Rola Helicobacter hepaticus w chorobach wątroby i dolnego odcinka przewodu pokarmowego

Transkrypt

1 PRACE POGLĄDOWE Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 6, ISSN X MONIKA BIERNAT, GRAŻYNA GOŚCINIAK Rola Helicobacter hepaticus w chorobach wątroby i dolnego odcinka przewodu pokarmowego Role of Helicobacter hepaticus in Lower Gastrointestinal Tract and Liver Diseases Katedra i Zakład Mikrobiologii AM we Wrocławiu Streszczenie Helicobacter hepaticus izolowano z dolnych odcinków przewodu pokarmowego i przewodów żółciowych wielu gatunków zwierząt. Drobnoustrój ten wywołuje przewlekłe stany zapalne wątroby i nowotwory tego narządu u la boratoryjnych myszy. Wykryto go również w żółci i wątrobie u ludzi. Związek między zakażeniem H. hepaticus a chorobami wątroby i jelit u człowieka wymaga dalszych badań (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 6, ). Słowa kluczowe: Helicobacter hepaticus, choroby wątroby i jelit. Abstract Helicobacter hepaticus has been isolated from the lower gastrointestinal tract and biliary tree of various animals. It was shown to induce chronic hepatitis and liver tumors in laboratory mice. Finally, H. hepaticus has been detec ted in the liver and bile of humans. Further studies on the association of H. hepaticus infection with human hepa tic and intestinal diseases are needed (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 6, ). Key words: Helicobacter hepaticus, liver and intestinal diseases. Wraz z odkryciem związku między zakaże niem Helicobacter pylori (H. pylori) a przewle kłym stanem zapalnym żołądka, chorobą wrzodo wą żołądka i dwunastnicy oraz rakiem żołądka wzrosło zainteresowanie naukowców drobnou strojami z rodzaju Helicobacter. Rodzaj Helico bacter obejmuje około gatunków spiral nych Gram ujemnych bakterii, oficjalnie zareje strowanych oraz kilka nowo odkrytych, ale for malnie nienazwanych [1 5]. W ciągu ostatnich lat drobnoustroje z rodzaju Helicobacter izolowano przede wszystkim z prze wodu pokarmowego wielu gatunków zwierząt, ptaków i ludzi. Helicobacter mustellae jest zwią zany z wrzodami trawiennymi u świnek morskich, w żołądku psów i kotów natomiast bytują: H. felis, H. heilmannii (dawniej Gastrospirillum hominis), H. bizzozeronii i H. bilis. U myszy wykryto H. he paticus, H. muridarum, H. bilis, H. rodentium i Flexispira rappini [6 11]. Niektórzy autorzy podzielili bakterie z rodzaju Helicobacter na dwie duże grupy ze względu na: miejsce bytowania, morfologię i właściwości biochemiczne [6]. Do pierwszej należą gatunki bytujące w błonie śluzo wej żołądka i są odpowiedzialne za choroby gór nego odcinka przewodu pokarmowego, ich przed stawicielem jest H. pylori. Drugą grupę stanowią spiralne, Gram ujemne pałeczki zasiedlające dol ne odcinki przewodu pokarmowego, w tym jelito kręte, jelito grube, odbytnicę, drogi żółciowe oraz wątrobę człowieka i innych ssaków. Najlepiej po znanym przedstawicielem tej grupy jest H. hepati cus, a inne gatunki to m.in. H. cinaedi, H. fennel liae, H. canis, H. cholecysticus, H. rodentium [6]. Jelitowo wątrobowe gatunki Helicobacter (Ente rohepatic Helicobacter Species EHS) mają ultra strukturalne i fizjologiczne cechy wspólne z ga tunkami żołądkowymi, choć nie kolonizują błony śluzowej żołądka. EHS po raz pierwszy wykryto u laboratoryjnych gryzoni, a w miarę postępu ba

2 786 M. BIERNAT, G. GOŚCINIAK dań uznano je za florę saprofityczną i fizjologicz ną jelita. Obecnie uważa się, że niektóre z nich, a być może wszystkie, są patogenami. Drobnou stroje te są odpowiedzialne u wielu zwierząt za przewlekłe zapalenie: kątnicy, jelita grubego, pę cherzyka żółciowego i przewlekłe aktywne zapa lenie wątroby. U myszy laboratoryjnych zakażenie H. hepaticus może prowadzić do raka wątroby [6, 12, 13]. Rola H. hepaticus i innych gatunków gru py EHS w chorobotwórczości u człowieka wyma ga dalszego zdefiniowania, jednak potencjalne znaczenie tych patogenów nie może być bagateli zowane. Rys historyczny Helicobacter hepaticus został odkryty jesienią 1992 r. przez patologów z Narodowego Instytutu Raka w USA [14], którzy prowadzili badania nad procesem chemicznej karcinogenezy i stwierdzili wysoką zapadalność na guzy wątroby wśród labo ratoryjnych myszy A/JCr. Wszystkie zwierzęta miały przewlekłe aktywne zapalenie wątroby. Po czątkowo naukowcy podejrzewali, że przyczyną występowania tak wysokiego odsetka guzów są: czynniki środowiskowe, wirusy, toksyny lub też czynniki chemiczne. Kontrola wody, żywności i warunków bytowania zwierząt w laboratorium nie potwierdziła jednak tej hipotezy. Na uwagę za sługiwał też fakt, że myszy hodowlane, odizolo wane od innych osobników również posiadały ogniska zapalne w wątrobie. Proces zapalny wą troby przebiegał ciężej u samców myszy linii: A/JCr, C3H/HeNCr, SJL/NCr, BALB/cAnNCr, SCID/NCr, ale nie u muszy C57BL/6NCr. H. ha paticus został wyizolowany z zawiesiny wątroby chorych zwierząt. U myszy zakażonych dootrzew nowo H. hepaticus drobnoustroje wykryto w ze wnątrzkomórkowej przestrzeni kanalików żółcio wych wewnątrzwątrobowych [6, 14]. Cechy morfologiczne i biochemiczne Helicobacter hepaticus to Gram ujemna bak teria spiralna, ruchliwa, wyglądem przypominająca Campylobacter jejuni, o długości około 1,5 5 µm i szerokości 0,2 0,3 µm. Na każdym z biegunów ma pojedynczą wić, ale nie ma rzęsek periplazma tycznych. H. hepaticus, podobnie jak inne gatunki Helicobacter, jest wysoce wymagający, jeśli cho dzi o warunki wzrostu. Fox et al. [6, 13] po raz pierwszy wyizolowali H. hepaticus z wątroby my szy po 3 i 7 dniowej inkubacji w warunkach mi kroaerofilnych w mieszaninie gazów zawierają cych: 3% H 2, 10% CO 2, 5% O 2 i 82% N 2 oraz w temperaturze 37 C. Rośnie na podłożach sta łych, wzbogaconych krwią, surowicą płodową cie lęcą lub końską w postaci kolonii o zlewnym wzroście. Jest katalazo i oksydazododatni, wyka zuje aktywność ureazową, rola ureazy w koloniza cji i chorobotwórczości tego drobnoustroju nie jest jednak wyjaśniona (tab. 1). W ostatnich latach co raz częściej do identyfikacji H. hepaticus wyko rzystuje się metody biologii molekularnej z uży ciem sekwencjonowania 16SrRNA i polimerazo wej reakcji łańcuchowej (PCR), co pozwala na szybką identyfikację bez konieczności trudnej i czasochłonnej hodowli [6, 10, 13 15]. Tabela 1. Charakterystyka H. hepaticus i H. pylori Table 1. Characteristic of H. hepaticus and H. pylori H. hepaticus H. pylori Wydzielanie katalazy + + (Catalase production) Redukcja azotanów + (Nitrate reduction) Hydroliza fosfatazy no + zasadowej (Alkaline phosphatase hydrolysis) Wydzielanie ureazy + + (Urease production) Hydroliza octanu + indoksylu (Indoxyl acetate hydrolysis) Wydzielanie γ glutamylo no + transferazy (γ Glutamyl transferase production) Wzrost w 42 C (Growth at 42 C) Wzrost z 1% glicyną + (Growth with 1% glycine) Obecność peri plazma tycznych rzęsek (Periplasmic fibers) Liczba wici (Bip) (No. of flagella) no nieoznaczone (not determined), Bip dwubieguno we (bi polar), + reakcja dodatnia (positive reaction), reakcja ujemna (negative reaction). Chorobotwórczość Helicobacter hepaticus jest najlepiej scharak teryzowanym gatunkiem EHS. Powoduje przewle kłe zapalenie wątroby oraz zapalenie kątnicy u wielu immunokompetentnych myszy [6, 14], gu

3 Helicobacter hepaticus a choroby wątroby i dolnego odcinka przewodu pokarmowego 787 zy wątrobowokomórkowe (hepatocellular tumor) u męskich osobników myszy A/JCr, B6C3F1 oraz choroby zapalne jelita grubego u myszy z niedo borami immunologicznymi [6, 14]. Dzięki wyko rzystaniu technik elektronowej mikroskopii trans misyjnej udało się ustalić, że H. hepaticus, a także inne gatunki bytujące w jelicie mają szczególne powinowactwo do błony śluzowej i nabłonka jelit, zwłaszcza krypt jelitowych. U myszy A/JCr w przebiegu zakażenia obser wowano ogniskowe, nieropne, nekrotyczne zapale nie wątroby, przechodzące w postać przewlekłą, która charakteryzowała się hiperplazją komórek owalnych, komórek Kupffera, zapalnymi zmiana mi w drogach żółciowych oraz nekrozą nieznacz nego stopnia. Początkowo ogniska zapalne były pojedyncze, z czasem zlewały się w większe skupi ska, a w miarę postępu zapalenia występowała hi perplazja komórek owalnych i komórek Kupffera, hiperplazja przewodów żółciowych i żyły wrotnej. W obrębie hepatocytów obserwowano kariomega lię z pseudowtrętami wewnątrzjądrowymi. Zmiany te rozwijały się szybciej u męskich osobników my szy, ale przyczyna tego zjawiska nie jest znana. Opisane wyżej zmiany zapalne u myszy A/JCr w toku przewlekłego procesu prowadziły do po wstania guzów hepatocelularnych i do śmierci [6]. Mechanizm, przez który zakażenie H. hepati cus prowadzi do procesu neoplazmatycznego, po zostaje słabo poznany. U myszy A/JCr z guzami wątroby nie znaleziono mutacji w genie supreso rowym p53 ani w onkogenie ras, które są charak terystyczne dla karcinogenezy w wątrobie wywo łanej chemicznie u gryzoni. Brak mutacji w gu zach wątroby związanych z zakażeniem H. hepati cus sugeruje, że mechanizm karcinogenezy może nie włączać genotoksycznych zniszczeń [6]. Wzrastający wskaźnik wątrobowej proliferacji oraz apoptoza, obserwowane u zakażonych myszy mogą wpływać na karcinogenezę poprzez działa nie jako promotor guza [6]. Nie bez znaczenia dla zainicjowania procesu neoplazmatycznego jest również stres oksydacyjny powstający w zakażo nych komórkach wątroby. H. hepaticus może po wodować indukcję peroksydacji lipidów oraz wy twarzania melanodialdehydu, który reagując z de oksyguanozyną w łańcuchu DNA, mógłby prowa dzić do mutacji i zapoczątkowania procesu karci nogenezy. Teza ta została poparta odkryciem podwyższonego stężenia deoksyguanozyny u za każonych myszy [6, 16]. Patogeneza zakażenia Mechanizm, dzięki któremu H. hepaticus nor malnie bytujący w dolnych odcinkach jelita kolo nizuje wątrobę, nie jest znany. Sugerowano, że podobnie do Salmonella typhi, drobnoustroje mo gą wnikać do wątroby przez makrofagi tkankowe, a później rozprzestrzeniać się drogą naczyń krwio nośnych do przewodów żółciowych. Alternatywną możliwością byłaby bezpośrednia translokacja przez enterocyty i migracja ze światła jelita do dróg żółciowych [17]. Zakażenie H. hepaticus często występuje u wielu laboratoryjnych linii myszy zarówno z ho dowli wsobnych, jak i niewsobnych. Myszy roz wijają trwałą humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną, która jest jednak niewystarcza jąca do eradykacji bakterii [6, 9, 14]. Zarówno ak tywne przewlekłe zapalenie wątroby u myszy A/JCr, jak i zapalenie jelita grubego u myszy z nie doborem IL 10 oraz Rag 2 (recombination activa ting gene Rag) jest związane z aktywacją limfo cytów Th1, wysokim wydzielaniem γ interferonu oraz aktywacją makrofagów [6, 9, 18, 19]. Odkry to prawdopodobny związek między epidermalnym czynnikiem wzrostu, białkami cyklu komórkowe go i czynnikami transkrypcyjnymi u myszy A/JCr. H. hepaticus i białko błonowe Hsp70 mają wspól ne, reagujące krzyżowo epitopy, co sugeruje istot ny udział odpowiedzi immunologicznej dla prze biegu zakażenia [9]. Potencjalnym czynnikiem wirulencji H. hepa ticus jest cytoletalna toksyna rozciągająca (ang. cy tolethal distending toxin CDT). Opisano ją u wie lu patogenów, takich jak: Campylobacter jejuni, in ne gatunki z rodzaju Campylobacter, niektóre szczepy Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus ducreyi, Actinobacillus actinomyce temcomitans, a także H. bilis, H. canis, H. pullo rum [21]. Cytotoksyna powoduje postępujące pęcz nienie komórek, nagromadzenie filamentów akty nowych i ostatecznie prowadzi do śmierci komór ki. Powoduje ponadto zahamowanie cyklu komór kowego G2/M w liniach komórkowych HeLa i wy kazuje bliską homologię z cytotoksyną Campylo bacter jejuni. Young et al. [20] odkryli 3 geny ko dujące toksynę cdta, cdtb, cdtc. Cytotoksyna CDT może odgrywać rolę w patogenezie zapalenia wątroby i zapalenia kątnicy u myszy A/JCr. Zaha mowanie cyklu komórkowego przez CDT sugeru je, że jej prawdziwym miejscem docelowego dzia łania nie są enterocyty ani hepatocyty, ale komórki epitelialne, w których hamuje proliferację. Nie którzy badacze podejrzewają, że toksyna może też odgrywać rolę w odpowiedzi immunologicznej, co pozwala przetrwać H. hepaticus w komórkach wą troby [6, 20]. H. hepaticus ma również inny me chanizm cytotoksyczny, tzw. cytotoksynę granulo cytarną, która jest białkiem termolabilnym o masie > 100 kda i powoduje wakuolizację komórek wą troby poprzez obecność ziarnistości w cytoplazmie

4 788 M. BIERNAT, G. GOŚCINIAK zakażonych komórek. Rola tej cytotoksyny w pato genezie zakażenia jest nieznana [6, 20]. Geny homologiczne dla vaca, kodujące cyto toksynę wakuolizującą (Vac) oraz caga, geny związane z cytotoksyną, które są częścią wyspy patogenności u H. pylori, nie zostały u H. hepati cus zidentyfikowane [20, 15]. Zakażenie u człowieka Dotychczas niewiele wiadomo o prawdopo dobnej roli H. hepaticus i innych gatunków z ro dzaju Helicobacter w chorobach wątroby i dróg żółciowych u ludzi. DNA H. pylori wykryto za po mocą technik PCR w bioptatach wątroby u cho rych z pierwotnym rakiem tego narządu [21]. Fox et al. [22] stwierdzili występowanie materiału ge netycznego H. bilis, H. pullorum oraz Flexispira rappini w próbkach żółci u pacjentów z przewle kłym zapaleniem pęcherzyka żółciowego. Badania nad związkiem H. hepaticus z przewlekłym zapa leniem wątroby i guzami wątroby u myszy mogą dostarczyć nowych informacji na temat prawdopo dobnej roli gatunków Helicobacter, innych niż H. pylori, w patogenezie raka żołądka, chłoniaków żołądka, chorób wątroby i dróg żółciowych [14]. Wadström et al. [11, 24] badali obecność prze ciwciał skierowanych przeciw H. pylori i H. hepa ticus w surowicach pacjentów z różnymi choroba mi wątroby: marskością wątroby związaną z cho robą alkoholową, chorobami autoimmunologicz nymi wątroby (pierwotna marskość żółciowa, au toimmunologiczne zapalenie wątroby, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych), a także z przewlekłymi wirusowymi zapaleniami wątroby. Przeciwciała przeciwko H. hepaticus występowa ły częściej u pacjentów z przewlekłymi chorobami wątroby w porównaniu do grupy kontrolnej osób zdrowych. Nie wykazano jednak bezpośredniej zależności w stosunku do konkretnej, jednej z wy żej wymienionych grup chorych [11, 24]. Nillson et al. [14] wykazali swoiste przeciwciała przeciw białkom powierzchniowym H. hepaticus w suro wicach pacjentów z zapaleniem wątroby na tle choroby alkoholowej. Ostatnie doniesienia o wieloogniskowym za paleniu wątroby u psów, indukowanym przez ga tunki Helicobacter niewrażliwe na niszczące dzia łanie żółci sugerują, że te drobnoustroje wykorzy stujące tropizm do wątroby, mogą powodować za palenie wątroby u ludzi i innych ssaków. Do tej pory nie izolowano jednak Helicobacter z przewo dów żółciowych wewnątrzwątrobowych, mimo że próbki żółci zawierały DNA H. pylori [14]. Dotychczasowe osiągnięcia związane z odkry ciem nowych gatunków Helicobacter, bytujących w dolnych odcinkach jelita i wątrobie oraz odgry wających zasadniczą rolę w patogenezie chorób zapalnych jelit i wątroby oraz w procesach karci nogenezy u laboratoryjnych gryzoni, podkreślają potrzebę dalszych intensywnych badań nad tą gru pą bakterii. Wobec trudności w hodowli i izolacji spiral nych Gram ujemnych pałeczek z dolnego odcinka przewodu pokarmowego niezbędne jest rozwinię cie technik PCR i identyfikacji swoistych przeciw ciał metodą immunoblotingu w celu prowadzenia dalszych obserwacji nad prawdopodobnym związ kiem H. hepaticus i innych bakterii jelitowo wą trobowych (EHS) z chorobami jelit, wątroby i dróg żółciowych u ludzi. Piśmiennictwo [1] Pena J. A., McNeil K., Fox J. G., Versalovic J.: Molecular evidence of Helicobacter cinaedi organisms in hu man gastric biopsy specimens. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, [2] Han S. R., Schindel C., Genitsariotis R., Märker Hermann E., Bhakdi S., Maeurer M. J.: Identification of a unique Helicobacter species by 16S rrna. Gene analysis in an abdominal abscess from a patient with x linked hypogammaglobulinemia. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, [3] Fox J. G., Chien C. C., Dewhirst F. E., Paster B. J., Shen Z., Melito P. L., Woodward D. L., Rodgers F. G.: Helicobacter canadensis sp. nov. isolated from humans with diarrhea as an example of an emerging pathogen. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, [4] Tee W., Hinds S., Montgomery J., Dyall Smith M. L.: A probable new Helicobacter species isolated from pa tient with bacteremia. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, [5] Saunders K. E., Shen Z., Dewhirst F. E., Paster B. J., Dangler C. A., Fox J. G.: Novel intestinal Helicobacter species isolated from cotton top tamarins (Saguinus oedipus) with chronic colitis. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, [6] Solnick J. V., Schauer D. B.: Emergence of diverse Helicobacter species in the pathogenesis of gastric and ente rohepatic diseases. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14, [7] Franklin C. L., Beckwith C. S., Livingston R. S., Riley L. K., Gibsin S. V., Besch Williford C. L., Hook Jr. R. S.: Isolation of a novel Helicobacter species, Helicobacter cholecysticus sp. nov., from the gallbladders of sy rian hamsters with cholangiofibrosis and centrilobular pancreatitis. J. Clin. Microbiol. 1996, 34, [8] Foley J. E., Marks S. L., Munson L., Melli A., Dewhirst F. E., Yu S., Shen Z., Fox J. G.: Isolation of Helico bacter canis from a colony of benegal cats with endemic diarrhea. J. Clin. Microbiol. 1999, 37,

5 Helicobacter hepaticus a choroby wątroby i dolnego odcinka przewodu pokarmowego 789 [9] Wadstöm T., Hänninen M. L.: Other helicobacters in the digestive tract. Gastroenterology 1999, 15, Suppl. 1, [10] Zenner L.: Pathology, diagnosis and epidemiology of the rodent Helicobacter infection. Comp. Immunol. Micro biol. Infect. Dis. 1999, 22, [11] Nilsson H. O., Taneera J., Castedal M., Glatz E., Olsson R., Wadström T.: Identification of Helicobacter py lori and other Helicobacter species by PCR, hybridization, and partial DNA sequencing in human liver samples from patients with primary sclerosing cholangitis or primary biliary cirrhosis. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, [12] Fox J.: Enterohepatic Helicobacters: natural and experimental models. Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 1998, 30, Suppl. 3, [13] Whary M. T., Cline J. H., King A. E., Corcoran C. A., Xu S., Fox J. G.: Containment of Helicobacter hepati cus by use of husbandry practices. Comp. Med. 2000, 50, [14] Nilsson I., Lindgren S., Eriksson S., Wadström T.: Serum antibodies to Helicobacter hepaticus and Helicobac ter pylori in patients with chronic liver disease. Gut 2000, 46, [15] Saunders K. E., McGovern K. J., Fox J. G.: Use of pulsed field gel electrophoresis to determine genomic di versity in strains of Helicobacter hepaticus from geographically distant locations. J. Clin. Microbiol. 1997, 35, [16] Singh R., Leuratti C., Josyula S., Sipowicz M. A., Diwan B. A., Kasprzak K. S., Schut H. A., Marnett L. J., Anderson L. M., Shuker D. E.: Lobe specific increases in malondialdehyde DNA adduct formation in the livers of mice following infection with Helicobacter hepaticus. Carcinogenesis 2001, 22, [17] Fox J. G., Drolet R., Higgins R., Messier S., Yan L., Coleman B. E., Paster B. J., Dewhirst F. E.: Helicobac ter canis isolated from a dog liver with multifocal necrotizing hepatitis. J. Clin. Microbiol. 1996, 34, [18] Kullberg M. C., Rothfuchs A. G., Jankovic D., Caspar P., Wynn T. A., Gorelick P. L., Cheever A. W., Sher A.: Helicobacter hepaticus induced colitis in interleukin 10 deficient mice: cytokine requirements for the induc tion and maintenance of intestinal inflammation. Infect. Immun. 2001, 69, [19] Burich A., Hershberg R., Waggie K., Zeng W., Brabb T., Westrich G., Viney J. L., Maggio Price L.: Heli cobacter induced inflammatory bowel disease in IL 10 and T cell deficient mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Li ver Physiol. 2000, 281, [20] Young V. B., Knox K. A., Schauer D. B.: Cytolethal distending toxin sequence and activity in the enterohepatic pathogen Helicobacter hepaticus. Infect. Immun. 2000, 68, [21] Chien C. C., Taylor N. S., Ge Z., Schauer D. B., Young V. B., Fox J. G.: Identification of cdtb homologues and cytolethal distending toxin activity in enterohepatic Helicobacter spp. J. Med. Microbiol. 2000, 49, [22] Avenaud P., Marais A., Monteiro L., Le Bail B., Bioulac Sage P., Balabaud C., Megraud F.: Detection of He licobacter species in the liver of patients with and without primary liver carcinoma. Cancer 2000, 89, [23] Fox J.G., Dewhirst F. E., Shen Z., Feng Y., Taylor N. S., Paster B. J., Ericson R. L., Lau C. N., Correa P., Araya J. C., Roa I.: Hepatic Helicobacter species identified in bile and gallbladder tissue from Chileans with chronic cholecystitis. Gastroenterology 1999, 114, [24] Ananieva O., Nilsson I., Vorobjova T., Uibo R., Wadström T.: Immune responses to bile tolerant helicobacter species in patients with chronic liver diseases, a randomized population group, and healthy blood donors. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9, Adres do korespondencji: Monika Biernat Katedra i Zakład Mikrobiologii AM ul. Chałubińskiego Wrocław Praca wpłynęła do Redakcji: r. Po recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r. Received: Revised: Accepted: