PRACE POGLĄDOWE. Helicobacter Species in Digestive Tract in Humans. Gatunki Helicobacter izolowane z przewodu pokarmowego człowieka

Transkrypt

1 PRACE POGLĄDOWE Adv Clin Exp Med 2006, 15, 1, ISSN X MONIKA BIERNAT, GRAŻYNA GOŚCINIAK Helicobacter Species in Digestive Tract in Humans Gatunki Helicobacter izolowane z przewodu pokarmowego człowieka Katedra i Zakład Mikrobiologii AM we Wrocławiu Streszczenie W ostatnich latach badania nad pałeczkami z rodzaju Helicobacter koncentrowały się głównie na zakażeniach wy wołanych przez Helicobacter pylori, jednocześnie donoszono o nowych gatunkach Helicobacter występujących u człowieka. Dzięki zastosowaniu nowoczesnych metod molekularnych wykazano obecność materiału genetycz nego Helicobacter spp. u osób z różnymi chorobami zapalnymi żołądka (H. heilmannii), jelit (H. cinaedi, H. ca nadensis) i wątroby (H. hepaticus, H. bilis), a także w zakażeniach systemowych ( H. pullorum, H. rappini ). Do tychczasowe osiągnięcia podkreślają potrzebę dalszych badań nad tą grupą drobnoustrojów (Adv Clin Exp Med 2006, 15, 1, ). Słowa kluczowe: gatunki Helicobacter, choroby żołądka, jelit i wątroby, zakażenia systemowe. Abstract During the last years researches in Helicobacter species have mainly concentrated on Helicobacter pylori infec tions. However, several new species of those spiral bacteria have been described in humans during this time. Using new molecular methods, the presence of Helicobacter spp. DNA in samples from patients with different gastric (H. heilmannii), intestinal (H. cinaedi, H. canadensis) and liver diseases (H. hepaticus, H. bilis) and also systemic infections (H. pullorum, H. rappini ) has been indicated. Current achievements emphasize the importance to con tinue the studies of these microorganisms (Adv Clin Exp Med 2006, 15, 1, ) Key words: Helicobacter species, gastric, intestinal and liver diseases, systemic infections. Odkrycie Helicobacter pylori (H. pylori) przez Warrena i Marshalla w 1982 r. zapoczątko wało badania nad spiralnymi pałeczkami z rodza ju Helicobacter. Liczba nowo odkrywanych ga tunków tych drobnoustrojów u zwierząt i u ludzi ciągle zwiększa się, o czym może świadczyć nie dawno opisany Helicobacter ganmani, wykryty u dzieci z różnymi chorobami wątroby [1]. Zasto sowanie nowoczesnych technik molekularnych i doskonalenie metod diagnostycznych stale wzbo gaca wiedzę na temat tych drobnoustrojów. Celem pracy jest przedstawienie gatunków z rodzaju Helicobacter innych niż H. pylori i wskazanie ich prawdopodobnej roli w patogene zie różnych chorób u człowieka. W ostatnich latach badania nad pałeczkami z rodzaju Helicobacter koncentrowały się głównie na zakażeniach wywołanych przez H. pylori. Jed nocześnie donoszono o nowych gatunkach tych spiralnych bakterii u zwierząt, a także sporadycz nie u ludzi. W większości znajdowały się one w przewodzie pokarmowym (H. heilmannii, H. ci naedi, H. fennelliae, H. pullorum, H. westmeadii, H. canadensis i H. rappini ) oraz drogach żółcio wych (H. bilis), a współwystępowanie z innymi bakteriami flory jelitowej stwarzało trudności w ich izolacji za pomocą rutynowo stosowanych sposobów hodowli i technik mikroskopowych [2]. Dopiero użycie nowoczesnych metod molekular nych, takich jak: reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR polymerase chain reaction), analiza poli morfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP restriction fragment length polimorfizm) oraz fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH fluorescent in situ hibridization) i inne pozwoli ło na lepsze poznanie tych drobnoustrojów.

2 114 M. BIERNAT, G. GOŚCINIAK Bakterie z rodzaju Helicobacter są rozpow szechnione wśród ludzi i zwierząt. Biorąc pod uwa gę miejsce ich bytowania, podzielono je na dwie grupy: drobnoustroje żołądkowe i jelitowo wątrobowe. Gatunki żołądkowe z rodzaju Helico bacter, takie jak: H. pylori, H. mustellae, H. felis, Wolinella succinogenes, H. heilmannii, kolonizują górny odcinek przewodu pokarmowego i mogą pro wadzić do przewlekłego zapalenia żołądka i dwuna stnicy, choroby wrzodowej oraz raka żołądka. Ga tunki jelitowo wątrobowe (EHS Enterohepatic Helicobacter Species) po raz pierwszy wykryto u laboratoryjnych gryzoni i wykazano, że nie tylko są zdolne do kolonizacji jelit i wątroby, ale również biorą udział w patogenezie chorób tych narządów. Należą do nich: H. hepaticus, H. bilis, H. pullorum, H. ganmani i inne [3]. U ludzi i zwierząt udoku mentowano ich rolę w powstawaniu chorób zapal nych wątroby i jelit, nowotworów pęcherzyka żół ciowego i wątroby oraz wywoływaniu przewlek łych biegunek. Większość spośród nowych gatunków z rodzaju Helicobacter jest bardzo trudna do hodowli, a ich zdolność do wzrostu zależy głów nie od zastosowanych podłoży hodowlanych i cha takterystycznych warunków atmosferycznych za stosowanych w hodowli [4]. Zwiększająca się licz ba izolowanych pałeczek z rodzaju Helicobacter u zwierząt oraz badania prowadzone na modelach zwierzęcych mogą potwierdzać tezę o ich roli w pa togenezie chorób człowieka. W przypadku więk szości nowych gatunków z rodzaju Helicobacter ich rola w chorobotwórczości wymaga jednak dal szych badań zarówno epidemiologicznych, jak i po twierdzenia postulatów Kocha dla zakaźnych czyn ników chorobotwórczości. Choroby żołądka Najlepiej poznanym gatunkiem z rodzaju He licobacter zasiedlającym żołądek jest Helicobac ter pylori. Dwa inne gatunki: Helicobacter heil mannii i Helicobacter felis są również związane z chorobami żołądka u ludzi. W 1987 r. Dent et al. [5] opisali Gram ujemne spiralne pałeczki znajdujące się w błonie śluzowej żołądka ludzkiego i nazwali je Gastrospirillum ho minis. Od tego odkrycia wielu badaczy, a przede wszystkim K. Heilmann i F. Borchard, kontynuo wało prace nad morfologią i rolą tych drobnou strojów w chorobach żołądka. Ostatecznie dla upamiętnienia zasług jednego z nich przyjęto na zwę tej bakterii Helicobacter heilmannii. Swoim wyglądem przypomina H. pylori, ma jednak więk sze rozmiary: ,5 0,89 mikrona i kształt korkociągu, posiada 5 8 skrętów i 8 12 wici na biegunach, a także wytwarza enzym ureazę. Po nieważ dotychczas nie udało się wyhodować tego drobnoustroju in vitro, jego charakterystykę i przynależność do rodzaju Helicobacter oparto na analizie sekwencji 16S rrna [6]. Zastosowanie technik molekularnych: PCR, analizy sekwencji produktów PCR oraz metody FISH, pozwoliło wyodrębnić dwa podtypy H. heilmannii. U ludzi występuje głównie podtyp pierwszy (78,5%), wy kazujący filogenetyczne podobieństwo do gatunku Candidatus Helicobacter suis wykrytego u świń, podtyp drugi natomiast jest blisko spokrewniony z 3 innymi gatunkami Helicobacter: H. bizzozero nii, H. salomonis i H. felis, które izolowano od psów i kotów. W 1996 r. wyhodowano jeden szczep z wycinka błony śluzowej żołądka kota, dokładna analiza DNA wykazała jednak, że był to gatunek H. bizzozeronii [7]. Zakażenie pałeczką H. heilmannii występuje powszechnie u wielu gatunków ssaków: u psów, kotów, szczurów, świń i innych, rzadko natomiast u ludzi [2, 8, 9]. Częstość zakażeń u człowieka wy nosi od około 0,5% w krajach rozwiniętych do oko ło 1,2 6,2% w krajach Europy Wschodniej i w Azji, przy czym z badań własnych we wrocław skim ośrodku wynika, że częstość ta nie przekracza 0,5% [8, 9]. U większości pacjentów zakażenie H. heilmannii ma przebieg bezobjawowy, jednak, podobnie jak w przypadku H. pylori, może prowa dzić do przewlekłego zapalenia żołądka, choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy, a także do raka żołądka i chłoniaków typu MALT [8, 10]. Stolte et al. [10] stwierdzili szczególnie dużą częstość wystę powania chłoniaków, towarzyszących temu zakaże niu (3,4%). Zapalenie żołądka będące następstwem zakażenia H. heilmannii ma łagodniejszy przebieg w porównaniu z zakażeniem H. pylori. Pałeczka H. heilmannii, podobnie jak H. pylori, kolonizuje trzon i część przedodźwiernikową żołądka, a rzad ko występuje w dnie żołądka, odźwierniku i dwuna stnicy. W odróżnieniu od H. pylori, bytującego głównie w błonie śluzowej warstwy epitelialnej na błonka, H. heilmannii żyje głębiej pod śluzówką, w kryptach [10, 11]. Przewlekłe zapalenie błony śluzowej żołądka charakteryzuje się umiarkowa nym naciekiem komórkowym z dominacją limfocy tów, leukocytów i komórek plazmatycznych w blasz ce właściwej, w ostrym zapaleniu dominują nato miast ogniska erozji i nacieki z neutrofilów. Diagnostyka zakażeń wywołanych H. heilmannii opiera się przede wszystkim na ocenie morfologii tych bakterii w preparatach mikroskopowych oraz na wykryciu tego gatunku metodą PCR w biopta tach z żołądka. Dotychczasowe próby hodowli in vitro zakończyły się niepowodzeniem, chociaż jest możliwe utrzymanie hodowli in vivo na zwierzętach laboratoryjnych. Leczenie zakażenia H. heilmannii jest podobne jak w przypadku H. pylori i opiera się

3 Gatunki Helicobacter izolowane z przewodu pokarmowego człowieka 115 na terapii trójlekowej, tj. podawaniu dwóch antybio tyków (klarytromycyny lub amoksycyliny z metro nidazolem) i inhibitora pompy protonowej [8, 11]. Przypuszcza się, że zakażenie H. heilmannii u ludzi występuje najprawdopodobniej w wyniku przeniesienia od zwierząt, najczęściej od psów i ko tów, a także od świń [8]. Stolte et al. [12] wykazali, na podstawie ankiety przeprowadzonej wśród 125 niemieckich pacjentów z przewlekłym zapaleniem żołądka, że 70,3% spośród nich miało kontakt z co najmniej jednym zwierzęciem (w porównaniu z 37% populacji osób zdrowych). Dietrich et al. [13] przedstawili natomiast przykład występowania zakażenia H. heilmannii u dziecka i u dwóch kotów. Badania DNA wyizolowanych szczepów wykazały obecność identycznego regionu 580 bp dla genu ure B. Także w ośrodku wrocławskim Gościniak et al. [14] opisali przypadek środowiskowego zapale nia błony śluzowej żołądka, wywołanego H. heil mannii u dziecka, psa i kota. Obserwacja dotyczyła 14 letniej dziewczynki, cierpiącej na przewlekłe bóle brzucha, u której za pomocą badania endosko powego stwierdzono przewlekły stan zapalny błony śluzowej żołądka z granulowaniem. Przewlekłe za palenie żołądka z nadżerkami wykazano też u kota i psa, z którymi dziecko miało codzienny kontakt [14]. Podczas badania endoskopowego od dziecka i od zwierząt pobierano wycinki z części przedo dźwiernikowej i trzonu żołądka do badania histopa tologicznego i bakteriologicznego. Zarówno u dziewczynki, jak i u zwierząt w preparacie bezpo średnim obserwowano spiralne (4 8 skrętów) Gram ujemne bakterie, podobne do korkociągu i morfo logicznie przypominające H. heilmannii. Posiewy bioptatów w kierunku H. pylori i H. heilmannii by ły negatywne. Metodą nested PCR potwierdzono u zwierząt obecność H. heilmannii w bioptatach. Innym gatunkiem z rodzaju Helicobacter, który również ma zdolność kolonizacji błony ślu zowej żołądka jest Helicobacter felis, morfolo gicznie bardzo podobny do H. heilmannii. Jego naturalnym rezerwuarem są gryzonie, koty, psy, świnie i inne ssaki. Zakażenie u człowieka wystę puje sporadycznie, najczęściej w wyniku zaraże nia od chorego zwierzęcia, o czym świadczy przy padek badacza, u którego rozwinęło się zapalenie żołądka po kontakcie z kotem zakażonym H. felis. Mikroskopia elektronowa wykazała identyczną morfologię spiralnych pałeczek w błonie śluzowej żołądka człowieka i zwierzęcia [15]. Zakażenia jelitowe Jelitowe gatunki z rodzaju Helicobacter ze względu na duże wymagania odżywcze i specjalne warunki wzrostu nie były dotychczas wykrywane w rutynowych testach diagnostycznych. Dopiero zastosowanie nowoczesnych technik molekular nych i specjalistycznych metod diagnostycznych pozwoliło na odkrycie nowych drobnoustrojów, które, oprócz już dobrze poznanych patogenów, takich jak: Campylobacter, Salmonella czy Shigel la, mogą być przyczyną biegunek u ludzi. Z próbek kału od pacjentów z biegunką wyhodo wano gatunki: H. pullorum, H. fennelliae, H. ca nadensis, pałeczki: H. cinaedi, H. canis, H. fennel liae, H. westmaedii oraz H. rappini izolowano natomiast od osób z zapaleniem jelit, a także z krwi pacjentów z rozpoznaną posocznicą [2]. W 1984 r. opisano grupę heterogennych drob noustrojów, podobnych morfologicznie do bakterii z rodzaju Campylobacter (CLO Campylobacter like organisms) u homoseksualistów chorych na zapalenie okrężnicy i odbytu. Pacjenci z zakaże niem CLO mieli podobne objawy do zakażenia Campylobacter jejuni, a sigmoidoskopia oraz ba danie histopatologiczne ujawniły zapalenie błony śluzowej okrężnicy z licznymi owrzodzeniami [15]. Na podstawie analizy fenotypowej i genoty powej drobnoustroje podobne do Campylobacter zakwalifikowano do 3 grup: pierwsza obejmuje ga tunek Helicobacter cinaedi, druga Helicobacter fennelliae, trzecia grupa natomiast zawiera szczepy wciąż badane i jeszcze nienazwane [3, 15]. Gatunek H. cinaedi dotychczas najczęściej stwierdzano u homoseksualistów, nosicieli wirusa HIV, ale izolowano go również od dzieci i doros łych cierpiących na przewlekłe biegunki bez nie doborów odporności [2, 8, 15]. Tee et al. [16] wy kryli 9 szczepów tej bakterii w próbkach kału od pacjentów chorych na zapalenie żołądka i jelit. Trzy z nich za pomocą metody hybrydyzacji DNA/DNA zostały sklasyfikowane jako H. cinaedi. Zakażenie jelitowe H. cinaedi objawia się biegun ką, bólami brzucha i gorączką, dając obraz klinicz ny podobny do obserwowanego w zakażeniach Campylobacter jejuni lub może przebiegać bezo bjawowo. Od chwili ustalenia, że ten drobnoustrój wchodzi w skład flory fizjologicznej jelit u chomi ków sugerowano, że zakażenie może mieć charak ter odzwierzęcy [2, 3]. H. cinaedi wyizolowano z krwi noworodka chorego na zapalenie opon mózgowych i posocznicę, którego matka opieko wała się chomikami podczas dwóch pierwszych trymestrów ciąży. W trzecim trymestrze przebyła ostre zapalenie jelit z biegunką, a badania diagno styczne oraz dochodzenie epidemiologiczne wy kazały, że źródłem zakażenia matki był chomik [17]. Kolonizację pałeczkami H. cinaedi obserwo wano również u makaków w przebiegu zapalenia okrężnicy i wątroby [18]. Sposoby przenoszenia zakażenia H. cinaedi od zwierząt na człowieka wymagają jednak dalszych badań.

4 116 M. BIERNAT, G. GOŚCINIAK H. fennelliae inna Gram ujemna spiralna pa łeczka z rodzaju Helicobacter także może wywoły wać przewlekłą biegunkę i zapalenie okrężnicy u człowieka. Dotychczas była stwierdzona głównie u homoseksualistów i u osób mających obniżoną odporność [11]. Za objawy zapalenia jelit u czło wieka, oprócz H. cinaedi i H. fennelliae, może być odpowiedzialnych także kilka innych drobnoustro jów z rodzaju Helicobacter. Gatunek Helicobacter pullorum, pierwotnie odkryty u drobiu, był izolo wany od pacjentów z niedoborami odporności, rów nież od nosicieli wirusa HIV, cierpiących na ostre lub przewlekłe biegunki [8]. Od innych gatunków Helicobacter różni się brakiem wici oraz tym, że nie wytwarza ureazy. Podobnie natomiast jak: H. hepaticus, H. bilis czy H. canis może bytować w drogach żółciowych, gdyż jest niewrażliwy na żółć. H. pullorum wytwarza cytoletalną toksynę rozciągającą (CDT cytolethal distending toxin), podobną do cytotoksyny wydzielanej m.in. przez H. pylori, która powoduje wakuolizację komórek, nieprawidłowości w budowie cytoszkieletu, zaha mowanie cyklu komórkowego na etapie G2/M i ostatecznie prowadzi do śmierci komórki. Może ona mieć istotne znaczenie w patogenezie zmian za palnych, powstających w jelicie i drogach żółcio wych w przebiegu zakażenia H. pullorum [11]. Badacze kanadyjscy zanalizowali 11 szczepów z rodzaju Helicobacter wyizolowanych od pacjen tów z objawami biegunki. Na podstawie analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych oraz analizy kwasów tłuszczowych bakterie te za klasyfikowano do gatunku H. pullorum. Cztery spo śród nich różniły się jednak cechami biochemiczny mi: brakiem hydrolizy octanu indoksylu i oporno ścią na kwas nalidyksowy, a także brakiem wytwarzania cytotoksyny CDT. Używając komplet nego genomu 16S RNA wykazano znaczne podo bieństwo tych szczepów do genomu H. pullorum, istotne różnice w sekwencji DNA pozwoliły jednak uznać je za nowy gatunek, należący do rodzaju He licobacter H. canadensis. Siedliskiem tego patoge nu, podobnie jak w przypadku H. pullorum i Cam pylobacter, był drób [19, 20]. W piśmiennictwie opi sywano również przypadki zapalenia żołądka i jelit u ludzi w wyniku zakażenia H. winghamensis, H. canis oraz Helicobacter rappini. Siedliskiem pałeczek H. canis był pies, a źródła zakażenia H. winghamensis nie udało się ustalić [11, 15]. Zakażenia układowe Helicobacter rappini (dawniej Flexispira rappini ) to heterogenna grupa drobnoustrojów, obejmująca więcej niż 10 gatunków z rodzaju He licobacter, różniących się między sobą morfologią i cechami biochemicznymi. Występują powszech nie u małych gryzoni, są zaopatrzone w wici na obu biegunach komórki i mają rzęski periplazma tyczne. Mogą wywoływać bakteriemię, o czym świadczy doświadczenie, w którym zakażono świnki morskie pałeczkami H. rappini i po 10 dniach wyhodowano te patogeny z krwi [8, 11]. Uogólnione zakażenie drobnoustrojami gatunku H. rappini opisywano też u ludzi, m.in. u 9 letnie go dziecka chorego na zapaleniem płuc [21]. Stwier dzono przypadek zakażenia H. rappini u pacjenta poddanego hemodializie z powodu schyłkowej nie wydolności nerek, u którego wystąpiła wysoka go rączka. Pacjent cierpiał również na przewlekłe zapa lenie trzustki i zaawansowaną cukrzycę. Z danych z wywiadu ustalono, że na dwa miesiące przed epi zodem gorączki przebył zapalenie tkanki łącznej w wyniku zadrapania przez kota. Szczep wyhodo wano z próbek krwi inkubowanych na podłożach standardowych do hodowli krwi w warunkach tle nowych. Analiza 16S rrna oraz charakterystyka biochemiczna wyhodowanego szczepu potwierdziła jego przynależność do gatunku H. rappini [22]. Wszystkie jelitowe gatunki Helicobacter, z wyjątkiem H. canadensis i H. winghamensis, mo gą wywoływać zakażenia uogólnione. W większo ści przypadków bakteriemia pojawia się u osób mających obniżoną odporność, zwłaszcza u nosi cieli wirusa HIV, rzadziej u osób bez zaburzonej bariery immunologicznej. Prawie u wszystkich pa cjentów ze stwierdzonym zakażeniem tymi spiral nymi bakteriami występuje gorączka, leukocytoza, a także wieloogniskowe zapalenie tkanki łącznej. Opisywano pojedyncze przypadki septycznego za palenia stawów, zapalenia opon mózgowo rdzenio wych, a ostatnio udokumentowano jeden przypa dek zapalenia szpiku kostnego u dziecka w prze biegu zakażenia Helicobacter cinaedi [15, 23]. Bakteriemia często nie ustępuje po antybiotykote rapii i ma charakter nawrotowy. Nawracającą bak teriemię H. rappinii, po kilku nieudanych próbach eradykacji, wykazano u pacjentów chorych na przewlekłe zapalenie tkanki łącznej i agammo globulinemię związaną z chromosomem X. Szczepy u tych chorych wyhodowano z próbek krwi, inkubo wanych na standardowych podłożach stosowanych do posiewu krwi w warunkach tlenowych [24, 25]. Wszystkie nowo poznane gatunki pałeczek jeli towych z rodzaju Helicobacter są blisko spokrew nione z rodzajem Campylobacter, co w połączeniu z trudnościami w ich hodowli i dużymi wymagania mi odżywczymi sprawia, że nie są rozpoznawane w rutynowych testach diagnostycznych, a ich iden tyfikacja jest trudna. Są wrażliwe na wiele antybio tyków, zawartych w standardowych podłożach se lektywnych dla Campylobacter, wymagają inkuba cji przez 7 10 dni w warunkach mikroaerofilnych

5 Gatunki Helicobacter izolowane z przewodu pokarmowego człowieka 117 i w atmosferze wzbogaconej wodorem [8]. W rezul tacie częstość występowania zakażeń tymi spiralny mi drobnoustrojami u ludzi oraz ich potencjalne zwierzęce siedliska są bardzo słabo poznane. W ostatnich latach są prowadzone intensywne badania dotyczące prawdopodobnej roli różnych gatunków z rodzaju Helicobacter w rozwoju cho rób zapalnych jelit (IBD inflammatory bowel di seases) u człowieka. Patogeneza tych chorób, do których zalicza się m.in. wrzodziejące zapalenie je lita grubego (colitis ulcerosa) i chorobę Leśniow skiego Crohna, nie jest do końca wyjaśniona. Obie choroby charakteryzują się zaostrzeniami i remi sjami procesów zapalnych błony śluzowej jelita i owrzodzeniami ściany jelit. Obecnie przyjmuje się dwie hipotezy powstawania zmian zapalnych. Pierwsza z nich głosi, że u osób genetycznie predys ponowanych rozwija się w przebiegu tych chorób nieprawidłowa i niekontrolowana odpowiedź im munologiczna w reakcji na skład flory jelitowej, druga hipoteza mówi natomiast o odpowiedzi ukła du immunologicznego na nieznany czynnik środo wiskowy lub niezidentyfikowany bliżej patogen pochodzenia jelitowego [26]. Badania prowadzone na myszach z różnymi zaburzeniami immunolo gicznymi wykazały, że do przewlekłego zapalenia jelita u tych zwierząt dochodziło w wyniku po wstania nieprawidłowej reakcji układu immunolo gicznego w odpowiedzi na zakażenie H. hepaticus lub H. bilis [27]. Pałeczki z rodzaju Helicobacter wyizolowano od małpy tamaryny białoczubej (Saguinus oedipus) z przewlekłym zapaleniem jeli ta. Obraz kliniczny i charakter zmian zapalnych były podobne do obserwowanych u człowieka w przebiegu colitis ulcerosa [28]. Te odkrycia su gerują, że zakażenie bakteriami z rodzaju Helico bacter może mieć znaczenie w rozwoju chorób za palnych jelit u człowieka. Streutker et al. [29] wykryli obecność materiału genetycznego H. pylori w wycinkach pobranych z je lit od pacjentów z IBD. Także Bohr et al. [30] dzięki zastosowaniu techniki PCR wykazali obecność DNA jelitowo wątrobowych gatunków z rodzaju Helico bacter u chorych z chorobą Leśniowskiego Crohna i colitis ulcerosa. Prace te są kontynuowane w wielu ośrodkach na świecie, chociaż dotychczas nie udało się wyizolować tych spiralnych drobnoustrojów z materiału klinicznego od pacjentów z IBD. Zakażenia wątroby i dróg żółciowych Drogi żółciowe w warunkach fizjologicznych są jałowe, w przypadku istnienia zmian patolo gicznych, takich jak np. kamienie żółciowe, jest jednak możliwe wykrycie różnych mikroorganiz mów w żółci i pęcherzyku żółciowym. Dobrze jest znana rola bakterii z rodzaju Leptospira i nie których wirusów w powstawaniu zapalenia wątro by. Choroby dróg żółciowych, takie jak: ostre i przewlekłe zapalenie pęcherzyka żółciowego, mogą także być indukowane przez Enterococcus spp., Escherichia coli czy Haemophilus influen zae. Wykazano, że Escherichia coli i enterokoki wykorzystują te same adhezyny powierzchniowe, które ułatwiają im przyleganie i kolonizację prze wodu pokarmowego, wątroby i nabłonka dróg żół ciowych [31]. Jelitowo wątrobowe gatunki z rodzaju Helico bacter (EHS) ze względu na zdolność przeżycia w środowisku żółci mogą również zasiedlać drogi żółciowe i wątrobę zwierząt oraz indukować po wstawanie zmian zapalnych, a nawet nowotworo wych. H. hepaticus i H. bilis odkryto u myszy, H. cinaedi wyizolowano z jelita grubego, węzłów chłonnych jelitowych i z wątroby od makaków. H. canis opisywano u psów i kotów z przewlekłym zapaleniem wątroby, a H. rappini u owiec z za paleniem pęcherzyka żółciowego [2, 8, 11]. Helicobacter hepaticus jest najlepiej pozna nym gatunkiem jelitowo wątrobowym z rodzaju Helicobacter. Powoduje choroby jelita grubego, przewlekłe zapalenie wątroby oraz pierwotnego raka wątroby u myszy z niedoborami odporności. Jest spiralną ruchliwą pałeczką o długości około 1,5 5 µm i szerokości 0,2 0,3 µm, na każdym z biegunów ma jedną wić. Potencjalnym czynni kiem wirulencji, podobnie jak w przypadku H. pullorum, jest cytoletalna toksyna rozciągająca. H. hepaticus jest trudny do hodowli, do wzrostu wymaga podłoży wzbogaconych i atmosfery mi kroaerofilnej. Mechanizmy translokacji H. hepati cus i innych gatunków EHS z jelita do wątroby i dróg żółciowych są mało poznane. Opierając się na doświadczeniach prowadzonych na modelach zwierzęcych, wielu badaczy sugeruje bezpośre dnią migrację ze światła jelita do dróg żółciowych lub wnikanie przez makrofagi tkankowe i później sze rozprzestrzenianie się drogą naczyń krwiono śnych i limfatycznych [32]. Dotychczas nie wiadomo, czy pałeczki z ro dzaju Helicobacter biorą udział w patogenezie chorób wątroby i dróg żółciowych u człowieka. Pionierskie badania przeprowadzone przez Foxa [33] wykazały obecność materiału genetycznego drobnoustrojów z rodzaju Helicobacter w prób kach żółci i w resekowanych pęcherzykach żółcio wych, pobranych od 46 chilijskich pacjentów, cierpiących na przewlekłe zapalenie pęcherzyka żółciowego. Hodowla drobnoustrojów z zamrożo nego materiału nie powiodła się, analiza sekwencji DNA na obecność genu Helicobacter wypadła jed nak pozytywnie w 13/23 przebadanych próbek

6 118 M. BIERNAT, G. GOŚCINIAK żółci i w 9/23 resekowanych pęcherzykach żółcio wych. W pięciu próbkach wykryto DNA H. bilis, w dwóch H. rappini oraz jeden wynik był po zytywny dla H. pullorum. Badania prowadzone przez Ponzetto [34] wykazały, że gatunki H. pylo ri i H. pullorum odgrywały rolę w patogenezie i progresji marskości wątroby u pacjentów z wiru sowym zapaleniem wątroby typu C i pierwotnego raka wątroby. Obecność DNA rodzaju Helicobac ter (Helicobacter spp.) metodą PCR wykrywano także w 11/12 bioptatów, pobranych z wątroby od pacjentów chorych na pierwotną marskość żółcio wą wątroby i w 9/12 bioptatów, pobranych od pa cjentów chorych na pierwotne stwardniające zapa lenie dróg żółciowych [35]. Avenaud et al. [36] oraz Pellicano et al. [37] za pomocą metody PCR potwierdzili obecność materiału genetycznego He licobacter spp. w materiale biopsyjnym, pobra nym z wątroby i dróg żółciowych od pacjentów chorych na pierwotnego raka wątroby i raka pę cherzyka żółciowego. Pomimo tak wielu doniesień o wykryciu mate riału genetycznego gatunków z rodzaju Helico bacter za pomocą techniki PCR w tkankach wątro by i pęcherzyka żółciowego u ludzi z chorobami tych narządów, wciąż nie udaje się wyhodować drobnoustrojów z materiału klinicznego. W wa runkach laboratoryjnych pałeczki te rosną wolno, wymagają kilkudniowej inkubacji na wybiór czych, wzbogaconych w krew i inne składniki podłożach oraz w atmosferze mikroaerofilnej, w mieszaninie gazów zawierających: 3% H 2, 10% CO 2, 5% O 2, i 82% N 2. Z piśmiennictwa jest znany tylko jeden przypadek udanej hodowli ga tunku H. pylori z wątroby od 23 letniej pacjentki z marskością wątroby w przebiegu choroby Wilso na [38]. Jego identyfikację oparto na analizie mor fologicznej, biochemicznej oraz potwierdzono ba daniem sekwencji 16S rrna. Ponieważ u pacjent ki wykonano test oddechowy, który potwierdził kolonizację żołądka pałeczkami H. pylori, uznano, że mogły one wtórnie przedostać się do wątroby wstecznie z dwunastnicy lub przez krążenie wrot ne ze światła przewodu pokarmowego. Opisany przypadek potwierdza przypuszczenia, że podob nie jak u zwierząt, także u ludzi niektóre gatunki z rodzaju Helicobacter mogą kolonizować wątrobę człowieka. Są wymagane jednak dalsze badania nad Tabela 1. Gatunki Helicobacter i ich prawdopodobna rola w chorobach u człowieka. Table 1. Helicobacter species and their possible role in human diseases Gatunki Helicobacter Choroba u człowieka Nosiciel (Helicobacter species) (Human disease) (Host) Żołądkowe (Gastric) H. pylori zapalenie żołądka, wrzody człowiek (gastritis, ulcer) (human) H. heilmannii zapalenie żołądka, wrzody człowiek (gastritis, ulcer) (human) H. bizzozeronii zapalenie żołądka pies, kot (gastritis, ulcer) (dog, cat) Jelitowo wątrobowe (Enterohepatic) H. cinaedi zapalenie jelit, sepsa człowiek, małpy, chomiki (enteritis, sepsis) (human, monkeys, hamsters) H. fennelliae zapalenie jelit, sepsa człowiek (enteritis, sepsis) (human) H. westmaedii zapalenie jelit, sepsa człowiek (enteritis, sepsis) (human) H. rappini zapalenie jelit, sepsa gryzonie, owce (enteritis, sepsis) (rodents, sheep) zapalenie pęcherzyka żółciowego? (cholecystitis?) H. canadensis zapalenie jelit człowiek? (enteritis) (human?) H. pullorum zapalenie jelita grubego człowiek, kurczaki (enterocolitis) (human, chicken) zapalenie pęcherzyka żółciowego? (cholecystitis?) H. bilis zapalenie pęcherzyka żółciowego? człowiek? mysz, pies, kot (cholecystitis?) (human? mouse, dog, cat) H. hepaticus przewlekłe choroby wątroby? mysz (chronic liver disease?) (mouse)

7 Gatunki Helicobacter izolowane z przewodu pokarmowego człowieka 119 prawdopodobną rolą tych drobnoustrojów w pato genezie chorób wątroby i dróg żółciowych u ludzi. Trudności w hodowli, a także inwazyjność pro cedur stosowanych w celu uzyskania materiału kli nicznego sprawia, że są poszukiwane inne nieinwa zyjne metody wykrywania EHS w chorobach wątro by i dróg żółciowych u ludzi. Nilsson et al. [39] za pomocą techniki immunoblottingu wykryli obec ność przeciwciał krzyżowych przeciw H. pylori, H. hepaticus i H. bilis w surowicy pacjentów z różny mi chorobami wątroby, przy czym przeciwciała IgG anty H. hepaticus stwierdzono u 56 spośród 144 (39%) pacjentów z przewlekłymi chorobami wątro by, w tym u 6 spośród 30 (20%) osób chorych na pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych. Kornilovska et al. [40], stosując metody podwójnej elektroforezy w żelu oraz immunoblottingu, wykry li i scharakteryzowali wysoko immunogenne białka powierzchniowe H. pullorum, H. bilis i H. hepati cus, które indukowały humoralną odpowiedź immu nologiczną u doświadczalnie uczulonych królików. Białka te mogłyby posłużyć do opracowania no wych serologicznych testów, wykorzystywanych w diagnostyce zakażeń pałeczkami EHS u ludzi. Podsumowanie Przez ponad dwadzieścia lat rodzaj Helicobac ter ewoluował i szybko powiększał się o nowe ga tunki izolowane zarówno od zwierząt, jak i od ludzi. Doświadczenia prowadzone w wielu ośrodkach na całym świecie z zastosowaniem metod moleku larnych i genetycznych pokazują, że mogą one ko lonizować dolny odcinek przewodu pokarmowego, drogi żółciowe i wątrobę wielu gatunków zwierząt, a w pewnych okolicznościach mogą wywoływać stan zapalny tych narządów i prowadzić do zmian chorobowych. Również u ludzi wykazano rolę nie których gatunków z rodzaju Helicobacter innych niż H. pylori w zakażeniach jelitowych, systemo wych, a także w chorobach dróg żółciowych i wą troby (tab. 1) [2]. Szczególnie interesujące wydają się badania nad rolą tych drobnoustrojów w patoge nezie chorób zapalnych jelit i wątroby, których etio logia jest mało poznana. Podkreślają one potrzebę doskonalenia metod diagnostycznych, a zwłaszcza opracowania technik izolacji tych bakterii z mate riału klinicznego oraz poszukiwania nowych sposo bów hodowli i identyfikacji. Piśmiennictwo [1] Tolia V, Nilsson HO, Boyer K, Wuerth A, Abu Al Soud W, Rabah R, Wadström T: Detection of Helicobac ter ganmani like 16S rdna in pediatric liver tissue. Helicobacter 2004, 9, [2] Andersen LP: New Helicobacter species in humans. Dig Dis 2001, 19, [3] Solnick JV, Schauer DB: Emergence of diverse Helicobacter species in the pathogenesis of gastric and entero hepatic diseases. Clin Microbiol Rev 2001, 14, [4] Bohr URM, Primus A, Zagoura A, Glasbrenner B, Wex T, Malfertheiner P: A group specific PCR assay for the detection of Helicobacteriaceae in human gut. Helicobacter 2002, 7, [5] Dent JC, Mc Nully CAM, Uff JC, Wilkinson SP, Gear MWL: Spiral organisms in the gastric antrum. Lancet 1987, 2, 96. [6] Solnick JV, O Rourke J, Lee A, Paster B, Dewhirst FE, Tompkins LS: An uncultured gastric spiral organism is a newly identified Helicobacter in humans. J Infect Dis 1993, 168, [7] Baele M, Van den Bulck K, Decostere A, Vandamme P, Hänninen ML, Ducatelle R, Haesebrouck F: Multi plex PCR assay for differentiation of Helicobacter felis, H. bizzozeronii, and H. salomonis. J Clin Microbiol 2004, 42, [8] O Rourke JL, Grehan M, Lee A: Non pylori Helicobacter species in humans. GUT 2001, 49, [9] Gościniak GM, Iwańczak B, Przondo Mordarska A: Frequency of Helicobacter pylori and Helicobacter heil mannii in children with gastroduodenal disease one year follow up study. Gut 2002, 51, (Suppl. 2), 89, Abstract [10] Stolte M, Kroher G, Meining A, Morgner A, Bayerdorffer E, Bethke B: A comparison of Helicobacter pylori and H. heilmannii gastritis. A matched control study involving 404 patients. Scand J Gastroenterol 1997, 32, [11] Fox JG: The non H. pylori helicobacters: their expanding role in gastrointestinal and systemic diseases. Gut 2002, 50, [12] Stolte M, Wellens E, Bethke B, Ritter M, Eidt H: Helicobacter heilmannii (formerly Gastrospirillum hominis) gastritis: An infection transmitted by animals? Scand J Gastroenterol 1994, 29, [13] Dietrich C, Wiesel P, Neiger R, Blum A, Corthesy Theulaz I: Presence of multiple Helicobacter heilmannii strains in an individual suffering from ulcers and in his two cats. J Clin Microbiol 1998, 36, [14] Gościniak G, Skała J, Kubiak K, Iwańczak B, Grabińska J: Przypadek środowiskowego zapalenia błony ślu zowej żołądka wywołanego przez Helicobacter heilmannii (dziecko, pies, kot). Post Mikrobiol 2004, 43 (Suppl.1), 178 Streszczenie. [15] Solnick JV: Clinical significance of Helicobacter species other than Helicobacter pylori. Clin Infect Dis 2003, 36, [16] Tee W, Anderson BN, Ross BC, Dwyer B: Atypical Campylobacters associated with gastroenteritis. J Clin Mi crobiol 1987, 25, [17] Orlicek SL, Welch DF, Kuhls TL: Septicemia and meningitis caused by Helicobacter cinaedi in neonate. J Clin Micribiol 1993, 31,

8 120 M. BIERNAT, G. GOŚCINIAK [18] Fox JG, Handt L, Sheppard BJ, Xu S, Dewhirst FE, Motzel S, Klein H: Isolation of Helicobacter cinaedi from the colon, liver and mesenteric lymph node of a rhesus monkey with chronic colitis and hepatitis. J Clin Micro biol 2001, 39, [19] Fox JG, Chien CC, Dewhirst FE, Paster BJ, Shen Z, Melito PL, Woodward DL, Rodgers FG: Helicobacter canadensis sp. nov. isolated from humans with diarrhea as an example of an emerging pathogen. J Clin Mirobiol 2000, 38, [20] Young VB, Chien CC, Knox KA, Taylor NS, Schauer DB, Fox JG: Cytolethal distending toxin in avian and human isolates of Helicobacter pullorum. J Infect Dis 2000, 182, [21] Tee W, Leder K, Karroum E, Dyall Smith M: Flexispira rappini bacteremia in a child with pneumonia. J Clin Microbiol 1998, 36, [22] Sorlin P, Vandamme P, Nortier J, Hoste B, Rossi C, Pavlof S, Struelens MJ: Recurrent Flexispira rappini bacteremia in an adult patient undergoing hemodialysis: case report. J Clin Microbiol 1999, 37, [23] Harris KA, Fidler KJ, Hartley JC, Vogt J, Klein NJ, Monsell F, Novelli VM: Unique case of Helicobacter sp. osteomyelitis in an immunocompetent child diagnosed by broad range 16S PCR. J Clin Microbiol 2002, 40, [24] Cuccherini B, Chua K, Gill V, Weir S, Wray B, Stewart D, Nelson D, Fuss I, Strober W: Bacteremia and skin/bone infections in two patients with X linked agammaglobulinemia caused by an unusual organism related to Flexispira/Helicobacter species. Clin Immunol 2000, 97, [25] Gerrard J, Alfredson D, Smith I: Recurrent bacteremia and multifocal lower limb cellulitis due to Helicobac ter like organisms in a patient with X linked hypogammaglobulinemia. Clin Infect Dis 2001, 33, [26] Bell SJ, Chisholm SA, Owen RJ, Borriello SP, Kamm MA: Evaluation of Helicobacter species in inflammato ry bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 2003, 18, [27] Cahill RJ, Foltz CJ, Fox JG, Dangler CA, Powrie F, Schauer DB: Inflammatory bowel disease: an immunity mediated condition triggered by bacterial infection with Helicobacter hepaticus. Infect Immun 1997, 65, [28] Saunders KE, Shen Z, Dewhirst FE, Paster B, Dangler CA, Fox JG: Novel intestinal Helicobacter species iso lated from cotton top tamarins (Saguinus oedipus) with chronic colitis. J Clin Microbiol 1999, 37, [29] Streutker CJ, Bernstein CN, Chan VL, Riddell RH, Croitoru K: Detection of species specific Helicobacter ribosomal DNA in intestinal biopsy samples from a population based cohort of patients with ulcerative colitis. J Clin Microbiol 2004, 42, [30] Bohr URM, Glasbrenner B, Primus A, Zagoura A, Wex T, Malfertheiner P: Identification of enterohepatic Helicobacter species in patients suffering from inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol 2004, 42, [31] Ljungh A, Wadström T: The role of microorganisms in biliary tract disease. Curr Gastroenterol Rep 2002, 4, [32] Biernat M, Gościniak G: Rola Helicobacter hepaticus w chorobach wątroby i dolnego odcinka przewodu pokar mowego. Adv Clin Exp Med 2003, 12, [33] Fox JG, Dewhirst FE, Shen Z, Feng Y, Taylor NS, Paster BJ, Ericson RL, Lau CN, Correa P, Araya JC, Roa I: Hepatic Helicobacter species identified in bile and gallbladder tissue from Chileans with chronic cholecy stitis. Gastroenterology 1998, 114, [34] Ponzetto A, Pellicano R, Leone N, Cutufia MA, Turrini F, Grigioni WF, D Errico A, Mortimer P, Rizzetto M, Silengo L: Helicobacter infection and cirrhosis in hepatitis C virus carriage: is it an innocent bystander or a tro ublemaker? Med Hypotheses 2000, 54, [35] Nilsson H O, Taneera J, Castedal M, Glatz E, Olsson R, Wadström T: Identification of Helicobacter pylori and other Helicobacter species by PCR, hybridization, and partial DNA sequencing in human liver samples from patients with primary sclerosing cholangitis or primary biliary cirrhosis. J Clin Microbiol 2000, 38, [36] Avenaud P, Marais A, Monteiro L, Le Bail B, Bioulac Sage P, Balabaud C, Megraud F: Detection of Helicobac ter species identified in the liver of patients with and without primary liver carcinoma. Cancer 2000, 89, [37] Pellicano R, Mazzaferro V, Grigioni WF, Cutufia MA, Fagoonee S, Rizzetto M, Ponzetto A: Helicobacter species sequences in liver samples from patients with and without hepatocellular carcinoma. World J Gastroente rol 2004, 10, [38] Queiroz DM, Santos A: Isolation of a Helicobacter strain from the human liver. Gastroenterology 2001, 121, [39] Nilsson I, Kornilovs ka I, Lindgren S, Ljungh A, Wadström T: Increased prevalence of seropositivity for non gastric Helicobacter species in patients with autoimmune liver disease. J Med Microbiol 2003, 52, [40] Kornilovs ka I, Nilsson I, Utt M, Ljungh A, Wadström T: Immunogenic proteins of Helicobacter pullorum, Helicobacter bilis and Helicobacter hepaticus identified by two dimensional gel electrophoresis and immunoblot ting. Proteomics 2002, 2, Adres do korespondencji: Monika Biernat Katedra i Zakład Mikrobiologii AM ul. Chałubińskiego Wrocław e mail: mbiernat@mbio.am.wroc.pl Praca wpłynęła do Redakcji: r. Po recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r. Received: Revised: Accepted: