Zaka enie latentne wirusem brodawczaka ludzkiego kobiet ci arnych a kolonizacja o yska HPV doniesienie wst pne

Transkrypt

1 latentne wirusem brodawczaka ludzkiego kobiet ci arnych a kolonizacja o yska doniesienie wst pne The latent infection of human papilloma virus in pregnat woman and colonization of placenta preliminary report Karowicz-Biliƒska Agata Zak ad Fizjopatologii arzàdu Rodnego Uniwersytetu Medycznego w odzi Streszczenie wirusem brodawczaka ludzkiego mo e przebiegaç w formie ukrytej, bez zmian cytologicznych i klinicznych charakterystycznych dla tej infekcji. Istniejà obserwacje sugerujàce mo liwoêç przeniesienia zaka enia na organizm p odu. WÊród przyczyn zespo u ograniczonego wzrastania p odu jest wymieniane równie zaka enie wirusem brodawczaka ludzkiego. Cel pracy: Celem pracy by o stwierdzenie obecnoêci DA wirusa brodawczaka ludzkiego wêród kobiet z prawid owymi wynikami badania cytologicznego, w materiale pobieranym z szyjki macicy oraz w o yskach pochodzàcych z cià powik anych zespo em ograniczonego wzrastania p odu. Materia i metody: Materia stanowi y wymazy z tarczy cz Êci pochwowej szyjki macicy pobrane w III trymestrze cià y oraz wycinki z centralnej cz Êci o yska pobierane po porodzie. badana liczy a kobiety ci arne z cià- à powik anà zespo em ograniczonego wzrastania p odu o Êrednim nasileniu mi dzy 5 a 9 centylem, bez obecno- Êci uchwytnych przyczyn IUGR. Grup kontrolnà utworzono z ci arnych z fizjologicznym przebiegiem cià y, z prawid owà masà urodzeniowà p odów. W materiale z szyjki macicy i z o ysk za pomocà techniki PCR i zestawu Human Papillomavirus Typing Set (TaKaRa, Japonia) wykrywano obecnoêç DA oraz wykonywano typowanie wkierunku wirusów onkogennych i nieonkogennych. Wyniki: W ie kobiet z prawid owym przebiegiem cià y oraz eutrofià p odów nie wykryto obecnoêci DA wirusa brodawczaka ludzkiego. W ie cià powik anych zespo em ograniczonego wzrastania p odu stwierdzono obecnoêç DA w przypadkach razy typ 6 i raz typ 8 zarówno w szyjce macicy jak i w o ysku. Wnioski:. Bezobjawowe zaka enie wirusem brodawczaka ludzkiego o wysokim ryzyku onkogenezy mo e byç przyczynà transmisji wirusa do p odu.. ObecnoÊç zaka eƒ wysokiego ryzyka w ie kobiet z cià ami powik anymi zespo em ograniczonego wzrastania p odu mo e sugerowaç wp yw tego zaka enia na powstanie IUGR. S owa kluczowe: / cià a / zaka enie / Adres do korespondencji: Karowicz-Biliƒska Agata Zak ad Fizjopatologii i arzàdu Rodnego UM w odzi ódê, ul. Wileƒska 7 agakar@interia.pl Otrzymano: 5..7 Zaakceptowano do druku: r /7

2 Karowicz-Biliƒska A, et al. Abstract Human papilloma virus infection may have a latent form without characteristic changes in Pap-smears. Some data suggests there exists a possibility of materno-foetal transmission of the infection. infection may be one of the possible reasons for IUGR. Aim: The main aim of the study was to find DA in the Pap-smear and placentas in pregnancy complicated by the intrauterine growth restriction. Material and methods: In two groups of women with normal Pap-smears, the material for DA presence was taken from the uterine cervix and from the central part of placenta after the delivery. The study group consisted of pregnant women with the pregnancy complicated by fetal growth restriction. The control group consisted of women with normal fetal weight pregnancy. In cervical smears and placental fragments the presence of DA and typing of using the PCR method has been done. Results: In the control group the presence of low risk types of was found but DA wasn t present in the placental fragments. In the study group, in 4 cases high risk DA was found in cervical smears and in of those cases DA was also present in the placental fragments. In two cases it was type 6, in one type 8. Conclusions: The latent form of high risk infection might be the reason for materno-foetal transmission of. The high rate of high oncogenic risk types of in the group of pregnancies complicated by IUGR might suggest the correlation between infection and IUGR etiology. Key words: / pregnancy / infection / Wst p Badania epidemiologiczne i kliniczne wykaza y zwiàzek mi dzy wyst powaniem Êródnab onkowej neoplazji i raka szyjki macicy, a zaka eniem wirusem brodawczaka ludzkiego (). ObecnoÊç DA typu onkogennego stwierdzana jest w ponad 9 przypadków raka inwazyjnego oraz w oko- o 5-8 przypadków neoplazji Êredniego i du ego stopnia []. Rozwój i progresja zmian na szyjce macicy jest zwiàzana zlatentnà formà zaka enia wysokiego ryzyka []. latentne mo e byç wykryte tylko za pomocà stwierdzenia obecnoêci DA wirusa, poniewa w badaniu cytologicznym i klinicznym brak jest charakterystycznych dla tej infekcji cech w obr bie komórek nab onka [, 4]. Zespó ograniczonego wzrastania p odu (IUGR, FGR) polega na niedoborze masy wynikajàcym z zaburzeƒ wymiany mi dzy matkà a p odem. ajcz stszà przyczynà pojawienia si tego stanu jest nieprawid owa migracja trofoblastu powodujàca powstawanie naczyƒ wysokooporowych, które w póêniejszym okresie cià y nie zapewniajà prawid owego przep ywu krwi [5, 6, 7]. Ze wzgl du na patogenez i czas powstania zaburzeƒ wymiany mi dzy matkà a p odem istniejà trzy typy hipotrofii. Hipotrofi I typu- symetrycznà wywo ujà najcz Êciej czynniki infekcyjne dzia ajàce przed 7 tygodniem cià y. WÊród nich wymienia si wirusa ró yczki, opryszczki typu II (HSV ), ospy wietrznej, HIV, brodawczaka ludzkiego, parwowirozy oraz cytomegalii CMV [8]. Cel pracy Celem pracy by a ocena cz stoêci wyst powania zaka enia wirusem brodawczaka ludzkiego u kobiet ci arnych w cià y fizjologicznej oraz powik anej zespo em ograniczonego wzrastania p odu oraz ocena obecnoêci DA wysokiego ryzyka w o yskach z tych cià. Materia i metody Badania zosta y przeprowadzone w latach 5-7 wêród kobiet ci arnych hospitalizowanych w Klinice Patologii Cià y I Katedry Ginekologii i Po o nictwa Uniwersytetu Medycznego w odzi. a badanie uzyskano zgod Komisji Bioetycznej UM w odzi nr R/8/5/KE/5. Grup badanà utworzono z ci arnych, u których stwierdzono za pomocà badania ultrasonograficznego zespó ograniczonego wzrastania p odu, a masa urodzeniowa noworodków kwalifikowa a je poni ej centyla. badana liczy- a ci arne b dàce w III trymestrze cià y. Grup kontrolnà utworzono z zdrowych kobiet ci arnych, u których ultrasonograficznie potwierdzono prawid owà mas p odów i które urodzi y donoszone eutroficzne noworodki. Wszystkie kobiety rozwiàzywane by y drogà planowego ci cia cesarskiego. U wszystkich kobiet ci arnych pobierano badanie cytologiczne z okolicy strefy przekszta ceƒ podczas badania wst pnego oraz materia do oznaczania obecnoêci wirusa brodawczaka ludzkiego (). Podczas ci cia cesarskiego po wydobyciu o yska pobierano fragment o yska. Miejsce pobrania, celem uzyskania obiektywizacji wyników, znajdowa o si w centralnej cz Êci o- yska w odleg oêci oko o cm od przyczepu p powiny, a wielkoêç wycinka wynosi a oko o xcm. Fragment o yska pobierany by w warunkach sterylnych, umieszczony natychmiast w pojemniku z roztworem formaliny a nast pnie przekazywany do dalszego opracowania i obróbki technicznej. Pobrany materia umieszczano w probówce Eppendorfa, dodawano 8µl buforu lizujàcego do próbki a nast pnie µl proteinazy K, mieszano przez worteksowanie, inkubowano probówk godziny w 55 C w aêni wodnej, dodawano µl roztworu lizujàcego i inkubowano w 7 C przez minut, dodawano µl 96 etanolu i mieszano przez worteksowanie sekund, a nast pnie przenoszono zawartoêç probówki do kolumienek dostarczonych w zestawie (Gen Eluate ucleic Acid binding column/ml collection tube) i wirowano przy 65g przez minut. 7 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne 967

3 latentne wirusem brodawczaka ludzkiego... Usuwano probówk z p ynem i umieszczano kolumn w nowej probówce zbierajàcej, dodawano 5µl roztworu Wash solution do kolumny i wirowano przy obrotach 65g przez minut, przemywano kolumienki ponownie 5µl roztworem Wash solution wirujàc przy g przez minuty, usuwano probówk z p ynem i prowadzono elucj z u yciem µl roztworu elucyjnego wirujàc przy 65g przez minut, dokonywano pomiarów spektrofotometrycznych st enia koƒcowego DA. Uzyskany DA wykorzystywano wreakcji aƒcuchowej polimerazy. W celu wykrycia wirusa niskiego lub wysokiego ryzyka zosta a przeprowadzona reakcja PCR z zastosowaniem komercyjnie dost pnego zestawu PCR Human Papillomavirus Typing Set (TaKaRa, Japonia). W badaniach zosta y zastosowane dwie pary -nukleotydowych starterów, których sekwencje odpowiadajà fragmentom sekwencji genów wirusowych E6 i E7. Para pu M/pU R pozwala na amplifikacj DA z y wysokiego ryzyka onkologicznego ( 6, 8,,, 5, 9, 45, 5, 5b, 58), natomiast para pu B/pU R na amplifikacj DA y niskiego ryzyka onkologicznego ( 6, ). W przypadkach, gdy d ugoêç zamplifikowanych fragmentów DA wynosi a 8 68 bp., produkty reakcji PCR poddawano oczyszczaniu metodà fenol/chloroform a nast pnie w celu identyfikacji typów wirusa trawiono okreêlonymi enzymami restrykcyjnymi (7 C, godz.). Analiz statystycznà przeprowadzono w oparciu program Statistica PL. Porównanie Êrednich mi dzy ami w przypadku nieodrzucenia hipotezy o normalnoêci rozk adu na poziomie istotnoêci p=,5 wykonano testem t Studenta dla prób niezale nych, a w przypadku odrzucenia hipotezy o normalnoêci rozk adów stosowano nieparametryczny test U Manna Whitney a. Wyniki Do obydwu zakwalifikowano jedynie kobiety ci arne z prawid owymi wynikami badania cytologicznego, bez cech zaka enia wirusem brodawczaka ludzkiego, co zosta o potwierdzone przez doêwiadczonego patomorfologa. Charakterystyk przedstawiono w tabeli I. Âredni wiek kobiet ci arnych w obydwu ach by podobny, równie odsetek pierwiastek i wieloródek nie ró ni si W badanym materiale w ie ci arnych z cià à powik anà zespo em opóênionego wzrastania p odów stwierdzono 4 przypadki zaka enia wirusami brodawczaka ludzkiego typów onkogennych. Póêniejsza analiza oceniajàca typ wirusa wykaza a obecnoêç 6 u trzech z zaka onych kobiet ci arnych i u jednej 8. W tej ie stwierdzono równie przypadki zaka enia wirusem o nieonkogennym 6. W ie kontrolnej nie wykryto obecnoêci DA wirusów o wysokim ryzyku onkogenezy, wykryto jeden przypadek zaka enia wirusem niskiego ryzyka, 6. Wyniki przedstawiono w tabelach II i III. Tabela I. Charakterystyka. Ârednia wieku w latach 7,6 5,4 6,8 Pierwiastki , 5, 4, Wieloródki W pierwszym etapie analizy o ysk stwierdzono obecnoêç DA wysokiego ryzyka w wycinkach o ysk z y kobiet z cià à powik anà zespo em ograniczonego wzrastania p odu, w ie kontrolnej nie wykryto obecnoêci DA wysokiego ryzyka. Typujàc wirusy o wysokim ryzyku onkogenezy stwierdzono obecnoêç typu 6 w dwóch przypadkach oraz typ 8 w jednym przypadku. ObecnoÊç DA wirusa i jego onkogennoêç by a zgodna z wynikami uzyskanymi z materia u z szyjki macicy ,8 65, 56,8 Tabela II. Analiza obecnoêci DA wirusa brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka 4 7,4 4 5,4 niskiego ryzyka 5,7 Tabela III. Analiza typowania DA wirusa brodawczaka ludzkiego typu 6 5,6 4, typu 8,8, typu 6 5 4, Tabela IV. Analiza obecnoêci DA wirusa brodawczaka ludzkiego oraz jego typowanie w preparatach o ysk wysokiego ryzyka 5,6 4, typem 6,6 typem 8,8, wysokiego ryzyka 968 r /7

4 Karowicz-Biliƒska A, et al. W o yskach oceniono równie obecnoêç DA niskiego ryzyka nie wykryto obecnoêci DA wirusów o niskim ryzyku onkogenezy wêród kobiet ci arnych obydwu. (Tabela IV). Stwierdzono obecnoêç DA onkogennych w obr bie o yska w z przypadków, w których stwierdzono obecnoêç latentnej infekcji 6 w materiale pobranym z szyjki macicy oraz wspó istnienie obecnoêci DA 8 w jednym przypadku zarówno w materiale pobranym z szyjki jak iz o yska. U ci arnych, u których wykryto zaka enie typem 6 nie potwierdzono obecnoêci DA w o yskach. Stwierdzono dodatnià korelacj mi dzy obecnoêcià DA wirusów wysokiego ryzyka w Êluzie szyjkowym a obecnoêcià w wycinkach z o yska. ie stwierdzono takiej korelacji w przypadku zaka- enia niskiego ryzyka. Dyskusja Badanie przeprowadzone za pomocà techniki PCR wêród kobiet ci arnych b dàcych w III trymestrze cià y zarówno w ie kobiet z cià à powik anà zespo em ograniczonego wzrastania p odu, jak i niepowik anà, potwierdzi o bezobjawowe zaka enie. Wy szy odsetek infekcji zarówno typami nieonkogennymi jak i onkogennymi stwierdzono w ie cià powik anych zespo em opóênionego wzrastania p odu, co mo e sugerowaç udzia wirusa brodawczaka ludzkiego w patogenezie tego zespo u. Rozwój metod diagnostycznych - technik molekularnych pozwala dok adnie okreêliç typ wirusa i tym samym oceniç zagro enie [9]. Stwierdzono wi kszà cz stoêç wyst powania DA typu 6 w porównaniu do 8, co zgodne jest z obserwacjami przeprowadzonymi zarówno wêród kobiet ci arnych jak i nieci arnych [,, ]. Podobnà zale noêç potwierdzi owak wêród kobiet ci - arnych z latentnà formà zaka enia []. Wspó istnienie obecnoêci DA wirusa brodawczaka ludzkiego w materiale pobranym z szyjki macicy oraz wwycinkach z o yska jest faktem wskazujàcym na kolonizacj organizmu p odu podczas cià y [4]. W ie kobiet z cià ami powik anymi zespo em ograniczonego wzrastania p odu stwierdzono zwi kszonà w stosunku do y cià fizjologicznych cz stoêç zaka eƒ latentnych, potwierdzajàc jednoczeênie mo liwoêç kolonizacji organizmu p odu przez obecnoêç DA w o ysku. Wirusy o wysokim ryzyku onkogenezy znajdowane sà równie w p ynie owodniowym i sà najprawdopodobniej zdolne do kolonizacji organizmu p odu []. Brak jest jak dotàd potwierdzenia, czy w efekcie zaka enia wewnàtrzmacicznego typem onkogennym, mo na po up ywie kilkunastu lat przewidzieç powstanie zmian nowotworowych na tym tle [4, 5]. Cià a jest stanem prawdopodobnie u atwiajàcym rozwój zaka enia, co spowodowane jest wysokim st eniem progesteronu mogàcym u atwiaç transkrypcj i replikacj przez element odpowiedzi glukokortykoidy/progesteron, odkryty w regionie LCR genomu wirusa [6]. Prawdopodobnie z tego powodu u kobiet ci arnych wzrasta równie ryzyko progresji zmian dysplastycznych. Wprzeprowadzonych badaniach nie potwierdzono mo liwoêci przeniesienia zaka enia niskoonkogennymi typami do p odu, co jest zgodne z obserwacjami innych autorów [4,, 7]. Przyjmujàc, e cz stoêç zaka eƒ nie jest uzale niona od trymestru cià y mo na stwierdziç, e tak wysoki odsetek zaka eƒ latentnych w ie kobiet z cià ami powik anymi zespo em opóênionego wzrastania p odu mo e byç zwiàzany z transmisjà zaka enia do trofoblastu [, 8]. Wp yw zaka enia na migracj trofoblastu nie jest do koƒca poznany, ale mo na podejrzewaç, e jest ona ograniczana, co powoduje powstawanie naczyƒ wysokooporowych prowadzàcych do rozwoju zespo u ograniczonego wzrastania p odu [9, ]. Poniewa zaka enie onkogennymi typami wirusa brodawczaka ludzkiego, rozpoznaje si cz Êciej u kobiet w wieku poni ej 5 lat z cz stoêcià nawet do ponad 8 []. Ta prawid owoêç mo e t umaczyç wysoki odsetek zaka eƒ latentnych wêród badanych ci arnych. W badaniach innych autorów cz stoêç zaka eƒ, zarówno jawnych jak i latentnych wynosi oko o, przy czym równie najwy szy odsetek zaka- onych, to ci arne poni ej 5 roku ycia [,, 4]. Podsumowujàc, nale y podkreêliç niedoskona oêç stosowanej powszechnie metody jakà jest badanie cytologiczne i koniecznoêç zastàpienia jej badaniem wykrywajàcym obecnoêç DA wirusa brodawczaka ludzkiego. ObecnoÊç onkogennych typów zarówno w latentnej jak i aktywnej formie zaka enia wskazuje na ryzyko przeniesienia zaka enia na p ód [5] oraz na wzrost ryzyka rozwini cia si zespo u ograniczonego wzrastania p odu, co powinno byç potwierdzone na wi kszym materiale. Wnioski. Bezobjawowe zaka enie wirusem brodawczaka ludzkiego o wysokim ryzyku onkogenezy mo e byç przyczynà transmisji wirusa do p odu.. ObecnoÊç zaka eƒ wysokiego ryzyka w ie kobiet z cià ami powik anymi zespo em ograniczonego wzrastania p odu mo e sugerowaç wp yw tego zaka enia na powstanie IUGR. Badania zosta y sfinansowane z funduszy Ministerstwa auki i Szkolnictwa Wy szego na lata 7- nr 4/B/PO/7/. PiÊmiennictwo. Munoz. Human papillomavirus and cancer: the epidemiological evidence. J Clin Virol., 9, -5.. obbenhuis M, Walboomers J, Helmerhorst T. Relation of human papillomavirus status to cervical lesions and consequences for cervical cancer screening: a prospective study. Lancet. 999,, -5.. owak Z, Karowicz-Biliƒska A. wirusem brodawczaka ludzkiego z uwzgl dnieniem onkogennoêci oraz obecnoêci wybranych czynników ryzyka, u kobiet ci arnych z prawid owymi wynikami badaƒ cytologicznych. Ginekol Pol. 7, 78, Tseng C, Liang C, Soong Y, Pao C. Perinatal transmission of human papilloma virus in infants: relationship between infection rate and mode of delivery. Obstet Gynecol. 998, 9, Madazli R, Benian A, Ilvan S. Placental apoptosis and adhesion molecules expression in the placenta and the maternal placental bed of pregnancies complicated by fetal growth restriction with and without pre-eclampsia. J Obstet Gynaecol. 6, 6, Polskie Towarzystwo Ginekologiczne 969

5 latentne wirusem brodawczaka ludzkiego Huppertz B, Kadyrov M, Kingdom J. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 6, 95, Kadyrov M, Kingdom J, Huppertz B. Divergent trophoblast invasion and apoptosis in placental bed spiral arteries from pregnancies complicated by maternal anemia and early-onset preeclampsia/intrauterine growth restriction. Am J Obstet Gynecol. 6, 94, Prada J, Tsang R. Biological mechanisms of environmentally induced causes of IUGR. Eur J Clin utr. 998, 5, suppl., Cubie H, Seagar A, McGoogan E. Rapid real time PCR to distinguish between high risk human papillomavirus types 6 and 8. Mol Pathol.,, Boulanger J, Sevestre H, Bauville E. Epidemiology of infection. Gynecol Obstet Fertil. 4,, 8-.. Worda C, Huber A, Hudelist G. Prevalence of cervical and intrauterine human papillomavirus infection in the third trimester in asymptomatic women. J Soc Gynecol Investig. 5,, Hildesheim A, Schiffman M, Gravitt P, [et al.]. Persistence of type-specific human papillomavirus infection among cytologically normal women. J Infect Dis. 994, 69, Alberico S, Pinzano R, Comar M, [et al.]. Maternal-fetal transmission of human papillomavirus. Minerva Ginecol. 996, 48, Arena S, Marconi M, Ubertosi M, [et al.]. and pregnancy: diagnostic methods, transmission and evolution. Minerva Ginecol.,, Puranen M, Yliskoski M, Saarikoski S. Vertical transmission of human papillomavirus from infected mothers to their newborn babies and persistence of the virus in childchood. Am J Obstet Gynecol. 996, Tseng C, Lin C, Wang R. Possible transplacental transmission of human papillomavirus. Am J Obstet Gynecol. 99, 66, Eppel W, Worda C, Frigo P, [et al.]. Human papillomavirus in the cervix and placenta. Obstet Gynecol., 96, Veress G, Csiky-Mészáros T, Kónya J. Follow-up of human papillomavirus () DA and local anti- antibodies in cytologically normal pregnant women. Med Microbiol Immunol. 996,85, Endo H, Okamoto A, Yamada K, [et al.]. Frequent apoptosis in placental villi from pregnancies complicated with intrauterine growth restriction and without maternal symptoms. Int J Mol Med. 5, 6, Murthi P, Kee M, Gude, [et al.]. Fetal growth restriction is associated with increased apoptosis in the chorionic trophoblast cells of human fetal membranes. Placenta. 5, 6,9-8.. Hinkula M, Pukkala E, Kyyronen P. A population-based study on the risk of cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia among grand multiparous women in Finland. Br J Cancer. 4, 9, Takakuwa K, Mitsui T, Iwashita M, [et al.]. Studies on the prevalence of human papillomavirus in pregnant women in Japan. J Perinat Med. 6, 4, K dzia W, Schmidt M, Por ba E, [i wsp.]. Diagnostyka immunohistochemiczna wirusa brodawczaka w raku szyjki macicy u 44 kobiet z rejonu Wielkopolski. Ginekol Pol. 5, 76, Szepietowska M, S odziƒski H, Polz-Dacewicz M, [i wsp.]. Cz stoêç wyst powania zaka eƒ u kobiet ci arnych. Ginekol Pol., 7, Sedlacek T, Lindheim S, Eder C, [et al.]. Mechanism for human papillomavirus transmission at birth. Am J Obstet Gynecol. 989, 6, Specjalistyczny Szpital Ginekologiczno-Po o niczy Im.E.Biernackiego w Wa brzychu zaprasza na SYMPOZJUM pod protektoratem PTG,PT i PTMP Aspekty medyczne, etyczne, prawne i spo eczne ci cia cesarskiego Wa brzych Ksià 9- maja 8 W sympozjum wezmà równie udzia wybitni prawnicy zajmujàcy si problemami medycznymi Cel sympozjum Opracowanie rekomendacji do ci cia cesarskiego Tematyka Ci cie cesarskie ze wskazaƒ po o niczych. Wskazania pozapo o nicze do ci cia cesarskiego. Ci cie cesarskie ze wskazaƒ psychologicznych. Ci cie cesarskie na yczenie w niektórych krajach Unii Europejskiej. oworodek urodzony drogà ci cia cesarskiego korzyêci i zagro enia. Powik ania po ci ciu cesarskim. Aspekty etyczne i prawne ci cia cesarskiego. Sekretariat sympozjum Specjalistyczny Szpital Ginekologiczno-Po o niczy im. E. Biernackiego 58- Wa brzych, ul.paderewskiego tel , tel/fax: Przewodniczàcy Komitetu aukowego prof. dr hab. Jan Kotarski Prezes PTG prof. dr hab. Jerzy Szczapa Prezes PT prof. dr hab. Jan Wilczyƒski Prezes PTMP Przewodniczàcy Komitetu Organizacyjnego Sympozjum dr hab. n. med. S awomir Suchocki prof. nadzw. Formularz uczestnictwa wraz z ofertà hotelowà, informacje dotyczàce nadsy ania prac dost pne b dà na stronie: po paêdziernika 7 r. 97 r /7