Biochemia stresu oksydacyjnego. Wykład 2 Powstawanie reaktywnych form tlenu w komórkach

Transkrypt

1 Biochemia stresu oksydacyjnego Wykład 2 Powstawanie reaktywnych form tlenu w komórkach

2 Źródła wolnych rodników w komórce - Enzymy generujące H 2 O 2 : np. * oksydaza aldehydowa * oksydaza D-aminokwasowa * okydaza -hydroksykwasowa * oksydaza ksantynowa * oksydaza acetylokoenzymu A * oksydaza glutarylokoenzymu A * oksydaza galaktozowa * oksydaza glikolanowa. - Enzymy generujące O 2 np. * oksydaza ksantynowa * oksydaza aldehydowa * oksydaza diaminowa * reduktaza cytochromu P450 * reduktaza glutationowa * oksydaza galaktozowa * mieloperoksydaza * oksydoreduktaza NADPH * hydroperoksydaza prostaglandynowa * tyrozynaza * syntaza tlenku azotu * reduktaza cytochromu b5 * lipooksygenaza * dioksygenaza tryptofanowa G. Bartosz "Druga twarz tlenu"

3 Źródła wolnych rodników w komórce - Cykle redoks i utleniania ksenobiotyków - Utlenianie białek oddechowych (hemoglobiny, mioglobiny) - Samoutlenianie związków niskocząsteczkowych (np. związków tiolowych) - Łańcuch oddechowy w mitochondriach G. Bartosz "Druga twarz tlenu"

4 Mitochondrium - Zewnętrzna błona mitochondrialna: * stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~1:1 * duża zawartość poryn, - Cząsteczki o masie do ~600 Da mogą swobodnie dyfundować do przestrzeni międzybłonowej. Większe muszą mieć sekwencję sygnałową na N-końcu, pozwalającą na wiązanie do translokaz. - Przestrzeń międzykomórkowa: * stężenie małych cząsteczek podobne jak w cytozolu * skład białek jest odmienny niż w cytozolu - Wewnętrzna błona mitochondrialna: * stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~3:1 * duża zawartość kardiolipiny (zmniejszenie przepuszczalności błony) * brak poryn * transport wszystkich substancji wymaga transporterów * obecność białek odpowiedzialnych za fosforylację oksydacyjną, syntezę i hydrolizę ATP, transport białek regulatorowych. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

5 Mitochondrium Reakcje w matriks mitochondrialnej - Pirogronian produkowany podczas glikolizy jest transportowany do matriks, dekarboksylowany oksydacyjnie i przyłączany do Co-A (powstaje CO 2, acetylo-coa i NADH). - Grupa acetylowa przyłączana jest do szczawiooctanu (C4), tworząc cytrynian (C6). Izomer cytrynianu jest następnie dekarbokylowany oksydacyjnie do -ketoglutaranu (C5) i bursztynianu (C4), z którego regenerowany jest szczawiooctan. Przy tym 3 jony wodorowe (6 e - ) są przenoszone na NAD +, a para atomów wodoru (2 e - ) na FAD. 6C - Elektrony z NADH mogą być transportowane z cytoplazmy przez czółenko jabłczanowoasparaginowe lub czółenko glicerolo-3-fosforanowe GDP+Pi GTP - W cyklu Krebsa powstają 2 cząsteczki CO 2, czemu towarzyszy produkcja 3 cząsteczek NADH i 1 cząsteczki FADH 2. Powstaje też 1 wysokoenergetyczne wiązanie fosforanowe, a 9 kolejnych ATP może powstawać podczas utleniania NADH i FADH 2 za pośred-nictwem łańcucha oddechowego. L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

6 Łańcuch oddechowy - Przepływ elektronów z NADH lub FADH 2 do O 2 poprzez łańcuch oddechowy powoduje wypompowywanie protonów z matriks. Wytworzona siła protonomotoryczna obejmuje dwie składowe: gradient ph (gradient protonowy) i transbłonowy potencjał elektryczny. - W łańcuchu oddechowym powstaje anionorodnik ponadtlenkowy w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu. Generowany jest w kompleksie I i III. L. Sryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

7 Łańcuch oddechowy Łańcuch oddechowy z zaznaczonymi wartościami standardowego potencjału redukcyjnego. - standardowy potencjał redukcyjny O 2 /O 2 ' - wynosi V, więc przeniesienie elektronu może być mediowane przez wiele związków). Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

8 Związki ułatwiające identyfikację miejsc tworzenia reaktywnych form tlenu Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

9 Produkcja O 2 ' - w kompleksie I łańcucha oddechowego Kompleks I (oksydoreduktaza NADH:ubichinon) - Jest transbłonowym kompleksem enzymatycznym, który: * utlenia NADH, przekazując elektrony na ubichinon * jest połączony z pompą protonową, a jego aktywność przyczynia się do powstania gradientu protonów * stanowi jedno z dwóch głównych miejsc pobierania równoważników redukcyjnych (drugie miejsce to kompleks II) * jest głównym źródłem ROS w komórce w warunkach fizjologicznych Flawina Centra Fe-S semichinon/ rodnik semichinonowy Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

10 Produkcja O 2 ' - w kompleksie I łańcucha oddechowego Odwrotny transport elektronów utlenianie pirogronianu - Kiedy mitochondria utleniają pirogronian, elektrony są przekazywane z NADH do chinonu (Q) poprzez FMN i centra Fe-S. Powstający QH' jest redukowany do chinolu (QH 2 ). - Kiedy mitochondria utleniają jedynie bursztynian (przy braku innych substratów) energia gradientu protonowego wykorzystywana jest do przenoszenia elektronu wbrew potencjałowi redoks ze zredukowanego chinonu (chinol, QH 2 ) na NAD +, zamiast w stronę końcowego akceptora, czyli O 2. NAD O 2 utlenianie samego bursztynianu Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

11 Produkcja O 2 ' - w kompleksie I łańcucha oddechowego - zależność produkcji H 2 O 2 od m. w obecności ph Regulacja produkcji O 2 ' - w kompleksie I - Produkcja H 2 O 2 przez kompleks I podczas odwrotnego transportu elektronów zależy bardziej od gradientu ph ( ph) niż od potencjału błonowego ( m). zależność produkcji H 2 O 2 od m. przy braku ph zależność produkcji H 2 O 2 od ph Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

12 Produkcja O 2 ' - w kompleksie III łańcucha oddechowego Kompleks III (oksydoreduktaza koenzym Q:cytochrom c) - Budowa kompleksu III: * zewnętrzną pulę chinonu (Q o ) * wewnętrzną pulę chinonu (Q i ) * cytochrom b566 (cyt b566) * cytochrom b562 (cyt 562) * białko Rieske (z kompleksami Fe-S) * cytochrom c1 * cytochrom c - Działanie kompleksu III: * Ubichinon jest redukowany do QH 2 po stronie wewnętrznej (Q i ) i migruje do strony zewnętrznej (Q o ) uwalniając 2H + i przenosząc 1 e - na cyt c1 za pośrednictwem białka Rieske. Powstaje przy tym QH' i Q. * Drugi e - redukuje cytochrom b, dzięki czemu elektrony są przenoszone na wewnętrzną stronę błony, gdzie redukują chinon do QH 2. * cyt c i cyt c1 przyjmują tylko pojedynczy e-, dlatego pełna redukcja Q wymaga utlenienia dwóch cząsteczek QH 2 w dwóch kolejnych cyklach. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

13 Produkcja O 2 ' - w kompleksie III łańcucha oddechowego - Inhibitory kompleksu III: * Myxothiazol: blokuje miejsce Q o uniemożliwiając przeniesienie elektronu z QH 2 do centrów Fe-S i cytochromu b. * Stigmatellin: blokuje przeniesienie pierwszego elektronu na centrum Fe-S. * Antimycin A: wiąże się do miejsca Q i i blokuje przeniesienie drugiego elektronu do miejsca Q i. Dzięki temu hamuje powstawanie QH 2 i nasila tworzenie O 2 ' -. - Wydaje się, że O 2 '- tworzony na kompleksie III jest uwalniany do przestrzeni międzybłonowej (czyli jest dysmutowany głównie przez CuZnSOD). To wciąż jednak nie jest jasne. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

14 Przemiany anionorodnika ponadtlenkowego Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

15 Detekcja reaktywnych form tlenu Widmo EPR uzyskane z mitoplastów po zastosowaniu DMPO (pułapki spinowej) - wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego DMPO Wykorzystanie fluorescnecji DCF (dichlorofluoresceiny) do wykrywania H 2 O 2 w mikronaczyniach siatkówki DMPO + antymycyna A DMPO + + antymycyna A + SOD Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009; Ishizaki et al. J Physiol 2009

16 Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego - Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H 2 O 2 w mitochondriach izolowanych z kardiomiocytów świnki morskiej. Aktywność łańcucha oddechowego stymulowana bursztynianem. - Wykorzystanie Amplex Red do wykrywania H 2 O 2 w komórkach hodowanych in vitro. kontrola stymulacja - CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone): czynnik rozprzęgający - rotenon: inhibitor kompleksu I - AA (antymycyna A): inhibitor kompleksu III - bursztynian: substrat oddechowy - pirogronian: substrat oddechowy Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

17 Detekcja anionorodnika ponadtlenkowego - Pomiar produkcji O 2 ' - za pomocą DHE (dihydroethidium), przekształcanej do 2-OH- E+ (2-hydroksyethidium) w izolowanym sercu świnki morskiej. - Pomiar produkcji ONOO - za pomocą dityr (dityrosine), przekształcanej z tyrozyny w izolowanym sercu świnki morskiej. BDM (butanedione monoxime): inhibitor skurczów kardiomiocytów MnTBAP: mimetyk SOD L-NAME (N-nitro-L-arginine methyl ester): inhibitor NOS manadione: inhibitor transportu elektronów Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

18 Regulacja produkcji O 2 ' - w mitochondriach - Cykliczne lub ciągłe chłodzenie izolowanego narządu (tu: serce świnki morskiej) prowadzi do wzrostu poziomu ROS. Jest to spowodowane: * zwiększoną produkcją ROS * zmniejszoną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych, przede wszystkim MnSOD. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

19 Ischemia i reperfuzja - Uszkodzenie tkanek po ischemii i reperfuzji jest powodowane przez wzrost produkcji ROS (szczególnie istotne przy transplantacji narządów): * Podawanie zmiataczy O 2 ' - i H 2 O 2 (ale nie jedynie O 2 ' - ) zmniejsza uszkodzenia * Nadekspresja enzymów antyoksydacyjnych (CuZnSOD, MnSOD, HO-1) zmniejsza uszkodzenia * Po reperfuzji dochodzi do zwiększonej produkcji O 2 ' - i ONOO -. kontrola - Większość ROS w ischemii i reperfuzji jest produkowana w łańcuchu oddechowym, zwłaszcza przez kompleks III. - Bardzo istotna jest rola oksydoreduktazy ksantynowej. - Schłodzenie narządu przed przeszczepem nasila produkcję ROS. nabłonek jelitowy I/R

20 Ischemia i reperfuzja - ultrastruktura mitochondriów Ischemia-reperfuzja w mięśniu przywodzącym łydki królika kontrola - zdrowy mięsień rozjaśnienie macierzy, utrata granul puchnięcie mitochondriów, fragmentacja grzebieni Korn et al. J Thor Cardiovasc Sur 2002

21 Wpływ hipoksji na produkcję ROS w izolowanym sercu - Produkcja ROS zwiększa się w niedotlenieniu. * komórki w zasadzie nigdy nie są anoksyjne - tlen jest zawsze dostępny * mitochondria oddychają normalnie w bardzo niskim po 2. Gdy po 2 spadnie poniżej wartości progowej, oddychanie zaczyna się obniżać, a produkcja ROS spada. - MnTbap: SOD mimetic - CG: katalaza + glutation - MCG: MnTbap + CG - L-NAME: inhibitor NOS Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

22 Wpływ hipoksji na produkcję ROS w izolowanych mitochondriach Faza 3 - W izolowanych mitochondriach niedotlenienie nie zwiększa produkcji ROS. Możliwe przyczyny: * hipoksja może indukować produkcję ROS poza mitochondriami * składniki cytoplazmatyczne są niezbędne do regulacji i nasilenia produkcji ROS w mitochondriach Faza 4 Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

23 Białka rozsprzęgające (UCP) - Białko UCP (UCP1) zostało po raz pierwszy opisane w brunatnych adipocytach, odpowiedzialnych za termogenezę bezdrżeniową. - UCP pozwala na powrót elektronów do matriks mitochondrialnej bez produkcji ATP (może więc zachodzić przy niedoborze ADP, zmniejszając ryzyko nadmiernej akumulacji H + w przestrzeni międzybłonowej). Towarzyszy temu produkcja ciepła. - UCP2 odgrywa rolę w regulacji wydzielania insuliny. - UCP3 ulega ekspresji głównie w mięśniach i ma działanie antyoksydacyjne. - UCP4 i UCP5 produkowane są głównie w układzie nerwowym i mają działanie antyoksydacyjne. G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008

24 UCP w łańcuchu oddechowym - Myszy pozbawione genu UCP3 wykazują nasilony stres oksydacyjny - Nadekspresja UCP2 zwiększa oporność na stres u Drosophila melanogaster. Wolkow & Isner. Aging Res Rev

25 Oksydoreduktaza ksantynowa (XOR) - Odkryta w 1902 w mleku (przez Franza Schardingera), uważana jest za enzym ułatwiający noworodkom zwalczanie infekcji bakteryjnych dzięki produkcji ROS. - Jest zaangażowana w hydroksylację puryn, pteryn i aldehydów, ale jej podstawową rolą jest przekształcanie hypoksantyny do ksantyny, a do kwasu moczowego. NH 3 Berry and Harre. J Physiol 2004

26 Oksydoreduktaza ksantynowa (XOR) - Należy do hydroksylaz molibdenowych zawierających reszty flawinowe i centra Fe-S. - Ulega ekspresji w różnych narządach, ale jej najwyższy poziom wykrywany jest w wątrobie i jelicie. - Jest obecna w komórkach śródbłonka i może stanowić główne źródło ROS w śródbłonku. - Występuje w dwóch formach: * oksydaza ksantynowa (XO) * dehydrogenaza ksantynowa (XDH) - W komórkach ssaczych XOR występuje jako XDR, ale jest łatwo przekształcana do XO w wyniku utlenienia reszt SH lub proteolizy. - Zarówno XDH jak i XO mogą produkować ROS. Berry and Harre. J Physiol 2004

27 Oksydoreduktaza ksantynowa (XOR) - Domena Mo-Co przyjmuje 2 e - z ksantyny, redukując Mo(VI) do Mo (IV), katalizując jednocześnie powstawanie kwasu moczowego z ksantyny. - Następnie elektrony są przyjmowane przez resztę flawinową (FADH 2 ) i przekazywane na NAD + lub O 2. - Przeniesienie 2 elektronów na O 2 prowadzi do powstania H 2 O 2. Redukcja jednoelektronowa tlenu prowadzi do powstania anionorodnika ponadtlenkowego. Berry and Harre. J Physiol 2004

28 Oksydoreduktaza ksantynowa - XOR jest głównym enzymem produkującym ROS w śródbłonku, odgrywającym kluczową rolę w uszkodzeniu tkanek podczas reperfuzji. Mięsień sercowy - komórki apoptotyczne Kontrola I/R G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008

29 Podjednostki oksydazy NADPH - Każda izoforma oksydazy NADPH zawiera błonowa domenę katalityczną NOX, posiadającą wszystkie elementy niezbędne do transferu elektronów z NADPH na tlen: * domenę wiążącą NADPH * FAD * dwie grupy hemowe - Nox1, Nox2 i Nox4 są związane z dodatkowymi czterema dodatkowymi podjednostkami: * p22phox (stabilizuje Nox w błonie) * p47phox (NoxO1, stabilizujące białko cytozolowe) * p67phox (NoxA1, regulatorowe białko cytozolowe) * Rac1 (małe białko G) Thomas et al. Antioxid Redox Signal 2008

30 Podjednostki oksydazy NADPH Lambeth JD. Nature Rev Immunol 2004

31 Podjednostki oksydazy NADPH - Struktura NOX1, NOX2, NOX3 i NOX4 jest podobna, a ich domena C-końcowa wiąże FAD i NADPH. - Domena C-końcowa NOX5 jest podobna do kalmoduliny i wiąże wapń. - DUOX1 i DUOX2 są podobne do NOX5, a dodatkowo posiadają domenę transbłonową przy N-końcu homologiczną do peroksydaz hemowych. - NOX1, NOX2, NOX3, NOX4 i NOX5 produkują głównie O 2 -. DUOX1 i DUOX2 produkują głównie H 2 O 2. Thomas et al. Antioxid Redox Signal 2008

32 Podjednostki oksydazy NADPH - Oksydazy NADPH katalizują transfer elektronów z NADPH na tlen, produkując przy tym anionorodnik ponadtlenkowy i nadtlenek wodoru. - W fagocytach oksydazy NADPH uwalniają ROS jako cząsteczki efektorowe w obronie przeciw patogenom. - W śródbłonku produkują ROS działające jako przekaźniki sygnału i modulujące (wraz z NO) funkcje naczyń krwionośnych, zwłaszcza ich relaksację. - Nasilona produkcja ROS przez oksydazy NADPH zmniejsza dostępność NO. - W śródbłonku NOX2, NOX3 i NOX5 są obecne przede wszystkim w błonach retikulum endoplazmatycznego. NOX2 może być również obecne w plazmalemmie. Lokalizacja subkomórkowa NOX1 nie jest jeszcze ustalona. Thomas et al. Antioxid Redox Signal 2008

33 Oksydazy NADPH Newsholme et al. J Physiol 2007

34 Oksydazy NADPH w cukrzycy W zdrowych tkankach NOX indukują mechanizmy antyoksydacyjne i mogą przyczyniać się do ochrony komórek. W cukrzycy NOX prowadzą do nadprodukcji ROS i nasilenia stresu oksydacyhjnego. Newsholme et al. J Physiol 2007

35 Oksydazy NADPH w cukrzycy Wpływ adipokin na ekspresję/aktywność oksydaz NADPH w ścianie naczynia HUVEC, BAEC: komórki śródbłonka; BASM: komórki mięśni gładkich aorty Aktywacja oksydaz NADPH w różnych modelach cukrzycy Newsholme et al. J Physiol 2007

36 Oksydazy NADPH w cukrzycy Newsholme et al. J Physiol 2007

37 Produkcja insuliny w komórkach Fajans SS. Nat Med. 2004

38 Stres oksydacyjny w cukrzycy - Zmiany w metaboliźmie komórek prowadzą do zmian w wydzielaniu insuliny: * Wzrost poziomu glukozy zwiększa poziom metabolizmu komórek i podnosi poziom komórkowego ATP. * To prowadzi do zamknięcia kanałów K ATP, depolaryzacji błony, aktywacji zależnych od potencjału kanałów Ca 2+, napływu Ca 2+ do cytoplazmy. * Wzrost poziomu Ca 2+ jest bezpośrednim sygnałem uwalnia-nia insuliny. Freeman & COX: Hum Mol Genet 2006.

39 UCP w łańcuchu oddechowym - Niedobór UCP może zwiększać produkcję ATP w mitochondriach. - W komórkach trzustki: * pobieranie glukozy przyczynia się do wzrostu aktywności łańcucha oddechowego i zwiększenia produkcji ATP z ADP. To stymuluje fuzję pęcherzyków zawierających insulinę i prowadzi do wydzielania insuliny. * Wysoki stosunek ATP/ADP aktywuje UCP2, co zmniejsza gradient protonów i obniża produkcję ATP, obniżając tym samym wydzielanie insuliny. - Czynnikiem aktywującym UCP2 jest prawdopodobnie anionorodnik ponadtlenkowy.

40 Stres oksydacyjny w cukrzycy Newsholme et al. J Physiol 2007

41 Regulacja produkcji insuliny przez ROS Newsholme et al. J Physiol 2007

42 Oksydazy NAD(P)H w cukrzycy Newsholme et al. J Physiol 2007

43 Wpływ ROS na insulinopoprność - ROS indukują wiele kinaz, w tym: * JNK * p38 * IK B - Kinazy te fosforylują IRS-1 (insulin receptor substrate-1). Ponadto IK b aktywuje NF B, co prowadzi do indukcji m.in. inos (inducible NO synthase) i nasilonej produkcji NO. - NO produkowany przez inos prowadzi do nitrozylacji IRS-1. - Zarówno nitrozylacja jak i fosforylacja serynowa IRS-1 stanowi sygnał do degradacji IRS-1 w proteasomach i hamuje trasdukcję sygnału od insuliny. Newsholme et al. J Physiol 2007

44 Dziękuję Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

45 Surface of the wound [%] Gojenie ran u myszy z cukrzycą db/db WT 100 WT Day ** *** ** *** db/db *** *** *** *** *** *** *** Day 1 Day 3 Day Days after wounding Day 17 Grochot-Przeczek et al. PLoS ONE, 2009

46 Fazy gojenia ran Faza zapalenia (kilka dni) - Natychmiast po utworzeniu skrzepu w ranie dochodzi do wazodylatacji i nacieku leukocytarnego. Bardzo nasila się aktywność fagocytarna neutrofili. Faza proliferacji (2 dni - kilka tygodni) - Fibroblasty proliferują wypełniając ubytki i tworząc tkankę ziarninową. Nasila się angiogeneza. Keratynocyty migrują i proliferują zamykając ranę. Faza przebudowy (miesiące) - Dochodzi do wzmożonej syntezy kolagenu wzmacniającego tkankę, oraz do przekształcenia tkanki ziarninowej w typowe tkanki (lub utworzenia blizny). Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

47 Upośledzenie funkcji EPC w cukrzycy - U zdrowych osobników czynniki uwalniane przez ischemiczne lub zranione tkanki mobilizują komórki progenitorowe (w tym EPC) ze szpiku, a te po dotarciu do miejsc zranienia lub niedotlenienia uwalniają czynniki proangenne (w tym niewielkie ilości NO i ROS) oraz biorą udział w neowaskularyzacji i naprawie naczyń. - W cukrzycy sygnały wysyłane przez niedotlenione lub zranione tkanki są słabsze, przez co mobilizacja komórek progenitorowych jest mniejsza. Komórki progenitorowe które docierają do zranionych tkanek uwalniają niewiele czynników proangiogennych, natomiast dużo prozapalnych i antyangiogennych (w tym duże ilości NO i ROS). EPC: komórki progenitorowe śródbłonka Jarajapu & Grant. Circ Res 2010.

48 Upośledzenie gojenia ran w cukrzycy - EPC: komórki progenitorowe śródbłonka - VEGF: vascular endothelial growth factor - SDF-1: stromal cell derived growth factor - enos: endothelial nitric oxide synthase Brem & Tomic-Canic. J Clin Invest 2007.

49 Mobilizacja EPC - Zranione tkanki uwalniają między innymi VEGF, który wpływa na komórki podścieliska szpiku. Prowadzi to do: * aktywacji enzymatycznej enos * nasilenia produkcji NO. - To zwiększa aktywność MMP-9, która uwalnia skitl z błonowego białka mkitl. - Związanie skitl do receptora c-kit prowadzi do uwolnienia EPC z niszy szpikowych do krążenia. EPC w szpiku Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

50 Mechanisms of blood vessels formation Incorporation to pre-existing vessels Formation of blood vessels de novo paracrine stimulation of endothelial cells (VEGF, bfgf, IL-8 ) Carmeliet P. Nat Med, 2000

51 Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji - W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji enos przez kinazy PI3K/Akt, przez co zmniejsza się produkcja NO. - Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnika ponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO - ) i zmniejszenia dostępności NO. - W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływ komórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się do upośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie. - Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku. WT db/db Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

52 number of cells cumulative kength of sprouts % CD45-/KDR+/Sca-1+/lectin+ number of connections Wpływ cukrzycy na EPC Percentage of EPC in bone marrow Morphogenesis * * healthy diabetic 0 healthy diabetic 800 Migration to SDF-1 10 Capillary sprouting * * healthy diabetic 0 healthy diabetic (one of) Primary mechanism: oxidative stress leading to increased ROS production, reduced NO availability, diturbed PI3K/Akt signaling and augmented inflammation Kotlinowski et al., in preparation

53 Wpływ cukrzycy na komórki śródbłonka Krążki aorty zatopione w matriżelu - 5 dni inkubacji. Widoczne tworzące się kapilary. Myszy WT Myszy db/db Kotlinowski et al., in preparation

54 Odtwarzanie krążenia w mięśniu myszy z cukrzycą diabetes diabetes + NAC diabetes diabetes + NAC NAC - N-acetylocyteina Ebrahimian et al. Am J Pathol 2006

55 Mobilizacja EPC ze szpiku - EPC: komórki progenitorowe śródbłonka - VEGF: vascular endothelial growth factor - MMP-9: matrix metalloproteinase-9 - enos: endothelial nitric oxide synthase Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

56 Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

57 Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji - EPC: komórki progenitorowe śródbłonka - MMP-9: matrix metalloproteinase-9 - enos: endothelial nitric oxide synthase - SDF-1 - stromal cell derived growth factor- - CXCR-4 - receptor dla SDF-1 Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008