologia Ryb. Zeszyt 1. ART, Olsztyn. Macrì F., Rapisarda G., Marino G., De Majo M., Aiudi G Use of laparoscopy for the evaluation of the reproductive status of tench (Tinca tinca). Reprod. Domest. Anim. 46: Marking L.L., Meyer F.P., Are better anesthetics needed in fisheries? Fisheries 10: 2-5. Martin P., San Juan L.D., Mario J., Alvariňo R. 13. Early spawning in tench (Tinca tinca (L.)). Pol. Arch. Hydrobiol. 46: Moczarski M., Kołdras M Properties of tench Tinca tinca L. sperm and experiments with freezing it at -196 C. Acta Ichthyol. Piscat. 12: Myszkowski L., Kamiński R., Wolnicki J Response of juvenile tench Tinca tinca (L.) to the anaesthetic 2 phenoxyethanol. J. Appl. Ichthyol. 19: Norma branżowa. BN-68/ Ryby hodowlane. Materiał zarybieniowy lina. Wydawnictwa Normalizacyjne, Warszawa. Norma branżowa. BN-83/ Ryby hodowlane. Przewóz materiału zarybieniowego karpia. Wydawnictwa Normalizacyjne, Warszawa. Penáz M., Wohlgemuth E., Hamáckova J., Kouřil J Early ontogeny of the tench, Tinca tinca. I. Embryonic period. Folia Zool. 30: Penáz M., Wohlgemuth E., Hamáckova J., Kouřil J Early ontogeny of the tench, Tinca tinca. II. Larval period. Folia Zool. 31: Peňaz M.; Proke M.; Kouřil J.; Hamáčková J Influence of water temperature on the early development and growth of the tench, Tinca tinca. Folia Zool. 38: Podhorec P., Socha M., Sokołowska-Mikołajczyk M., Drozd B., Policar T., Stejskal V., Kouřil J Effective dose of mgnrha for induction of ovulation in tench (Tinca tinca L.). Aquaculture: 319: Rodina M., Cosson J., Gela D., Linhart O Kurokura solution as immobilizing medium for spermatozoa of tench (Tinca tinca L.). Aquacult. Int. 12:

40 Rodina M., Gela D., Kocour M., Hadi Alavi S.M., Hulak M., Linhart O Cryopreservation of tench, Tinca tinca, sperm: Sperm motility and hatching success of embryos. Theriogenology 67: Rodríguez R., Celada J.D., Sáez-Royuela M., Carral J.M., Aguilera A., Melendre P.M Artificial reproduction in 1-year-old tench (Tinca tinca L.). J. Appl. Ichthyol. 20: Rodríguez R., Celada J.D., Sáez-Royuela M., Carral J.M., Aguilera A. i Melendre P.M Egg production of tench (Tinca tinca L.) kept in semi-intensive culture conditions. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems: 388 (04). Targońska K., Perkowski T., Żarski D., Krejszeff S., Mamcarz A., Kujawa R., Kucharczyk D Method of evaluation of wild common tench, Tinca tinca (L.), female suitability for artificial reproduction during the spawning season. Italian Journal of Animal Science 11. Von Lukowicz M., Proske Chr Production and reproduction of tench. EIFAC Technical Paper No. 35 Suppl. 1. Woynarovich E., Horváth L The artificial propagation of warm-water finfishes a manual for extension. FAO Technical Paper No Yamamoto T. 1961: Physiology of fertilization in fish ova. Int. Rev. Cytol. 12: Zohar Y., Mylonas C.C Endocrine manipulations of spawning in cultured fish: from hormones to genes. Aquaculture 197: Żarski D The effect of application of new spawning agents in artificial reproduction of wild common tench, Tinca tinca (L.). Pol. J. Nat. Sci. 26: Żuromska H Effect of different thermal regimes on reproductive cycles of tench (Tinca tinca L.). Part VI. estimation of milt quality. Pol. Arch. Hydrobiol 28: Żuromska H. and Markowska, J The effect of sexual products quality on offspring survival and quality in tench (Tinca tinca L.). Pol. Arch. Hydrobiol 31:

41 Receptury Płyn Serra: alkohol etylowy 96% (6 części) formaldehyd 70% (3 części) lodowaty kwas octowy (1 część) Płyn Woynarovicha: 3 g chlorku sodu 4 g mocznika 1 l wody (destylowanej) Skład płynu inaktywującego plemniki (mm wyraża mmol l -1 ): 180 mm NaCl 2,7 mm KCl 1,4 mm CaCl 2 2,4 mm NaHCO 3 z dodatkiem 1,36 mm CaCl 2 2H 2 O WAŻNE: wszystkie składniki należy rozpuścić w wodzie destylowanej. 41

42