QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Zestaw QUANTA Lite TM H. pylori IgG to test immunoabsorpcji enzymatycznej (ELISA) do ilościowego wykrywania przeciwciał IgG przeciwko H. pylori (Helicobacter pylori) w surowicy ludzkiej. Ten test jest przeznaczony do wspomagania diagnozy infekcji H. pylori u dorosłych pacjentów z klinicznymi oznakami choroby układu pokarmowego. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przyczynowe relacje pomiędzy infekcją H. pylori oraz wrzodami żołądka zostały dobrze określone od chwili ich pierwszego zaproponowania w 1983 roku. 1 Infekcja H. pylori występuje u ponad 95% pacjentów z chorobą wrzodową dwunastnicy, 80% pacjentów z wrzodami żołądka i jest powiązana z gruczolakorakiem żołądka i chłoniakiem. 2-5 Wyeliminowanie infekcji H. pylori ogranicza nawroty wrzodów. 2-5 Leczenie infekcji H. pylori jest zalecane w przypadku pacjentów z wrzodami dwunastnicy lub żołądka, a ostatnio w przypadku dyspepsji czynnościowej. 5,6 Diagnoza infekcji H. pylori obejmuje metody inwazyjne oraz nieinwazyjne. Badania inwazyjne obejmują endoskopię umożliwiającą bezpośrednią obserwację gastrycznej śluzówki zatokowej oraz w celu uzyskania biopsji do badania ureazy, zabarwienia histologicznego (Warthin-Starry) oraz kultury 5,7. Kultura jest traktowana jako złoty standard, jest to najmniej czuły test (70-80% czułości). Badanie histologiczne i ureazowe charakteryzuje się czułością i swoistością na poziomie powyżej 90% 5. Podstawową wadą metod inwazyjnych jest ryzyko i dyskomfort pacjenta, wysokie koszty oraz fałszywe negatywne wyniki na skutek niejednolitego rozprowadzenia H. pylori w żołądku. Badania nieinwazyjne obejmują badania oddechu 14 C lub 13 testy mocznika z oznaczeniem C oraz serologiczne. Badanie oddechu jest czułe i swoiste, ale jest kosztowne. Serologia stanowi tanią alternatywę badań inwazyjnych, zapewniającą wysoką czułość i swoistość badań oraz wobec drogich badań, takich jak endoskopia oraz badania oddechowe14mocznika C. 2,3,5,8,9 Zestaw QUANTA Lite H. pylori IgG stanowi część rodziny QUANTA Lite zestawów ELISA. Testy ELISA w przypadku wykrywania przeciwciał H. pylori wykazały wysoką czułość i swoistość. Zasada badania Oczyszczony antygen H. pylori wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Uprzednio wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjenta są dodawane do oddzielnych dołków, dzięki czemu wszelkie przeciwciała H. pylori IgG wiążą się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem H. pylori (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgG przeciwkoh. pylori, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo dodatnie IgG H. pylori ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała IgG w surowicy przeciwko H. pylori, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 4. Wysoko dodatnie IgG H. pylori ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała IgG w surowicy przeciwko H. pylori, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml 1

2 Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Dlatego słabo dodatnie H. pylori IgG ELISA, wysoko dodatnie H. pylori IgG ELISA oraz ujemna kontrola ELISA powinny być traktowane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. 2

3 Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CSLI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami H. pylori IgG ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej pozytywnej niskiej H. pylori IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej pozytywnej wysokiej H. pylori IgG ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ nisko pozytywnego testu H. pylori IgG ELISA, wysoko pozytywnego testu H. pylori IgG ELISA oraz negatywnej kontroli ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku H. pylori IgG, stosując jednostki umowne wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonego H. pylori IgG ELISA, wysoko pozytywnego H. pylori IgG ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA oraz rozcieńczonych próbek pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 3

4 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną H. pylori IgG ELISA, wysoko pozytywną H. pylori IgG ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. W związku z tym, że słabo pozytywna H. pylori IgG ELISA, wysoko pozytywna H. pylori IgG ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej H. pylori IgG ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej H. pylori IgG ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysokiej pozytywnej H. pylori IgG ELISA musi być większa niż 1,0, a absorbancja wstępnie rozcieńczonej negatywnej kontroli ELISA nie może być większa niż 0,2. c. Absorbancja słabo dodatniej H. pylori IgG ELISA musi być większa niż dwukrotna wartość negatywnej kontroli ELISA lub powinna przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna testu ELISA oraz wysoko pozytywnah. pylori IgG ELISA mają monitorować występowanie poważnych nieprawidłowości związanych z odczynnikami. Wysoko pozytywna IgA H. pylori IgG ELISA nie zapewnia dokładności przy wartości granicznej testu. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CSLI (NCCLS) C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki może być obliczona przez podzielenie średniej gęstości optycznej przez średnią słabo dodatniej gęstości optycznej H. pylori IgG ELISA. Wynik jest pomnożony przez liczbę jednostek przypisanych do słabo dodatniego H. pylori IgG ELISA znalezioną na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo pozytywna H. pylori IgG ELISA (jednostki) H. pylori IgG gęstość słabo pozytywnej ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbki uznaje się za dające wynik negatywny (negatywny pod względem przeciwciała IgG przeciwko H. pylori), niejednoznaczny lub pozytywny (wykryte zostaje przeciwciało IgG przeciwko H. pylori) w oparciu o poniższą tabelę. Jednostki Negatywny <20 Niejednoznaczna 20,1 24,9 Pozytywna >25 Niejednoznaczne próbki powinny zostać ponownie przebadane przed przedstawieniem wyników. 1. Wynik pozytywny wskazuje wyłączenie na wcześniejsze immunologiczne wystawienie na działanie H. pylori. Nie może on rozróżnić aktywnej infekcji H. pylori od nieaktywnej. Infekcja aktywna jest oceniana na podstawie kultury materiału biopsji, za pomocą testu oddechowego mocznika 13 C lub przy użyciu metod wykrywania ureazy. 2. W przypadku próbek o niejednoznacznym poziomie H. pylori IgG nie można ustalić stanu przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę. 4

5 3. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko H. pylori, lub że ich poziom jest poniżej granicy wykrywania dla tego testu. Próbki pobrane zbyt wcześnie podczas początkowego etapu infekcji mogą nie wykazać obecności przeciwciał IgG. Jeśli podejrzewany jest wstępny etap infekcji, należy pobrać kolejne próbki po 4-6 tygodniach i należy przebadać je przy użyciu tych samych testów, co początkowe próbki. 4. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości H. pylori IgG przeciwko gliadynie uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Celem tego testu jest wspomaganie diagnozy infekcji H. pylori. 2. Test powinien być stosowany wyłącznie w przypadku osób z objawami sugerującymi choroby układu pokarmowego i nie jest przeznaczone dla pacjentów, u których nie występują żadne objawy. 3. Negatywny wynik na obecność przeciwciał nie wyklucza obecności H. pylori, ponieważ stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 4. Można uzyskać negatywne wyniki, jeśli próbki zostaną pobrane na zbyt wczesnym etapie infekcji, przed pojawieniem się wykrywalnych przeciwciał. Jeśli podejrzewana jest infekcja H. pylori, należy pobrać próbki 4-6 tygodni później i przebadać je w identyczny sposób, jak pierwsze próbki. 5. Pozytywny wynik testu nie umożliwia rozróżnienia pomiędzy aktywną infekcją a kolonizacją H. pylori. 6. Pozytywny wynik testu wskazuje jedynie obecności przeciwciał przeciwko H. pylori i nie musi oznaczać obecności choroby układu pokarmowego. 7. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 8. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Ustalono, że około 50% światowej populacji jest zainfekowane H. pylori. W krajach rozwijających się 50% populacji lub więcej jest zarażone od 10 roku życia, natomiast w krajach rozwiniętych, przypadki infekcji w dzieciństwie są sporadyczne. Powszechność przeciwciał w surowicy wzrasta o około 0,5 1,0% na rok wraz ze wzrostem wieku (tzn. około 60% powszechności w grupie wiekowej 60 lat). 3,7,12,13 Normalny zakres Przy użyciu testu QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA przebadano dwie grupy zdrowych osób bez objawów (w wieku 18 75) jedna pochodziła z San Diego, CA a druga z Buffalo, NY. Wyniki 1,8% (1/53) surowicy z grupy San Diego i 11,3% (11/97) surowicy z grupy Buffalo i były pozytywne w przypadku przeciwciał H. pylori IgG. Dane wykazały wzrost pozytywności surowicy wraz ze wzrostem wieku, tak jak sugerowała to literatura. Swoistość i wrażliwość względna Badanie próbek Wyniki testu QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA było testowane na panelu składającym się z 295 klinicznie potwierdzonych próbek retrospektywnych pochodzących od pacjentów, którzy mieli endoskopię. Obecność infekcji H. pylori została oceniona na podstawie testów kultury, histologii oraz CLO. Próbki były traktowane jako pozytywne dla H. pylori, jeśli były pozytywne na kulturę lub jeśli 2 z 3 badań miało wynik pozytywny. Tabela 1: Czułość i swoistość w panelu klinicznym n = 295 INOVA H.pylori IgG POZ NIEJEDN NEG Kliniczne POZ* n= NEG n= *Próbki były traktowane jako pozytywne, gdy kultura była pozytywna lub jeśli CLO lub histologia były pozytywne Czułość: 94,0% (141/150) Swoistość: 92,0% (126/137) Zgodność: 93,0% (267/287) Uwaga: wyniki niejednoznaczne były wykluczone z obliczeń Pomimo tego, że w chwili pobrania próbki pacjenci byli określeni jako negatywni przez badania kultury, histologii i CLO, istnieje prawdopodobieństwo, że niektórzy pacjenci byli wcześniej narażeni na H. pylori na podstawie silnej reakcyjności IgG w niektórych negatywnych próbkach. W związku z tym 7 z 11 klinicznie negatywnych próbek orzeczonych jako pozytywne przy użyciu testu INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA, zostało ponownie przebadanych przy użyciu podobnego zestawu H. pylori IgG dopuszczonego do badań diagnostycznych for in vitro. Ten dostępny w handlu zestaw umożliwił wykrycie 6 pozytywnych próbek oraz 1 nieokreślonej. Wyniki testowania anonimowego panelu klinicznego w trzech placówkach Wyniki uzyskane w ramach panelu 40 utajnionych próbek klinicznych, wykonane w 3 różnych placówkach testowych zostały podsumowane w tabeli 2. Swoistość była na poziomie 100% (10/10) we wszystkich trzech placówkach. Czułość wyniosła 96,3% w placówce 1, 96,6% w placówce 2 oraz 93,1% w placówce 3 5

6 Tabela 2: Czułość i swoistość określone na podstawie testu QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA, na podstawie wyników uzyskanych z 3 różnych placówek przy użyciu utajnionego panelu klinicznego. Placówka 1 Placówka 2 Placówka 3 Czułość N=30 96,3% (26/27) 96,6% (28/29) 93,1% (27/29) Swoistość N=10 100% (10/10) 100% (10/10) 100% (10/10) Łączna zgodność 97,3% (36/37) 97,4% (38/39) 94,9% (37/39) Uwaga: Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione. Weryfikacja wartości granicznych Wartość graniczna dla tego badania została zweryfikowana poprzez przetestowanie panelu próbek klinicznych za pomocą analizy wartości granicznej ROC (Receiver Operating Characteristics) 11. Analiza ROC Analiza ROC zapewniła estymację dokładności diagnostycznej testu INOVA H. pylori IgG w porównaniu ze zgłoszonym stanem klinicznym pacjenta. Umożliwia ona również weryfikację punktu granicznego badania 11. Analiza wspiera wykorzystywanie zakresów interpretacji, które ustanowiliśmy dla tego kościoła. Badanie reaktywności krzyżowej Zostało przeprowadzone badanie absorpcyjne w celu ocenienia reaktywności krzyżowej antygenów bakteryjnych za pomocą testu INOVA QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA. W zasadzie surowice z różnymi poziomami przeciwciał przeciwko H. pylori zostały absorbowane przez antygeny H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus lub E. coli, a próbki nieleczonego serum zostały przebadane za pomocą badania H. pylori IgG. Wszystkie surowiczo dodatnie próbki H. pylori pozostały surowiczo dodanie gdy zostały absorbowane antygenami innymi niż H. pylori. Średnia wartość procentowa zahamowania wyszła 82,1% przy użyciu antygenu H. pylori oraz 2,9%, gdy zostały użyte antygeny pochodzące od innych organizmów. Obecność przeciwciał przeciwjądrowych (5 surowic), czynnik reumatoidalny (5 surowic) oraz przeciwciała przeciwko DNA (5 surowic) zostały również przetestowane i nie wykazały kolidowania ze swoistością testu INOVA QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA. Interferencja Zostały przeprowadzone dwa badania, aby określić, czy obecność wysokich poziomów bilirubiny, cholesterolu lub trójglicerydów w próbkach surowicy koliduje z testem QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA. W pierwszym badaniu 20 próbek surowicy (6 H. pylori pozytywne i 14 negatywne) zostało przebadanych z dodatkiem oraz bez dodatku bilirubiny (40x normalny poziom) lub hemoglobiny (66x normalny poziom). Drugie badanie obejmowało iglicowanie pozytywnej surowicy H. pylori z surowicą zawierającą wysokie poziomy cholesterolu, trójglicerydów lub bilirubiny. Wyniki wykazały, że żadna z tych substancji nie kolidowała z testem QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA. Precyzja i powtarzalność Zmienność pomiędzy badaniami oceniono przeprowadzając zdublowane badanie panelu 14 próbek, w tym dwóch negatywnych, 3 słabo pozytywnych, 2 średnio pozytywnych o 1 wysoko pozytywnej oraz negatywnej, słabo pozytywnej i wysoko pozytywnej kontroli dwa razy dziennie (raz rano i raz po popołudniu) przez 3 dni w 3 placówkach testowych. Tabela 4: Zespolone wyniki pomiędzy testami dla trzech placówek Surowica R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 NC LPC HPC SRU 46,7 23,8 30,2 46,5 45,6 25 4,2 24, ,6 3,5 4,0 25,8 3,4 4, ,6 SD 2,4 2,3 4,9 2,3 2,5 3,4 2,6 2,9 3,0 8,8 2,7 3,0 2,5 2,8 3,2 0 5 CV% Wyniki wewnątrz badania zostały ocenione na podstawie 15-krotnego testu 6 próbek, w tym negatywnej, niejednoznacznej, pozytywnej na granicy, słabo pozytywnej, umiarkowanie pozytywnej i wysoko pozytywnej. Wyniki zostały podsumowane w tabeli 5. Tabela 5: Wyniki w ramach badania QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Surowica 1 Surowica 2 Surowica 3 Surowica 4 Surowica 5 Surowica 6 Średnio 84,03 99,28 31,98 25,96 21,12 2,98 S,D, 3,09 4,21 1,44 1,52 0,91 0,30 C,V,% 3,6 4,2 4,5 5,9 4,3 10,1 6

7 Liniowość Aby ocenić liniowość testu QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA, 4 próbki zostały rozcieńczone w serii od 1:50 do 1: i przebadane za pomocą testu QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA. Analiza wykazała, że badanie było liniowe od około jednostek w skrajnie dolnym zakresie do przynajmniej 121 jednostek w skrajnie wysokim zakresie. Wartości R 2 dla 4 rozcieńczonych surowic wynosiły 0,99 lub więcej., 4 2 = x 4 9 8, 3 1 y = - 5, 68 y = -10,639x + R 2 = 0, ,0 y = -15,844x + 120,41 R

8 Piśmiennictwo 1. Marshall BJ Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii: Walsh JH and Peterson WL The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): Blaser MJ Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: The Eurogast Study Group An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease JAMA 272: Malfertheiner P, et al Current European concept in the mangement of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9: Hirschl AM, et al Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15: Patel P, et al Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet 346: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests using receiver operating characteristic (ROC) Plots; approved guideline (NCCLS document GP10-A), Wayne, PA. 12. Megraud F, et al Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: Veldhuyzen SJO, et al Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169: QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Sierpień 2011 Wersja 0 8