QUANTA Lite ssdna ELISA test ELISA jednoniciowego DNA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite ssdna ELISA test ELISA jednoniciowego DNA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test QUANTA Lite TM ssdna ELISA jest testem immunoenzymatycznym (ELISA) do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko jednoniciowemu DNA (ssdna). Zestaw INOVA QUANTA Lite TM ssdna ELISA stosowany w połączeniu z zestawem INOVA QUANTA Lite TM dsdna służy do półilościowego oznaczania autoprzeciwciał przeciwko ssdna w surowicy ludzkiej do wspomagania diagnozy tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i określonych innych chorób reumatycznych. Test nie jest sam w sobie rozstrzygający, ale jest jednym z parametrów procesu diagnostycznego obejmującego wiele kryteriów. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) występują w wielu różnych chorobach tkanki łącznej i jako takie stanowią czuły cel badania przesiewowego. 1 Przeciwciała przeciwko dwuniciowemu DNA (dsdna) występują niemal wyłącznie u pacjentów z SLE i jako takie są uznawane za przeciwciała markerowe dla tej choroby. Obecność przeciwciał przeciwko dsdna silnie wskazuje na obecność SLE, jednak brak tych przeciwciał nie wyklucza SLE we wszystkich przypadkach. 2 Autoprzeciwciała przeciwko ssdna występują w kilku chorobach reumatycznych i różnych rodzajach innych chorób. 3,4 Najczęstsze występowanie i najwyższe miana przeciwciał anty-ssdna występują u pacjentów z SLE. 4 Stwierdzono, że u pacjentów z SLE i pozytywnym wynikiem testu na obecność autoprzeciwciał przeciwko ssdna, miano może posłużyć do monitorowania aktywności choroby i odpowiedzi na terapię farmakologiczną. 5,6 Chociaż przeciwciała przeciwko ssdna nie są swoiste dla SLE, u niektórych pacjentów z SLE bez istotnego miana przeciwciał ANA mogą stanowić one jedyny pozytywny dowód serologiczny. 7 Wielu z pacjentów o wysokich mianach przeciwciał przeciwko ssdna wykazuje chorobę skórną związaną z fotowrażliwością. Około 25% pacjentów z toczniem przewlekłym posiada przeciwciała anty-ssdna i mogą u nich wystąpić objawy układowe. 3 Obecność przeciwciał anty-ssdna wykazano wyłącznie u pacjentów z ciężkim toczniem przewlekłym z zapaleniem kłębuszkowym nerek. 3 Takie badania wskazują, że oznaczanie przeciwciał przeciwko ssdna może stanowić istotny test diagnostyczny do oceny pacjentów z toczniem przewlekłym lub pacjentów negatywnym pod względem SLE, którzy posiadają przeciwciała ANA. 3 Przeciwciała reagujące z termicznie zdenaturowanym ssdna reagują z purynami i pirymidynami oraz szkieletem cukrowo-fosforanowym cząsteczki DNA. 1,4 Z technicznego punktu widzenia nadal niemożliwie jest oznaczenie za pomocą pojedynczego testu prawdziwych przeciwciał przeciwko ssdna (z jedynym antygenem w postaci zasad purynowych i pirymidynowych). Zastosowana w tym teście technika ELISA jest obiektywna i wyniki mogą być podawane w formie półilościowej. Test ELISA może być dogodnie stosowany do badania małych i dużych ilości od próbek pacjentów w formacie profilu wraz z innymi testami oceniającymi choroby reumatyczne, takimi jak testy na obecność przeciwciał przeciwko dsdna, histonom i ekstrahowalnych przeciwciał przeciwjądrowych (ENA). Zasada badania Wysoce czyszczony zdenaturowany termicznie antygen ssdna grasicy cielęcej wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając wszelkim obecnym przeciwciałom przeciwko ssdna związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem ssdna (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko ssdna, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 1

2 3. Słabo pozytywna kontrola testu ssdna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko ssdna, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu ssdna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko ssdna, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu ssdna ELISA, wysoko pozytywną kontrolę testu ssdna ELISA i kontrolę negatywną testu ELISA należy obsługiwać w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 2

3 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperatur z e 8 C. 2 Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami ssdna ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3

4 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA, wysoko pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA i kontroli negatywnej testu ELISA. 4. Ustalenie obecności lub nieobecności ssdna z zastosowaniem jednostek arbitralnych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA, wysoko pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA, kontroli negatywnej ssdna ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. AB Y UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu ssdna ELISA, wysoko pozytywną kontrolą testu ssdna ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu ssdna ELISA, wysoko pozytywna kontrola testu ssdna ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze -20 C. 4

5 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA musi być przynajmniej dwukrotnie wyższa niż absorbancja kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA i wysoko pozytywna kontrola testu ssdna ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu ssdna ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna kontrola testu ssdna ELISA (jednostki) Gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu ssdna ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Poniższa informacja służy jako przykład wspomagający interpretację wyników. Ponieważ z antygenem ssdna tego zestawu mogą reagować zarówno autoprzeciwciała przeciwko jednoniciowemu DNA (ssdna) oraz niektóre przeciwko dwuniciowemu DNA (dsdna), próbki pacjentów powinny być także badane pod kątem reaktywności z dsdna. Te wyniki podane w jednostkach WHO powinny być uwzględniane podczas oceny poziomów ssdna. Łącząc wyniki testu INOVA QUANTA Lite dsdna ELISA z wynikami testu INOVA QUANTA Lite ssdna ELISA obliczając stosunek (ssdna/dsdna) można wyciągnąć wnioski na temat występowania przeciwciał przeciwko ssdna. Stosunek <0,5 wskazuje na brak przeciwciał przeciwko ssdna. Stosunek >0,5 wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko ssdna. UWAGA: Próbka od pacjenta powinna być uznana za dającą wynik pozytywny jedynie wówczas, gdy wynik testu na obecność przeciwciał przeciwko ssdna jest pozytywny i stosunek jednostek ssdna do jednostek dsdna wynosi >0,5. Przykład 1: Test 1: stężenie przeciwciał przeciwko dsdna w teście: 120 WHO U/ml Test 2: stężenie przeciwciał przeciwko ssdna w teście: 160 U/ml Stosunek przeciwciał przeciwko ssdna (ssdna/dsdna): 160/120 = 1,33 (+) Interpretacja: Próbka pacjenta daje wynik pozytywny na obecność przeciwciał przeciwko ssdna 5

6 Przykład 2: Test 1: stężenie przeciwciał przeciwko dsdna w teście: 270 WHO U/ml Test 2: stężenie przeciwciał przeciwko ssdna w teście: 130 U/ml Stosunek przeciwciał przeciwko ssdna (ssdna/dsdna): 130/270 = 0,48 (-) Interpretacja: Próbka pacjenta daje wynik negatywny na obecność przeciwciał przeciwko ssdna Przykład 3: Test 1: stężenie przeciwciał przeciwko dsdna w teście: 80 WHO U/ml Test 2: stężenie przeciwciał przeciwko ssdna w teście: 80 U/ml Stosunek przeciwciał przeciwko ssdna (ssdna/dsdna): 80/80 = 1.0 (+) Interpretacja: Próbka pacjenta daje wynik pozytywny na obecność przeciwciał przeciwko ssdna Jeżeli wynik testu ssdna jest pozytywny, wówczas jednostki ssdna można porównać z następującymi kategoriami klinicznymi. Poniżej 68,6 U/ml Brak przeciwciał przeciwko ssdna 68,6 229 U/ml Wynik na obecność przeciwciał przeciwko ssdna jest powyżej 229 U/ml umiarkowanie pozytywny Wynik na obecność przeciwciał przeciwko ssdna jest silnie pozytywny Określenie aktywności ssdna w próbkach wykazujących wartości silnie pozytywne (tj. gęstość optyczna powyżej 2,0) pod kątem zarówno ssdna i dsdna może być trudne. Gdy próbki dają wynik silnie pozytywny wówczas stosunek może być mylący, ponieważ test ELISA jest wysycony autoprzeciwciałami pacjenta. Próbki silnie pozytywne zarówno pod względem ssdna jak i dsdna zaleca się zbadać ponownie w rozcieńczeniu 1:4 i 1:20 (tj. 1:404 i 1:2020) w rozcieńczalniku do próbek HRP w celu ustalenia, czy aktywność ssdna jest wyższa niż dsdna. Powyższe obliczenia muszą zostać przeprowadzone na tym samym rozcieńczeniu próbki pacjenta. Ograniczenia badania 1. Ponieważ uważa się, że przeciwciała IgG mają większe znaczenie kliniczne, niniejszy test wykorzystuje koniugat swoisty wobec IgG. Nie oznaczane w tym teście przeciwciała IgM przeciwko ssdna mogą konkurować z przeciwciałami IgG o dostępne miejsca wiązań. Jeżeli podejrzewana jest interferencja spowodowana przeciwciałami IgM, należy ponownie zbadać próbkę przy wyższym rozcieńczeniu rozcieńczalnikiem do próbek HRP. Silne zwiększenie wartości dla próbki wskazuje na obecność konkurującego przeciwciała IgM. Ta nowa wartość pozwoli na dokładniejsze oznaczenie miana przeciwciał IgG przeciwko ssdna w macierzystej próbce pacjenta. 2. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 3. Ponieważ z antygenami ssdna tego zestawu mogą reagować zarówno autoprzeciwciała przeciwko jednoniciowemu DNA (ssdna) oraz niektóre przeciwko dwuniciowemu DNA (dsdna), próbki pacjentów powinny być także badane pod kątem reaktywności z dsdna i wyniki te należy uwzględnić podczas oceny poziomów ssdna. 4. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, fotometr użyty do pomiaru wyników i błąd systematyczny czasu podczas testu. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 5. Test QUANTA Lite ssdna ELISA nie jest samodzielnym testem na obecność przeciwciał przeciwko ssdna. W celu pomiaru przeciwciał przeciwko ssdna musi być on stosowany w połączeniu z testem QUANTA Lite dsdna ELISA firmy INOVA Diagnostics, Inc. Nie należy stosować testu na obecność przeciwciał przeciwko dsdna innych producentów ponieważ kalibracje testów ssdna ELISA i dsdna ELISA są do siebie dopasowane. 6. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 7. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite ssdna ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko ssdna oceniano poprzez porównanie z dostępnym w handlu testem ELISA. Wyniki testu ELISA ustalono zgodnie z broszurą jego producenta. 6

7 Normalny zakres Wybrano sto siedemnaście losowych próbek surowic prawidłowych i zbadano je za pomocą zestawu QUANTA Lite ssdna ELISA. Spośród tych próbek siedem wykazywało 69 lub więcej jednostek (wynik pozytywny w tym układzie ELISA). Pięć z tych siedmiu próbek dało także wynik pozytywny w dostępnej w handlu referencyjnej metodzie oznaczania przeciwciał anty-ssdna i dlatego usunięto je z populacji prawidłowej. Średnia próbek populacji wyniosła 27 przy odchyleniu standardowym 21. Zakres w populacji wynosił od 12 do 186. Badanie to wskazało, że średnia próbka prawidłowa to 2,0 odchylenia standardowego poniżej wartości granicznej. Swoistość i wrażliwość względna Trzydzieści dwie losowe próbki z pozytywnym wynikiem ANA zbadano za pomocą testu QUANTA Lite ssdna ELISA i innego zestawu dostępnego w handlu (metoda referencyjna). Według obu metod osiemnaście próbek było pozytywnych, a 12 było negatywnych. Dwie próbki były pozytywne w metodzie referencyjnej, ale negatywne w teście INOVA. Te dwie próbki były także negatywne w innym zestawie dostępnym w handlu. Wyniki te przedstawiono poniżej. INOVA Wrażliwość względna 90% Referencje Swoistość względna 100% Skuteczność względna 94% W celu dalszego zbadania swoistości fazy stałej ssdna, za pomocą zestawu QUANTA Lite ssdna ELISA zbadano różne kontrole autoprzeciwciał monoswoistych o wysokich mianach. Kontrole te obejmowały kontrole silnie pozytywne z następujących zestawów NOVA QUANTA Lite ELISA: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, mikrokosmki i tyroglobulina tarczycy, histony i mitochondrialne M2. Wszystkie spośród powyższych kontroli dały w teście ssdna wyniki negatywne. Reaktywność ssdna w różnych chorobach tkanki łącznej Liczba pacjentów % Pozytywny SLE Zespół Sjogrena Twardzina Zapalenie wielomięśniowe 6 17 Toczeń polekowy Reumatoidalne zapalenie stawów 11 45* *2 z 5 próbek pozytywnych były jedynie granicznie pozytywne (69 i 99 jednostek). Dwudziestu pięciu pacjentów z SLE miało pozytywny wynik ssdna. Sześć spośród tych pozytywnych wyników ssdna należało do pacjentów z SLE, dla których w czułej metodzie ELISA wykrywania dwuniciowego DNA (dsdna) (INOVA) uzyskano wynik niejednoznaczny. Trzynaście spośród 21 pacjentów z zespołem Sjogrena miało pozytywny wynik ssdna. Przy zastosowaniu metody metodą ELISA (INOVA) wszystkich 21 pacjentów miało pozytywny wynik SS-A, SS-B lub zarówno SS-A i SS-B. Trzy spośród próbek od pacjentów z zespołem Sjogrena miało pozytywny wynik ssdna, chociaż było całkowicie negatywne w czułej metodzie ELISA dsdna (INOVA). Dwunastu z piętnastu pacjentów z twardziną i pozytywnym wynikiem Scl-70 miało także pozytywny wynik ssdna, natomiast taki wynik pozytywny miał tylko 1 z 6 pacjentów z zapaleniem wielomięśniowym. Przy zastosowaniu metody ELISA (INOVA) wszyscy pacjenci z zapaleniem wielomięśniowym mieli pozytywny wynik autoprzeciwciał Jo-1. Jeden pacjent z zapaleniem wielomięśniowym, który miał pozytywny wynik ssdna (112 U) był całkowicie negatywny pod względem przeciwciał przeciwko dsdna badanych metodą ELISA (INOVA). Precyzja i powtarzalność Precyzja i powtarzalność badania wyznaczono testując sześć powtórzeń każdej negatywnej, umiarkowanie pozytywnej i silnie pozytywnej próbki w czterech oddzielnych badaniach. Średnia wyników silnie pozytywnych wyniosła 814 jednostek, umiarkowanie pozytywnych wyniosła 300 jednostek, a negatywnych 72 jednostki. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki. Negatywny Silnie pozytywna Średnio pozytywna SD CV SD CV SD CV Łącznie 4,7 6,6% 36 4,5% 8,0 2,7% W ramach serii 4,7 6,5% 35 4,3% 6,8 2,7% Pomiędzy seriami 4,6 6,3% 24 3,0% 8,7 2,9% 7

8 Piśmiennictwo 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Provost TT, Herrera-Esparza R and Diaz LA: Nucleoprotein autoantibodies in lupus erythematosus. J. Invest. Dermatol. 85: , Koffler D, et al: Occurence of single-stranded DNA in serum of patients with systemic lupus erythematosus and other diseases. J. Clin. Invest. 52: , Land A: Evaluation of the simultaneous estimation of antidsdna and antissdna antibodies for clinical purposes. Clin. Exp. Immunol. 31: , Gripenberg M, et al: Assessment of class-specific antibodies against denatured DNA in patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Immunol. 5: 314, Maddison PJ, Provost TT and Reichlin M: Serological findings in patients with "ANA" negative systemic lupus erythematosus. Medicine(Baltimore) 60: 87-94, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Merzec 2011 Wersja 0 8