Kontrolowany rozród karasia pospolitego - poradnik hodowcy. Autor: Katarzyna Targońska. Recenzent: dr. inż. Daniel Żarski

Transkrypt

1

2 Kontrolowany rozród karasia pospolitego - poradnik hodowcy Autor: Katarzyna Targońska Recenzent: dr. inż. Daniel Żarski Projekt okładki: Szymon Czarnowski Fotografie na okładce: Roman Kujawa ISBN: Pozycja powstała w ramach projektu Innowacje w akwakulturze ryb ze szczególnym uwzględnieniem biotechniki rozrodu ryb Program Operacyjny RYBY (OR OR /09/10/11). Korekta: Agnieszka Szamreta Skład: Sławomir Karetko Druk i oprawa: Białystok, ul. Zwycięstwa 10 tel biuro@partnerpoligrafia.pl

3 Spis treści Wstęp... 4 Pozyskiwanie i transport tarlaków Selekcja i warunki przetrzymywania tarlaków Warunki inkubacji ikry Anestezja Preparaty hormonalne Ocena stadiów dojrzałości oocytów Ocena przydatności samic do stymulowania rozrodu Stymulacja spermacji Stymulacja owulacji Pozyskiwanie gamet Zapłodnienie i pozbawianie jaj kleistości Inkubacja jaj i klucie zarodków Notatki Literatura Receptury

4 Wstęp Karasie należą do rodziny ryb karpiowatych. Naszym rodzimym gatunkiem jest karaś pospolity (Carassius carassius L.). Jego naturalne występowanie historycznie związane jest ze środkową i wschodnią Europą, a także zachodnią, północną i centralną Azją. Karaś pospolity zasiedla niemal wszystkie wody śródlądowe: jeziora, stawy oraz rzeki o spokojnym nurcie, starorzecza czy glinianki. Jego występowaniu sprzyjają niewielka głębokość zbiorników i duża ilość roślinności zanurzonej, na której składa ikrę w kilku porcjach w ciągu sezonu. Dojrzałość płciową samice osiągają zazwyczaj w wieku w wieku 3-5 lat. Do tarła przystępują, gdy temperatura wody przekroczy 14 C. Trwa ono zazwyczaj od maja do lipca. Płodność tego gatunku jest bardzo zróżnicowana i silnie powiązana z wielkością osobniczą. Chociaż wykazano wysoką odporność karasi na zanieczyszczenia, to podobnie jak w przypadku innych gatunków mogą one negatywnie wpłynąć na sukces rozrodczy. Występowanie karasi w Polsce od lat podlega niekorzystnym zmianom. Siedliska, które niegdyś były typowe dla karasia pospolitego, są systematycznie zajmowane przez jego wschodniego kuzyna, karasia srebrzystego (Carassius gibelio), introdukowanego na terenie Polski i wypierającego nasz rodzimy gatunek. Karaś srebrzysty doskonale zaaklimatyzował się w naszych wodach. Pomimo zbliżonej odporności na niekorzystne warunki środowiskowe obu gatunków to właśnie on wygrywa konkurencję o zasoby, a podstawą ostatecznego sukcesu jest strategia rozrodcza. Zdobywanie przez niego przewagi liczebnej w zespołach ichtiofauny w danych zbiornikach wynika m.in. z szybszego tempa klonalnego rozrodu karasia srebrzystego. Wykorzystuje on do rozrodu nasienie innych ryb karpiowatych, jak na przykład karasia pospolitego. Wchodząc w tego typu kontakt rozrodczy, jakim jest gynogeneza, karaś srebrzysty zakłóca tarło rodzimych ryb karpiowatych. W konsekwencji obniża się odsetek zapłodnionych jaj tych gatunków, które zostały wykorzystane do gynogenezy. Zmniejszenie sukcesu rozrodczego ryb współwystępujących wynika też z tego, iż karaś srebrzysty żeruje na ich ikrze. Efektem jest wypieranie wielu rodzimych gatunków, w tym karasia pospolitego. Pod względem liczby stanowisk C. gibelio przewyższył obecnie C. carassius. Na Pomorzu karaś pospolity już niemalże nie występuje, natomiast na Mazurach w bardzo wielu zbiornikach bytuje jego skarłowaciała forma. Ekspansja karasia srebrzystego skłania do opracowania i wdrożenia nowoczesnych technik rozrodu i produk- 4

5 cji materiału zarybieniowego karasia pospolitego w celach ochrony całego gatunku oraz konkretnych populacji. Karaś pospolity był prawdopodobnie jednym z pierwszych gatunków hodowanych (chowanych) w stawach na terenie Polski. Głównym tego powodem była wysoka odporność tych ryb na niekorzystne warunki środowiska i możliwość przetrzymywania ich w małych, płytkich stawach, w których inne gatunki nie były w stanie przetrwać, np. z powodu pojawiających się przyduch. Inną przyczyną zainteresowania tym gatunkiem były wysoko cenione walory kulinarne karasia. Niemożliwe wydaje się dziś ocenienie skali chowu w pierwszych wiekach, jednak wiadomo, że źródła historyczne traktują o jego hodowli już w XIII w., choć większość informacji dotyczy XVI i XVII w., kiedy stała się ona bardzo popularna ze względu na liczne dni postne w ciągu roku. Sprzyjało to rozpowszechnieniu karasia pospolitego na terenie Polski. W wielu przypadkach hodowla karasi pospolitych nadal jest prowadzona w sposób ekstensywny i w oparciu o rozród naturalny w stawach. Nie jest to korzystne z kilku ważnych powodów. Efekty tarła naturalnego są nieprzewidywalne, co wiąże się z brakiem możliwości planowania produkcji. Brak wiedzy o ilości materiału zarybieniowego, jaka zostanie uzyskana, nie pozwala np. na rozsądne zarządzanie produkcją, kontrolę jej ilości i jakości czy też prowadzenie programów hodowlanych opartych na selektywnym krzyżowaniu. Dążyć do rozmnażania ryb, w tym karasia pospolitego, w sposób w pełni kontrolowany należy też z innych powodów. Opanowanie takiej technologii produkcji pozwala łatwo łączyć pary tarłowe w dowolny sposób. Dysponując własnym stadem tarłowym, nie tylko uniezależniamy się od odłowu tarlaków z wód otwartych, lecz także możemy skuteczniej troszczyć się o środowisko. Posiadanie poznakowanych tarlaków pochodzących z różnych populacji umożliwia dbanie o jeden z ekologicznych celów zarybień, jakim powinna być nie tylko ochrona gatunku, ale również ochrona konkretnych populacji. Ich mieszanie jest zagrożeniem, o którym często się zapomina. Tymczasem wprowadzanie ryb pochodzących z innych wód nie jest obojętne, lecz niesie za sobą negatywne skutki dla środowiska. Unikalna, wykształcona w drodze doboru pula genów danej populacji z powodu wprowadzania obcych genów ulega zmianie, a co za tym idzie niszczona jest bioróżnorodność na poziomie genetycznym. Opanowanie i wdrożenie biotechniki kontrolowanego rozrodu karasia w ostatnich latach nabrało szczególnego znaczenia, ponieważ rola tego gatunku wzrasta zarówno z perspektywy produkcji komercyjnej, jak i z powodu konieczności planowania programów restytucyjnych. 5

6 Pozyskiwanie i transport tarlaków Istnieje możliwość pozyskania tarlaków karasia zarówno z hodowli stawowych (prowadzonych w stawach typu karpiowego), jak również odłowienia ich z wód otwartych. W obu przypadkach odłów zaleca się przeprowadzać podczas trwania sezonu reprodukcyjnego, kiedy woda osiągnie temperaturę około C. Sugerowanymi narzędziami do połowu tarlaków karasia są agregat prądotwórczy i narzędzia pułapkowe (żaki), gdyż ryby odłowione w ten sposób charakteryzują się najmniejszą ilością uszkodzeń. Wszystkie manipulacje na tarlakach należy prowadzić z zachowaniem szczególnej ostrożności, a transport rozpocząć natychmiast po odłowie ryb i skrócić go do niezbędnego minimum (rozpocząć tuż po załadunku). Normy transportowe (BN-75/ ) podają jedynie wytyczne dotyczące narybku i kroczka karasi (pospolitego oraz srebrzystego) transportowanych w zbiornikach z napowietrzaniem i bez napowietrzania, a nie obejmują tarlaków, dlatego podczas przewozu reproduktorów tego gatunku należy stosować się do ogólnie przyjętych zasad transportu. Tarlaki karasia można przewozić, podobnie jak inne ryby, w basenach albo w workach. Zagęszczenie ryb i ilość wody uzależnione będą od wybranej metody transportu, tego, czy woda jest napowietrzana, czy też nie, oraz od czasu i temperatury wody, w jakiej przewozimy tarlaki. W temperaturach niższych można transportować większą ilość ryb, dlatego podczas przewozu, szczególnie w workach, w których objętość wody jest mniejsza, jej temperatura powinna być kontrolowana. Najmniej problematyczny jest transport ryb w basenach wyposażonych w system natleniający wodę. Zbiorniki takie wykonane muszą być z materiałów, które nie mają szkodliwego wpływu na ryby. Planując transport warto pamiętać o tym, że wielkość ryb wpływa na zużycie tlenu (1 kg ryb mniejszych zużywa więcej tlenu niż 1 kg ryb większych). Ponadto na konsumpcję tlenu wpływa dojrzałość płciowa (tarlaki mają większe zapotrzebowanie na tlen niż osobniki niedojrzałe tej samej wielkości), a także wypełnienie przewodu pokarmowego. Ryby powinny mieć puste przewody pokarmowe (tych o długości powyżej 20 cm nie powinniśmy żywić przez 72 godziny), czego nie da się kontrolować w przypadku pozyskiwania tarlaków z wód otwartych bądź bezpośrednio ze stawów ziemnych. Powinniśmy to uwzględnić, zmniejszając zagęszczenie ryb. Przewożąc ryby w workach, należy je umieścić w pozycji poziomej. Ponieważ przy tym rodzaju transportu ryby dysponują ograniczoną ilością tlenu, dostarczonego przed zawiązaniem worka, to dłuższy przewóz wiąże się z koniecznością wymia- 6

7 ny tlenu i wody. Przy pierwszych objawach zaniepokojenia i słabnięcia ryb, a także po 16 godzinach transportu wymienić należy około ½ objętości wody, a także cały tlen. Jeżeli dla danego gatunku nie wyznaczono norm transportowych, to można zastosować normy przewidziane dla blisko spokrewnionego gatunku. W przypadku karasia można posiłkować się normami przewidzianymi dla karpia (tabela 1, tabela 2). Tabela 1. Zapotrzebowanie na wodę w litrach przy przewozie 1 kg tarlaków karpia w zbiornikach bez napowietrzania (wg BN-83/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] do Tabela 2. Zapotrzebowanie wody w litrach przy przewozie 1 kg tarlaków karpia w zbiornikach z napowietrzaniem (wg BN-83/ ) Temperatura wody [ C] Czas trwania przewozu [h] Rys. 1. Transport tarlaków w basenach z napowietrzaniem (fot. R. Kujawa) 7

8 Selekcja i warunki przetrzymywania tarlaków W wylęgarni należy dokonać selekcji ryb pod względem ich przydatności do tarła. Tarlaki powinny charakteryzować się dobrą kondycją oraz brakiem uszkodzeń powłok ciała. Nie zaleca się używania ryb młodszych niż 3-letnie (3+), a jeszcze korzystniej będzie, jeśli samice osiągną wiek 5+ i masę powyżej 200 g. Samice przeznaczane do tarła powinny mieć silnie zaokrąglone powłoki brzuszne, a ich przydatność do rozrodu zaleca się dodatkowo skontrolować przy pomocy cewnika (patrz str ). Ryby należy rozdzielić według płci, a następnie samice i samce umieścić w oddzielnych zbiornikach. Pomimo że karasie są w stanie przebywać w większych zagęszczeniach, to w przypadku tarlaków nie powinno ono przekraczać 20 kg/1 m 3. Zbiorniki w których przetrzymujemy ryby przed kontrolowanym tarłem, muszą być wyposażone w elementy dające możliwość regulowania kilku parametrów. Długość dnia świetlnego należy ustalić na 16 godzin (16h L:8h D), a ilość tlenu rozpuszczonego w wodzie nie powinna spadać poniżej 6 ppm (jego stężenie powinno być kontrolowane minimum dwukrotnie w ciągu doby), co zapewni dodatkowe napowietrzanie wody. Temperatura w jakiej przetrzymywane są tarlaki przed stymulacją hormonalną, powinna wynosić 17 C. Jeżeli transport prowadzony był w temperaturach różniących się o ponad 2 C od wymaganych, to należy przeprowadzić aklimację ryb, stosując się do zasady, iż zmiany temperatury wody nie powinny przebiegać w tempie szybszym niż 1 C na godzinę. W trakcie prowadzenia kontrolowanego rozrodu do przetrzymywania tarlaków karasia z powodzeniem można stosować systemy przepływowe lub pracujące w zamkniętym obiegu wody. W takim systemie może się znajdować kilka zbiorników, jednakże do rozrodu karasia potrzebne będą minimum dwa: każdy przeznaczony dla jednej płci. Pojemność basenów dla tarlaków powinna wynosić od około 0,6 do 1,0 m 3. Oprócz zbiorników tarlakowych w układzie istotny jest także górny oraz dolny zbiornik retencyjny, każdy o pojemności około 1,0 m 3. Woda znajdująca się w górnym zbiorniku retencyjnym jest podgrzewana (znajdują się tu elementy grzewcze oraz czujniki temperatury podłączone do termoregulatora) i może być też w tym miejscu dodatkowo natleniana lub napowietrzana. Termoregulator powinien umożliwiać regulację temperatury w zakresie od 15 do 22 C z dokładnością do ± 0,1 C. Urządzenie natleniające powinno zapewniać natlenienie na poziomie nie niższym niż 80%. Z górne- 8

9 go zbiornika woda grawitacyjnie doprowadzana jest przez rurki do basenów tarlakowych, w których również może być prowadzone jej natlenianie. Nad basenami powinno się zamontować lampy jarzeniowe podłączone do zegara sterującego, dzięki któremu regulowana jest długość dnia świetlnego. Z basenów tarlakowych woda odpływa i jest gromadzona w dolnym zbiorniku retencyjnym. Dalej przy pomocy pompy tłoczona jest do górnego zbiornika retencyjnego, przepływając przez elementy systemu oczyszczania wody: filtr mechaniczny i sterylizator UV. Dodatkowymi elementami zapewniającymi bezpieczeństwo są dwa przelewy awaryjne, którymi może zostać odprowadzony nadmiar wody z górnego i dolnego zbiornika retencyjnego. Rys. 2. Uproszczony schemat obiegu służącego do krótkookresowego przetrzymywania tarlaków (Żarski, Krejszeff 2011, zmodyfikowany): 1 dopływ wody do obiegu; 2 doprowadzenie wody z górnego zbiornika retencyjnego do basenów tarlakowych; 3 odpływ wody z basenów tarlakowych do dolnego zbiornika retencyjnego; 4 filtr zewnętrzny (mechaniczny), przez który woda odprowadzana jest z dolnego do górnego zbiornika retencyjnego; 5 lampa UV; 6 odpływ z górnego zbiornika retencyjnego do dolnego zbiornika retencyjnego (tzw. przelew awaryjny); 7 odpływ wody z systemu; 8 termoregulator; 9 grzałka, spirala chłodząca lub inny wymiennik ciepła; 10 butla z tlenem; 11 rozpylacze (dyfuzory) gazów; 12 oświetlenie; 13 baseny tarlakowe; 14 górny zbiornik retencyjny; 15 dolny zbiornik retencyjny; 16 stelaż Na potrzeby prowadzenia manipulacji związanych z rozrodem kontrolowanym dodatkowe niezbędne wyposażenie stanowią: kasar do odłowu tarlaków, zbiorniki do usypiania/odpijania ryb o pojemności dm 3, stół manipulacyjny. 9

10 Warunki inkubacji ikry W trakcie prowadzenia inkubacji ikry karasia powinno się stosować system pracujący w zamkniętym lub częściowo otwartym obiegu wody, wyposażony w aparaty inkubacyjne typu Weissa (albo inne o pionowym, odwróconym przepływie wody, np. McDonalda). W skład systemu, oprócz aparatów, powinien wchodzić górny zbiornik retencyjny, wyposażony w urządzenia natleniające i utrzymujące wymaganą temperaturę wody. Oprócz elementu grzewczego w zbiorniku tym musi znajdować się czujnik temperatury podłączony do termoregulatora. Termoregulator ma za zadanie umożliwiać sterowanie temperaturą w zakresie od 15 C do 30 C z dokładnością do ± 0,1 C. Urządzenie natleniające znajdujące się w górnym zbiorniku retencyjnym powinno zapewniać natlenienie na poziomie nie niższym niż 80%. Odpowiednio natleniona i podgrzana do żądanej temperatury woda wypływa grawitacyjnie z górnego zbiornika i zasila aparaty inkubacyjne. Przepływ wody odbywa się w omawianych słojach od dołu ku górze, a jego wielkość jest regulowana przy pomocy zaworów. Ze słojów woda odpływa do dolnego zbiornika retencyjnego poprzez odbieralnik, który może pełnić również funkcję podchowalnika larw. Zamontowane nad nim lampy jarzeniowe są podłączone do zegara sterującego długością dnia świetlnego. Przepływ wody z dolnego do górnego zbiornika retencyjnego wymuszany jest przy pomocy pompy, a woda przepływa przez elementy systemu jej oczyszczania: filtr mechaniczny i sterylizator UV. W układzie powinny być też zamontowane dwa przelewy awaryjne, którymi może zostać odprowadzony nadmiar wody z górnego i dolnego zbiornika retencyjnego. 10

11 Rys. 3. Uproszczony schemat obiegu do inkubacji i wstępnego podchowu larw (Żarski, Krejszeff 2011, zmodyfikowany): 1 dopływ wody do obiegu; 2 doprowadzenie wody z górnego zbiornika retencyjnego do słojów inkubacyjnych; 3 słoje inkubacyjne Weissa; 4 odpływ wody z odbieralnika/podchowalnika do dolnego zbiornika retencyjnego; 5 filtr mechaniczny; 6 filtr zewnętrzny, przez który woda jest przetłaczana z dolnego do górnego zbiornika retencyjnego; 7 lampa UV; 8 awaryjny odpływ wody z górnego zbiornika retencyjnego do dolnego zbiornika retencyjnego (tzw. przelew awaryjny); 9 odpływ wody z obiegu; 10 termoregulator; 11 grzałka, spirala chłodząca lub inny wymiennik ciepła; 12 oświetlenie; 13 odbieralnik/ podchowalnik larw; 14 górny zbiornik retencyjny; 15 dolny zbiornik retencyjny; 16 stelaż 11

12 Anestezja Anestetyki zaleca się stosować m.in. po to, aby zmniejszyć negatywne efekty stresu wywoływanego np. podczas kontroli dojrzałości tarlaków czy pozyskiwania produktów płciowych. Środki używane do wprowadzenia ryb w stan znieczulenia podawane są zazwyczaj poprzez imersję. Ryby umieszcza się w kąpieli wodnej zawierającej właściwą dawkę anestetyku i przetrzymuje w niej aż do momentu wywołania u nich znieczulenia ogólnego. Istotne jest właściwe dobranie rodzaju anestetyku i jego dawki. Dokładne dawki dobrać należy doświadczalnie, gdyż skuteczne stężenie anestetyku zależy od wielu różnych czynników: temperatury wody (w wyższej temperaturze działanie preparatów znieczulających jest silniejsze), wielkości ryb (większe/starsze ryby są z reguły mniej wrażliwe niż mniejsze/ młodsze), liczby wcześniejszych uśpień (częste usypianie może powodować zmniejszenie wrażliwości ryb i wydłużyć czas indukcji) czy kondycji ryb. Dawka musi być dobrana tak, żeby tarlaki osiągnęły stan anestezji chirurgicznej w krótkim czasie (do 3-5 minut), a po trwającej kwadrans ekspozycji wybudzały się w czasie nie dłuższym niż 10 minut. Testujemy najpierw mniejsze z podanych poniżej dawek i ewentualnie je zwiększamy, jeśli efekt nie jest zadowalający. W przypadku gdy czas indukcji znieczulenia ogólnego jest krótszy niż 2 minuty, to należy przyjąć, że stężenie roztworu znieczulającego jest zbyt duże i należy je zmniejszyć. Istnieje wiele środków i substancji znieczulających stosowanych dla ryb w badaniach naukowych lub w innych krajach, jednakże do usypiania karasi w praktyce rybackiej w Polsce polecić można przede wszystkim MS-222. Jest to preparat służący do wywoływania znieczulenia ogólnego, zarejestrowany w Norwegii i dopuszczony do użycia w Unii Europejskiej. Ma postać białego, krystalicznego proszku, którego zalecane dawkowanie to ppm ( mg/dm 3 ). Działanie tego preparatu charakteryzuje krótki czas indukcji i wybudzania, ale jego wadę stanowi stosunkowo wysoka cena. 12

13 Preparaty hormonalne W badaniach naukowych dotyczących rozrodu karasia pospolitego stosowano kilka rodzajów preparatów hormonalnych. Działając na poziomie gonad, owulację można wywołać dzięki podawaniu w postaci dootrzewnowej iniekcji z CPH w ilości 3 mg/kg masy ciała samicy (w dwóch dawkach podanych w odstępie 12 godzin wynoszących odpowiednio 10% i 90%). Inna metoda stymulowania finalnego dojrzewania oocytów oraz owulacji polega na działaniu na poziomie przysadki. Czynność tego gruczołu można stymulować przez podawanie gonadoliberyn (GnRH) lub ich syntetycznych analogów. Najlepiej, jeśli dostarczane są one do organizmu w połączeniu ze związkami hamującymi działanie dopaminy (DA), gdyż to właśnie dopamina ogranicza aktywność gonadotropową przysadki. Takie preparaty skutecznie stymulują finalne dojrzewanie i owulację wielu różnych gatunków ryb, w tym karasia pospolitego. Najlepsze rezultaty w badaniach naukowych osiągano, podając samcom karasia dootrzewnowo preparat zawierający 5 μg łososiowego analogu sgnrha [(D-Arg 6, Pro 9 Net)-sGnRH] i 2,5 mg domperidonu w przeliczeniu na kilogram masy ciała. Przy takiej stymulacji samce oddawały największą ilość najwyższej jakości nasienia. Z kolei najlepsze efekty stymulacji samic (wyrażone odsetkiem owulujących ryb oraz przeżywalnością embrionów do stadium zaoczkowania) uzyskano, wykonując dwie iniekcje dootrzewnowe. Pierwszą z preparatu zawierającego 3,6-4 μg ssaczego analogu mgnrha [(D-Arg 6, Pro 9 Net)-sGnRH] w połączeniu z 1,6-2 mg metoklopramidu w przeliczeniu na kilogram masy ciała. Po 12 godzinach podawano drugą iniekcję z preparatu zawierającego 10 μg łososiowego analogu sgnrha [(D-Arg 6, Pro- 9 Net)-sGnRH] wraz z 5 mg domperidonu/kg. O ile w badaniach naukowych do stymulowania rozrodu ryb używana jest cała gama preparatów, to w praktyce rybackiej ich stosowanie napotyka szereg ograniczeń prawnych. Ponieważ zgodnie z dyrektywą 2001/82/WE nie wolno stosować w stosunku do zwierząt żadnych preparatów niezarejestrowanych jako produkty lecznicze, podawanie rybom ekstraktu z przysadek mózgowych jest niedozwolone. W związku z tym nie należy stosować przysadek mózgowych ani preparatów na nich opartych (np. CPE, CPH) w rozrodzie karasia, gdyż nie jest to produkt leczniczy w rozumieniu ww. przepisów. Do stymulowania rozrodu tego gatunku (oczywiście wyłącznie pod nadzorem lekarza weterynarii) sugeruje się użycie preparatów opartych na gonadoliberynach albo ich syntetycznych analogach w połączeniu ze związkami antydopaminowymi, pod warunkiem iż są one zawarte w preparatach, które zostały zarejestrowane na terenie przynajmniej jednego z krajów UE. 13

14 Ocena stadiów dojrzałości oocytów W przypadku ryb karpiowatych stosowany jest czterostopniowy system oceny dojrzałości oocytów, który pozwala określić, czy powinno się poddawać tarlaki (samice) stymulacji hormonalnej. Oceniane są oocyty pobrane przy pomocy cewnika i poddane klaryfikacji w płynie Serra (patrz: receptury, str. 33). System oceny jest oparty na określeniu położenia jąder komórkowych względem błony komórkowej i wyróżnia cztery stadia: I stadium oocyty z jądrami położonymi centralnie, II stadium wczesnej migracji jądra (jądra przesunięte nie dalej niż do połowy średnicy oocytu), III stadium późnej migracji jądra (jądra przesunięte poza połowę średnicy oocytu), IV stadium oocyty z jądrami położonymi peryferyjnie (na obrzeżu oocytu). Rys. 4. Stadia dojrzałości oocytów opisane dla ryb karpiowatych (za Brzuską i Bieniarzem 1977) 14

15 W przypadku wielu gatunków ryb o tarle jednoporcyjnym stopień dojrzałości pobranych w trakcie sezonu rozrodczego komórek jajowych jest zbliżony i klasyfikacja oocytów na podstawie położenia jądra nie przysparza problemów. Karaś pospolity jest jednak gatunkiem o tarle porcyjnym, dlatego oocyty w jajnikach mogą znajdować się w więcej niż jednym stadium dojrzałości. Aby ocenić przydatność samic karasia do tarła, należy kierować się zasadą, iż ocena stopnia dojrzałości komórek jajowych powinna dotyczyć tylko największych spośród pobranych komórek (rys. 5). Ponadto do rozrodu w trakcie sezonu rozrodczego najlepiej jest przeznaczyć samice, u których stwierdzono, że największe oocyty (o średnicy równej lub powyżej 1 mm) stanowią ponad 10% wszystkich oocytów. Rys. 5. Oocyty karasia pospolitego prześwietlone w płynie Serra. W celu oceny stopnia dojrzałości samic klasyfikacji poddaje się wyłącznie oocyty o największej średnicy (fot. D. Żarski) 15

16 Ocena przydatności samic do stymulowania rozrodu Wymagane odczynniki i akcesoria wanienka do anestezji, wanienka do odpijania anestetyk ręcznik kateter CH06 strzykawka o pojemności 10 ml płyn Serra szalki Petriego mikroskop stereoskopowy Uwagi Przydatność samic do rozrodu należy ocenić tuż po przywiezieniu ich do wylęgarni, gdyż stymulację hormonalną powinno się przeprowadzać 2-3 dni po odłowieniu tarlaków. Najpierw trzeba ocenić, czy powłoki brzuszne samicy są silnie zaokrąglone i do tarła przeznaczyć tylko takie, u których stwierdzono tę cechę. Aby dodatkowo zweryfikować przydatność samic do tarła, powinno się zastosować ocenę stopnia dojrzałości największych oocytów. W tym celu należy: wprowadzić samicę w stan znieczulenia ogólnego, rybę ułożyć na stole manipulacyjnym na wilgotnym ręczniku, do otworu płciowego wprowadzić końcówkę zamocowanego na strzykawce katetera (cewnika), na głębokość nie większą niż połowa odległości pomiędzy końcem płetwy piersiowej i nasadą płetwy brzusznej, odciągnąć tłoczek strzykawki i zassać niewielką próbkę oocytów (około 50 szt.), samicę umieścić w odpijalniku wyposażonym w system napowietrzania, a po wybudzeniu przenieść z powrotem do basenu tarlakowego przeznaczonego dla samic, oocyty umieścić na szalce Petriego i zalać cienką warstwą płynu Serra, a po około 5 minutach, kiedy zwiększy się przejrzystość osłonek oocytów, każdą próbkę należy umieścić pod mikroskopem stereoskopowym w celu określenia pozycji jądra w największych oocytach, do dalszych stymulacji (fototermicznej i hormonalnej) należy przeznaczyć tylko te samice, u których największe oocyty zostały zaklasyfikowane do II, III lub IV stadium dojrzałości. Aby uzyskać najwyższą przeżywalność zarodków do stadium zaoczkowania, hormonalną stymulację samic należy przeprowadzać najpóźniej w trzecim dniu po ich odłowieniu. 16

17 Rys. 6. Samica karasia pospolitego i cewnik (kateter) służący do podciśnieniowego pozyskiwania próbek ikry (fot. D. Żarski) 17

18 Stymulacja spermacji Wymagane odczynniki i akcesoria anestetyk wanienka do anestezji, wanienka do odpijania waga ręcznik igły 0,7 x 40 mm strzykawki o pojemności 2 ml płyn fizjologiczny preparat hormonalny Uwagi Hormonalną stymulację samców należy przeprowadzić 24 godziny przed spodziewaną owulacją samic. Zalecany rodzaj stymulacji hormonalnej samców został przedstawiony w tab. 3. W celu przeprowadzenia stymulacji spermacji należy postępować według następującej procedury: samca wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego, rybę zważyć z dokładnością do 10 g, a następnie ułożyć na stole manipulacyjnym na wilgotnym ręczniku, przeprowadzić iniekcję dootrzewnową pod płetwę brzuszną: igłę wprowadzić pod kątem około stopni do linii ciała na głębokość około 5 mm, wstrzyknąć odpowiednią ilość preparatu hormonalnego, zgodną z dawką podaną w tab. 3, umieścić samca w odpijalniku, a po wybudzeniu przenieść do basenu tarlakowego przeznaczonego dla samców, po wykonaniu iniekcji temperaturę wody stopniowo podnieść z 17ºC do 20ºC i utrzymać aż do momentu pobrania nasienia, zmiany temperatury wody dokonywać w tempie nie szybszym niż 1 C na godzinę. Przez cały okres stymulowania spermacji długość dnia świetlnego powinna wynosić 16 godzin. Tabela 3. Dawkowanie preparatu służącego stymulowaniu spermacji karasia pospolitego (Cejko i in. 2012) Iniekcja Składnik Dawka Pobieranie nasienia sgnrha 5 μg kg godziny po stymulacji I domperidon 2,5 mg kg -1 hormonalnej 18

19 19 Rys. 7. Anestezja tarlaków karasia (pospolitego i złotej rybki) oraz iniekcja wykonywana pod płetwę brzuszną karasia pospolitego (fot. A D. Kucharczyk, fot. B D. Żarski)

20 Stymulacja owulacji Wymagane odczynniki i akcesoria wanienka do anestezji, wanienka do odpijania anestetyk waga ręcznik igły 0,7 x 40 mm strzykawki o pojemności 2 ml płyn fizjologiczny (0,9% NaCl) 2 preparaty hormonalne homogenizator lub moździerz Uwagi Aby uzyskać najwyższą przeżywalność zarodków do stadium zaoczkowania, stymulację hormonalną tarlaków (samic) zacznij przeprowadzać nie później niż 2-3 dni po ich odłowieniu. Zalecany wariant stymulacji hormonalnej samic przedstawiony został w tab. 4. Prawidłową stymulację owulacji ułatwi postępowanie według następującej procedury: jeżeli składniki preparatu hormonalnego nie są dostępne w formie płynnej, to należy je starannie rozetrzeć przy pomocy homogenizatora lub moździerza w płynie fizjologicznym, samicę należy wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego, rybę zważyć z dokładnością do 10 g, a następnie ułożyć na stole manipulacyjnym na wilgotnym ręczniku, przeprowadzić I iniekcję dootrzewnową pod płetwę brzuszną: igłę wprowadzić pod kątem około stopni do linii ciała na głębokość około 5 mm, wstrzyknąć odpowiednią ilość preparatu hormonalnego nr 1, zgodną z dawką podaną w tab. 4, samicę umieścić w odpijalniku, a po wybudzeniu przenieść do basenu tarlakowego, po 12 godzinach od I iniekcji samicę ponownie wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego, rybę ułożyć na stole manipulacyjnym, przeprowadzić II iniekcję dootrzewnową pod płetwę brzuszną, podając odpowiednią ilość preparatu hormonalnego nr 2, zgodną z dawką podaną w tab. 4, samicę umieścić w odpijalniku, a po wybudzeniu przenieść do basenu tarlakowego, po II iniekcji temperaturę wody w basenie podnieść stopniowo (w tempie nieprzekraczającym 1ºC na godzinę) z 17ºC do 21 C, 20

21 przez cały okres stymulowania owulacji długość dnia świetlnego powinna wynosić 16 godzin, kontrolę owulacji należy rozpocząć po 14 godzinach od przeprowadzenia drugiej iniekcji, w przypadku braku owulacji następne przeglądy należy wykonywać w czterogodzinnych odstępach czasu. Tabela 4. Dawkowanie preparatów służących stymulowaniu owulacji karasia pospolitego (Targońska i in. 2012) Iniekcja Składnik Dawka I II mgnrha 4 μg kg -1 metoklopramid 2 mg kg -1 sgnrha 10 μg kg -1 domperidon 5 mg kg -1 Interwał pomiędzy iniekcjami 12 h 21

22 Pozyskiwanie gamet Wymagane odczynniki i akcesoria wanienka do anestezji, wanienka do odpijania anestetyk ręczniki o wysokiej chłonności wody (np. tetrowe) strzykawki o pojemności 2 ml sucha miska mikroskop stereoskopowy Uwagi Ikrę karasia pozyskuje się partiami, więc po pierwszym pozyskaniu ikry owulację samic należy skontrolować jeszcze dwukrotnie (co 4-5 h) i pozyskać kolejne porcje ikry. W związku z tym podczas pobierania nasienia nie należy pozyskiwać jego całej objętości od danego samca. Pozyskiwanie gamet przebiegać powinno zgodnie z poniższymi wskazówkami: samca wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego, rybę ułożyć na stole manipulacyjnym, osuszyć powłoki brzuszne, płetwy odbytową i ogonową oraz brodawkę płciową i wykonać masaż powłok brzusznych, pozyskać nasienie do strzykawki i umieścić je w lodówce, samca umieścić w odpijalniku wyposażonym w system napowietrzania, a po wybudzeniu przenieść z powrotem do basenu tarlakowego przeznaczonego dla samców, po pozyskaniu nasienia od wszystkich samców z nasienia każdego samca pobrać niewielką próbkę, każdą próbkę nasienia umieścić pod mikroskopem na szkiełku podstawowym (obiektyw x 20) i aktywować ruch plemników, dodając wodę wylęgarniczą, po maksymalnie 10 s od aktywacji plemników dokonać oceny odsetka ruchliwych plemników, do dalszych procedur przeznaczyć nasienie charakteryzujące się 80% ruchliwych plemników, samicę wprowadzić w stan znieczulenia ogólnego, rybę ułożyć na stole manipulacyjnym, osuszyć powłoki brzuszne, płetwy odbytową i ogonową oraz brodawkę płciową, ikrę pozyskać (poprzez delikatny masaż powłok brzusznych) do suchej miski i pozostawić pod przykryciem nie dłużej niż 1 godzinę po pobraniu, samicę umieścić w odpijalniku wyposażonym w system napowietrzania, a po wybudzeniu przenieść z powrotem do basenu tarlakowego przeznaczonego dla samic. 22

23 23 Rys. 8. Kontrola owulacji oraz spermacji, pozyskiwanie ikry od samicy karasia pospolitego (fot. D. Żarski)

24 Zapłodnienie i pozbawianie jaj kleistości Wymagane odczynniki i akcesoria plastikowe łyżki pojemnik na wodę woda destylowana (lub RO) woda wylęgarnicza płyn Woynarovicha, tanina waga szalka Petriego Uwagi Zapładniając jaja mieszaniną nasienia uzyskanego od wielu samców, uzyskuje się lepsze efekty hodowlane Temperatura płynu Woynarovicha i roztworu taniny powinna być taka sama jak temperatura wody w aparatach inkubacyjnych. Przed umieszczeniem w aparatach inkubacyjnych należy: odważoną porcję ikry zmieszać delikatnie łyżką z ustaloną porcją nasienia, na każde 100 g ikry należy dodać minimum 1 cm 3 mieszaniny nasienia pozyskanego od minimum 5 samców, do połączonych gamet dodać niewielką ilość roztworu Woynarovicha sporządzonego z wykorzystaniem wody destylowanej (lub tzw. RO, czyli po odwróconej osmozie) i przeprowadzić zapłodnienie, w trakcie zapłodnienia ikrę intensywnie mieszać przez około 1 minutę, wykonać rozklejającą kąpiel zapłodnionych jaj roztworem Woynarovicha: do zapłodnionych jaj dodać roztwór w ilości około 10-20% objętości jaj i nieprzerwanie, delikatnie mieszać plastikową łyżką, w kilkunastominutowych odstępach, nieustannie mieszając, dodawać kolejne porcje płynu (uprzednio odlawszy część roztworu znad ikry), po godzinie (do 1,5 godziny) od rozpoczęcia mieszania i po kilkukrotnej wymianie roztworu Woynarovicha należy zlać roztwór znad ikry, ikrę dwukrotnie przepłukać roztworem taniny o stężeniu 6 g dm -3 : za pierwszym razem przez 20 sekund, za drugim przez 10 sekund, każdorazowo zlewając po tym czasie roztwór znad ikry i przemywając ją dużą ilością wody wylęgarniczej, w celu sprawdzenia, czy ikra została prawidłowo rozklejona, nabrać niewielką porcję jaj na szalkę Petriego, po chwili spróbować zlać je, sprawdzając, czy się do niej przykleją. Jeśli nie, umieścić ikrę w aparatach inkubacyjnych, jeśli próba kleistości wypadnie negatywnie (ikra się klei), powtórzyć kąpiel w roztworze Woynarovicha przez około 30 min, a następnie jednokrotnie przepłukać ikrę w roztworze taniny przez 10 sekund, po czym przepłukać ją wodą wylęgarniczą i dopiero wówczas umieścić ikrę w aparatach inkubacyjnych. 24

25 Rys. 9. Łączenie gamet karasia, zaplemnienie, mechaniczne rozklejanie w płynie Woynarovicha oraz kontrola stopnia pozbawienia ikry kleistości na szalce Petriego (fot. D. Żarski) 25

26 Inkubacja jaj i klucie zarodków Wymagane odczynniki i akcesoria wąż gumowy słoje inkubacyjne miski ramki inkubacyjne aparaty podchowowe Uwagi Ikra karasia rozwija się w sposób normalny w temperaturach od 15 C do 28 C. Zaleca się przeprowadzać inkubację w temperaturze 21 C. Czas inkubacji zależy od temperatury wody i wynosi ponad 4 dni w 21 C, a 2 dni w 27 C (95 D przy 21,5 C). Podczas inkubacji jaj i klucia zarodków sugeruje się: temperaturę wody w obiegu ustalić na 21,5 C, zakręcić dopływ wody do słoja inkubacyjnego, przy pomocy węża gumowego zlewarować z niego około ½ - ¾ objętości wody, napęczniałą ikrę obsadzić na aparaty inkubacyjne, zajmując nie więcej niż 40% objętości słoja, odkręcić dopływ wody ustalić go na takim poziomie, aby ikra delikatnie krążyła w słoju, po dostrzeżeniu oznak klucia (co nastąpi po około 4 dniach), takich jak piana w obiegu, pierwsze unoszące się larwy w słojach) zakręcić dopływ wody do aparatów inkubacyjnych na około 10 minut, zlewarować zawartość słojów do misek, powoli zlewać osłonki wraz z wodą, uważając, aby nie wylać świeżo wyklutych larw, w miarę potrzeby do misek dolewać wodę z wylęgarni i powtarzać zabieg zlewania osłonek aż do całkowitego rozdzielenia wyklutych larw, larwy przenieść do podchowalników (temperatura wody w podchowalnikach powinna być taka jak temperatura podczas inkubacji), resztę niewyklutych larw można umieścić na pływających ramkach inkubacyjnych, lokując je w podchowalniku, w ciągu 24 godzin (po tym, jak reszta embrionów się wykluje) należy zabrać z obiegu ramki wraz osłonkami i martwymi embrionami, żywienie larw karasia należy rozpocząć od podawania żywego pokarmu (np. stadiów nauplialnych solowca) przed zresorbowaniem przez larwy 2/3 zawartości woreczka żółtkowego (od około 4. dnia od wyklucia). 26

27 27 Rys. 10. Ikra karasia pospolitego podczas inkubacji w słoju Weissa i rozdzielanie świeżo wyklutego wylęgu od osłonek (fot. D. Żarski)

28 Notatki 28

29 29

30 Literatura Astanin L.P., Podgornyj J Osobiennosti plodivitosti karasej Carassius carassius (L.), C auratus gibelio (Bloch.). Vopr. Ikhtiol., 8: Bell G.R A guide to the properties, characteristics, and uses of some general anesthetics for fish. Fish. Res. Bd. Canad. Bull., 148: 1-4. Berg L.S Ryby presnykh vod SSSR i sopredelnykh stran. II I. Izd. Akad. Nauk SSSR. Moskva-Leningrad. Brzuska E., Bieniarz K Metoda przyżyciowego określania stadium dojrzałości samic karpia w związku z iniekcjami homogenatu przysadki mózgowej karpia. IRŚ, Zakł. Upowsz. Post. 105: 28 s. Cejko B.I., Żarski D. Krejszeff S., Kucharczyk D., Kowalski R.K Effect of hormonal stimulation of the Crucian Carp Carassius carassius (L.) on milt volume, number of sperm and its motility. IJA.,7p (in press). Cerny K Growth and mortality of crucian carp Carassius carassius (L.) m. humilis Heckel 1840, in the natural pond Mansfeldova in the central Ebe Basin. Vst Cesk. Sp. Zool., 35: Cios S Chów karasia pospolitego Carassius carassius w Polsce od XVI do XIX wieku. Forum Faunistyczne 2: 2-4. FAO Cultured Aquatic Species Information Programme. Carassius carassius. Cultured Aquatic Species Information Programme. Text by Weimin, M. In: FAO Fisheries and Aquaculture Department [online]. Rome. Updated 1 January [Cited 19 October 2014]. Gomułka P., Antychowicz J. 19. Anestetyki stosowane u ryb. Medycyna Wet., 55: Gomułka P Anestetyki hodowli ryb jesiotrowatych. W: Innowacyjne techniki oceny biologicznej i ochrony cennych gatunków ryb hodowlanych i raków (Red. K. Demska-Zakęś). Wyd. IRS, Olsztyn, Hellawell J.M Biological indicators of freshwater pollution and environmental management. Elsevier Applied Science. London and New York. 509pp. Heath A.G. 15. Water pollutions and fish physiology. CRC Press, 384pp. Holopainen I.J., Hyvrinen H Ecology and physiology of crucian carp (Carassius carassius L.) in small Finnish ponds with anoxic ccondition in winter. Verh. Internat. Verein. Limnol., 22: Kamler E Ontogeny of yolk-feeding fish: an ecological perspective. Rev. Fish Biol. Fisher., 12: Kujawa R., Kucharczyk D. 16. Przyżyciowe pobieranie oocytów ryb karpiowatych i okoniowatych przy pomocy katetera. Komun. Ryb., 4: Kwiatkowski M Problem karasiowy. Materiały Konferencyjne Aktualne problemy gospodarki zarybieniowej oraz tworzenie Lokalnych Grup Rybackich II. Olsztyn. 30

31 Kwiatkowski M., Kucharczyk D., Szczerbowski A., Żarski D., Targońska. K Akwakultura karasi w warunkach kontrolowanych. W: Elementy nowoczesnej akwakultury ryb-rozród, inkubacja ikry i profilaktyka (Red. M. Łuczyński, A. Szczerbowski, M. Szkudlarek). Wyd. IRS, Olsztyn Laurila S., Piironen J., Holopainen I.J Notes on egg development and larval growth of crucian carp (Carassius carassius ( L.)). Ann Zool. Fennici., 24: Norma branżowa. BN-75/ Ryby hodowlane. Materiał zarybieniowy karasia. Wydawnictwa Normalizacyjne, Warszawa. Norma branżowa. BN-83/ Ryby hodowlane. Przewóz materiału zarybieniowego karpia. Wydawnictwa Normalizacyjne, Warszawa. Rybkin N.I O sposbnosti karasiej zaryvatsa v grunt. Ryb. Khoz., 8: Sakar A., Upadhyay B Effect of Yamuna River water at agra (U.P.) on different parameters in goldfish: Carassius auratus. I.J.B.R.S., 1: Silin B.V., Utochnenie vidovogo statusa karasja (Rod carassius, Cyprinidae) vodoemov Jakutii. Vopr. Ikhtiol., 23: Skóra S Karausche (Carassius carassius L.) aus der Teichwirtschaft Gołysz. Acta Hydrobiol., 3: Targońska K., Kucharczyk D., Mamcarz A., Glogowski J., Krejszeff S., Prusińska M., Kupren K Influence of individual variability in the percentage of motile spermatozoa and motility time on the survival of embryos of chosen fish species. Pol. J. Nat. Sci., 23: Targońska K., Żarski D., Krejszeff S., Kucharczyk D Artificial reproduction of Crucian carp, Carassius carassius (L.) preliminary results. Aquaculture Europe 2009, Conference New research frontiers novel approaches for evolving needs, Trondheim, Norway, August 14-17, European Aquaculture Society, Abstracts Book Targońska K., Kucharczyk D The application of hcg, CPH and Ovopel in successful artificial reproduction of goldfish (Carassius auratus auratus) under controlled conditions. Reprod. Dom. Anim., 46: Targońska K., Żarski D., Müller T., Krejszeff S., Kozłowski K., Demény F., Urbányi B., Kucharczyk D Controlled reproduction of the crucian carp Carassius carassius (L.) combining temperature and hormonal treatment in spawners. J. Appl.Ichthyol., 28: Teletchea F., Fostier A., Kamler E., Gardeur J.N., Le Bail P.Y., Jalabert B., Fontaine P Comparative analysis of reproductive traits in 65 freshwater fish species: application to the domestication of new fish species. Rev. Fish Biol. Fisher., 19: Welcomme R.L International introductions of inland aquatic species. FAO Fisheries Technical Paper 294: Woynarovich E., Woynarovich A Modified technology for elimination of stickiness of common carp Cyprinus carpio eggs. Aquacul. Hung., 2: Żarski D., Krejszeff S Akwakultura lina. W: Lin, rybactwo i akwakultura. (Red. D. Żarski). Olsztyn, 129s. 31

32 Żarski D., Horváth A., Bernáth G., Palińska-Żarska K., Krejszef S., Müller T., Kucharczyk D Application of different activating solutions to in vitro fertilization of crucian carp, Carassius carassius (L.), eggs. Aquacult. Int., 22:

33 Receptury Płyn Serra alkohol etylowy 96% (6 części) formaldehyd 70% (3 części) lodowaty kwas octowy (1 część) Płyn Woynarovicha 3 g chlorku sodu 4 g mocznika 1 dm 3 wody destylowanej lub RO (po odwróconej osmozie) 33

34