GENETYK A I LECZENIE CHŁONIAK A ROZLANEGO Z DUŻYCH KOMÓREK B (DLBCL) w erze leków ukierunkowanych na cele molekularne

Transkrypt

1 Tomasz Chojnacki Piotr Rzepecki GENETYK A I LECZENIE CHŁONIAK A ROZLANEGO Z DUŻYCH KOMÓREK B (DLBCL) w erze leków ukierunkowanych na cele molekularne

2

3 Genetyka i leczenie chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) w erze leków ukierunkowanych na cele molekularne Tomasz Chojnacki, Piotr Rzepecki

4 Genetyka i leczenie chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL) w erze leków ukierunkowanych na cele molekularne Tomasz Chojnacki, Piotr Rzepecki Copyright by Tomasz Chojnacki, Piotr Rzepecki Wszystkie prawa zastrzeżone. Żaden z fragmentów tej książki nie może być publikowany w jakiejkolwiek formie bez wcześniejszej pisemnej zgody wydawcy. Dotyczy to także fotokopii i mikrofilmów oraz rozpowszechniania za pośrednictwem nośników elektronicznych. Wydanie na podstawie udzielonych licencji: Termedia Wydawnictwa Medyczne ul. Kleeberga Poznań tel./faks termedia@termedia.pl Termedia Wydawnictwa Medyczne Poznań 2016 r. Wydanie I Skład i łamanie: TERMEDIA ISBN: Wydawca dołożył wszelkich starań, aby cytowane w książce nazwy leków, ich dawki oraz inne informacje były prawidłowe. Wydawca ani autorzy nie ponoszą odpowiedzialności za konsekwencje wykorzystania informacji zawartych w niniejszej publikacji. Każdy produkt, o którym mowa w książce, powinien być stosowany zgodnie z odpowiednimi informacjami podanymi przez producenta. Ostateczną odpowiedzialność ponosi lekarz prowadzący.

5 SPIS TREŚCI ROZDZIAŁ 1 Genetyka 5 Tomasz Chojnacki ROZDZIAŁ 2 Zalecenia diagnostyczne 43 Tomasz Chojnacki ROZDZIAŁ 3 Leczenie 51 Tomasz Chojnacki ROZDZIAŁ 4 Rola przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych 81 stan wiedzy na 2015 rok Piotr Rzepecki

6

7 ROZDZIAŁ 1 GENETYKA Tomasz Chojnacki Informacje ogólne Chłoniak rozlany z dużych komórek B (diffuse large B-cell lymphoma DLBCL) jest najczęstszym chłoniakiem rozpoznawanym u dorosłych. Stanowi 30 40% wszystkich przypadków chłoniaków nieziarniczych (non-hodgkin s lymphoma NHL). Terminem chłoniak rozlany z dużych komórek B tak naprawdę określa się jednorodną morfologicznie, ale heterogenną pod innymi względami grupę chorób o różnej manifestacji klinicznej i różnej odpowiedzi na leczenie. Dotychczasowe próby podziału tej jednostki na podkategorie bazują na morfologii, cytogenetyce, immunohistochemii, dominujących manifestacjach klinicznych i profilu genowym. W przyszłości populacja chorych na DLBCL nie będzie leczona w ten sam sposób. Już teraz wiadomo, że wśród pacjentów z DLBCL istnieje pewna grupa o szczególnie niekorzystnym rokowaniu, w której zastosowanie immunochemioterapii wg schematu R-CHOP (rytuksymab, cyklo fosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon) jest niewystarczające. Do tej grupy zaliczają się pacjenci z obecnością translokacji MYC; t(8;14), a także pacjenci ze współistnieniem tej translokacji z translokacją BCL2; t(14;18), tzw. double hit lymphoma, oraz pacjenci ze współistnieniem MYC, BCL2 i BCL6; t(3;14), tzw. triple hit lymphoma. Podkreśla się, że bardziej intensywnej chemioterapii wymagają najprawdopodobniej również młodzi pacjenci (< 60. roku życia) z dużym i pośrednim dużym stopniem ryzyka wg Międzynarodowego Wskaźnika Rokowniczego (International Prognostic Index IPI). Na podstawie profilu ekspresji genów (gene expressions profile GEP), wg klasyfikacji Cell of Origin (COO) DLBCL można podzielić na 3 podtypy molekularne. Klasyfikacja ta ujawnia w poszczególnych podtypach choroby całe kompleksy genów ulegających nadekspresji. Pokazuje również, że medycyna spersonalizowana (ukierunkowana na cele molekularne) w DLBCL musi brać pod uwagę nie tylko mutacje odpowiedzialne za genezę nowotworu, lecz także szereg mutacji współistniejących, warunkujących np. oporność na stosowaną terapię. 5

8 Tomasz Chojnacki podtyp DLBCL ABC GCB PMBCL IRF4 PIM2 CCND2 FOXP1 IL16 CD44 IGHM MME CR2 KCNN3 LRMP LMO2 MYBL1 SLAM zaangażowane geny ekspresja genów wysoka niska TNFSF4 CCL17 PDL2 MAL IL4I1 Rycina 1. Profil ekspresji genów w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL) z podziałem na 3 podkategorie wg klasyfikacji Cell of Origin [za Roschewski M, Staudt LM, Wilson WH. Diffuse large B-cell lymphoma treatment approaches in the molecular era. Nat Rev Clin Oncol 2014; 11: 12-23] Nadekspresja danych grup genów w poszczególnych typach chłoniaka koresponduje z etapem rozwoju, na jakim znajduje się limfocyt B, z którego wywodzi się nowotwór. Podtyp GCB wywodzi się z komórek centrów rozmnażania (germinalnych), w których zachodzą somatyczne hipermutacje związane z reakcją w ośrodkach rozmnażania i dlatego cechuje się nadekspresją genów uczestniczących w tej reakcji, np. LRMP i LMO2. Dla tego podtypu charakterystyczna jest ekspresja genów związanych z proliferacją i wzmożonym metabolizmem komórek. Ponadto w podtypie GCB częste są translokacje BCL6, który jest głównym regulatorem transkrypcji w centrum rozmnażania, a także BCL2. W 21% przypadków GCB występuje mutacja w EZH2. Utrata ekspresji PTEN (55% przypadków DLBCL GCB) skutkuje aktywacją szlaku sygnałowego 3-kinazy fosfatydyloinozytolu i kinazy Akt PI3K/Akt, który staje się obecnie jednym z głównych celów leczenia ukierunkowanego. Podtyp ABC wywodzi się z limfocytów postgerminalnych i charakteryzuje się nadekspresją genów zaangażowanych w różnicowanie limfocytów B w komórki plazma 6

9 Rozdział 1 Tabela 1. Mechanizmy onkogenezy i potencjalne cele terapeutyczne w poszczególnych typach chłoniaka rozlanego z dużych komórek B Podtyp Mechanizmy onkogenezy Potencjalne cele terapeutyczne GCB ABC PMBCL translokacje BCL2 mutacje EZH2 delecja PTEN utrata ekspresji PTEN aktywacja NF-κB mutacje CARD11 delecje A20 aktywacja szlaku BCR konstytutywna aktywność MYD88 aktywacja NF-κB amplifikacje 9p24 amplifikacje REL mutacje JAK2 translokacje CIITA BCL6 EZH2 PI3K-AKT BCR kompleks CBM IRAK4 JAK-STAT JAK-STAT PD-1 tyczne, takich jak IRF4, PIM2 i FOXP1. Zasadniczą wspólną cechą chłoniaków ABC jest konstytutywna aktywacja szlaków NF-κB i szlaku sygnałowego BCR. Stwierdzane są też mutacje MYD88, CARD11 i CD79B oraz delecje i mutacje TNFAIP3. Podtyp PMBCL cechuje się amplifikacją fragmentu chromosomu 9 (9p24) i aktywacją szlaku NF-κB. Nadekspresji w tym podtypie ulegają też PDL1 i PDL2, czyniąc receptor PD-1 potencjalnym celem terapeutycznym. Mogą występować również translokacje, których wynikiem jest aktywacja szlaku PD-1. Podtyp PMBCL wywodzi się z unikalnych limfocytów B, które opuściły grasicę, i charakteryzuje się ekspresją rzadkiego garnituru genów typowego bardziej dla chłoniaka Hodgkina niż DLBCL, dlatego też nie będzie przedmiotem tego opracowania. Nadekspresje i rearanżacje onkogenów Rearanżacje MYC W prawidłowych limfocytach B BCL6 hamuje transkrypcję onkogenu MYC. W 10 15% przypadków DLBCL mechanizm ten jest omijany poprzez translokację onkogenu MYC, co skutkuje niekontrolowanym wzrostem i proliferacją komórek chłoniaka. U ok. 10% pacjentów z nowo zdiagnozowanym DLBCL stwierdza się rearanżacje onkogenu MYC ze złożonym kariotypem i u tych pacjentów występuje największe ryzyko niepowodzenia leczenia z użyciem standardowo stosowanej chemioterapii R-CHOP. Nie wiadomo, czy do złego rokowania w DLBCL-MYC+ wystarcza sama obecność rearanżacji MYC czy też niezbędne jest współistnienie dodatkowych aberracji cytogenetycznych. Badania retrospektywne wskazują, że guzy, w których występuje rearanżacja MYC, mają również inne dodatkowe rearanżacje, np. BCL2, BCL6 lub CCND1. Te tzw. double- i triple-hit lymphomas cechują się szczególnie złym rokowaniem, gdy są leczone R-CHOP. Ograniczone dane pokazują, że w tych przy 7

10 Tomasz Chojnacki padkach skuteczne może być leczenie DA-EPOCH-R (etopozyd, winkrystyna, cyklofosfamid, doksorubicyna, prednizon oraz rytuksymab), co jest obecnie przedmiotem badań klinicznych. Co istotne, z badania CORAL wynika, że pacjenci z rearanżacją MYC podczas nawrotu nie odnoszą korzyści z autotransplantacji (autologous stem cell transplantation ASCT). W fazie wczesnych badań klinicznych znajdują się inhibitory bromodomeny BET, które są próbą regulacji epigenetycznej guzów związanych z rearanżacją onkogenu MYC. Białka z rodziny Bcl-2 i ich znaczenie w patogenezie chłoniaka rozlanego z dużych komórek B Głównymi białkami wykonawczymi uczestniczącymi w procesie apoptozy są proteazy cysteinowe zwane kaspazami. Jest to rodzina białek występujących w komórkach w formie nieaktywnych zymogenów, które są uczynniane na dwa niezależne od siebie sposoby. Pierwsza droga aktywacji kaspaz (ewolucyjnie starsza), zwana szlakiem wewnątrzpochodnym (lub mitochondrialnym), jest indukowana wewnątrzkomórkowym stresem. W odpowiedzi na uwolnienie cytochromu c z uszkodzonych mitochondriów aktywowana jest kaspaza 9. Szlak ten jest regulowany przez białka z rodziny Bcl-2. Szlak zewnątrzpochodny rozpoczyna się od tzw. death receptors na powierzchni komórki, do których przyłączają się białka z rodziny TNF. Powoduje to aktywację kaspaz 8 i 10. Aktywowane w obu szlakach kaspazy (9 lub 8 i 10) uczynniają kolejne kaspazy efektorowe, tj. kaspazę 3, 6 i 7. Te z kolei powodują destrukcję komórek poprzez wyłączenie kilkuset białek. Oba szlaki są od siebie niezależne do tego stopnia, że nadekspresja Bcl-2 nie chroni limfocytów przed apoptozą wywołaną przez ligandy receptorów śmierci komórkowej (death receptors). Rodzina białek Bcl-2 funkcjonuje w komórce na podobieństwo przełącznika (życie lub śmierć) [1]. Zbierając wewnątrz- i międzykomórkowe sygnały o stresie komórkowym, decydują one o skierowaniu komórki na drogę apoptozy. Podczas gdy część rodziny Bcl-2 stanowią białka antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 i Bcl-B), inne dwie podrodziny (tzw. białka wiążące Bcl-2) mają działanie proapoptotyczne. Należą tu podrodzina białek apoptotycznych Bax-like (Bax, Bak i Bok) o strukturze podobnej do Bcl-2 oraz podrodzina białek BH3-only (BH3-only proteins), obejmująca białka: Bik, Bad, Bid, Bim, Bmf, Hrk, Noxa i Puma, zawierające na podobieństwo Bcl-2 tylko domenę BH3, która jest jednak kluczowa dla ich funkcji. W normalnych warunkach białka proapoptotyczne (Bax i Bak) są związane i unieczynnione przez białka antyapoptotyczne z rodziny Bcl-2, co chroni komórkę przed skierowaniem na drogę apoptozy (ryc. 2A). Stres komórkowy indukuje ekspresję białek BH3-only, które wypierają białka Bax i Bak z kompleksów z białkami antyapoptotycznymi. Uwolnione białka proapoptotyczne doprowadzają do permabilizacji błony mitochondrialnej, uwolnienia cytochromu c i aktywacji kaspaz. 8 Rearanżacje Bcl-2 Translokacje Bcl-2 są stwierdzane w ponad 35% przypadków DLBCL GCB i 20 25% DLBCL ogółem. Dla podtypu ABC charakterystyczne są natomiast ampli

11 Rozdział 1 A białka proapoptotyczne Bim, Puma, Bad, Bid, Bik Noxa, Hrk, Bmf białka antyapoptotyczne Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1, A-1 sygnalizacja przez tzw. death receptors BH3 Bcl-2 like białka antyapoptotyczne chronią komórkę przed apoptozą poprzez unieczynnienie ich proapoptotycznych odpowiedników Bax Bax Bax Bax Bax Bak zmiana konformacji Bak Bak Bak Bak oligomeryzacja aktywacja kaskady kaspaz MOMP apoptoza cytochrom c B sygnalizacja przez tzw. death receptors białka proapoptotyczne Bim, Puma, Bad, Bid, Bik Noxa, Hrk, Bmf BH3 białka antyapoptotyczne Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1, A-1 Bcl-2 like małe molekuły, takie jak venetoclax, przerywają interakcję pomiędzy białkami anty- i proapoptotycznymi i indukują apoptozę Bax Bax Bax Bax Bax Bak Bak Bak Bak Bak zmiana konformacji oligomeryzacja apoptoza aktywacja kaskady kaspaz MOMP cytochrom c Rycina 2. Schemat działania białek z rodziny Bcl-2 (A) oraz inhibitora Bcl-2 ABT-199 (B) [za: Mobasher M. Poster. ASCO 2014 (abstr. TPS7120)] 9

12 Tomasz Chojnacki fikacje Bcl-2 w locus 18q24 [2]. Zaburzenia te skutkują nadekspresją Bcl-2, które zyskuje przewagę ilościową nad białkami proapoptotycznymi, co powoduje zahamowanie apoptozy komórki nowotworowej. Translokacja t(14;18) może być związana z transformacją z chłoniaka grudkowego (follicular lymphoma FL) lub wystąpić de novo. Podczas gdy obecność translokacji t(14;18) nie koreluje z gorszym przeżyciem w DLBCL de novo, ekspresja białka Bcl-2 jest związana z gorszym przeżyciem, szczególnie w podtypie ABC. Celem terapeutycznym stało się więc zablokowanie funkcji białek antyapoptotycznych z rodziny Bcl-2 przez mimetyki BH3 (inhibitory Bcl-2). Obecnie najbardziej zaawansowana w badaniach klinicznych jest cząsteczka ABT-199 selektywny inhibitor Bcl-2, który w odróżnieniu od swoich poprzedników (inhibitorów nieselektywnych, np. navitoclax) pozbawiony jest wielu działań niepożądanych. Inhibicja Bcl-X L skutkowała bowiem głęboką małopłytkowością, znacznie ograniczającą stosowanie leków nieselektywnych [3]. Deregulacje Bcl-6 Kolejnym czynnikiem transkrypcyjnym, którego konstytutywna aktywność w znacznym stopniu warunkuje fenotyp komórek nowotworowych w części DLBCL, jest Bcl-6. Chłoniaki DLBCL zależne od szlaków molekularnych regulowanych przez ten czynnik transkrypcyjny wykazują skoordynowany profil ekspresji genów kontrolowanych przez Bcl-6, odrębny od profilu chłoniaków niezależnych od Bcl-6. Bcl-6 jest często aktywowany w DLBCL GCB i wiąże się to z wystąpieniem mutacji w domenie odpowiadającej za autoregulację Bcl-6. Dla podtypu ABC charakterystyczne są natomiast translokacje Bcl-6. Deregulacje Bcl-6 skutkują nasileniem proliferacji komórek nowotworowych poprzez: zmniejszenie ekspresji protein p21 i p27, pełniących funkcje punktów kontrolnych cyklu komórkowego, upośledzenie naprawy DNA w wyniku zmniejszonej ekspresji p53, zaburzenie metabolizmu komórki, oporność na apoptozę. Do pełnienia funkcji represora transkrypcji BCL6 wymaga korepresorów BCoR, NCoR oraz SMRT, zatem rozerwanie tej interakcji za pomocą peptydu BPI (Bcl-6 peptide inhibitor) wyłącza funkcję Bcl-6. W badaniach in vitro BPI powodował zahamowanie proliferacji i apoptozę w liniach komórkowych DLBCL o charakterystyce molekularnej BCR. Podobny efekt obserwowano w badaniach in vivo z użyciem ludzkich DLBCL ksenotransplantowanych immunoniekompetentnym myszom. Peptyd BPI, ze względu na niski stopień helikalności i stabilności w roztworach, wymaga wysokich stężeń, co nie wyklucza jego stosowania jako związku narzędziowego w celu udokumentowania hipotezy, lecz wyklucza jego wykorzystanie w terapii. Tych wad może być pozbawiony peptyd inhibitorowy sztucznie stabilizowany klamrą węglowodorową obejmującą jeden skok helisy (hydrocarbon-stapled peptide). Leki, których celem są kluczowe białka korepresorowe Bcl-6, są w trakcie badań przedklinicznych. 10

13 Rozdział 1 Rola sygnału z receptora B-komórkowego w patogenezie chłoniaka rozlanego z dużych komórek B Sygnał za pośrednictwem receptora B-komórkowego (B-cell receptor BCR) jest kluczowy dla rozwoju i przeżycia limfocytów B. W świetle liczby szlaków pochodzących od BCR promujących proliferację i przeżycie komórek nie dziwi, że także chłoniaki wykorzystują ten receptor dla promowania swojego przeżycia. Rola zarówno zależnej, jak i niezależnej od antygenu sygnalizacji z BCR, jak również sygnalizacji tonicznej została już opisana w odniesieniu do wielu typów chłoniaków. W przypadku szeregu tych nowotworów trwają badania nad lekami ukierunkowanymi na cele molekularne uczestniczące w przekazywaniu sygnału z tego receptora. Obecnie leki te są z powodzeniem stosowane w terapii niektórych chłoniaków. Różne typy chłoniaków używają jakościowo różnych trybów aktywacji szlaków sygnałowych pochodzących od receptora B-komórkowego. W celu odpowiedniego zahamowania tego sygnału niezbędna jest znajomość tych niuansów [4]. Fizjologiczne znaczenie sygnalosomu BCR Każdy limfocyt B, a co za tym idzie każda komórka chłoniaka z komórek B, ma unikalny BCR składający się z par immunoglobulin o łańcuchach lekkich (IgL) i ciężkich (IgH). Każda IgH i IgL cechuje się unikalnym regionem zmiennym (variable V), pozwalającym na przyłączenie różnych antygenów ze środowiska zewnętrznego komórki. Ta część receptora jest połączona niekowalencyjnie za pomocą mostka dwusiarczkowego z podjednostkami CD79α i CD79β (Igα i Igβ), które pośredniczą w przekazywaniu sygnału do wnętrza komórki. Cząsteczki te mają moduły pośredniczące w przekazywaniu sygnału zawierające dwie reszty tyrozynowe zwane ITAM (immunoreceptor tyrosine based activation motiv). Sygnał z receptora BCR prowadzi do fosforylacji tyrozyn ITAM przez kinazy z rodziny SRC (Lyn, Fyn i Blk). Do ufosforylowanych ITAM przyłącza się kinaza SYK poprzez swoje podwójne domeny SH2 (SRC homology 2 domain). Skutkuje to fosforylacją SYK, aktywacją kinaz z rodziny SRC i następczą dalszą autoaktywacją. Aktywowana SYK przyłącza kompleksy białkowe CIN85 (Cbl-interacting protein of 85 kda), znane również jako SH3KBP1, oraz BLNK (B-cell linker protein). Te z kolei koordynują fosforylację i aktywację kinazy BTK (Bruton tyrosine kinase) oraz fosfolipazy Cγ2 (PLCγ2). PLCy2 katalizuje hydrolizę fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu (PIP2) do diacyloglicerolu (DAG) i trifosforanu inozytolu (IP3), co powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Koincydencja DAG i zwiększającego się stężenia wapnia powoduje aktywację PKCβ (protein kinase Cβ). Ta z kolei fosforyluje wiele substratów, w tym CARD11 (caspase recruitment domain-containing protein 11). Białko to jest łącznikiem koordynującym działanie kompleksu aktywującego szlak NF-κB. Aktywacja szlaku BCR powoduje także przekształcenie fosfatydyloinozytolo-4,5 -bisfosforanu (PIP2) w fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforan (PIP3) przez kinazę Lyn z rodziny SRC i co za tym idzie dalszą aktywację szlaku PI3K/Akt/mTOR. O znaczeniu tego szlaku będzie mowa w dalszej części opracowania. 11

14 Tomasz Chojnacki Końcowym efektem aktywacji sygnalosomu BCR jest aktywacja szlaków NF-κB, PI3K, MAPK (mitogen activated protein kinase), NFAT (nuclear factor of activated T-cells) oraz RAS. Wszystkie te szlaki uczestniczą w procesach promujących proliferację i przeżycie zarówno prawidłowych, jak i patologicznych limfocytów B. 12 Aktywacja sygnalosomu BCR inicjująca odpowiedź w limfocytach ośrodków rozmnażania Montaż elementów IgL i IgH rozpoczynają białka RAG1 (recombination-activating protein 1) i RAG2. Zapoczątkowują one rekombinację genów V, D (diversity) i J (joining), która prowadzi do stworzenia kompletnego regionu V. Kompletne regiony zmienne składają się z trzech dalece zmiennych podregionów zwanych CDRs (complementarity-determing regions), zdolnych do rozpoznawania licznych antygenów. Regiony V są połączone z regionami C (constant). W przypadku IgH regiony te mogą należeć do wszystkich klas immunoglobulin (IgM, IgD, IgG, IgA i IgE). Klasy te mogą być użyte do budowy receptora zamiennie w procesie zwanym class switch recombination. Klasa IgH ma znaczenie dla trybu sygnalizacji za pośrednictwem BCR. Antygeny rozpoznawane jako obce powodują odpowiedź immunologiczną, w którą zaangażowane są zarówno dojrzałe limfocyty B, jak i limfocyty T pomocnicze. Stwarza to warunki dla powstania nowej mikrośrodowiskowej niszy, zwanej ośrodkiem rozmnażania, składającej się z limfocytów B ośrodka rozmnażania (GCB), grudkowych pomocniczych komórek T oraz grudkowych komórek dendrytycznych. Limfocyty z ośrodków rozmnażania mają odrębny charakterystyczny fenotyp narzucony przez zbiór charakterystycznych dla nich czynników transkrypcyjnych. W ośrodkach rozmnażania następuje zmiana klas immunoglobulin tworzących IgH BCR z początkowych IgM lub IgD (charakterystycznych dla naive GCB) na IgA, IgE i IgG. Dodatkowo komórki centrów rozmnażania urozmaicają wachlarz możliwości w zakresie różnorodności regionów V łańcuchów lekkich i ciężkich poprzez zachodzące tu somatyczne hipermutacje (somatic hypermutations SHM). Mechanizm ten jest katalizowany przez AID (activation-induced cytidine deaminase). Antygen związany na prezentującej go komórce dendrytycznej zostaje przechwycony przez GCB i jest prezentowany komórkom TFH, które wytwarzają immunologiczne połączenie aktywujące komórki B. Podtyp GCB ze zmutowanym BCR, charakteryzującym się większym powinowactwem do antygenu, są ewolucyjnymi zwycięzcami i wchodzą na ścieżkę różnicowania do komórek plazmatycznych produkujących przeciwciała. Toniczna aktywacja sygnalosomu BCR w dojrzałych limfocytach Proces tonicznej aktywacji BCR jest niezbędny dojrzałym limfocytom B do przeżycia. Proces ten jest najpewniej niezależny od obecności antygenu BCR, choć na razie brakuje na to formalnych dowodów. Doświadczenia pokazują, że kluczowym szlakiem w przekazywaniu tonicznego sygnału BCR jest szlak PI3K. Niejasny pozostaje jednak sposób aktywacji PI3K. Rolę aktywatora PI3K przypisuje się m.in.

15 Rozdział 1 antygen IgL BCR IgH CD79A CD79B CD19 PIP 3 PIP 2 SFK CIN85 BLNK BTK PLCg P kompleks CBM P P BCL-10 BCL-10 SFK SFK SYK P Y Y P P Y Y P SYK IP 3 DAG PI3K P Y MALT1 MALT1 Ca 2+ CARD 11 PKCb P IKKg IKK IKKa IKKb aktywacja MAPK aktywacja NFAT aktywacja AKT/mTOR aktywacja NF-kB Rycina 3. Podstawy fizjologicznej aktywacji sygnalosomu BCR [za: Young RM, Staudt LM. Targeting pathological B cell receptor signalling in lymphoid malignancies. Nature 2013; 12: ] 13

16 Tomasz Chojnacki kinazie SYK [5] albo GTP-azie TC21 [6], znanej także jako R-RAS2, która może być pośrednikiem tonicznego sygnału pomiędzy CD79 a PI3K. Możliwe jest również, że PI3K wiąże się bezpośrednio z niefosforylowaną formą CD79A, inicjując toniczną aktywację. Najnowsze badania wskazują, że na limfocytach znajdujących się w spoczynku BCR jako monomery nie istnieją, występują jednak jako samokontrolujące się oligomery zdolne do produkcji tonicznego sygnału [7]. Fizjologiczne znaczenie szlaku PI3K/Akt/mTOR Szlak sygnałowy 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3K) odgrywa rolę w wielu procesach komórkowych, które są krytyczne dla progresji, wzrostu, migracji i przeżycia komórek nowotworowych oraz angiogenezy. W warunkach fizjologicznych szlak ten jest aktywowany w wyniku stymulacji receptora/białka przezbłonowego CD19 insuliną, cytokinami i różnymi czynnikami wzrostu: płytkowym czynnikiem wzrostu (platelet-derived growth factor PDGF), naskórkowym czynnikiem wzrostu (epidermal growth factor EGF), czynnikiem wzrostu fibroblastów (basic fibroblast growth factor bfgf), czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular endothelial growth factor VEGF), czynnikiem wzrostu hepatocytów (hepatocyte growth factor HGF) czy insulinopodobnym czynnikiem wzrostu (insulin-like growth factor 1 IGF-1). Aktywacja szlaku następuje także podczas aktywacji szlaku sygnałowego BCR przez kinazę Lyn z rodziny SRC. Jak wspomniano powyżej, szlak PI3K/Akt/ mtor jest kluczowy dla przekazywania tonicznego sygnału z BCR w dojrzałych limfocytach. Przyłączenie czynnika wzrostu do CD19 powoduje autoaktywację w wyniku fosforylacji i rekrutacji do błony komórkowej PI3K. Kinaza PI3K przekształca fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (PIP2) w fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforan (PIP3). Fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforan wpływa na aktywację poprzez rekrutację do błony komórkowej kinaz Akt, BTK (poprzez interakcję z domeną PH na tych efektorach) i PDK-1. Niektóre badania wskazują, że za aktywację szlaku PI3K/Akt może odpowiadać także nadekspresja mir-155 (microrna-155). Aktywacja ta może się odbywać kilkoma drogami: poprzez supresję p85α podjednostki regulatorowej PI3K, poprzez mechanizm down-regulation ukierunkowany na supresory PI3K, np. PTEN (za pośrednictwem mir-21 i mir-17-92) i SHIP1. Wykazano, że nadekspresja mir-155 występuje znacząco częściej w podtypie ABC niż GCB [8]. Akt to serynowo-treoninowa kinaza białkowa zwana także PKB (protein kinase B). Jest ona głównym efektorem PI3K przyczyniającym się w warunkach fizjologicznych do przeżycia komórek w odpowiedzi na działanie czynników wzrostu [9]. Wyróżnia się 3 izoformy kinazy Akt: Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) i Akt3 (PKBγ). Ponadto istnieje jeszcze kinaza Akt3-(γ1) stanowiąca produkt alternatywnego składania mrna dla Akt3. Izoformą odgrywającą rolę w regulacji procesów związanych z przeżyciem komórki jest PKBα. Akt2 jest zaangażowana w regulację gospodarki węglowodanowej, a Akt3 w regulację rozwoju układu nerwowego. 14

17 Rozdział 1 Wszystkie kinazy Akt są zbudowane z trzech domen: N-końcowej domeny PH (pleckstrin homology domain), centralnej domeny kinazowej oraz C-końcowej domeny regulatorowej. W domenie regulatorowej znajduje się stały motyw charakterystyczny dla wszystkich kinaz z podrodziny AGC FxxF/Y-S/T-Y/F (x oznacza dowolny aminokwas). Do aktywacji kinazy jest potrzebna fosforylacja seryny w pozycji 473 i treoniny, które znajdują się w tym motywie. Za fosforylację treoniny (w pozycji 308 w przypadku Akt1) odpowiada wspomniana wcześniej kinaza PDK-1. Umiejscowienie przy błonie komórkowej kinazy Akt, ale także kinazy PDK-1 jest możliwe dzięki domenie PH wykazującej duże powinowactwo do PIP3. Nie ma pewności, która kinaza odpowiada za fosforylację seryny domeny regulatorowej. Jako kandydatów do tej roli bierze się pod uwagę kinazy PDK-1 i -2, ILK (integrin-linked kinase), MK2 (MAPK-activated protein kinase 2), kinazę białkową CβII, mtorc2 (mtor complex 2). Istnieje też możliwość, że proces ten zachodzi autokatalitycznie. Aktywna kinaza Akt fosforyluje wiele białek związanych z procesami proliferacji, metabolizmu, apoptozy czy migracji komórki. Wpływ aktywacji szlaku na metabolizm komórki Jednym z enzymów fosforylowanych, a co za tym idzie inaktywowanych przez Akt jest TSC2 (tuberous sclerosis complex 2). TSC2 jest białkiem aktywującym GTP-azę Rheb. Brak tej aktywacji powoduje, że białko Rheb pozostaje połączone z GTP i aktywuje kinazę mtor (mammalian target of rapamycin). Aktywna kinaza mtor reguluje syntezę białka przez fosforylację kinazy p70s6 i regulację eukariotycznego czynnika inicjacyjnego eif-4f, wpływając m.in. na ekspresję swoistych białek oraz wraz z innymi enzymami aktywowanymi przez Akt na regulację metabolizmu glukozy (nasilenie procesu glikolizy beztlenowej) oraz transport przez błonę komórkową innych substancji, np. aminokwasów (w sposób zależny od mtorc1). Aktywacja szlaku PI3K/Akt/mTOR w komórkach nowotworowych ma znaczący wpływ na metabolizm tych komórek. Poprzez nasilenie procesów wychwytywania glukozy, glikolizy beztlenowej, supresję β-oksydacji i stymulację syntezy kwasów tłuszczowych szlak ten zabezpiecza znaczne potrzeby energetyczne tych komórek i promuje ich przeżycie. Wpływ aktywacji szlaku na proces apoptozy Akt wpływa na proces apoptozy w sposób bezpośredni i pośredni. Bezpośrednio poprzez fosforylację proapoptotycznych białek, a pośrednio poprzez fosforylację czynników transkrypcyjnych, modyfikujących działanie genów związanych z apoptozą, co następuje w odpowiedzi na działanie czynników proapoptotycznych. Antyapoptotyczne działanie kinazy Akt przejawia się hamowaniem wielu mechanizmów proapoptotycznych. Fosforylacja białka Bad, należącego do rodziny kinaz Bcl-2, powoduje jego nieprzyłączenie do Bcl-x L, dzięki czemu białko to nabiera zdolności do blokowania uwalniania cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy. Uwalniany do cytoplazmy w przebiegu apoptozy cytochrom c jest odpowiedzialny za aktywację proka 15

18 Tomasz Chojnacki Tabela 2. Białka fosforylowane przez Akt [na podstawie: Krześlak A. Akt kinase: a key regulator of metabolism and progression of tumors. Postepy Hig Med Dosw 2010; 64: ] Białko fosforylowane przez Akt 16 Efekt regulacyjny Procesy zachodzące za pośrednictwem regulowanego białka Acinus hamowanie białko proapoptotyczne ACL aktywacja metabolizm; synteza lipidów; liaza ATP-cytrynianowa AS160/TBC1D4 hamowanie metabolizm; transport Glut4; białko aktywujące GTP-azę Rab ASK1 hamowanie apoptoza; kinaza kinazy MAPK Bad hamowanie apoptoza; białko proapoptotyczne z rodziny Bcl-2 Bax hamowanie apoptoza; białko proapoptotyczne z rodziny Bcl-2 Chk1 hamowanie proliferacja; kinaza punktu kontrolnego fazy S CREB aktywacja przeżycie komórki, proliferacja; czynnik transkrypcyjny enos aktywacja angiogeneza; syntaza tlenku azotu FOXO (FOXO1, FOXO3A, FOXO4) hamowanie przeżycie komórki, proliferacja, wzrost; czynniki transkrypcyjne GIV/Girdin migracja; białko wiążące aktynę GSK3α/β hamowanie przeżycie komórki, metabolizm, proliferacja; 3-kinaza syntazy glikogenowej Htra2/Omi hamowanie apoptoza; proteaza serynowa, powoduje proteolizę inhibitorów apoptozy IKKα aktywacja przeżycie komórki; kinaza fosforylująca I-κB kaspaza 9 hamowanie apoptoza; białko proapoptotyczne MDM2 aktywacja przeżycie komórki, proliferacja; białko hamujące aktywność p53 MLK3 hamowanie apoptoza; kinaza kinazy MAPK p21 (CIP1/WAF1) hamowanie proliferacja; inhibitor kinaz cyklinozależnych p27 (KIP1) hamowanie proliferacja; inhibitor kinaz cyklinozależnych PRAS40 hamowanie wzrost komórki; inhibitor kinazy mtor RAF1 hamowanie przeżycie komórki, proliferacja; kinaza kinazy MAPK SEK1/MKKK4 hamowanie apoptoza, kinaza kinazy MAPK TSC2 hamowanie wzrost komórki, proliferacja WNK1 regulacja przepuszczalności błon dla jonów YAP hamowanie apoptoza, koaktywator czynników transkrypcyjnych

19 Rozdział 1 spazy 9, o czym pisano powyżej. Aktywna kaspaza 9, będąca kaspazą inicjatorową, powoduje aktywację kolejnych kaspaz wykonawczych (3 i 7), które degradują szereg białek. Akt oprócz fosforylacji białka Bad unieczynnia też prokaspazę 9 poprzez jej fosforylację. Dodatkowo kinaza Akt fosforyluje Htra2/Omi, co osłabia jego aktywność proteolityczną względem białek z rodziny IAP (inhibitor of apoptotic protein). Akt fosforyluje również białko Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), blokując jego aktywację przez kaspazy, co z kolei hamuje kondensację chromatyny jądrowej. Innym białkiem z rodziny Bcl-2 jest białko Bax, które ufosforylowane promuje przeżycie neutrofilów. Ponadto kinaza GSK-3, której aktywność jest hamowana przez Akt, ogranicza translokację Bax do mitochondriów. Inaktywacja GSK-3 wpływa także na wzrost stabilności białka antyapoptotycznego Mcl-1. Kolejnym białkiem blokowanym przez Akt jest AIF (apoptosis inducing factor). Kinaza Akt blokuje indukowaną ceramidem translokację AIF z cytozolu do jądra komórkowego. Mechanizm ten został dotychczas odkryty w neuronach [10]. Kinaza Akt uczestniczy także w hamowaniu apoptozy indukowanej stresem i cytokinami za pośrednictwem szlaku SAPK (stress-activated protein kinase). Akt fosforyluje jednocześnie i unieczynnia trzy kinazy z rodziny MKKK (MAP kinase kinase kinase) związane z tym szlakiem: ASK1 (apoptosis signal regulating kinase 1), MLK3 (Mied lineale kinase 3) oraz SEK1. Akt oddziałuje także na szlak NF-κB. Fosforylacja I-κB (inhibitora NF-κB) przez IKK (I-κB kinase) powoduje degradację inhibitora i umożliwia przejście czynnika NF-κB z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie ten indukuje transkrypcję białek promujących przeżycie komórki (np. inhibitorów kaspaz ciap-1 i ciap-2). Akt aktywuje NK-κB poprzez łączenie się z kinazą IKK i jej aktywowanie. Fosforylacja białek FOXO (forkhead box O transcription factor) powoduje, że łączą się one z białkiem , są eksportowane z jądra i zatrzymywane w cytoplazmie. Dzięki temu jest hamowana odbywająca się z udziałem białek FOXO 1, 3a i 4 transkrypcja genów promujących apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego. Ważnym celem czynników FOXO jest gen kodujący proapoptotyczne białko Bim, które po usunięciu cytokin przyczynia się do śmierci komórek hematopoetycznych [11]. W podobny sposób Akt oddziałuje na kolejne proapoptotyczne białko YAP (Yes-associated protein). Również w tym przypadku fosforylacja YAP powoduje jego wiązanie z , zatrzymanie białka w cytoplazmie i w rezultacie brak transkrypcji genów odbywającej się za pośrednictwem aktywowanego przez YAP białka p73, np. genu Bax. Kolejnym ważnym mechanizmem antyapoptotycznym regulowanym przez Akt jest aktywacja białka HDM2 (E3 ligazy ubikwitynowej). Aktywowane białko wiąże się z białkiem p53, przyłącza do niego ubikwitynę, kierując je w ten sposób na drogę degradacji proteolitycznej. Ciekawą nową obserwacją dotyczącą białek z rodziny FOXO jest to, że zahamowanie FOXO1 powoduje oporność na inhibitory SYK. W komórkach pozbawionych FOXO1 działanie inhibitora SYK nie prowadzi do indukcji ekspresji HRK. Rodzi się więc pytanie, czy obecność FOXO1 nie będzie w przyszłości biomarkerem dla możliwości zastosowania inhibitorów SYK w DLBCL. 17

20 Tomasz Chojnacki 18 Wpływ AKT na cykl komórkowy Prawidłowy przebieg cyklu komórkowego zależy od regulacji aktywności cyklinozależnych kinaz Cdk (cyclin-dependent kinase). Akt promuje proliferację komórek, wpływając na postęp cyklu komórkowego poprzez fosforylację i co za tym idzie redukcję ekspresji takich inhibitorów Cdk, jak p27 kip1 oraz p21 CIP1/WAF1. Ponadto poprzez fosforylację i w rezultacie inaktywację kinazy GSK3 blokuje degradację proteolityczną cyklin D i E oraz czynników transkrypcyjnych c-jun i c-myc, odgrywających istotną rolę w przejściu komórki z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego. Dodatkowo Akt promuje proliferację komórek poprzez aktywację mtorc1. Aktywny mtorc1 hamuje 4E-BP1, co prowadzi do aktywacji eif-4e, które pobudza ekspresję cykliny D1 i c-myc. Wpływ AKT na proces przerzutowania oraz angiogenezę Przedmiotem badań pozostaje wpływ kinazy Akt na procesy migracji komórek i w konsekwencji ich potencjał do tworzenia przerzutów. Wpływ ten wydaje się jednak zależny od rodzaju komórek oraz różny dla poszczególnych izoform Akt. Temat ten z całą pewnością wymaga dalszych badań. Akt jest ważnym regulatorem procesów związanych z angiogenezą, a więc odpowiedzi komórek śródbłonka na czynniki wzrostu, migracji komórek i dojrzewania nowych naczyń. Głównym aktywatorem angiogenezy jest VEGF. Kinaza Akt aktywuje ekspresję VEGF w komórkach nowotworowych poprzez aktywację p70s6k1 oraz HDM2, które nasilają ekspresję czynnika indukowanego niedotlenieniem (HIF-1α). HIF-1 łączy się z kolei z HRE (hypoxia response element) w obrębie promotora genu VEGF, nasilając jego ekspresję. Kinaza Akt z uwagi na swoją kluczową rolę w progresji nowotworów może się więc wydawać idealnym celem terapeutycznym dla leków hamujących aktywność jej poszczególnych izoform. Próby z zastosowaniem takich leków w różnych nowotworach (w tym w DLBCL) napotykają jednak na wiele trudności. Dzieje się tak głównie z powodu nie do końca poznanych mechanizmów działania tej kinazy, w szczególności różnic pomiędzy poszczególnymi izoformami kinazy i ich niekiedy przeciwstawnym działaniem, oraz selektywności czynników aktywujących kinazy Akt względem jej substratów. Fizjologiczne znaczenie szlaku BTK/PKCβ/CARD11 Pobudzenie receptora BCR w limfocytach B skutkuje aktywacją szeregu kinaz uczestniczących w przekazywaniu sygnału, a kulminacją tego procesu jest aktywacja szlaku NF-κB [12]. Kolejno aktywowane są kinaza Brutona (BTK) i PKCβ (protein kinase Cβ). Kolejnym elementem aktywowanym w tym szlaku jest trójcząsteczkowy kompleks białkowy znany jako CBM. Zbudowany jest on z: CARMA1 (CARD- and membrane-associated guanylate kinase-containing protein 1), nazywanego również CARD11, Bcl-10 oraz MALT1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma trans-

21 Rozdział 1 location protein 1). Kompleks ten odgrywa kluczową rolę w aktywacji NF-κB poprzez przekazanie sygnału i aktywację takich komponentów, jak TRAF2/TRAF6, TAK1 (transforming growth factor β-activated kinase 1) i TAB (TAK1 binding protein), co z kolei prowadzi do aktywacji kompleksu IKK (inhibitor of nuclear factor κb kinase), który zapoczątkowuje aktywację NF-κB. Dodatkowo kompleks CBM aktywuje parakaspazę MALT1, która rozszczepia i inaktywuje negatywne regulatory NFκB, wzmacniając przez to jego aktywację [13]. Wiele badań wskazuje na to, że geny kodujące CARD11, Bcl-10 i MALT1 są onkogenami, a mutacje i translokacje tych genów to częste zjawiska w chłoniakach niehodgkinowskich [14]. Budowa i znaczenie kompleksu CBM CARD11 (CARMA1, Bimp3) występuje tylko w komórkach hematopoetycznych. Zbudowany jest z N-końcowej domeny CARD (caspase recruitment domain), domeny CC (coiled-coil domain), regionu łączącego oraz C-końcowej domeny MAGUK (membrane-associated guanylate kinase). CARD należy do rodziny DD (death domain), które zwykle uczestniczą w interakcjach pomiędzy dwoma i więcej proteinami, np. DD-DD, CARD-CARD. Inni członkowie rodziny CARMA występują w różnych tkankach i uczestniczą m.in. w aktywacji szlaku NF-κB za pośrednictwem różnych szlaków sygnałowych. Domena CC jest odpowiedzialna za autooligomeryzację. Wykazano, że przy braku domeny CC CARD funkcjonuje jako monomer, podczas gdy w obecności CC przyjmuje postaci od rozpuszczalnego trimera do nierozpuszczalnych dużych agregatów zbudowanych z CARD. Region łączący pomiędzy domenami CC i MAGUK został zidentyfikowany jako cel dla kinazy PKCβ. Fosforylacja seryny w tym regionie powoduje zmianę konformacji CARMA1 i jego aktywację, dlatego region ten jest określany również jako PRD (PKC-regulated domain). W spoczynku CARMA1 funkcjonuje jako cząsteczka samoograniczająca swoją aktywację. W tej konformacji PRD wchodzi w interakcje z CARD i blokuje CARD-zależne reakcje oligomeryzacji. Fosforylacja PRD powoduje zmianę konformacji CARMA1 i umożliwia przyłączenie Bcl-10 i MALT1. Domena MAGUK jest typowym przedstawicielem rodziny białek rusztowania. Przypuszcza się, że odgrywa ona rolę w zwrotnej down-regulation CARMA1 poprzez jego ubikwitynację. Bcl-10 jest zbudowane z N-końcowej domeny CARD oraz C-końcowego motywu bogatego w serynę lub treoninę. Domena CARD odpowiada za interakcję z domeną CARD cząsteczki CARMA1, natomiast region C-końcowy za interakcje z MALT1. Region C-końcowy bierze również udział w potranslacyjnej regulacji odpowiedzi na aktywację receptora BCR. MALT1 składa się z N-końcowej domeny DD, dwóch domen Ig, następnie domeny określanej jako paracaspase domain. Na C-końcu znajduje się jeszcze trzecia domena Ig. N-końcowa część DD-Ig2 jest odpowiedzialna za wiązanie z Bcl-10, podczas gdy część C-końcowa wykazuje aktywność proteolityczną. Budowa MALT1 sprzyja łączeniu się cząsteczek w dimery. Zasadniczą rolą MALT1 jest jednak przyłączenie do sygnalosomu CBM cząsteczek TRAF6 i ligazy ubikwitynowej E3 w odpowiedzi na sygnał z BCR. Następnie TRAF6 ulega autoubikwitynacji, ubikwitynując jednocześnie MALT1 i Bcl-10, co powoduje rekrutację kompleksu IKK i aktywację NF-κB. 19

22 Tomasz Chojnacki Wskutek przyłączenia ligandu do receptora BCR i zadziałania sygnału przekazanego przez PKCβ CARD11 poprzez zmianę konformacji zostaje wyzwolone z autoinhibicji. Staje się zdolne do łączenia z Bcl-10 poprzez wiązania CARD-CARD. Bcl-10 przyłącza z kolei MALT1. Bcl-10 i MALT1 formują oligomery, które dzięki swojej złożonej architektonice są w stanie aktywować NF-κB. W supramolekularnej strukturze filamentowej kompleks CBM służy jako platforma dla wielu białek efektorowych, które oddziałują na szlak NF-κB. Kompleks ten może oddziaływać z IKKγ, znanym także jako NEMO, będącym komponentem regulatorowym kompleksu IKK. MALT1 rekrutuje, powoduje oligomeryzację i aktywuje dodatkowo TRAF oraz ligazę ubikwitynową E3. Aktywacja TRAF ułatwia z kolei sprzężoną z K63 poliubikwitynację wielu białek, w tym NEMO, samego TRAF6, Bcl-10 i MALT1. Poliubikwitynacja tych białek zapewnia natomiast powierzchnię dokującą dla kolejnych składników szlaku sygnalizacyjnego, m.in. TAK1 (transforming growth factor β-activated kinase 1), TAB (TAK1-binding protein) i kompleksu IKK. MALT1, jedyny komponent enzymatyczny kompleksu CBM, wpływa na aktywację NF-κB również przez oddziaływanie za pomocą negatywnego sprzężenia zwrotnego na poboczne szlaki. Zidentyfikowano pięć substratów MALT1. Są to: A20, CYLD, Bcl-10, RelB i NIK (NF-κB inducing kinase). A20 i RelB są negatywnymi regulatorami NF-κB. MALT1 promuje ich proteolityczną degradację i tym samym wzmacnia aktywację NF-κB. CYLD jest z kolei negatywnym regulatorem JNK. MALT1 poprzez rozszczepienie CYLD promuje zatem indukowaną przez TCR aktywację JNK. NIK jest natomiast istotnym mediatorem zależnej od IKKα niekanonicznej aktywacji NF-κB stymulowanej przez członków rodziny receptora TNF. Rozszczepienie NIK przez MALT1 powoduje jej oporność na proteolityczną degradację i aktywuje niekanoniczną drogę aktywacji NF-κB. Znaczenie szlaku BCR w limfoproliferacjach Większość chłoniaków B-komórkowych utrzymuje ekspresję BCR na powierzchni swoich komórek. Wiele z nich do tworzenia regionów stałych wykorzystuje IgM, mimo że fizjologicznie w ośrodkach rozmnażania IgM tego regionu są zamieniane w mechanizmie class switch recombination na IgG. Zjawisko to można wyjaśnić tym, że BCR zbudowane z IgM i IgG produkują jakościowo różne sygnały. Sygnał z BCR IgM promuje proliferację i przeżycie komórki poprzez aktywację wielu szlaków (w tym NF-κB), podczas gdy sygnał z BCR IgG promuje różnicowanie w kierunku plazmocytów, aktywując szlaki ERK i MAPK. Przykładem chłoniaka, w którym następuje promowanie szlaku związanego z BCR zbudowanego z IgM, jest chłoniak grudkowy. Charakteryzuje się on translokacją t(14;18), w wyniku której BCL2 jest przenoszony w rejon IgH i podlega jego kontroli, co uniemożliwia jednocześnie ekspresję immunoglobuliny przez allel zaangażowany w ten proces. W większości limfocytów B jeden z alleli IgH określany jest jako produktywny, a drugi jako nieproduktywny, gdyż jego region V-D-J pozostaje poza ramką odczytu. W chłoniaku grudkowym translokacja IgH nigdy nie dotyczy produktywnego allela IgH i ten pozostaje jako IgM. Allel nieproduktywny ulega 20

23 Rozdział 1 CARD CARMA1 MAGUK stymulacja fosforylacja PKCθ/PKCb P CARD P P MAGUK CARD Bcl-10 sygnał montaż sygnalosomu CBM MALT1 1. Zahamowanie funkcji CARMA1 MAGUK MAGUK MAGUK MAGUK MAGUK 2. Zahamowanie oligomeryzacji Bcl-10 MALT1 MALT1 MALT1 MALT1 MALT1 CARD CARD CARD CARD CARD CARD CARD CARD CARD CARD MALT1 MALT1 MALT1 MALT1 MALT1 rekrutacja 3. Zahamowanie aktywności proteolitycznej MALT1 TAK1 TRAF6 A20 CYLD TAB IKK aktywacja NF-kB Rycina 4. Model przekaźnictwa sygnału poprzez sygnalosom CBM [za: Yang C. The CBM signalosome: potential therapeutic target for aggressive lymphoma? Cytokine Growth Factor Rev 2014; 25: ] translokacji i przechodzi proces przełączenia klas. Sprzyja to podtrzymaniu produkcji BCR zbudowanego z IgM na powierzchni komórki tego chłoniaka. Inaczej jest w DLBCL. W podtypie GCB BCR jest zbudowany z IgG i chłoniak ten nie potrzebuje sygnału z BCR dla przeżycia. Podtyp ABC jest natomiast zależny od aktywnego sygnału z BCR, przy czym ekspresja BCR zbudowanego z IgM jest 21

24 Tomasz Chojnacki skutkiem delecji w obrębie regionów IgH odpowiedzialnych za zmianę klas (Sμ oraz Sγ). Delecje te pojawiają się wybiórczo w allelu produktywnym, blokując proces zmiany klas, podczas gdy allel nieproduktywny przechodzi przez ten proces. Rola szlaku BCR w patogenezie DLBCL GCB toniczna aktywacja BCR Jest niemal pewne, że w chłoniaku Burkitta (Burkitt lymphoma BL) translokacja Myc w rejon IgH jest niewystarczająca do nowotworzenia. Wiadomo, że komórki BL, pomimo swojego pochodzenia z ośrodków rozmnażania, gdzie następuje proces przełączenia klas, charakteryzują się ekspresją IgM-BCR. Wiadomo również, że komórki BL nie są zależne od przewlekle aktywnego sygnału z BCR przekazywanego za pośrednictwem BTK przez PKCβ do CARD11, jak to ma miejsce w DLBCL ABC. Sygnał w komórkach tego chłoniaka jest przekazywany za pośrednictwem PI3K do Akt, co można zmierzyć, oznaczając ufosforylowane Akt i kinazę S6. Pośrednim dowodem na prawdziwość tej tezy jest to, że linie komórkowe BL są wrażliwe na działanie inhibitorów PI3K oraz inhibitorów mtorc1, a nie są wrażliwe chociażby na inhibitory BTK. Tak więc toniczny sygnał przekazywany poprzez PI3K zapewnia komórkom BL niezbędne do przeżycia sygnały, co pozwala na tolerowanie ektopowej ekspresji Myc, która jest letalna dla większości komórek przy nieobecności czynników wzrostu. Ponadto w BL za pomocą metod sekwencjonowania odkryto mutacje odpowiedzialne za wzmacnianie sygnału pochodzącego z BCR. W ok. 70% przypadków dotyczą one czynnika transkrypcyjnego TCF3, znanego również jako E2A, lub jego negatywnego regulatora ID3. Postuluje się rolę tonicznej aktywacji BCR w patogenezie DLBCL GCB, podobnie jak w BL. Przypuszczenia te wysnuto na podstawie obserwacji, że komórki pewnych linii DLBCL GCB są wrażliwe na działanie inhibitora SYK R406 [15]. Wiadomo jednak, że R406 jest również inhibitorem wielu innych kinaz, nie jest więc idealnym narzędziem do badania tonicznego sygnału z BCR. Zablokowanie poszczególnych elementów receptora BCR (w tym CD79A i CD79B) nie powoduje obumarcia wielu linii DLBCL GCB, co sugeruje, że jeśli SYK jest rzeczywiście krytyczne dla rozwoju tego chłoniaka, to inne receptory mogą odgrywać rolę w jego aktywacji. W komórkach chłoniaka DLBCL GCB szlak PI3K może być aktywowany również w innych mechanizmach. Udowodniono, że może się to odbywać poprzez: amplifikację i mutację genu katalitycznej podjednostki PI3K (PI3KCA) (8% DLBCL GCB), delecje i mutacje genu PTEN (fosfatazy fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trisfosforanu) na chromosomie 10 (37% DLBCL GCB), amplifikacje microrna (MIHG1 z locus na chromosomie 13), amplifikacje lub mutacje genów kodujących izoformę Akt1. 22 Amplifikacja i/lub mutacja katalitycznej podjednostki PI3K Opisano 3 klasy PI3K. Najważniejsza w kontekście etiopatogenezy nowotworu jest klasa IA. Cząsteczki PI3K klasy IA są aktywowane przez czynniki wzrostu za pośrednictwem licznych receptorów kinaz tyrozynowych. Najczęściej występującą

25 Rozdział 1 błona komórkowa PI3K inhibitory PI3K PIP 2 PIP 3 PDK1 inhibitory BCL-6 p21 PTEN BCL-6 p27 mir inhibitory BCL-2 inhibitory BET inhibitory Akt Akt MYC BCL-2 inhibitory mtor mtor p53 działanie antyapoptotyczne, przyspieszenie cyklu komórkowego, promocja przeżycia komórek poprzez zabezpieczenie ich potrzeb energetycznych, nasilenie angiogenezy proliferacja osłabienie mechanizmów naprawczych DNA zahamowanie apoptozy Rycina 5. Kluczowe szlaki sygnałowe w DLBCL GCB [za: Roschewski M, Staudt LM, Wilson WH. Diffuse large B-cell lymphoma treatment approaches in the molecular era. Nat Rev Clin Oncol 2014; 11: 12 23] 23

26 Tomasz Chojnacki izoformą na leukocytach jest izoforma p110δ. Poszczególne izoformy podjednostki katalitycznej PI3K stają się obecnie celem terapeutycznym dla małych molekuł. Dla przykładu idelalisib jest inhibitorem izoformy p110δ PI3K [16], a duvelisib to inhibitor izoform δ i γ PI3K. 24 Utrata lub zmniejszenie ekspresji PTEN Utrata lub zmniejszenie ekspresji PTEN dotyczy 55% przypadków DLBCL GCB i tylko w 14% DLBCL non-gcb. Skutkuje ona konstytutywną aktywacją szlaku sygnałowego PI3K/Akt/mTOR. Inhibitory tego szlaku sygnałowego mogą być potencjalnym celem terapeutycznym [17]. W modelach DLBCL, jak również w przypadku niewielu badań u pacjentów z DLBCL status PTEN cechuje się odwrotną korelacją do aktywacji szlaku PI3K/ Akt, a przywrócenie ekspresji PTEN w tych komórkach skutkuje cytotoksycznością przez zahamowanie aktywacji szlaku PI3K/Akt. Inhibicja szlaku PI3K/Akt powoduje zahamowanie transkrypcji Myc, a reekspresja Myc chroni komórki DLBCL przed cytotoksycznością indukowaną przez PTEN. Jest to nowa, nieznana dotąd funkcja onkogenu Myc w komórkach DLBCL. Wreszcie farmakologiczna inhibicja szlaku PI3K/Akt skutkuje cytotoksycznością tylko w przypadkach DLBCL GCB z niedoborem PTEN. Wyniki tych badań wskazują, że utrata ekspresji PTEN definiuje podtyp DLBCL zależny od aktywacji PI3K/Akt i Myc. Skłania to do postawienia hipotezy, że farmakologiczna interwencja polegająca na zahamowaniu przekaźnictwa PI3K/Akt w tych podtypach może być obiecującą opcją terapeutyczną, a utrata ekspresji PTEN może być markerem odpowiedzi na te leki. Rola kompleksu CBM w patogenezie DLBCL ABC Aberrantna aktywacja kompleksu CBM i co za tym idzie NF-κB jest spotykana w różnych limfoproliferacjach. Nadekspresję CARD11 stwierdza się m.in. w DLBCL, pierwotnych chłoniakach żołądka i białaczce T-komórkowej dorosłych (adult T cell leukemia ATCL). Mutacje typu gain of function (wzmacniające funkcję) w domenie coiled-coil prowadzą do konstytutywnej aktywacji NF-κB i są obserwowane w DLBCL. Natomiast translokacje chromosomalne obejmujące Bcl-10 i MALT1 są częste w chłoniakach MALT. Translokacja MALT1, tj. t(14;18), oraz Bcl-10, czyli t(1;14)(p22;q32), polega na przeniesieniu tych cząsteczek w pobliże loci dla IgH, co prowadzi do nadekspresji odpowiednio MALT1 i Bcl-10 i aktywacji NF-κB. Inną translokacją często znajdowaną w chłoniakach MALT jest t(11;18)(q21;q21). W jej wyniku powstaje białko fuzyjne zawierające trzy domeny BIR białka ciap2 (cellular apoptosis inhibitor-2) oraz domenę parakaspazy MALT1. Również ta translokacja prowadzi do konstytutywnej aktywacji NF-κB. W odniesieniu do podtypu ABC DLBCL do aktywacji NF-κB wymagana jest obecność kompleksu CBM (CARD11-BCL10-MALT1). W 10% przypadków DLBCL ABC aktywacja kompleksu CBM jest spowodowana mutacją izoformy CARD11. Mutacja ta wpływa na domenę coiled-coil CARD11, powodując spontaniczne tworzenie się agregatów, które rekrutują wszystkie elementy niezbędne do aktywacji NF-κB.

27 Rozdział 1 Dane te wskazują, że kompleks CBM może w przyszłości również stać się celem leczenia ukierunkowanego na cele molekularne. Istnieją dwie główne drogi hamowania aktywacji kompleksu CBM: poprzez ingerencję w montaż kompleksu CBM i co za tym idzie inhibicję CBM poprzez zaburzenie rusztowania, bezpośrednio poprzez hamowanie proteolitycznej aktywności MALT1. Mutacja Rnf-31 Szlak NF-κB może być aktywowany konstytutywnie również przez mutację aktywującą genu Rnf-31 wchodzącego w skład kompleksu CBM. Wystąpienie tej mutacji powoduje zmniejszenie hamowania IKK (aktywatora NF-κB) przez białko A20, co powoduje zwiększenie aktywacji NF-κB. W większości DLBCL ABC nie występuje jednak mutacja CARD11, a jednak guzy te potrzebują stałej obecności kompleksu CBM do przeżycia. W tych przypadkach do aktywacji NF-κB i tym samym wzrostu i przeżycia komórek niezbędna jest kinaza BTK aktywowana przez BCR. Rola szlaku BCR w patogenezie DLBCL ABC przewlekle aktywna sygnalizacja z BCR Cząsteczki BCR na powierzchni komórki w DLBCL ABC są zorganizowane w większe grupy, które przypominają oligomery na powierzchni zdrowych limfocytów poddanych ekspozycji na antygen. Te same, które są odpowiedzialne za powstawanie tonicznego sygnału z BCR. Fosforylowane cząsteczki tyrozyny zlokalizowane poniżej tych klastrów, widoczne w mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence), nasuwają przypuszczenie, że są to miejsca o konstytutywnej sygnalizacji BCR. Z kilku względów sygnalizacja BCR w DLBCL ABC przypomina bardziej sygnał aktywny niż toniczny. Po pierwsze uzależnienie od aktywacji szlaku NF-κB nie jest cechą tonicznej sygnalizacji BCR, która opiera się na szlaku inicjowanym przez PI3K. Po drugie w przypadku sygnalizacji tonicznej BCR nie jest wymagana obecność CBM, a knockout poszczególnych jego składowych nie ma w tym przypadku wpływu na przeżycie komórki. Po trzecie klastry BCR na powierzchni DLBCL ABC są obecne w komórkach stymulowanych antygenem, a nie występują nigdy w komórkach naiwnych (przed ekspozycją na antygen), nawet jeśli ich przeżycie zależy od tonicznej aktywacji BCR. Z tych powodów termin przewlekle aktywna sygnalizacja z BCR jest używany do opisania konstytutywnej aktywności szlaku BCR w tym chłoniaku. Mutacje motywów ITAM CD79A/B Mutacje motywów ITAM CD79A i CD79B są podłożem przewlekle aktywnej sygnalizacji w 20% przypadków DLBCL ABC. W większości przypadków tych mutacji dochodzi do zamiany pierwszej aminokońcowej tyrozyny CD79B na inną resztę. Mutacje dotyczące innych miejsc CD79B są mniej częste, a mutacje dotyczące CD79A jeszcze rzadsze. Mutacje CD79A i B nie inicjują przewlekle aktywnego sygnału BCR, ale raczej go wzmacniają. Czynią to na dwa sposoby. Po pierwsze mutacje te 25

28 Tomasz Chojnacki chronią BCR przed endocytozą, prowadząc do wzostu ekspresji BCR na powierzchni komórki. Po drugie mutacje CD79 osłabiają działanie Lyn (kinazy z rodziny SRC), która dostarcza negatywne sygnały zwrotne tłumiące aktywność BCR. W wielu chłoniakach przewlekle aktywna sygnalizacja BCR powstaje wskutek ekspozycji na antygen obcego pochodzenia lub autoantygen. Rolę ekspozycji na obcy antygen udowodniono w chłoniaku śledzionowym strefy brzeżnej (splenic marginal zone lymphoma SMZL), gdzie etiopatogeneza chłoniaka jest często związana z zakażeniem wirusem zapalenia wątroby typu C (hepatitis C virus HCV). W większości chłoniaków aktywacja BCR następuje jednak w odpowiedzi na autoantygen. W DLBCL ABC obecność na powierzchni komórek chłoniaka zgrupowań BCR zwiększa prawdopodobieństwo związania autoantygenu. W przypadku autoreaktywnych limfocytów obecność mutacji CD79 wzmacnia sygnał, współuczestnicząc w transformacji nowotworowej. Prawidłowe limfocyty B z niską awidnością dla autoantygenu utrzymują się przy życiu jako limfocyty anergiczne. Cechą charakterystyczną tego stanu jest wysoka aktywność kinazy Lyn w komórkach. Niewykluczone, że mutacje CD79A i B w anergicznych komórkach mogą tłumić aktywność Lyn, przekierowując sygnalizację BCR w kierunku BTK, przełamując ten stan anergii. Badania epidemiologiczne pokazują, że niektóre choroby autoimmunologiczne są czynnikiem ryzyka rozwoju DLBCL. Wspiera to hipotezę, że DLBCL ABC jest nowotworem wykorzystującym te same mechanizmy patogenetyczne co autoreaktywne komórki B w chorobach autoimmunologicznych (np. toczeń rumieniowaty układowy, cukrzyca typu 1). Wyjaśnienie roli anergicznych limfocytów B w patogenezie chorób z autoagresji i ich związku z DLBCL ABC wykracza poza ramy tego opracowania, choć stanowi niezwykle ciekawą hipotezę badawczą. Znaczenie MYD88 w patogenezie DLBCL W warunkach fizjologicznych MYD88 jest białkiem przekaźnikowym, które aktywuje szlak NF-κB po stymulacji receptora TLR (toll-like receptor) oraz receptorów dla IL-1 i IL-18. Przekaźnictwo za pośrednictwem MYD88 odbywa się poprzez zbudowanie na podstawie białka MYD88 kompleksu sygnalizacyjnego złożonego z kinaz serynowo-treoninowych z rodziny IRAK. Onkogenne mutacje w MYD88 występują w ponad 35% DLBCL ABC [18]. W 29% jest to substytucja w pozycji L265P w domenie TIR (Toll/IL-1 receptor) białka MYD88. Mutacja ta jest skrajnie rzadka w DLBCL GCB oraz chłoniaku Burkitta, spotyka się ją natomiast w 9% chłoniaków MALT. Ze zdecydowanie mniejszą częstością (ok. 9%) obserwowane są inne mutacje w domenie TIR MYD88, a jeszcze rzadziej w innych domenach MYD88. Dotyczą one zarówno podtypu ABC, jak i DLBCL GCB. Analizując trójwymiarową strukturę MYD88, dochodzi się do wniosku, że zdecydowana większość mutacji innych niż L265P dotyczy tego samego regionu związanego z interakcjami domeny TIR, tzw. regionu B-B loop, nawet jeśli nie dotyczą one bezpośrednio domeny TIR. Tylko jedna mutacja stwierdzana w DLBCL dotyczy innego regionu trójwymiarowej struktury MYD88. Jest to mutacja T294P zlokalizowana w motywie box 3, położonym po przeciwnej stronie cząsteczki, ale również istotnym w sygnalizacji związanej z IL-1. Z badań wynika jednak, że mutacja 26

29 Rozdział 1 przewlekła aktywacja sygnału BCR konstytutywna aktywność MYD88 autokrynna sygnalizacja za pośrednictwem cytokin IFN-b IL-6/IL-10 inhibitory SYK inhibitory PI3K inhibitory Akt SFK SFK P P Y Y PI3K szlak Akt/mTOR Akt Y Y CD79B BTK mutacja CD79A/B ITAM PKC-b enzastaurin sotrastaurin ibrutinib delecja A20 P CARD11 MALT1 ruksolitinib A20 mutacja CARD11 typu coiled-coil inhibitory MALT szlak NF-kB mutacja MYD88 P MYD88 TRAF6 IRF-4 inhibitory IRAK-4 IRAK-4 IRAK-4 IRAK-1 IRAK-1 P szlak interferonowy TYK2 P P STAT-1 STAT-3 śmierć JAK1 ruksolitinib bortezomib ewerolimus temsirolimus mtor przeżycie lenalidomid Rycina 6. Kluczowe szlaki sygnałowe w DLBCL ABC [za: Roschewski M, Staudt LM, Wilson WH. Diffuse large B-cell lymphoma treatment approaches in the molecular era. Nat Rev Clin Oncol 2014; 11: 12 23] 27

30 Tomasz Chojnacki T294P ma najmniejszą siłę aktywowania NF-κB oraz że to mutacje L265P, M232T oraz S243N aktywują ten szlak najsilniej. Mutacja L265P jest mutacją typu gain of function. Zmutowany MYD88 spontanicznie buduje kompleks białkowy z IRAK1 i IRAK4, prowadząc do aktywacji szlaku NF-κB, aktywacji poprzez fosforylację czynnika transkrypcyjnego STAT3 kinazy JAK oraz wydzielania IL-6, IL-10 i interferonu β (IFN-β). Autokrynne wydzielanie IL-6 oraz IL-10 napędza aktywację sygnału JAK-STAT3. Mutacje w MYD88 nakładają się w części przypadków na inne mutacje stwierdzane w podtypie DLBCL ABC, takie jak mutacje CD79A/B, CARD11 i A20. Dla przykładu w chłoniakach z mutacją L265P aż w 34% przypadków współistnieje mutacja CD79A/B, w 10% przypadków mutacja CARD11, a w ok. 30% przypadków mutacja A20. Z uwagi na to, że mutacja MYD88 jest niejednokrotnie kluczowa dla patogenezy DLBCL ABC, trwają prace nad stworzeniem inhibitorów kinazy IRAK4 i innych składowych tego szlaku. Jednocześnie z pewnością nie bez znaczenia dla patogenezy DLBCL ABC jest rola wzrostu wydzielania IL-6, IL-10 oraz przede wszystkim IFN-β w wyniku działania zmutowanego MYD88. Przyszłe prace powinny się skupiać również na immunomodulującym wpływie tych cytokin na mikrośrodowisko chłoniaka. Znaczenie aktywacji szlaku JAK/STAT3 Część chłoniaków ABC wykorzystuje szlak sygnałowy kinazy JAK do aktywacji czynnika transkrypcyjnego STAT3. Czynnik ten działa synergistycznie z NF-κB w promocji przeżycia komórek chłoniaka. Aktywacja szlaku JAK/STAT3 często współistnieje z mutacjami MYD88. Dzieje się tak w przypadku 37% DLBCL ABC w grupie tzw. STAT3-high, podczas gdy w grupie STAT3-low DLBCL ABC mutacja MYD88 występuje tylko w 13% przypadków. Mutacje MYD88 przyczyniają się więc do aktywacji szlaku JAK/STAT3 [19]. Białka STAT (signal transducer and activator of transcription) to grupa czynników transkrypcyjnych, które regulują proliferację, różnicowanie i przeżycie komórek. W warunkach fizjologicznych za aktywację białek STAT odpowiada wiele cytokin i czynników wzrostu przyłączających się do receptora na powierzchni komórki. Wyzwala to aktywację związanych z receptorami członków rodziny kinaz JAK (Janus kinase): JAK1, JAK2, JAK3 i TYK. Kinazy JAK fosforylują białka STAT, prowadząc do ich dimeryzacji i przejścia do jądra komórkowego. Celami czynników transkrypcyjnych STAT są białka odgrywające rolę w progresji cyklu komórkowego (cyklina D1, c-myc, p21) oraz w przeżyciu komórki (Bcl-xL, MCL1, Bcl-2). Konstytutywna aktywność STAT (w szczególności STAT3 i STAT5) przyczynia się do progresji nowotworu. Jest ona efektem autokrynnej aktywacji receptorów na powierzchni komórki, głównie poprzez stymulację IL-6 i IL-10 produkowanymi w nadmiarze w wyniku aktywacji m.in. NF-κB. Aktywacja STAT3 prowadzi do uczynnienia genów docelowych, które typowo zawierają motywy DNA zwane GAS (gamma activated site). Należy zwrócić uwagę, że STAT również zawiera w cząsteczce motywy GAS, przez co jest zdolny do pobudzania swojej ekspresji. Zasadnicze dla patogenezy DLBCL wydaje się jednak to, że STAT3 wchodzi w interakcje z podjednostką p65 28

31 Rozdział 1 NF-κB, hamując przyłączanie I-κB. Inhibicja czynnika transkrypcyjnego STAT3 może być kolejnym potencjalnym celem terapeutycznym. Zastosowanie takiego inhibitora może być szczególnie cenne w połączeniu z inhibitorami NF-κB. Rola NF-κB w patogenezie DLBCL Fizjologiczna rola szlaku NF-κB NF-κB jest jednym z najważniejszych czynników transkrypcyjnych. Zidentyfikowano dotychczas 5 czynników transkrypcyjnych należących do rodziny białek NF-κB: NF-κB1 (p50 oraz jego prekursor p105), NF-κB2 (p52 i jego prekursor p100), RelA (czyli p65), RelB oraz c-rel. Białka te charakteryzują się obecnością w N-końcowym odcinku łańcucha peptydowego regionu zwanego domeną RHD (Rel homology domain). Fragment ten odpowiada za dimeryzację, łączenie się cząsteczek z właściwą sekwencją DNA oraz interakcje z białkami będącymi swoistymi inhibitorami (I-κB). Ponadto w obrębie domeny RHD znajduje się sekwencja NLS (nuclear localization sequence), która odpowiada za przemieszczenie dimerów do jądra komórkowego. Ze względu na różnice w odcinku C-końcowym łańcucha peptydowego wśród białek NF-κB wyodrębniono 2 grupy. Do pierwszej zalicza się białka RelA, RelB i c-rel zawierające na C-końcu sekwencję TAD (transcription activation domain), dzięki której mogą aktywować transkrypcję cząsteczki DNA. Drugą grupę stanowią białka NF-κB1 (p105/p50) i NF-κB2 (p100/p52), które w formie prekursorowej, jako białka p105 i p100, mają w odcinku C-końcowym domenę ARD (ankirin repeat domain) zawierającą wiele (5 7) powtórzeń ankirynowych. Powtórzenia te odpowiadają za wiązanie z sekwencją NLS białek NF-κB. Na skutek proteolizy ubikwitynozależnej tychże fragmentów generowane są postaci ostateczne (p50 i p52), które mają domenę RHD, dzięki czemu mogą się łączyć z cząsteczką DNA. Są one jednak pozbawione domeny TAD, odpowiedzialnej za aktywację transkrypcji. Ponadto białka p105 i p100 są zaopatrzone w region bogaty w glicynę (glycine-rich region GRR), który zapobiega całkowitej degradacji tych cząsteczek w proteasomie, oraz region SRR (signal responsive region), zawierający miejsce fosforylacji dla IKK (kinaz inhibitora IκB). Aktywny czynnik transkrypcyjny składa się zawsze z dwóch podjednostek, a najczęściej występującym wariantem NF-κB jest kompleks RelA (p65)/p50. W zależności od struktury poszczególnych dimerów mogą one w zróżnicowany sposób regulować ekspresję genów oraz mieć różne powinowactwo do poszczególnych miejsc promotorowych, przez co wywołują odmienny efekt biologiczny. Homodimery p50/p50 i p52/p52 funkcjonują jako inhibitory transkrypcji (nie zawierają domeny TAD), jednakże mogą aktywować ją w chwili, gdy utworzą kompleks z białkiem Bcl-3, należącym do rodziny białek IκB. RelA, RelB i c-rel mają w swojej budowie domenę RHD, dlatego po połączeniu z p52 lub p50 funkcjonują jako aktywatory transkrypcji. Natomiast heterodimery RelB/RelA są represorami, ponieważ nie mogą się związać z cząsteczką DNA. W formie nieaktywnej czynnik NF-κB jest zlokalizowany w cytoplazmie komórki w powiązaniu z białkiem inhibitorowym IκB. Do rodziny białek IκB należą: IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε (C-końcowy fragment p105), IκBδ (C-końcowy fragment p100), 29

32 Tomasz Chojnacki IκBζ, Bcl-3. Białka IκB charakteryzują się obecnością wielu powtórzeń ankirynowych (6 7), za pomocą których IκB przyłącza się do sekwencji NLS białek NF-κB. Prekursory p105 i p100 również zawierają powtórzenia ankirynowe, dlatego zaliczane są do białek IκB mających zdolność do retencji podjednostek Rel w obrębie cytoplazmy. Białka Bcl-3 i IκBζ są wyjątkami wśród IκB. Zaliczono je do tej grupy tylko ze względu na budowę, jednak pełnią odmienną funkcję. Bcl-3 łączy się z homodimerami p52 i p50 i jest aktywatorem transkrypcji, gdyż ma w swej budowie domenę TAD. Podobnie działa IκBζ, na stałe umiejscowiony w jądrze komórkowym. Istotą działania białek IκB jest maskowanie sekwencji NLS podjednostek NF-κB, jednakże badania krystalograficzne, strukturalne i biochemiczne ujawniły, że IκBα maskuje sekwencję NLS tylko w podjednostce RelA, pozostawiając tym samym wolną NLS w p50. Pozwala to na ciągłą translokację kompleksu białek NF-κB do jądra komórkowego. Wolne dimery NF-κB w jądrze komórkowym, łącząc się z właściwą sekwencją DNA, umożliwiają transkrypcję swoistych dla danego modelu aktywacji genów. Co ważne, białko IκB zawiera na N-końcu łańcucha polipeptydowego sekwencję NES (nuclear export signal), która odpowiada jednocześnie za ciągłe usuwanie kompleksu NF-κB z jądra komórkowego. Ponieważ proces eksportu jest o wiele bardziej wydajny niż importu, przyjmuje się, że dimery pozostają uwięzione w cytoplazmie, a jądrową lokalizację kompleksu NF-κB/IκB można wykryć po zablokowaniu transportu z jądra do cytoplazmy z użyciem inhibitora leptomycyny B. Podobnie przemieszczają się pomiędzy jądrem a cytoplazmą kompleksy związane z inhibitorami IκBε. Co ciekawe, IκBβ nie mają sekwencji NES, a kompleksy NF-κB/IκBβ pozostają w cytoplazmie, ponieważ inhibitor ten maskuje obie sekwencje NLS w dimerze. Za przejście białek NF-κB z formy nieaktywnej (związanej z IκB) do formy aktywnej odpowiadają kinazy inhibitorów IκB. Jest to kompleks białek, którego zadaniem jest fosforylacja IκB. Rdzeniem tej struktury są dwie podjednostki o właściwościach enzymatycznych: kinazy IKK1 (IKKα) i IKK2 (IKKβ), oraz podjednostka strukturalna IKKγ, powszechnie zwana NEMO (NF-κB essential modulator), niezbędna do prawidłowej fosforylacji cząsteczki inhibitora. Kinazy, oprócz charakterystycznych dla swojej funkcji domen, zawierają również motyw zamka leucynowego łączącego podjednostki katalityczne motyw helisa pętla helisa, oraz domenę NBD (NEMO binding domain), odpowiedzialną za kontakt z jednostką regulatorową. Niedawno odkryto dodatkowe elementy związane z kompleksem IKK: HSP90, CDC37, ELKS oraz białko NAP1, których funkcja nie została do końca poznana. Wyodrębniono 3 główne sposoby aktywacji NF-κB prowadzące do translokacji wolnych dimerów NF-κB z cytoplazmy do jądra komórkowego: klasyczna (z ang. canonical kanoniczna) droga aktywacji NF-κB, alternatywna (niekanoniczna) droga aktywacji NF-κB, atypowa droga aktywacji NF-κB. 30 Klasyczna (kanoniczna) droga aktywacji NF-κB Aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-κB zachodzi poprzez oddziaływanie na receptory komórki cytokin prozapalnych (np. TNF-α, IL-1β), lipopolisacharydów wchodzących w skład ściany bakterii Gram-ujemnych, antygenów, wirusów oraz ligan

33 Rozdział 1 du CD40. Istotą tego sposobu jest degradacja IκBα, który więzi dimery p50/rela i p50/c-rel w cytoplazmie. Dzieje się to z udziałem kinazy IKKβ, która po zadziałaniu bodźca katalizuje fosforylację IκBα na N-końcowej domenie regulatorowej w dwóch resztach seryny: Ser-32 i Ser-36. Ufosforylowane miejsca w IκBα są następnie rozpoznawane przez ligazę ubikwityny SCF, co prowadzi do gwałtownej ubikwitynacji IκBα na dwóch sąsiadujących resztach lizyny (Lys-21 i Lys-22), a następnie do degradacji IκBα przez proteasom 26S i uwolnienia dimerów NF-κB. Odłączenie IκBα powoduje odsłonięcie sekwencji NLS i translokację dimerów NF-κB do jądra komórkowego, gdzie łączą się ze swoistym miejscem w cząsteczce DNA i aktywują transkrypcję genów. Alternatywna (niekanoniczna) droga aktywacji NF-κB Poza szlakiem klasycznej aktywacji NF-κB działanie białek z rodziny TNF, takich jak limfotoksyna β (LTβ) i stymulator limfocytów B (BAFF) oraz ligandu CD40, może prowadzić do aktywacji NF-κB drogą alternatywną. Po zadziałaniu bodźca dochodzi do aktywacji kinazy NIK, która fosforyluje i aktywuje kinazę IKKα. W następstwie tego kinaza IKKα fosforyluje w obrębie regionu SRR nieaktywne białko prekursorowe p100 związane z RelB. Ufosforylowane białko p100 podlega ubikwitynacji i częściowej degradacji (proteolizie podlega C-koniec łańcucha polipeptydowego bogaty w powtórzenia ankirynowe). Dzięki temu powstaje aktywny transkrypcyjnie dimer p52/relb, który jest transportowany do jądra komórkowego. Aktywacja drogi alternatywnej w limfocytach B w odpowiedzi na wiązanie ligandu CD40 prowadzi do zakończenia programu reakcji germinalnej oraz zapoczątkowuje dalsze różnicowanie limfocytu w kierunku komórki pamięci lub plazmocytu. Atypowa droga aktywacji NF-κB NF-κB ulega aktywacji również w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Aktywacja ta została nazwana atypową, ponieważ indukcja następuje bez udziału mechanizmu ligand receptor oraz jest niezależna od działania kompleksu kinaz IKK. Uszkodzenie dwuniciowego DNA przez czynniki genotoksyczne (promieniowanie UV, chemioterapeutyki, np. doksorubicyna) skutkuje sumoilacją zlokalizowanego w jądrze komórkowym IKKγ, co zapobiega jego eksportowi z jądra. Jednocześnie uszkodzenie DNA aktywuje ATM, które fosforyluje zmodyfikowane IKKγ, doprowadzając w konsekwencji do jego ubikwitynizacji. Ubikwitynizowane IKKγ podlega translokacji do cytoplazmy, gdzie w kooperacji z ATM i kinazami TAK1/TAB1 aktywuje kompleks IKK, doprowadzając do degradacji IκBα. W konsekwencji wolne dimery NF-κB, głównie p50/rela, aktywują ekspresję genów w sposób podobny do metody klasycznej. O Connor i wsp. opisali sposób aktywacji polegający na degradacji IκBα z udziałem białka PIR (proteasome inhibitor-resistant), a co za tym idzie niewymagający degradacji inhibitora κb w proteasomie. W wyniku działania białka PIR zależnego od kompleksu kinaz IKK powstają dimery p50/c-rel, które wykazują konstytutywną aktywność w limfocytach B. 31

34 Tomasz Chojnacki wirusy bakterie cytokiny prozapalne błona komórkowa IKKa IKKg IKKb IkBa degradacja w proteasomie 26S IkBa ReIA IkBa ReIA p50 p50 P P Ub Ub fosforylacja Ub Ub Ub Ub ubikwitynacja błona jądrowa ReIA p50 transkrypcja geny aktywowane przez NF-kB Rycina 7. Schemat klasycznej drogi aktywacji NF-κB Aktywowany NF-κB podlega w jądrze komórkowym szeregom modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja, acetylacja, metylacja. Regulują one siłę i czas trwania aktywacji NF-κB. Aktywowany NF-κB przyłącza się do swoistych sekwencji DNA (oznaczonych jako sekwencje κb) i reguluje transkrypcję ponad 500 genów uczestniczących w immunoregulacjach, kontroli wzrostu, odpowiedzi na zapalenie, kancerogenezie i apoptozie. 32 Antyapoptotyczne działanie NF-κB Czynniki transkrypcyjne z rodziny Rel/NF-κB działają antyapoptotycznie na dwa sposoby: indukując transkrypcję genów antyapoptotycznych oraz hamując aktywność genów proapoptotycznych. NF-κB pobudza ekspresję wielu genów, których produkty końcowe mają zdolność hamowania apoptozy, np.: komórkowych inhibitorów apoptozy (c-iaps), inhibitorów XIAPs, białka cflip, białka A1/Bfl1, czynnika związanego z receptorem TNF (TRAF1 i TRAF2). Działanie antyapoptotyczne NF-κB przejawia się na wiele sposobów: 1. Białka ciap to najlepiej poznane komórkowe inhibitory apoptozy. Wiążą się i hamują aktywność kaspaz efektorowych 3 i 7 oraz blokują aktywację prokaspaz 6 i 9. Co z tego wynika, ciap hamują apoptozę indukowaną aktywacją szlaku zewnątrzpochodnego [przez TNF, limfotoksynę (LT), ligand FAS, TRAIL, THANK (homolog TNF aktywujący apoptozę, NF-κB i kinazę JNK) oraz VEGI (inhibitor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego)] i wewnątrzpochodnego (mitochondrialnego). Białka c-iap łączą się też z kompleksem sygnałowym TNF-R1 poprzez

35 Rozdział 1 błona komórkowa BAFF/Blys limfotoksyna B NIK IKKa IKKa degradacja w proteasomie 26S p100 ReIB p100 ReIB P P Ub Ub Ub Ub fosforylacja Ub ubikwitynacja Ub C-koniec łańcucha białka p100 błona jądrowa ReIB p52 geny aktywowane przez NF-kB transkrypcja Rycina 8. Schemat alternatywnej drogi aktywacji NF-κB białko TRAF2, hamując w ten sposób działanie kaspazy 8 (c-iap nie mają zdolności bezpośredniego wiązania się z kaspazą 8). 2. Kolejnym inhibitorem apoptozy, którego ekspresja podlega regulacji NF-κB, jest białko cflip. Zawiera ono dwie efektorowe domeny śmierci (DED) oraz katalitycznie nieaktywną domenę o właściwościach kaspazy. Wiąże się zatem z domenami śmierci białka adaptorowego FADD oraz przyłącza prokaspazę 8 i zakłóca jej aktywację. Białko cflip może również oddziaływać z białkami TRAF2 i RIP, wiążącymi się z kompleksem TNF-R1. Białka te mają zdolność do aktywowania kinazy IKK, a co za tym idzie do translokacji dimerów NF-κB do jądra komórkowego, gdzie zapoczątkowują transkrypcję określonych genów. Stąd wniosek, że cflip ma wpływ na hamowanie apoptozy również poprzez zwiększenie aktywności samego NF-κB. 3. NF-κB bierze także udział w inhibicji apoptozy indukowanej przez szlak wewnątrzpochodny. Główną rolę odgrywają tutaj białka z rodziny Bcl-2: A1 i Bcl-xL. Białko A1 hamuje depolaryzację mitochondriów, uwalnianie z nich cytochromu c i czynników indukujących apoptozę (IAF). Hamuje też aktywację kaspazy NF-κB działa hamująco na aktywność białka Bax, którego ekspresja zwiększa się w komórkach zawierających superrepresory IαBα, natomiast nadekspresja NF-κB opóźnia aktywność promotora genu Bax stymulowanego przez białko p NF-κB indukuje ekspresję genów hamujących akumulację ROS (reaktywnych form tlenu) w komórce. ROS działają proapoptotycznie. 6. NF-κB reguluje ekspresję genów związanych z cyklem komórkowym akty wuje cyklinę D1 odpowiedzialną za przejście komórki z fazy G1 do fazy S cyklu podziałowego. 33

36 Tomasz Chojnacki LTbR, BAFF, TNF CD40L, RANKL UV-C EGF LPS PERVANADATE/ H 2 O 2 ANTYGEN RECEPTOR TRADO, TRAF2, RIP TRAF2/TRAF3 P38MAPK EGFR TLR BCR TCR MYD88, IRAK 1/2, TAK1, MEKK1, MEKK3 NIK TRAF6, ECSIT CKII fosforylacja aktywacja IKK aktywacja IKKa IkBa aktywacja IKKa ubikwitynacja IkBa fosforylacja i ubikwitynacja p100 fosforylacja i ubikwitynacja IkBa fosforylacja i ubikwitynacja IkBa Syk fosforylacja IkBa PLCg1, PI3K, PDK1, PKCθ PLCg2, PI3b, PDK1, PKCθ CBM (CARMA1-BCL-MALT1) TRAF2/TRAF6 degradacja IkBa p100/p52 degradacja IkBa dysocjacja IkBa-NF-kB IKK-g-UB TAK1/TAB1 GSK3b/TpI2 aktywacja IKK fosforylacja p105 degradacja IkBa translokacja p50/p65 RelB/p52 p50/p55 p65 phos (S 276, S 529, S 536 ) acetylacja (K 221, S 310 ) metylacja (K 314, S 315 ) WIP1 JĄDRO transkrypcja genów aktywowanych przez NF-kB DSBS ATM sumoilacja IKK-g IKK-g-ub fosforylacja SUMO-modified IKK-g Rycina 9. Główne szlaki aktywacji NF-κB czynniki genotoksyczne 34

37 Konstytutywna (autonomiczna) aktywność NF-κB Rozdział 1 Konstytutywna aktywność NF-κB (stwierdzana poprzez oznaczenie jądrowej lokalizacji NF-κB) występuje u > 60% pacjentów z DLBCL ABC. Głównym mechanizmem tej aktywacji są obecne w > 50% mutacje somatyczne dotyczące genów kodujących białka regulujące aktywność NF-κB [20], w tym: delecja TNFAIP3 (A20) występuje w 24,3% DLBCL ABC, w 2,3% przypadków DLBCL GCB oraz w 20% przypadków DLBCL non-gc/nc (niesklasyfikowane DLBCL z równoczesną ekspresją IRF-4 i CD10), mutacja CARD11 w 10,8% przypadków DLBCL ABC, w 6,8% DLBCL GCB oraz w 10% DLBCL non-gc/nc, mutacja TNFRSF11A (RANK) w 8,1% DLBCL ABC, w 2,3% DLBCL GCB oraz w 10% DLBCL non-gc/nc, mutacja TRAF5 w 5,4% przypadków DLBCL ABC, w 4,5% DLBCL GCB oraz w 5% DLBCL non-gc/nc, mutacja TRAF2 w 2,7% przypadków DLBCL ABC, w 9,1% DLBCL GCB oraz w 5% DLBCL non-gc/nc, mutacja MAP3K7 (TAK1 kinaza uczestnicząca w aktywacji kompeksu IKK w klasycznej drodze aktywacji NF-κB) w 5,4% DLBCL ABC, nie występuje w DLBCL GCB oraz w DLBCL non-gc/nc, BIRC2 (i jego produkt ciap1) oraz BIRC3 (i jego produkt ciap2), MAP3K14 (i jego produkt NIK), IKBKB (i jego produkt IKKβ). W pozostałych przypadkach z tych > 60% DLBCL ABC za konstytutywną aktywację NF-κB odpowiada: sygnał z aktywowanego szlaku BCR, konstytutywna aktywność MYD88. Konsekwencją konstytutywnej aktywności NF-κB jest m.in. ekspresja genów warunkujących progresję cyklu komórkowego i proliferację (cyklina D2) oraz genów antyapoptotycznych (BCL2, BFL1/A1, BCL-xL, TRAF-1, TRAF-2, c-iap, cflip). Mutacje aktywujące NF-κB w mechanizmie innym niż poprzez sygnał z aktywowanego szlaku BCR powodują pierwotną oporność na inhibitory sygnalosomu BCR (ryc. 10). Wniosek jest taki, że ponad połowa pacjentów z DLBCL ABC, u których stwierdza się konstytutywną aktywność NF-κB, będzie oporna na inhibitory sygnalosomu BCR. Wykrycie tych mutacji powinno więc być priorytetem przed zastosowaniem tych leków. Tezę tę potwierdza badanie Wilsona i wsp. prezentowane na ASH 2012, w którym ibrutinib powodował 40% (tylko?) odpowiedzi w nawrocie DLBCL ABC [21]. Leki hamujące aktywację NF-κB Potencjalnymi inhibitorami NF-κB są leki działające poprzez hamowanie kinaz proteinowych i fosfataz, inhibitory proteasomów, inhibitory ubikwitynizacji, acetylacji, metylacji i wiązania DNA. Jednym z mechanizmów prowadzących do aktywacji NF-κB jest fosforylacja IκB przez swoiste kinazy (IKKs), a następnie degradacja inhibitora przez proteasomy. 35

38 Tomasz Chojnacki A B C przewlekła aktywacja szlaku BCR szlak TLR CD40 BAFF TACI MYD88 CD79A CD79B TLR2 TLR9,4 SFK P Y Y TRAF2 ciap1/2 TRAF3 SYK P Y Y NIK IRAK4 IRAK1 BTK TRAF6 NIK IKKg PKC IKKa IKKa IKKb IKKa kompleks CBM P CARD11 BCL10 MALT1 P P P P IkBa p50 p50 p100 ReIB p50 p50 p52 ReIB klasyczny szlak NF-kB alternatywny szlak NF-kB Rycina 10. Mutacje somatyczne i aktywacja NF-κB w komórkach chłoniaka (gwiazdką oznaczono mutacje powodujące oporność na inhibitory sygnalosomu BCR) 36

39 Rozdział 1 Wśród wielu strategii prowadzących do zahamowania aktywności NF-κB można wymienić zapobieganie fosforylacji IκB przez blokowanie kinaz IKKs oraz degradacji IκB w proteasomach. Bortezomib poprzez inhibicję proteasomów może hamować aktywację NF-κB zależną od degradacji IκB (na drodze klasycznej w odpowiedzi na TNF, jak i w odpowiedzi na LPS, EGFR, UV-C oraz na drodze aktywacji sygnału z BCR i TCR). Zaburzenia regulacji epigenetycznej w patogenezie DLBCL Regulacja epigenetyczna jest procesem dynamicznych zmian architektury chromatyny jądrowej napędzanych przez enzymy modyfikujące histony. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, który składa się z DNA owiniętego wokół oktameru białek histonowych. Histony podlegają posttranslacyjnej modyfikacji, jak metylacja i acetylacja w miejscach lizyny i argininy. Modyfikacje te skutkują zmianami struktury chromatyny jądrowej i służą do kierowania za pośrednictwem kodu histonowego białkami efektorowymi, odpowiedzialnymi za transkrypcję, replikację i naprawę DNA. Za modyfikację histonów odpowiada wiele enzymów kierowanych w odpowiednie miejsca nici DNA takich jak wzmacniacze (enhancers) i promotory przez czynniki transkrypcyjne. Pozwala to na włączenie lub wyłączenie ekspresji danego genu na zasadzie włącznika. Głównymi procesami w białkach histonowych związanymi z ich aktywnością transkrypcyjną są: metylacja lizyny 4 histonu 3 (H3K4me), acetylacja lizyny 27 histonu 3 (H3K27ac). Metylacja lizyny 27 histonu 3 prowadzi natomiast do represji transkrypcji. Konfiguracje tych procesów są zależne m.in. od czynników zewnętrznych, co pozwala na epigenetyczną regulację funkcji komórki w odpowiedzi na różnorodne bodźce. Mutacje somatyczne poszczególnych enzymów modyfikujących histony są jednymi z najczęściej występujących zaburzeń genetycznych w limfoproliferacjach. W przypadku DLBCL dotyczą one następujących białek: KMT2D (zwanego także MLL2 lub MLL4), EZH2, CREBBP oraz EP300. Podczas gdy mutacje w aktywatorach transkrypcji (KMT2D, CREBBP i EP300) skutkują zmniejszeniem ich aktywności, mutacje w EZH2, będącym epigenetycznym represorem transkrypcji, zwiększają jego aktywność jako supresora. Mutacje EZH2 są spotykane głównie w DLBCL GCB, natomiast mutacje CREBBP/EP300 oraz KMT2D występują również w DLBCL ABC. Znajomość mechanizmów deregulacji epigenetycznych w DLBCL może dostarczyć nowe narzędzie dla skuteczniejszego leczenia pacjentów, gdyż ok. 30% z nich jest pierwotnie opornych na I linię leczenia, a następne 30% ma wznowy. Wiedza o obecności mutacji w ww. genach może pozwolić na zastosowanie skutecznego leczenia odwracającego zaburzenia regulacji epigenetycznej [22]. Przykładowo: linie komórkowe DLCBL z mutacjami EZH2 wydają się uzależnione od zwiększonej aktywności metylotransferazy histonowej, a selektywne inhibitory EZH2 (GSK126 i El1) hamują proliferację i indukują cell-cycle arrest i apoptozę komórek chłoniaka. W fazie wczesnych prób klinicznych we wszystkich podtypach nawrotowego DLBCL jest doustny inhibitor metylotransferazy histonowej E7438. W fazie badań klinicznych znajdują się również połączenia inhibitorów EZH2 z lekami demetylującymi. Pozostaje pytanie, 37

40 Tomasz Chojnacki kogo powinniśmy leczyć inhibitorami EZH2, bo działają one również w przypadku komórek mających wild-type genu EZH2. Wiadomo również, że inhibitory deacetylazy histonowej mogą odwrócić efekt mutacji KMT2D. Deregulacje epigenetyczne wymagają jednak dużo bardziej szczegółowego poznania, zanim skierowane na nie terapie zaczną przynosić oczekiwane efekty. Mutacje EZH2 W podtypie DLBCL GCB zostały zidentyfikowane mutacje somatyczne w egzonie 15 genu EZH2, który koduje białko histonowe EZH2 (N-metyltransferazę lizynową). Skutkiem tych mutacji jest zastąpienie tyrozyny w pozycji Tyr641 w domenie SET tego białka. Za pomocą technik sekwencjonowania oceniono, że mutacje te występują w 22% DLBCL GCB i nie występują wcale w podtypie ABC. Białko EZH2 jest składową kompleksu PRC2 i odpowiada za dodawanie grupy metylowej do lizyny w pozycji Lys27 histonu H3 (H3K27). Mutacja EZH2 Y641 skutkuje wzrostem trimetylacji ww. histonu. EZH2 odgrywa główną rolę regulatorową w komórkach DLBCL poprzez promowanie nowotworzenia wskutek wyciszenia kluczowych genów antyproliferacyjnych i supresorowych regulujących cykl komórkowy (np. CDKN1A) oraz genów napędzających końcowe różnicowanie komórek centrów rozmnażania (np. IRF4 i PRDM1). Ekspresja zmutowanego EZH2 w komórkach centrów rozmnażania prowadzi do hiperplazji tych ośrodków i prawdopodobnie w kooperacji z Bcl-2 do przyspieszenia nowotworzenia. Mutacje inaktywujące CREBBP i EP300 Mutacje inaktywujące acetylotransferaz histonowych CREBBP i EP300 są spotykane u ok. 30% pacjentów z FL i DLBCL. Obie te cząsteczki należą do rodziny białek KAT3, odpowiedzialnych za acetylację lizyny w histonach i w wielu innych białkach. Najnowsze badania wskazują, że rola białka BCL6 jako represora transkrypcji jest antagonizowana przez wzmacniacze (enhancers) transkrypcji genów, aktywowane przez CREBBP/EP300. Utrata funkcji tych białek w wyniku mutacji może więc prowadzić do zwiększonej aktywności Bcl-6 w transformujących komórkach chłoniaka. W dodatku mutacje inaktywujące CREBBP/EP300 mogą skutkować zmniejszeniem acetylacji Bcl-6 i p53, co nasila działanie pierwszego i upośledza funkcję drugiego z nich. Mutacje EP300 mogą ponadto skutkować zahamowaniem ekspresji genów A20 oraz IκBa oraz promować onkogenną funkcję Hsp90. Mutacje inaktywujące KMT2D KMT2D jest podjednostką kompleksu COMPASS (complex of proteins associated with SET1). Kompeks ten promuje transkrypcję poprzez mono-, di- i trimetylację H3K4. KMT2D jest głównym regulatorem wzmacniaczy transkrypcji podczas różnicowania komórek B. Mutacje inaktywujące w domenie C-końcowej SET białka KMT2D występują w ok % FL i DLBCL i skutkują utratą aktywności metylotransferazy. Wydaje się, że może to promować nowotworzenie w limfocytach B 38

41 Rozdział 1 poprzez zwiększenie ich szansy na wystąpienie kolejnych mutacji i co za tym idzie transformacji w wyniku braku różnicowania do aktywowanych limfocytów B. Mutacje w KMT2D często współistnieją z mutacjami EZH2 i wydaje się, że mogą wzajemnie wzmacniać swoją funkcję. Inaktywacje supresorów wzrostu guza Mutacje A20 A20 jest białkiem enzymatycznym odpowiadającym za hamowanie aktywacji NF-κB w wyniku stymulacji receptorów TNF i Toll-like. A20 działa poprzez odłączenie łańcucha ubikwitynowego od lizyny w pozycji 63 (Lys63) kinazy RIP1 i dołączenie łańcucha poliubikwitynowego w pozycji Lys48 tej kinazy. Kinaza RIP1 jest rekrutowana do receptora po stymulacji TNF. Odpowiada ona za aktywację kompleksu IKK. Przeniesienie łańcucha ubikwitynowego kieruje kinazę RIP na drogę proteosomalnej degradacji, co wyjaśnia hamowanie aktywacji NF-κB przez A20. A20 może także hamować aktywację NF-κB na inne sposoby, m.in. poprzez interakcje z TRAF1 i TRAF2. Gen TNFAIP3 kodujący A20 znajduje się na chromosomie 6 (6q23). Region ten często ulega delecji w limfoproliferacjach [23]. Dotyczy ona prawie 25% DLBCL ABC, 2,3% przypadków DLBCL GCB oraz 20% przypadków DLBCL non-gc/nc (niesklasyfikowane DLBCL z równoczesną ekspresją IRF-4 i CD10). Inaktywacja białka p53 Głównym zadaniem białka p53 jest zabezpieczenie komórki przed zmianami w genomie powstającymi w wyniku uszkodzenia DNA. Białko p53 w prawidłowej komórce, niepoddanej żadnemu stresowi jest nieaktywne, związane z białkiem MDM2, które promuje jego ubikwitynację i degradację w proteasomach. Krytycznym momentem jest fosforylacja domeny N-końcowej, która zapobiega ubikwitynacji, co doprowadza do szybkiego nagromadzenia białka w komórce. Pod kontrolą transkrypcyjną p53 znajdują się liczne geny zaangażowane w zatrzymanie cyklu komórkowego (p53 może zatrzymać cykl komórkowy na dwóch punktach kontrolnych G1/S oraz G2/M), naprawę DNA, apoptozę (zależnie od stopnia uszkodzenia komórki p53 decyduje, czy komórka zostanie poddana naprawie, czy skierowana na drogę apoptozy) i starzenie się komórek. Te geny to m.in. CDKN1A, GADD45 (growth arrest and DNA damage inducible gene), BAX, DR5/KILLER (death receptor 5), CD95 (cell-death signaling receptor), PIG3 (p53-inducible gene), PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis), NOXA i in. Oprócz indukcji transkrypcji p53 może też powodować supresję transkrypcji niektórych genów, takich jak Bcl-2, Bcl-x L, cyklina B1 i MAP4. Kontrolę transkrypcyjną nad tymi genami p53 sprawuje poprzez liczne modyfikacje epigenetyczne na skutek oddziaływania z transacetylazą histonów, białkiem p300 oraz metylotransferazami PRMT1 i CARM1. Białko p53 może też bezpośrednio stymulować transkrypcję, m.in. poprzez rekrutację głównych czynników transkrypcyjnych TFIIA i TFIID. Poza kontrolą transkrypcji genów p53 odgrywa też nie mniejszą rolę w regulacji procesów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych w wyniku interakcji białko białko. Dodatkowym mechanizmem regulacji apoptozy jest hamowanie transkrypcji czynników wzrostu i promujących 39

42 Tomasz Chojnacki przeżycie komórki, takich jak IGF1 oraz surwininy (białka z rodziny IAP inhibitor of apoptosis protein), powodujące inhibicję aktywacji kaspaz. Inaktywacja białka p53 w komórkach nowotworowych jest zjawiskiem powszechnym i może przebiegać na kilka sposobów. Po pierwsze może dojść do delecji fragmentu chromosomu 17 zawierającego gen TP53 (del17p13.1). Po drugie może nastąpić punktowa mutacja w genie TP53, prowadząca do powstania nieaktywnego białka. W pozostałych przypadkach obserwuje się zaburzenia regulacji p53 przez jego główny regulator w komórce białko MDM2. Badania wskazują, że inaktywacja białka p53 występuje w ok. 14% DLBCL (zarówno GCB, jak i ABC) i jest związana z krótszym czasem przeżycia po immunochemioterapii R-CHOP. Inaktywacja BLIMP1/PRDM1 Inaktywacja tego genu może nastąpić w co najmniej kilku różnych mechanizmach: poprzez delecje fragmentu chromosomu, poprzez wystąpienie mutacji w genie (w tym mutacji nonsensownych), poprzez zahamowanie transkrypcji genu przez konstytutywnie aktywny BCL6. Inaktywacja BLIMP1/PRDM1 jest w zasadzie ograniczona do podtypu ABC i dotyczy wg różnych źródeł 24 53% pacjentów z tym podtypem chłoniaka [24]. Mutacje dotyczą N-końcowej części genu, zawierającej domenę PR (proline rich) i DNA-binding zinc finger domain. Analiza regionu 6q21 ujawniła, że w większości zmutowanych przypadków występuje utrata ekspresji drugiego allela w wyniku delecji, wyciszenia wskutek modyfikacji epigenetycznych lub uniparentalnej disomii zmutowanego allela. W przypadku mutacji o typie missense dochodzi natomiast do utraty stabilności produktu uszkodzonego genu lub zaburzeń jego funkcji. W około połowie przypadków przyczyną inaktywacji produktu białkowego genu BLIMP nie są zaburzenia struktury genu. Przypadki te charakteryzują się dodatkowo prawidłową ekspresją IRF4, który z reguły współwystępuje z PRDM1 w prawidłowych komórkach centrów rozmnażania i uczestniczy w procesie aktywacji produktu białkowego BLIMP1 i różnicowania limfocytów w plazmocyty. Za inaktywację białka BLIMP1 jest w tych wypadkach odpowiedzialne Bcl-6, które ulega nadekspresji w wyniku translokacji. Zjawisko to jest charakterystyczne dla podtypu ABC IRF+. W około 1/3 przypadków inaktywacja BLIMP1 następuje pomimo braku zaburzeń strukturalnych w genach BLIMP1 i Bcl-6. Jest prawdopodobne, że za inaktywację w tych przypadkach odpowiedzialna jest hipermetylacja promotora BLIMP1 w nieznanym dotąd mechanizmie. BLIMP1 jest genem kodującym represor transkrypcji, który jest niezbędny w końcowej fazie różnicowania limfocytów B w komórki plazmatyczne. Działa przez tłumienie transkrypcji genów odpowiedzialnych za przekazywanie sygnału z receptora B-komórkowego (BCR) i proliferację. Komórki ze zmutowanym genem BLIMP1 charakteryzują się brakiem zdolności do zatrzymywania cyklu komórkowego i różnicowania w plazmocyty. Doświadczenia na modelach zwierzęcych wykazały, że izolowana inaktywacja BLIMP1 może odpowiadać za powstawanie nowotworów limfoproliferacyjnych. 40

43 Rozdział 1 U ludzi inaktywacja BLIMP1 często współwystępuje z konstytutywną aktywnością NF-κB, które jest aktywowane w większości przypadków DLBCL ABC. Co ciekawe, uważa się, że u znacznego odsetka pacjentów (dane nie są znane) inaktywacja BLIMP1 współwystępuje z mutacjami w obrębie szlaku NF-κB. Delecja CDKN2A CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), zwane również p16, jest białkiem supresorowym, kodowanym przez gen o tej samej nazwie położony na chromosomie 9 (9p21.3). Odgrywa ono istotną rolę w regulacji cyklu komórkowego, hamując przechodzenie z fazy G1 do fazy S poprzez inhibicję kinaz CDK4 i CDK6. Ma to znaczenie w profilaktyce choroby nowotworowej. Utrata CDKN2A opisywana jest u 35% pacjentów z DLBCL [25]. Związana jest ze znacząco gorszym rokowaniem, tj. krótszym czasem przeżycia po standardowej chemioterapii R-CHOP niezależnie od IPI (International Prognostic Index). Pacjentów z tą delecją charakteryzuje podtyp ABC ze specyficznym profilem ekspresji genów, cechującym się deregulacją szlaku RB/E2F, aktywacją metabolizmu komórkowego oraz hamowaniem odpowiedzi immunologicznej i zapalnej. Podsumowanie W patogenezie chłoniaka DLBCL mogą brać udział aktywacje kilku głównych i kilku dodatkowych komórkowych szlaków sygnałowych oraz mutacje w genach białek uczestniczących w przekazywaniu sygnału w tych szlakach w liczbie kilkudziesięciu. Podkreśla się również, że znaczenie ma jakość przekazywanego tymi szlakami sygnału (toniczny vs przewlekle aktywny sygnał z receptora BCR). Ponadto w procesie limfomagenezy uczestniczą z jednej strony rearanżacje/nadekspresje onkogenów, a z drugiej strony istotną rolę w części przypadków odgrywają inaktywacje supresorów wzrostu guza. W ostatnim czasie podkreśla się też nietuzinkową, a niekiedy nawet dominującą rolę deregulacji epigenetycznych. Niezwykle ciekawe wydają się badania poszukujące wspólnych mechanizmów patogenetycznych chłoniaków i chorób z autoagresji oraz badające rolę podścieliska w powstaniu i rozwoju chłoniaka. Co ważne, do zaistnienia nowotworzenia zwykle konieczne jest wystąpienie w jednej komórce kilku zaburzeń jednocześnie. Wiadomo, że pojawienie się jednej deregulacji może nie być wystarczające do skierowania komórki na patologiczny tor rozwoju. Ta mnogość możliwych zaburzeń jest najlepszym dowodem na to, że DLBCL jest grupą chorób o podobnej charakterystyce morfologicznej, z której najpewniej z czasem wyodrębniane będą kolejne podjednostki o szczególnej charakterystyce molekularnej. Z analizy tej można wyciągnąć jeszcze jeden bardzo istotny z punktu widzenia terapii wniosek. Na podstawie analizy deregulacji w poszczególnych przypadkach DLBCL już teraz w ich części można przewidzieć odpowiedź na standardową immunochemioterapię, jak również reakcję na nowe leki ukierunkowane na cele molekularne. W przyszłości być może pozwoli to na uniknięcie narażania pacjenta na ryzyko wystąpienia działań niepożądanych po leku, o którym już wcześniej można było po 41

44 Tomasz Chojnacki wiedzieć, że nie zadziała, a jednocześnie na optymalizację kosztów leczenia bardzo drogimi lekami. Aby tak się stało, konieczne są jednak dalsze badania skupiające się na ostatecznym wyjaśnieniu patogenezy chłoniaka, jego podziale na podtypy molekularne oraz badania nad nowymi lekami i ich skojarzeniami w konkretnych wydzielonych podtypach choroby. 42 Piśmiennictwo 1. Adams JM, Cory S. The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy. Oncogene 2007; 26: Lam LT, Wright G, Davis RE i wsp. Cooperative signaling through the signal transducer and activator of transcription 3 and nuclear factor-{kappa}b pathways in subtypes of diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2008; 111: Souers AJ, Leverson JD, Boghaert ER i wsp. ABT-199, a potent and selective Bcl-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med 2013; 19: Young RM, Staudt LM. Targeting pathological B cell receptor signalling in lymphoid malignancies. Nat Rev Drug Discov 2013; 12: Monroe JG. ITAM-mediated tonic signalling through pre-bcr and BCR complexes. Nat Rev Immunol 2006; 6: Delgado P, Cubelos B, Calleja E i wsp. Essential function for the GTPase TC21 in homeostatic antigen receptor signaling. Nat Immunol 2009; 10: Yang J, Reth M. Oligomeric organization of the B-cell antigen receptor on resting cells. Nature 2010; 467: Huang X, Shen Y, Liu M i wsp. Quantitative proteomics reveals mir-155 regulates the PI3K-AKT pathway in diffuse large B-cell lymphoma. Am J Pathol 2012; 181: Krześlak A. Akt kinase: a key regulator of metabolism and progression of tumors. Postepy Hig Med Dosw 2010; 64: King FW, Skeen J, Hay N i wsp. Inhibition of Chk1 by activated PKB/Akt. Cell Cycle 2004; 3: Fu Z, Tindall DJ. FOXOs, cancer and regulation of apoptosis. Oncogene 2008; 27: Yang C, David L, Qiao Q i wsp. The CBM signalosome: potential therapeutic target for aggressive lymphoma? Cytokine Growth Factor Rev 2014; 25: Hailfinger S, Nogai H, Pelzer C i wsp. Malt1-dependent RelB cleavage promotes canonical NF-kappaB activation in lymphocytes and lymphoma cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108: Lenz G, Staudt LM. Aggressive lymphomas. N Engl J Med 2010; 362: Chen L, Monti S, Juszczynski P i wsp. SYK-dependent tonic B-cell receptor signaling is a rational treatment target in diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2008; 111: Lannutti BJ, Meadows SA, Herman SE i wsp. CAL-101, a p110delta selective phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor for the treatment of B-cell malignancies, inhibits PI3K signaling and cellular viability. Blood 2011; 117: Pfeifer M, Grau M, Lenze D i wsp. PTEN loss defines a PI3K/AKT pathway-dependent germinal center subtype of diffuse large B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 2013; 110: Ngo VN, Young RM, Schmitz R i wsp. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature 2010; 470: Ding BB, Yu JJ, Yu RY i wsp. Constitutively activated STAT3 promotes cell proliferation and survival in the activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphomas. Blood 2008; 111: Compagno M, Lim WK, Grunn A i wsp. Mutations of multiple genes cause deregulation of NF-kappaB in diffuse large B-cell lymphoma. Nature 2009; 459: Wilson WH, Gerecitano JF, Goy A i wsp. The Bruton s Tyrosine Kinase (BTK) Inhibitor, Ibrutinib (PCI ), Has Preferential Activity in the ABC Subtype of Relapsed/Refractory De Novo Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL): Interim Results of a Multicenter, Open-Label, Phase 2 Study. 54 th ASH Annual Meeting and Exposition, December , Atlanta. 22. Roschewski M, Staudt LM, Wilson WH. Diffuse large B-cell lymphoma treatment approaches in the molecular era. Nat Rev Clin Oncol 2014; 11: Schmitz R, Hansmann ML, Bohle V i wsp. TNFAIP3 (A20) is a tumor suppressor gene in Hodgkin lymphoma and primary mediastinal B cell lymphoma. J Exp Med 2009; 206: Mandelbaum J, Bhagat G, Tang H i wsp. BLIMP1 is a tumor suppressor gene frequently disrupted in activated B cell-like diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell 2010; 18: Jardin F, Jais JP, Molina TJ i wsp. Diffuse large B-cell lymphomas with CDKN2A deletion have a distinct gene expression signature and a poor prognosis under R-CHOP treatment: a GELA study. Blood 2010; 116:

45 ROZDZIAŁ 2 ZALECENIA DIAGNOSTYCZNE Tomasz Chojnacki Optymalną metodą diagnozowania chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (diffuse large B-cell lymphoma DLBCL) pozostaje biopsja chirurgiczna. Materiałem może być pobrany węzeł, rzadziej szpik kostny lub wycinek tkankowy. W odróżnieniu od biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej biopsja chirurgiczna pozwala na ocenę architektoniki węzła oraz podścieliska, co odgrywa niebagatelną rolę. Ponadto dostarcza dobrej jakości materiału do badań immunofenotypowych i molekularnych. W optymalnych warunkach pobrany węzeł lub wycinek powinien zostać dostarczony do laboratorium nieutrwalony, aby umożliwić wykonanie fenotypowania i ekstrakcji DNA i RNA do dalszych badań. Biopsja cienkoigłowa i pobieranie materiału do badań podczas zabiegów endoskopowych powinny być ograniczone wyłącznie do przypadków, gdy istnieją przeciwwskazania do operacji lub ze względu na umiejscowienie guza jest ona niepraktyczna i/lub zbyt ryzykowna. Rozpoznanie morfologiczne w każdym przypadku powinno być potwierdzone badaniem immunofenotypowym i/lub immunohistochemicznym. Użyty panel przeciwciał musi być tak zaprojektowany, aby wykazać pochodzenie komórek z linii B i pozwolić na zróżnicowanie z alternatywnymi diagnozami, takimi jak chłoniak plazmablastyczny, naciek tkanek miękkich przez szpiczaka plazmocytowego, chłoniak Burkitta, wariant blastyczny chłoniaka z komórek płaszcza, a także chłoniaki szarej strefy i niektóre przypadki chłoniaka Hodgkina. Może to być trudne przy użyciu jedynie badania morfologicznego. Dodatkowo taki panel musi umożliwić zróżnicowanie różnych podtypów choroby, np. chłoniak immunoblastyczny, pierwotny chłoniak śródpiersia, T-cell/histiocyte rich large B-cell lymphoma, pierwotnie skórny DLBCL leg-type czy EBV+ DLBCL wieku podeszłego. Przykładowy panel immunohistochemiczny powinien zawierać: CD20, CD79a, BCL6, Myc, BCL2, CD10, Ki-67, IRF-4, cyklinę D1, CD5 i CD23 [1]. Do rozpoznania podtypu EBV+ DLBCL może być użyte LMP1-EBV lub barwienie EBER. Raport histopatologiczny powinien umożliwić postawienie diagnozy zgodnie z najnowszą klasyfikacją Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization WHO). W wątpliwych przypadkach, 43

46 Tomasz Chojnacki spowodowanych np. zbyt skąpym materiałem, monoklonalność komórek B powinna zostać potwierdzona badaniem PCR (polymerase chain reaction). W obrębie DLBCL NOS (non otherwise speccified) wyróżnia się warianty morfologiczne (centroblastyczny, immunoblastyczny i anaplastyczny), podgrupy molekularne (germinal center B-cell like, activated B-cell like i typ 3) i podtypy immunohistochemiczne (germinal center B-cell type, non-germinal center B-cell type i typ z ekspresją CD5+) określane według schematu Hansa lub Choi: CD19+, CD20+, powierzchniowe lub cytoplazmatyczne IgM>IgG>IgA, CD45+, CD5 /+, CD10+/, BCL6+/, IRF4/MUM1+/, GCET1+/, FOXP1+/. Podział na podtypy, będący wynikiem badania immunohistochemicznego, dzieli DLBCL na dwie zasadnicze grupy do podtypu GC należą chłoniaki wykazujące następujące cechy immunohistochemiczne: GCET/CD10/BCL6/MUM1/FOXP1, natomiast do podtypu non-gc należy zaliczyć przypadki, które immunohistochemicznie charakteryzują się obecnością GCET1/CD10/MUM1/FOXP1/LMO2. W klasyfikacji molekularnej (cell-of-origin) na podstawie profilu ekspresji genów wyróżnia się podtyp GCB o następującej charakterystyce: MME (CD10), BCL6, MYBL1 (A-MYB), oraz podtyp ABC, mający wymienione cechy: BCL2, IRF4 (MUM1), CCND2. Obie te klasyfikacje immunohistochemiczna i molekularna mają jednak wady. Jeśli chodzi o klasyfikację molekularną, duży odsetek chłoniaków nie może zostać zaliczony ani do grupy ABC, ani do GCB. Chłoniaki typu 3 i inne (niesklasyfikowane) wymagają z całą pewnością dalszych badań i trudno na podstawie zaliczenia do którejś z tych dwóch grup mówić o rokowaniu, a tym bardziej o odmiennym sposobie leczenia. W odniesieniu do klasyfikacji immunohistochemicznej należy podkreślić, że dane na temat możliwości jej zastosowania do prognozowania rokowania są sprzeczne i nie jest zalecane jej używanie w codziennej praktyce, lecz tylko w badaniach naukowych. Wadą tej klasyfikacji jest także niesatysfakcjonująca powtarzalność. Zakłada się, że pokrywa się ona z klasyfikacją molekularną w 71 93% przypadków. Badania immunohistochemiczne pozwalają na wyróżnienie w dużej grupie DLBCL odrębnych jednostek nozologicznych: T-cell/histiocyte-rich DLBCL można go scharakteryzować następująco: nieliczne duże komórki B (CD19+, CD20+, BCL6+, BCL2 /+, EMA /+) znajdują się w podścielisku zawierającym limfocyty T (CD3+, CD5+) i histiocyty (CD68+); pierwotny chłoniak ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wyróżnia się występowaniem nacieków centroblastów i immunoblastów zlokalizowanych wokół naczyń krwionośnych. Mają one fenotyp: CD19+, CD20+, CD10 /+, CD5 /+, BCL6+/, IRF4/MUM1+/, BCL2 /+; pierwotny chłoniak skórny leg-type cechuje się występowaniem w skórze nacieków z centroblastów i immunoblastów o fenotypie: CD20+, CD10, BCL2+, BCL6+, IRF/MUM1+/, FOX-P1+, cigm; EBV+ DLBCL wieku podeszłego nacieki z dużych komórek, które uległy transformacji do immunoblastów lub komórek Reed-Stenberga. Fenotyp tych komórek: CD20+/, CD79a+/, CD10, IRF/MUM1+/, BCL6, CD30+/, CD15, EBV-LMP1+, EBER+. W naciekach obecna jest populacja komórek zapalnych; 44

47 Rozdział 2 + ABC + MUM1 GCB GCET1 CD10 + GCB BCL6 ABC + + ABC FOXP1 GCB Rycina 1. Algorytm podziału na podtypy immunohistochemiczne DLBCL związany z przewlekłym zapaleniem morfologicznie nie różni się od DLBCL NOS. W niektórych przypadkach można jednak wykazać różnicowanie w kierunku komórek plazmatycznych, co skutkuje utratą CD20 i nabyciem CD138. Fenotyp wygląda więc następująco: CD20+/, CD79a+/, CD138 /+, IRF/MUM /+, CD30 /+, markery T-komórkowe /+, CD10, BCL6, LMP1+/, EBER+/ ; pierwotny chłoniak śródpiersia (primary mediastinal B-cell lymphoma PMBCL) charakteryzuje się występowaniem centroblastów lub komórek z płatowatym jądrem i jasną cytoplazmą z towarzyszącym włóknieniem. Niektóre komórki przypominają komórki Reed-Stenberga. Ich fenotyp to: sig /+, CD19+, CD20+, CD10 /+, CD15, CD30 /+, IRF4/MUM1+/, BCL2+/, BCL6+/, CD23+, MAL+, crel+; wewnątrznaczyniowy chłoniak z dużych komórek B (IvLBCL) wyróżnia się lokalizacją komórek chłoniaka w świetle naczyń krwionośnych, zwykle w obrębie skóry lub OUN, o fenotypie: PanB+, CD5 /+, CD10 /+, IRF/MUM+, BCL2+; ALK+ DLBCL cechuje się naciekami z immunoblastów lub plazmablastów o fenotypie: CD138+, EMA+, Vs38c+, CD45 /+, CD4 /+, CD57 /+, CD20, CD79a, CD3, CD30 /+, IRF/MUM1 /+, ALK+, EBV ; pierwotny chłoniak wysiękowy (PEL) charakteryzuje się wysiękiem w jamach ciała zawierającym komórki o morfologii immunoblastów lub plazmablastów i fenotypie: CD45+/, CD30+/, CD38+/, CD138+/, EMA+/, CD19, CD20, CD79a, CD3 /+, BCL6, HHV8/KSHV+, EBER+/ ; chłoniak plazmablastyczny (PBL) podobnie jak PEL rozwija się u osób w stanie immunosupresji, głównie u zakażonych HIV. Cechują go nacieki z immunoblastów lub plazmablastów o fenotypie: CD38+, CD138+, Vs38c+, IRF/MUM1+, CD79a+/, EMA+/, CD45 /+, CD20 /+, PAX5 /+, EBER+/. 45

48 Tomasz Chojnacki Dla porządku należy ująć w tym podziale również chłoniaki szarej strefy z cechami pośrednimi pomiędzy DLBCL i chłoniakiem Burkitta oraz z cechami pośrednimi pomiędzy DLBCL i chłoniakiem Hodgkina. Cechują się one wyższą złośliwością i gorszym rokowaniem, dlatego wymagają bardziej agresywnego leczenia, co zostanie omówione w kolejnym rozdziale. Należą do nich: chłoniak z komórek B, niesklasyfikowany, z cechami pośrednimi pomiędzy DLBCL a chłoniakiem Burkitta (DLBCL/BL) charakteryzuje się naciekiem komórek morfologicznie przypominających komórki Burkitta o wysokim indeksie proliferacyjnym, ale atypowa morfologia, fenotyp i cechy genetyczne nie pozwalają na rozpoznanie chłoniaka Burkitta. Mają one fenotyp: CD19+, CD20+, CD10+, BCL6+, BCL2 /+, IRF4/MUM1, Ki-67 od 75% do 100%; chłoniak z komórek B, niesklasyfikowany, z cechami pośrednimi pomiędzy DLBCL a klasycznym chłoniakiem Hodgkina (DLBCL/cHL) to choroba, w której guz zbudowany jest z dużych pleomorficznych komórek przypominających komórki Reed-Sterberga/lakunarne z obecnością włóknienia, nacieków zapalnych i ognisk martwicy. Komórki te mają fenotyp pośredni pomiędzy chl i PMBCL: CD45+/, CD20+/, CD79a+/, CD30+/, CD15+/, PAX-5+/, OCT-2+/, BOB.1+/, CD10, ALK. Dalsze pogłębienie diagnostyki wiąże się z wykonaniem badań cytogenetycznych i molekularnych. Największą wartość ma stwierdzenie w komórkach chłoniaka jednoczesnej rearanżacji genu Myc i Bcl2. Takie chłoniaki nazywamy double-hit lymphoma, a jeśli do tego zestawu dołączy się trzecia rearanżacja, najczęściej genu Bcl6, to mówimy o tripple-hit lymphoma. Obecność tych rearanżacji, w szczególności zaś rearanżacji Myc, wiąże się z gorszym rokowaniem [2 4]. I choć mówi się powszechnie o potrzebie bardziej agresywnego leczenia chłoniaków double- i tripple-hit, nie znalazło to dotąd odzwierciedlenia w najpoważniejszych zaleceniach. Należy jednak zaznaczyć, że jeśli istnieje taka możliwość, trzeba dążyć do wykonania badania tych rearanżacji techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescent in situ hybridization FISH). Należy zaznaczyć, że ekspresja Myc, BCL2 i BCL6 w barwieniach histochemicznych nie zawsze koreluje z obecnością rearanżacji tych genów. W przypadku obecności ekspresji Myc, BCL2 i BCL6 na jednej komórce mówi się o tzw. double- i trippleexpressors, a cecha ta wiąże się z gorszym rokowaniem [5 7]. Istnieje ponadto wiele zaburzeń genetycznych znajdowanych częściej w poszczególnych podtypach DLBCL. W pierwotnym chłoniaku OUN często występuje rearanżacja Bcl-6 i del6q21-22 oraz dodatkowe fragmenty 12q, 22q i 18q21. W DLBCL leg-type stosunkowo często spotyka się translokacje z udziałem genów Myc, Bcl-2, Bcl-6 i IgH. W dość odległej etiologicznie od DLBCL jednostce, jaką jest PMBCL, występują amplifikacje 9p24, amplifikacje 2p z udziałem crel, mutacje JAK2 i translokacje CIITA. Natomiast w ALK+ DLBCL stosunkowo często występują t(2;17) (p23;q23) oraz t(2;5)(p23;p35). Aż w 50% przypadków chłoniaka plazmablastycznego występuje rearanżacja Myc w postaci t(8;14). Po zdiagnozowaniu DLBCL, a jeszcze przed podjęciem decyzji o rodzaju leczenia należy dokonać oceny stopnia zaawansowania choroby (staging) i tzw. oceny ryzyka. Rekomendowanym obecnie badaniem służącym do oceny stopnia zaawansowania DLBCL (klasyfikacja Lugano) jest badanie pozytonowej tomografii emisyjnej po 46

49 Rozdział 2 łączone z tomografią komputerową PET-CT (positron emission tomography/computed tomography), z użyciem fluorodeoksyglukozy (FDG) [8]. Rola klasycznej CT z kontrastem jest obecnie mniejsza, choć są sytuacje, w których ma ona przewagę nad obrazowaniem PET-CT. Przykładem jest możliwość dokładniejszego odgraniczenia limfadenopatii od jelita czy możliwość wykrycia ucisku lub zakrzepicy w żyłach głównych i żyłach śródpiersia. W ostatnim czasie wykazano natomiast, że ogniskowy wychwyt FDG w obrębie szpiku kostnego jest bardziej czuły w ocenie nacieczenia szpiku przez chłoniaka niż biopsja szpiku [9]. Dlatego nie zaleca się wykonywania biopsji szpiku, gdy na podstawie badania PET-CT można udowodnić zajęcie szpiku i zakwalifikować pacjenta do wyższych stadiów zaawansowania choroby. Biopsja szpiku jest jednak nadal zalecana w przypadkach PET-negatywnych, ponieważ wówczas jej wynik może zmienić rokowanie i leczenie, a istnieje możliwość niewykrycia nieznacznego (10 20%) nacieczenia szpiku za pomocą PET-CT. Jednakże wynik dodatni biopsji przy negatywnym wyniku PET-CT zdarza się w < 10% przypadków [10]. Dla porządku należy dodać, że w przypadku pierwotnego chłoniaka OUN badaniem obrazowym z wyboru jest rezonans magnetyczny (magnetic resonance MR). W przypadku DLBCL o dużym ryzyku zawsze należy pamiętać o nakłuciu lędźwiowym z pobraniem płynu mózgowo-rdzeniowego na badanie immunofenotypowe w celu oceny zajęcia płynu przez komórki chłoniaka. Każdorazowo przed rozpoczęciem leczenia z użyciem antracyklin istnieje konieczność wykonania badania echokardiograficznego w celu ustalenia możliwości leczenia tymi potencjalnie kardiotoksycznymi cytostatykami. Podstawowym narzędziem, od lat używanym do oceny stopnia zaawansowania choroby, jest klasyfikacja Ann Arbor. W obecnej wersji klasyfikacja ta od 2014 r. funkcjonuje pod nazwą klasyfikacja Lugano bądź kryteria Chesona [8]. Grupa pracująca nad nimi podczas XI i XII Międzynarodowej Konferencji ICML (International Conference on Malignant Lymphoma) w Lugano oprócz kryteriów oceny stopnia zaawansowania stworzyła również kryteria odpowiedzi na leczenie. Obie te klasyfikacje w przypadku chłoniaków awidnych, do których należy DLBCL, opierają się na wykorzystaniu PET-CT. Tabela 1. Klasyfikacja Ann Arbor Stadium I II III IV Zajęcie jednej grupy węzłów chłonnych (I) lub ograniczone zajęcie jednego narządu lub obszaru pozalimfatycznego (IE) Zajęcie dwóch lub więcej grup węzłów po tej samej stronie przepony (II) lub ograniczone zajęcie jednego narządu albo obszaru pozalimfatycznego oraz jednej lub więcej grup węzłów po tej samej stronie przepony (IIE) Zajęcie 2 grup węzłów chłonnych po obu stronach przepony Rozlane lub rozsiane zajęcie jednego lub więcej narządów pozalimfatycznych z zajęciem lub bez zajęcia węzłów chłonnych 47

50 Tomasz Chojnacki Tabela 2. Zrewidowany system oceny stadium zaawansowania DLBCL (klasyfikacja Lugano) Stadium Zajęte obszary Status pozawęzłowy (E) ograniczone I II II bulky* zaawansowane III IV jeden węzeł lub grupa przyległych węzłów dwie lub więcej grup węzłów po tej samej stronie przepony stadium II jak powyżej z chorobą bulky węzły po obu stronach przepony, węzły powyżej przepony z zajęciem śledziony dodatkowe nieprzylegające zajęcie obszaru pozalimfatycznego pojedyncze ognisko pozawęzłowe bez zajęcia węzłów stadium I lub II w obszarze węzłowym z ograniczonym przyległym obszarem pozawęzłowym nie dotyczy nie dotyczy nie dotyczy UWAGA: Obszary zajęte są określane na podstawie PET-CT dla chłoniaków awidnych i CT dla chłoniaków nieawidnych. Migdałki, pierścień Waldeyera i śledziona są traktowane jak lokalizacja węzłowa. *Sposób leczenia stadium II bulky (czy leczyć jak stadium ograniczone, czy też jak zaawansowane) zależy od histologii i liczby niekorzystnych czynników prognostycznych Do oceny ryzyka i podejmowania decyzji o rodzaju i czasie trwania terapii stosuje się także skale oceny ryzyka: Międzynarodowy Wskaźnik Rokowniczy (International Prognostic Index IPI), aaipi (age-adjusted International Prognostic Index) oraz enhanced International Prognostic Index (NCCN-IPI). Obecnie są one wykorzystywane m.in. przy podejmowaniu decyzji o autotransplantacji komórek krwiotwórczych. W przyszłości najprawdopodobniej będą przydatne przy wyborze terapii. Wydaje się, że spośród innych czynników rokowniczych największe znaczenie mają ekspresje i rearanżacje BCL2, BCL6 i MYC oraz podtyp wg klasyfikacji Cell of Origin (GCB vs ABC). Wysoki poziom ekspresji BCL2 występuje w 40 60% przypadków DLBCL. Jego niekorzystne znaczenie prognostyczne zostało osłabione w erze rytuksymabu. Wydawało się, że ekspresja BCL6 ma korzystne znaczenie rokownicze, choć najprawdopodobniej poprawa rokowania w grupie z wysoką ekspresją BCL6 wiąże się z faktem, że większość z tych przypadków należy do podtypu GCB. Niewątpliwie niekorzystnym czynnikiem rokowniczym jest zwiększona ekspresja i rearanżacja MYC, a szczególnie źle rokują przypadki double- i tripple-hit, co było analizowane w innych częściach opracowania. Najistotniejsze z punktu widzenia możliwości poprawy wyników leczenia wydaje się to, że odsetek 2-letnich przeżyć u pacjentów leczonych schematem R-CHOP (rytuksymab, cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon) w podtypie GCB różni się znacząco od odsetka 2-letnich przeżyć w podtypie ABC (74% vs 46%) [11]. 48

51 Rozdział 2 Tabela 3. Skale do oceny ryzyka i podejmowania decyzji o rodzaju i czasie trwania terapii Skala Liczba punktów Szacowane 3-letnie OS [%] Międzynarodowy Wskaźnik Rokowniczy (International Prognostic Index IPI) Czynniki ryzyka wiek > 60 lat stężenie LDH > normy stadium III IV wg A-A ECOG 2 4 zajęcie > 1 obszaru pozawęzłowego Kategorie ryzyka ryzyko niskie ryzyko pośrednie niskie ryzyko pośrednie wysokie ryzyko wysokie (89 94) 81 (73 86) 65 (58 73) 59 (49 69) Międzynarodowy Wskaźnik Rokowniczy zmodyfikowany dla wieku 60 lat (age-adjusted International Prognostic Index aaipi) Czynniki ryzyka stężenie LDH > normy stadium III IV wg A-A ECOG 2 4 Kategorie ryzyka ryzyko niskie ryzyko pośrednie niskie ryzyko pośrednie wysokie ryzyko wysokie (96 100) 92 (87 95) 75 (66 82) Enhanced International Prognostic Index (NCCN-IPI) Czynniki ryzyka wiek 40 lat lat lat > 75 lat stężenie LDH w normie 1 3 razy powyżej normy > 3-krotności normy ECOG 2 ANN ARBOR III IV choroba pozawęzłowa* Kategorie ryzyka ryzyko niskie ryzyko pośrednie niskie ryzyko pośrednie wysokie ryzyko wysokie *Zajęcie szpiku, OUN, wątroby, przewodu pokarmowego, płuc OS (overall survival) przeżycie całkowite, LDH (lactate dehydrogenase) dehydrogenaza mleczanowa, ECOG skala sprawności według Eastern Cooperative Oncology Group

52 Tomasz Chojnacki Piśmiennictwo 1. Tilly H, Gomes da Silva M, Vitolo U i wsp. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL): ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2015; 26 (Suppl. 5): v116-v Savage KJ, Johnson NA, Ben-Neriah S i wsp. MYC gene rearrangements are associated with a poor prognosis in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with R-CHOP chemotherapy. Blood 2009; 114: Barrans S, Crouch S, Smith A i wsp. Rearrangement of MYC is associated with poor prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated in the era of rituximab. J Clin Oncol 2010; 28: Lin P, Dickason TJ, Fayad LE i wsp. Prognostic value of MYC rearrangement in cases of B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between diffuse large B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma. Cancer 2012; 118: Green TM, Young KH, Visco C i wsp. Immunohistochemical double-hit score is a strong predictor of outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol 2012; 30: Johnson NA, Slack GW, Savage KJ i wsp. Concurrent expression of MYC and BCL2 in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol 2012; 30: Horn H, Ziepert M, Becher C i wsp. MYC status in concert with BCL2 and BCL6 expression predicts outcome in diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2013; 121: Cheson BD, Fisher RI, Barrington SF i wsp. Recommendations for initial evaluation, staging, and response assessment of Hodgkin and non-hodgkin lymphoma: the Lugano classification. J Clin Oncol 2014; 32: Khan AB, Barrington SF, Mikhaeel NG i wsp. PET-CT staging of DLBCL accurately identifies and provides new insight into the clinical significance of bone marrow involvement. Blood 2013; 122: Pelosi E, Penna D, Douroukas A i wsp. Bone marrow disease detection with FDGPET/CT and bone marrow biopsy during the staging of malignant lymphoma: results from a large multicenter study. QJ Nucl Med Mol Imaging 2011; 55: Nowakowski GS, LaPlant B, Macon WR. Lenalidomide combined with R-CHOP overcomes negative prognostic impact of non-germinal center B-cell fenotype in newly diagnosed diffuse large B-cell lymphoma: a phase II study. J Clin Oncol 2015; 33:

53 ROZDZIAŁ 3 LECZENIE Tomasz Chojnacki Obecny standard postępowania Na samym wstępie trzeba zaznaczyć, że obecne standardy postępowania (European Society for Medical Oncology ESMO, National Comprehensive Cancer Network NCCN) nie uzależniają rodzaju leczenia od podtypu immunohistochemicznego lub molekularnego chłoniaka. Zarówno chłoniaki typu GCB, jak i non-gcb (wg klasyfikacji histopatologicznej) oraz ABC (wg klasyfikacji molekularnej) leczone są tymi samymi podstawowymi schematami chemioterapii, choć uzależnienie rodzaju leczenia od tych czynników mogłoby wydawać się oczywiste i jest pewnie kwestią najbliższych lat. Według ESMO strategia leczenia powinna być uzależniona od wieku pacjenta, oceny ryzyka wg wskaźnika aaipi (age-adjusted International Prognostic Index) i możliwości zastosowania terapii wysokodawkowej. W przypadkach o dużej masie guza zalecany jest kilkudniowy pretreatment z użyciem doustnego prednizonu w celu zapobiegania zespołowi lizy guza (tumor lysis syndrome TLS). U pacjentów leczonych z intencją wyleczenia oraz u pacjentów > 60. roku życia jako profilaktyka gorączki neutropenicznej powinny być używane czynniki wzrostu granulocytów (granulocyte-colony stimulating factor G-CSF). Wszystkie analizowane poniżej schematy leczenia są oparte na rytuksymabie. Wprowadzenie tego przeciwciała do terapii chłoniaków stało się tak wielkim przełomem, że dziś w odniesieniu do leczenia chłoniaków z komórek B mówimy o erze przed rytuksymabem i erze rytuksymabu. Rytuksymab został zarejestrowany w 1997 r. przez FDA (Food and Drug Administration). Jest chimerycznym (mysio-ludzkim) przeciwciałem wybiórczo wiążącym się z antygenem CD20 na powierzchni limfocytów (pre-b i dojrzałych komórek B), dzięki temu oszczędzającym inne komórki. Antygen CD20 występuje w 95% przypadków chłoniaków z komórek B. 51

54 Tomasz Chojnacki Po związaniu z CD20 rytuksymab uruchamia mechanizmy śmierci komórki na drodze trzech reakcji: cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (antibody-dependent cell cytotoxicity ADCC), cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (complement-dependent cytotoxicity CDC), bezpośredniej indukcji apoptozy. Skuteczność rytuksymabu w skojarzeniu ze schematem CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon) w leczeniu chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (diffuse large B-cell lymphoma DLBCL) poddano analizie w wielu badaniach. W badaniu francuskim GELA porównano leczenie R-CHOP (rytuksymab, cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon) z CHOP u pacjentów > 60. roku życia. Dodanie rytuksymabu zwiększyło odsetek całkowitych remisji (complete remission CR) z 63% do 76%, 2-letni czas wolny od zdarzeń (event free survival EFS) z 38% do 57%, a całkowite przeżycie (overall survival OS) z 57% do 70%. Podobnych wyników dostarczyło amerykańskie badanie US Intergroup (ECOG/ CALGB), w którym odsetek 3-letniego okresu wolnego od niepowodzenia (failure free survival FFS) wyniósł 53% w grupie leczonej R-CHOP i 36% w grupie leczonej CHOP. Kolejnym sukcesem było wykazanie skuteczności w grupie młodszych pacjentów. W badaniu MInT (Mabthera International Trial) udowodniono, że u chorych < 60. roku życia z grupy niskiego ryzyka w stadiach II IV i I bulky dodanie rytuksymabu do schematu CHOP lub podobnego zwiększa EFS z 61% do 80%, a OS z 86% do 95%. Wprowadzenie rytuksymabu przyczyniło się do poprawy leczenia w obu podtypach molekularnych DLBCL, przy czym podtyp ABC nadal rokuje gorzej. Jak już wspomniano powyżej, wydaje się, że zastosowanie rytuksymabu niweluje niekorzystne znaczenie prognostyczne ekspresji BCL2 w komórkach DLBCL. W kolejnych latach udowodniono, że rytuksymab zmniejsza ryzyko zajęcia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w przebiegu DLBCL (badanie RICOVER), ma zastosowanie w leczeniu II linii w połączeniu z chemioterapią ratunkową, a jedynym ograniczeniem dla jego użycia w przypadku nawrotu jest wcześniejsza ekspozycja na rytuksymab. Ma ona jednak znaczenie tylko w przypadku wczesnego nawrotu (< 12 miesięcy). Obecnie w chłoniaku grudkowym badane jest przeciwciało anty-cd20 nowej generacji obinutuzumab, oraz wiele innych cząsteczek anty-cd20. Wyniki są zachęcające i zapewne kwestią czasu są badania nad zastosowaniem tego leku w DLBCL. Pora jednak wrócić do standardu postępowania. Młodzi pacjenci (< 60. roku życia) z niskim ryzykiem wg IPI (aaipi = 0) powinni otrzymać 6 cykli immunochemioterapii R-CHOP w odstępach 21-dniowych. Od niedawna zaznacza się, że konsolidacja przy użyciu radioterapii w przypadkach nonbulky nie przynosi dodatkowych korzyści. Nieco inne podejście do problemu radioterapii prezentują wytyczne NCCN, gdzie radioterapia na obszary pierwotnie zajęte jest jedną z opcji klinicznych po zakończeniu chemioterapii w stadiach I i II (zarówno bulky, jak i non-bulky), mogącą przynieść korzyści również u niektórych pacjentów w stadiach III i IV (radioterapia na obszar pierwotnie bulky). Ponadto jest ona zalecana po zakończeniu terapii u pacjentów z DLBCL jądra (naświetlenie krocza), stanowi również 52

55 Rozdział 3 opcję kliniczną dla pacjentów niekwalifikujących się do chemioterapii (involved-site radiation therapy ISRT). Standardem jest, aby młodzi pacjenci (< 60. roku życia) z ryzykiem pośrednim niskim (aaipi = 1) oraz niskim (aaipi = 0) z chorobą bulky otrzymali 6 kursów R-CHOP21 z następczą radioterapią na obszar pierwotnie bulky. Alternatywą jest intensyfikacja chemioterapii do R-ACVBP (rytuksymab, doksorubicyna, windezyna, cyklofosfamid, bleomycyna i prednizon) podawanej co 14 dni, ale z pominięciem radioterapii [1]. W grupie młodych pacjentów (< 60. roku życia) z wysokim i pośrednim wysokim ryzykiem (aaipi > 2) nie ma obecnie jednego standardu postępowania. Najczęściej stosuje się 6 8 cykli CHOP z 8 dawkami rytuksymabu podawanymi co 21 dni. Warto zaznaczyć, że obecnie uważa się, że stosowanie R-CHOP w odstępach 14-dniowych (R-CHOP14) nie przynosi korzyści w żadnej grupie chorych i w żadnym podtypie DLBCL [2]. Często używanymi schematami są R-ACVBP i R-CHOEP (rytuksymab, cyklofosfamid, doksorubicyna, etopozyd, prednizon), ale w tej grupie chorych nie ma badań porównujących je z R-CHOP. Wytyczne NCCN podają natomiast możliwość zastosowania schematu DA-EPOCH-R (dose-adjusted etopozyd, prednizon, winkrystyna, cyklofosfamid, doksorubicyna, rytuksymab) u pacjentów w stadium III i IV. DA-EPOCH-R polega na 96-godzinnym wlewie dożylnym etopozydu, winkrystyny i doksorubicyny oraz podaniu pojedynczej dawki cyklofosfamidu i doustnym przyjmowaniu prednizonu w taki sposób, aby zmiana dawki (do 20%) etopozydu, doksorubicyny i cyklofosfamidu w danym cyklu spowodowała nadir neutrofilów we krwi obwodowej poniżej 500/μl. Takie postępowanie przyczynia się do poprawy wyników leczenia przy porównywalnej toksyczności. Obecnie wydaje się, że jest to właściwy kierunek działań zmierzających do poprawy wyników i zminimalizowania toksyczności leczenia poprzez jego indywidualizację. Rozbieżnych wyników dostarczyły cztery badania z randomizacją porównujące efekty leczenia pacjentów otrzymujących chemioterapię wysokodawkową z następczą autotransplantacją szpiku (autologous stem cell transplant ASCT) vs immunochemioterapię (rytuksymab + chemioterapia) bez ASCT. Dlatego ASCT w tej grupie pacjentów pozostaje opcją kliniczną. Nie jest jasna rola radioterapii na obszary pierwotnie bulky u tych chorych. Nie jest również znana rola tzw. interim PET wykonywanego w trakcie leczenia. Bada się obecnie, czy interim PET może służyć do wyodrębnienia grupy pacjentów, którzy odniosą korzyści z ASCT. Standardem leczenia pacjentów w wieku lat jest podanie 6 8 cykli chemioterapii CHOP z 8 dawkami rytuksymabu w odstępach 21-dniowych. Podobnie jak w poprzednich grupach nie wykazano korzyści z intensyfikacji dawki R-CHOP14 ani z następczej radioterapii w grupie pacjentów z chorobą zlokalizowaną poza przypadkami bulky disease. Do leczenia R-CHOP pacjenci powinni być kwalifikowani z należytą ostrożnością, po kompleksowej ocenie geriatrycznej na podstawie dostępnych skal sprawności, oceny kardiologicznej i indeksu chorób współistniejących. U pacjentów w wieku > 80 lat poprawę, a niekiedy nawet całkowitą remisję może przynieść zastosowanie zredukowanych dawek immunochemioterapii, np. R-mini CHOP, zastąpienie doksorubicyny gemcytabiną, etopozydem, liposomalną doksorubicyną lub jej pominięcie (R-CVP) od początku lub w kolejnych cyklach leczenia. 53

56 Tomasz Chojnacki W ocenie efektów leczenia rekomendowane jest badanie pozytonowej tomografii emisyjnej połączone z tomografią komputerową (positron emission tomography/computed tomography PET-CT) lub CT. Na podstawie klasyfikacji Lugano każdego pacjenta należy zakwalifikować do jednej z grup: całkowita odpowiedź metaboliczna (complete molecular response CMR) dla PET-CT, całkowita odpowiedź (complete response CR) dla CT, częściowa odpowiedź (metaboliczna) (partial response PR), brak odpowiedzi metabolicznej dla PET-CT, stabilna choroba (stable disease SD) dla CT, oraz progresywna choroba (metaboliczna) (progressive disease PD). Omawianie tych kryteriów wykracza poza ramy tego opracowania, warto jednak wspomnieć w kilku zdaniach o roli interim PET. Jest to badanie PET-CT wykonywane w trakcie leczenia. Według obecnej wiedzy jego rola sprowadza się jedynie do oceny, czy nie dochodzi do progresji w trakcie leczenia. Zmiana leczenia wyłącznie na podstawie interim PET jest dopuszczalna tylko w przypadku niezbitych dowodów progresji choroby. W przypadku uzyskania PR po zakończeniu chemioterapii dalsze postępowanie wg wytycznych NCCN powinno być uzależnione od wyjściowego stadium zaawansowania choroby. Każdorazowo w takich przypadkach zalecana jest powtórna biopsja zmiany dodatniej w PET-CT przed podjęciem decyzji terapeutycznych. W przypadku stadiów I i II dopuszczalne jest zastosowanie radioterapii z większą niż zwykle dawką, tj Gy, i ponowna ocena. Drugą opcją jest wysokodawkowa chemioterapia z następczym ASCT. W przypadku stadiów III i IV pacjenci z PR traktowani są tak jak pacjenci z nawrotem choroby (patrz niżej). Po uzyskaniu całkowitej remisji pacjent powinien być monitorowany. Brak nawrotu w ciągu 2 lat od zakończenia leczenia sprawia, że pacjenci ci mają takie samo OS jak populacja ogólna. Najprościej rzecz ujmując w ponad 30% przypadków dochodzi do nawrotu. U każdego pacjenta z podejrzeniem nawrotu choroby należy go potwierdzić badaniem histopatologicznym. W tych okolicznościach jest jednak dopuszczalna biopsja aspiracyjna. Każdy pacjent z potwierdzonym nawrotem powinien być oceniony w ten sam sposób jak przy rozpoznaniu. Poza wyjściowym IPI czynnikami wpływającymi na rokowanie są rodzaj leczenia zastosowanego w pierwszej linii oraz czas, jaki upłynął od początku leczenia. W przypadku chorych w wieku < lat w dobrym stanie ogólnym, bez poważnych obciążeń powinno być zastosowane leczenie ratunkowe (salvage treatment) złożone z rytuksymabu i chemioterapii z następczą ASCT (oczywiście u pacjentów odpowiadających na leczenie). Schematy chemioterapii ratunkowej poza rytuksymabem powinny zawierać platynę. Przykłady to R-DHAP (rytuksymab, cisplatyna, cytarabina, deksametazon) i R-ICE (rytuksymab, ifosfamid, karboplatyna, etopozyd). Gisselbrecht i wsp. nie stwierdzili znaczących różnic pod względem EFS i OS pomiędzy tymi schematami po 3 cyklach [3]. Na leczenie odpowiedziało 63% pacjentów otrzymujących R-ICE i 64% pacjentów leczonych z użyciem R-DHAP, CR osiągnięto u 24% pacjentów leczonych R-ICE i u 28% pacjentów leczonych R-DHAP. Okazuje się jednak, że podobną skuteczność do R-DHAP przy mniejszej toksyczności i zachowaniu lepszej jakości życia (quality of life QoL) ma schemat R-GDP (rytuksymab, cisplatyna, gemcytabina, deksametazon) [4]. W jednym z badań uwidacznia się prze 54

57 Rozdział 3 waga R-DHAP nad pozostałymi schematami w podtypie GCB, ale to wymaga jeszcze potwierdzenia [5]. Najczęściej używaną chemioterapią wysokodawkową z następczą transplantacją komórek krwiotwórczych jest BEAM (karmustyna, etopozyd, cytarabina, melfalan). Dodatkowo można przeprowadzić radioterapię obszarów pierwotnie zajętych, dotyczy to szczególnie choroby ograniczonej. Należy jednak zaznaczyć, że skuteczność tej procedury nie była nigdy poddana żadnemu wiarygodnemu badaniu. Transplantacja alogeniczna może być rozważana u pacjentów z chorobą oporną i z wczesnym nawrotem albo nawrotem po ASCT. Pacjenci niekwalifikujący się do wysokodawkowej chemioterapii mogą być leczeni tym samymi bądź podobnymi schematami chemioterapii ratunkowej. Przykładem jest R-GEMOX (rytuksymab, gemcytabina, oksaliplatyna). Alternatywą dla badań klinicznych z użyciem nowych leków ukierunkowanych na cele molekularne w grupie pacjentów po ciężkim leczeniu jest piksantron pochodna antracyklin o zredukowanej kardiotoksyczności. To jedyny zarejestrowany w Polsce lek dla pacjentów w tej fazie choroby. Piksantron w badaniach klinicznych powodował znacząco większy odsetek odpowiedzi (w tym również remisji całkowitych) w porównaniu z innymi dostępnymi na tym etapie leczenia opcjami terapeutycznymi stosowanymi w monoterapii (CR: 24,3% vs 7,1%, ORR: 40% vs 14,3%). W przeciwieństwie do zarejestrowanych antracyklin i antracenedionów (mitoksantron) piksantron jest jedynie słabym inhibitorem topoizomerazy II, który bezpośrednio alkiluje DNA i tworzy trwałe związki addycyjne z DNA, prowadząc do przerwania podwójnej nici. Ponadto z powodu wbudowania heteroatomu azotu do pierścienia i braku grup ketonowych ma mniejszy potencjał wytwarzania reaktywnych form tlenu wiążących żelazo i tworzenia metabolitów alkoholu, które jak się uważa odpowiadają za kardiotoksyczne działanie antracyklin. Z uwagi na unikalną budowę w modelach zwierzęcych piksantron wywierał minimalny wpływ kardiotoksyczny w porównaniu z doksorubicyną i mitoksantronem. Należy zaznaczyć, że lek ten po analizie ryzyka i korzyści może również zostać zastosowany u pacjentów, którzy wyczerpali życiową dawkę antracyklin (skumulowaną dawkę doksycykliny > 450 mg/m² p.c.). Leczenie zależne od podtypu Wyniki leczenia DLBCL różnią się w dużym stopniu w zależności od podtypu immunohistochemicznego i/lub molekularnego i są znacznie gorsze w przypadku chłoniaków non-gcb [6]. Podobnie różne były wyniki leczenia w zależności od podtypu u wcześniej nieleczonych pacjentów z DLBCL po chemioterapii DA-EPOCH-R. W podtypie GCB Tabela 1. Wyniki leczenia przy użyciu R-CHOP w zależności od podtypu Podtyp Trzyletnie przeżycie wolne od progresji (%) Trzyletnie przeżycie całkowite (%) ABC 40 ok. 45 GCB 74 ok

58 Tomasz Chojnacki 5-letnie przeżycie wolne od progresji (progression free survival PFS) wyniosło 100%, a w podtypie ABC było na poziomie 67% [7]. Z obserwacji tych można wyciągnąć wniosek, że większość pacjentów z oporną lub nawrotową postacią DLBCL należy do podtypu ABC. Gdy jednak pacjent z DLBCL nie odpowiedział na pierwszą linię terapii, to rokowanie jest tak samo złe w obu grupach (ABC i GCB). Kolejnym milowym krokiem w poprawie leczenia pacjentów z DLBCL jest odrębne podejście do pacjentów z poszczególnymi podtypami. Jest to zarazem pierwsza próba personalizacji leczenia w DLBCL, której ostatecznym celem jest indywidualne podejście do każdego pacjenta. Leki hamujące aktywację szlaku NF-κB Wysunięto hipotezę, że gorsze efekty leczenia w podtypie ABC wynikają z aktywacji NF-κB, która może blokować działanie chemioterapii [8]. Dlatego zahamowanie aktywacji NF-κB, powodujące zmniejszenie oddziaływania antyapoptotycznego, może uwrażliwić komórki chłoniaka na chemioterapię i wpłynąć na poprawę efektów leczenia w podtypie ABC, nie będzie natomiast miało wpływu na leczenie w podtypie GCB. W celu zahamowania aktywacji NF-κB można zastosować wiele leków, w tym: inhibitory proteasomów, np. bortezomib, carfilzonib, inhibitory szlaku BTK-PKCβ-CARD11, np. ibrutinib, leki immunomodulujące, np. lenalidomid. 56 Bortezomib Bortezomib jest inhibitorem proteasomu. Działa poprzez zablokowanie degradacji Iκ-Bα. IκB jest bezpośrednim aktywatorem NF-κB. Wskutek zadziałania kompleksu SCF-β-TrCP ligazy ubikwityny na IκB ulega on ubikwitynacji i następczej szybkiej degradacji z udziałem proteasomu 26S. Dlatego zablokowanie proteasomu może uchronić IκB przed degradacją i co za tym idzie zapobiec aktywacji NF-κB. Bortezomib ingeruje jednak jeszcze w inne mechanizmy powiązane z przeżyciem komórki: reguluje cykl komórkowy poprzez akumulację p21/p27, moduluje działanie białek z rodziny BCL-2, zwiększa ekspresję białka p53. Dunleavy i wsp. [8] w swoim badaniu wykazali, że bortezomib stosowany w monoterapii nie ma aktywności w DLBCL (96% pacjentów nie odpowiedziało na leczenie samym tylko bortezomibem). Jeżeli bortezomib skojarzy się z chemioterapią opartą na antracyklinach (DA-EPOCH), wyniki leczenia są znacząco lepsze w porównaniu z samą chemioterapią. Odpowiedź na leczenie (overall response rate ORR) uzyskano w 83% przypadków opornych lub nawrotowych DLBCL ABC leczonych z użyciem bortezomibu i tylko w 13% przypadków opornych lub nawrotowych DLBCL GCB. Uderzający był fakt, że w 41,5% przypadków z podtypem ABC uzyskano CR, podczas gdy w grupie GCB tylko u 6,5% chorych. Ciekawie prezentują się również wyniki, gdy w poszczególnych grupach podzieli się pacjentów w zależności od metody, którą określono podtyp. I tak w grupie pacjentów zdiagnozowanych za pomocą immunohistochemii (IHC) ORR wyniósł odpowied

59 Rozdział 3 nio 17% dla podtypu GCB i 83% dla ABC. W grupie chorych, u których dla określenia podtypu wykonano badanie profilu ekspresji genów (gene expression profiling GEP), odsetek ORR wyniósł odpowiednio 20% dla GCB i 100% dla ABC. Stąd wniosek, że niezależnie od metody (IHC vs GEP) wyniki w poszczególnych podtypach są podobne. Znaczące różnice pomiędzy podtypami otrzymano również, analizując OS. Wyniosło ono 10,8 miesiąca vs 3,4 miesiąca na korzyść podtypu ABC. Również tutaj metoda określenia podtypu nie miała dużego znaczenia. Z powyższej analizy wyników badania można wyciągnąć kilka interesujących wniosków: bortezomib nie działa w monoterapii niezależnie od podtypu DLBCL. Możliwe są dwa wyjaśnienia: komórki DLBCL ABC otrzymują dodatkowe sygnały antyapoptotyczne z mikrośrodowiska, które nie są zależne od inhibicji proteasomów, siła zahamowania proteasomów nie była wystarczająca do zahamowania szlaku NF-κB w odpowiednim stopniu; bortezomib działa synergistycznie z chemioterapią u pacjentów z DLBCL ABC, co sprawia, że NF-κB staje się potencjalnym celem terapeutycznym dla nowych leków ukierunkowanych na cele molekularne. Kolejne badania zmierzają do wykazania przewagi bortezomibu dodanego do chemioterapii nad samą chemioterapią u nieleczonych wcześniej pacjentów z podtypem ABC. Niestety dostarczają one niezbyt satysfakcjonujących wyników. W badaniu Offnera i wsp. [9] porównano standardową chemioterapię R-CHOP z VR-CAP (bortezomib, rytuksymab, cyklofosfamid, doksorubicyna, prednizon). Zrezygnowano z łączenia bortezomibu z winkrystyną z uwagi na możliwą dużą neurotoksyczność takiego schematu. Pacjenci otrzymali 6 cykli leczenia z bortezomibem lub winkrystyną. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy obiema grupami w zakresie częstości CR, ORR, PFS i OS. Schemat z bortezomibem okazał się natomiast bardziej toksyczny większa liczba neuropatii (6% vs 3%). Wydaje się, że rezygnacja z winkrystyny w zamian za bortezomib nie jest dobrym rozwiązaniem i konieczne są dalsze badania nad rolą bortezomibu w leczeniu DLBCL non-gc. Ibrutinib Ibrutinib jest doustnym lekiem, który selektywnie i nieodwracalnie blokuje kinazę Brutona (BTK) poprzez kowalencyjne wiązanie z cysteiną-481. Od 2013 r. jest zarejestrowany do leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej i chłoniaka z komórek płaszcza, gdzie ma status leku przełomowego. W tych chorobach działa w monoterapii. W doświadczeniach wykazano, że zablokowanie BTK jest toksyczne dla komórek DLBCL ABC, lecz nie dla tych, które mają zmutowane CARD11 [10]. W jednym z pierwszych badań nad zastosowaniem ibrutinibu u chorych z nawrotowym lub opornym DLBCL niezależnie od podtypu molekularnego ustalono, że na ibrutinib odpowiada do 40% pacjentów z podtypem ABC i tylko jeden na dwudziestu chorych z podtypem GCB, co potwierdziło jego selektywność do podtypu ABC [11]. Analiza mutacji wykazała, że ibrutinib nie wymaga do działania obecności mutacji CD79B. Odpowiedzi wywoływał również u pacjentów z niezmutowanym CD79B. 57

60 Tomasz Chojnacki Nie odpowiadali natomiast na leczenie pacjenci z niezmutowanym CD79B i z mutacją MYD88, podczas gdy chorzy z obecnością obu tych mutacji, tj. CD79B i MYD88, odpowiadali na ten lek. Sugeruje to istnienie dodatkowych alternatywnych dróg aktywacji. Badania przedkliniczne wskazują, że aktywność przeciwnowotworowa ibrutinibu jest zależna nie tylko od hamowania szlaku BCR-BTK-PKCβ-CARD11. Inhibicja BTK skutkuje również hamowaniem sygnału z receptora Toll-like (Toll-like receptor TLR), a co za tym idzie hamowaniem wielu szlaków komórkowych, w tym istotnego dla limfoproliferacji szlaku MYD88, a w konsekwencji NF-κB [12]. Pokazuje to, że aktywacja NF-κB w DLBCL ABC jest związana nie tylko z sygnałem z BCR, lecz także z przewlekle aktywnym sygnałem z TLR. Ponadto ibrutinib, blokując BTK za pośrednictwem CXCL-12 i CXCL-13, hamuje fosforylację PLC-γ, ERK1, ERK2, JNK i AKT. Hamuje także indukowaną przez ligand 19 chemokiny CC (CCL19) adhezję i migrację. Bezpośrednim tego efektem jest limfocytoza po podaniu ibrutinibu obserwowana w nowotworach układu chłonnego w ciągu pierwszych tygodni leczenia. W wielu przypadkach przeciwnowotworowe działanie ibrutinibu wynika więc z hamowania wielu szlaków w komórkach B oraz odpowiedzi na stymulację z mikrośrodowiska. Dodatkowo ibrutinib poprzez hamowanie IRF-4 działa synergistycznie z lenalidomidem, co zostanie opisane w dalszej części rozdziału. Obecnie toczy się badanie porównujące skuteczność ibrutinibu z R-CHOP vs R-CHOP u nowo zdiagnozowanych pacjentów z DLBCL non-gcb [13]. Trwa rekrutacja i nie ma jeszcze żadnych wyników. 58 Lenalidomid Lenalidomid jest doustnym lekiem immunomodulującym, który wywiera efekt przeciwnowotworowy za pośrednictwem wielu mechanizmów. Niektóre z nich to: zahamowanie angiogenezy, rekrutacja komórek NK, zwiększenie ekspresji CD80 i CD40, upośledzenie produkcji cytokin zapalnych oraz oddziaływanie na mikrośrodowisko guza czy nasilenie przeciwnowotworowego działania rytuksymabu. Poprzez zablokowanie czynnika transkrypcyjnego IRF-4 (interferon regulatory factor 4) prowadzi do wzrostu poziomu IFN-β, hamując jednocześnie zależną od BCR aktywację NF-κB, przez co doprowadza do śmierci komórki chłoniaka ABC. Aby lenalidomid mógł zadziałać, konieczna jest ekspresja białka cereblon koreceptora kompleksu ligazy ubikwitynowej E3, bezpośredniego celu molekularnego lenalidomidu. Z uwagi na centralne położenie na skrzyżowaniu wielu szlaków komórkowych odpowiedzialnych za działanie pro- lub antyapoptotyczne oraz nadekspresję, jakiej ulega w wielu chorobach limfoproliferacyjnych, IRF-4 jest potencjalnym znakomitym celem terapeutycznym. Podanie lenalidomidu w ciągu 3 dni doprowadza do znacznego spadku ekspresji IRF-4 w komórkach wrażliwych na lenalidomid i wydaje się, że jest podstawowym mechanizmem odpowiedzialnym za jego aktywność w komórkach DLBCL [14]. Jednak lenalidomid tylko częściowo hamuje ekspresję IRF-4. Możliwe, że inhibicja będzie większa w połączeniu z blokerami szlaku NF-κB, gdyż zmniejszy zależną od NF-κB ekspresję IRF-4 (o czym poniżej). Za pośrednictwem białka cereblon następuje jeszcze jedno interesujące zjawisko, jakim jest aktywacja limfocytów T. Za pośrednictwem lenalidomidu dochodzi do inter

61 Rozdział 3 CRL4 CRBN A/1 A/1 Len/Pom CRBN CRL4 CRBN CRBN Roc1 DDB1 Roc1 DDB1 Cul4 Cul4 Len/Pom A/1 A/1 promotor IL-2 A/1 A/1 promotor IL-2 Aiolos i Ikaros hamują ekspresję IL-2 Lenalidomid promuje degradację Aiolos i Ikaros, prowadząc do wzrostu ekspresji IL-2 Rycina 1. Model obrazujący wpływ lenalidomidu na stymulację komórek T za pośrednictwem cereblonu, Ikaros i Aiolos oraz IL-2 [za: Gandhi A, Kang J, Havens CG i wsp. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T-cell repressors Ikaros and Aiolos bia modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL CRBN. Br J Haematol 2014; 164: ] akcji pomiędzy czynnikami transkrypcyjnymi Ikaros i Aiolos a CRL CRBN (E3 ubiquitin ligase complex). Połączenie to powoduje odblokowanie ekspresji interleukiny 2 (IL-2), gdyż w normalnych warunkach Ikaros i Aiolos są transkrypcyjnymi represorami IL-2. Interleukina 2 jest natomiast odpowiedzialna za aktywację limfocytów T. Co istotne, Aiolos może w przyszłości posłużyć za marker aktywności lenalidomidu (i pomalidomidu), gdyż pod wpływem leku dochodzi do degradacji Aiolos w limfocytach T. Lenalidomid w monoterapii odznacza się dużą aktywnością w podtypie ABC, podczas gdy w podtypie GCB jego aktywność jest znikoma (ORR 52,9% vs 8,7%) [15]. Rewelacyjne wyniki przyniosło badanie Grzegorza Nowakowskiego z Mayo Clinic, w którym porównano skuteczność R-CHOP z R2CHOP (lenalidomid, rytuksymab, cyklofosfamid, winkrystyna, doksorubicyna, prednizon) u nieleczonych wcześ niej chorych z DLBCL [16]. Lenalidomid był podawany w dawce 25 mg dziennie przez pierwsze 10 dni każdego z sześciu cykli leczenia. W grupie pacjentów leczonych R-CHOP, jak można się było spodziewać, obserwowano znaczące różnice w 24-miesięcznym PFS i OS pomiędzy podtypami DLBCL PFS wyniosło 28% w non-gcb vs 64% w GCB, a OS 24% vs 78% oczywiście na korzyść GCB. Okazało się, że różnice te całkowicie zacierają się w grupie leczonej R2CHOP: 24-miesięczny PFS wyniósł 60% w podtypie non-gcb i 59% w GCB, a OS 83% vs 75% na korzyść non-gcb. Przy tym schemat R2CHOP nie wykazuje znacząco większej toksyczności w porównaniu z R-CHOP. 59

62 Tomasz Chojnacki Przede wszystkim nie wykazano zwiększonej liczby neuropatii w grupie lenalidomidu. Wydaje się, że kwas acetylosalicylowy jest wystarczającą formą profilaktyki z uwagi na zwiększone ryzyko zakrzepicy w grupie lenalidomidu. Zakrzepica żył głębokich wystąpiła tylko u jednego pacjenta (1,6%), przy czym podawanie lenalidomidu zostało wznowione po otrzymaniu przez pacjenta odpowiedniej antykoagulacji i nie obserwowano u tego chorego dalszych problemów. Tylko w 6% cykli nie podano lenalidomidu, a w następnych 7% dawka była zredukowana. Obecnie to właśnie lenalidomid jest najpoważniejszym kandydatem do stania się standardem w leczeniu I linii podtypu non-gcb DLBCL. Inne leki blokujące sygnał z receptora B-komórkowego Ostatnie lata przyniosły rozwój badań nad wieloma cząsteczkami, z których liczne są w trakcie prób klinicznych. Należą do nich: inhibitory PI3K, mtor, AKT, MEK (mitogen-activated protein kinase kinase 7 MAP2K7), PKCβ, MALT1, JAK-STAT, CD79B, SYK oraz inhibitory kinaz z rodziny SRC. 60 Inhibitory PI3K Szlak PI3K-AKT-mTOR kontroluje m.in. proliferację, migrację i metabolizm komórki, o czym pisano obszernie w rozdziale dotyczącym genetyki DLBCL. Jego zahamowanie powoduje indukcję apoptozy w części linii komórkowych DLBCL. Pierwszym przedstawicielem tej grupy zarejestrowanym do leczenia chłoniaków indolentnych w 2014 r. jest idelalisib. Jest on selektywnym inhibitorem izoformy p110 delta kinazy fosfatydyloinozytolu. Izoforma ta dominuje we wszystkich leukocytach. Wiadomo, że idelalisib nie jest skuteczny w monoterapii DLBCL [17]. Trwają badania II fazy nad zastosowaniem idelalisibu w DLBCL (również w połączeniu z inhibitorem SYK GS-9973). Wydaje się, że inhibitory PI3K będą skuteczniejsze w podtypie GCB. Badania na liniach komórkowych wykazały, że na terapię inhibitorem PI3K hamującym wszystkie jego izoformy (LY294002) odpowiadają przede wszystkim komórki z utratą ekspresji PTEN. Utrata ekspresji PTEN, jak wiadomo, dotyczy aż 55% przypadków w podtypie GCB i tylko 14% DLBCL non-gcb. Inne cząsteczki o aktywności inhibitora PI3K to duvelisib, copanlisib, TGR-1202 i INCB Inhibitory mtor Rapamycyna, odkryta w 1975 r., i jej analogi, tj. ewerolimus i temsirolimus, są inhibitorami kompleksu mtor. Temsirolimus jest zarejestrowany w leczeniu chłoniaka z komórek płaszcza, a ewerolimus, selektywny inhibitor mtorc1, jest dopuszczony do leczenia DLBCL. Wiadomo jednak, że ewerolimus nie indukuje apoptozy w monoterapii [18]. Ponadto częsta jest oporność na ten lek, prawdopodobnie w wyniku aktywacji AKT poprzez mtorc2. W fazie badań znajdują się cząsteczki blokujące oba kompleksy mtorc1 i mtorc2. Należy do nich m.in. cząsteczka o symbolu AZD2014 [19]. Istnieją doniesienia, że inhibitory mtor uwrażliwiają komórki chłoniaka na działanie rytuksymabu. Inhibitory mtor przejawiają umiarko

63 Rozdział 3 waną aktywność w agresywnych chłoniakach (25 30% odpowiedzi na leczenie). Nie ma jednak żadnych danych pozwalających określić, którzy pacjenci mogą osiągnąć korzyści z leczenia tymi cząsteczkami. Inhibitory AKT Skuteczność w przełamywaniu oporności na inhibitory mtor na liniach komórkowych wykazano w przypadku kilku cząsteczek blokujących kinazę AKT, m.in. MK Trwa obecnie badanie wczesnej fazy testujące te leki w monoterapii we wszystkich podtypach w nawracającym DLBCL [20, 21]. Inhibitory PKCβ Enzastauryna jest obiecującym doustnym inhibitorem PKCβ znajdującym się w fazie prób klinicznych. W badaniu II fazy lek ten testowano u 55 pacjentów z nawrotowym lub opornym DLBCL [22]. Podawana raz dziennie enzastauryna spowodowała zahamowanie progresji choroby u 22% chorych. W kolejnym badaniu II fazy, do którego zakwalifikowano 100 pacjentów z DLBCL wysokiego lub pośredniego ryzyka, porównano skuteczność R-CHOP z enzastauryną vs R-CHOP [23]. W grupie leczonej R-CHOP z enzastauryną uzyskano 71% 1-rocznego PFS, natomiast w grupie otrzymującej tylko R-CHOP odsetek ten wyniósł 52%. W badaniu nie określono podtypu DLBCL, w którym leczenie to przyniosło największe korzyści. Kolejną cząsteczką nacelowaną na PKCβ jest sotrastauryna. Skuteczność tego leku wykazano w podtypie ABC na modelach mysich. Co więcej, udało się ustalić, które mutacje na szlaku z BCR wpływają na wyniki leczenia [24] mutacje CD79B korelują z wrażliwością na sotrastaurynę, podczas gdy mutacje CARD11 wiążą się z opornością na ten lek. Obecnie sotrastauryna jest testowana w badaniu I fazy w opornym lub nawrotowym DLBCL z mutacją CD79A i CD79B [25]. Inhibitory MALT1 Leki będące inhibitorami MALT1 były testowane na liniach komórkowych DLBCL i na modelach mysich. Blokują one nieodwracalnie aktywność proteolityczną MALT1 [26]. Zdolność blokowania aktywności proteolitycznej MALT1 ma m.in. fenotiazyna. Leki te badane są również w połączeniu z inhibitorami BTK, aby wzmocnić ich działanie i przełamać oporność [27]. Inhibitory JAK-STAT Kinazy z rodziny JAK za pośrednictwem cytokin aktywują białka STAT, które są czynnikami transkrypcyjnymi i po aktywacji przechodzą do jądra komórkowego, gdzie regulują zdarzenia związane z proliferacją i przeżyciem komórki. Zwiększona aktywność JAK-STAT3 może być związana z mutacjami aktywującymi MYD88 za pośrednictwem pętli sprzężenia zwrotnego z udziałem IL-6, IL-10 i IFN-β. Aktywacja STAT3 jest wyraźnie wyższa w DLBCL ABC. Wyłączenie tej aktywności w modelach zwierzęcych skutkowało zahamowaniem wzrostu chłoniaka. 61

64 Tomasz Chojnacki Białko STAT3 jest pozbawione wewnętrznej aktywności enzymatycznej, w związku z tym jego bezpośrednie zablokowanie jest dużym wyzwaniem. Inhibitorem kinaz z rodziny JAK, znanym z zastosowania w zwłóknieniu szpiku, jest ruksolitinib. Jest on inhibitorem JAK-1 i JAK-2. Obecnie trwa badanie II fazy nad zastosowaniem ruksolitinibu w opornym lub nawrotowym DLBCL. Drugą badaną małą cząsteczką jest pankritinib (SB1518). Jest on inhibitorem JAK-2 i wykazuje aktywność in vitro w JAK-2-zależnych chłoniakowych liniach komórkowych bez względu na obecność czy brak mutacji JAK-2. W badaniu I fazy pankritinib wykazał się korzystnym profilem toksyczności [28]. 62 Inhibitory SYK Inhibitory kinazy SYK to obecnie liczna grupa leków, której pierwszym przedstawicielem jest fosfamatinib. W badaniach I i II fazy na leczenie fosfamatinibem odpowiedziało 22% pacjentów z DLBCL [29]. Dalszy rozwój fosfamatinibu został niespodziewanie zahamowany przez jego działania niepożądane (nieżyty żołądkowo-jelitowe, neutropenie i nadciśnienie tętnicze) zmuszające do znacznego ograniczenia dawki. Obecnie najbardziej zaawansowane są badania nad nowszym inhibitorem SYK entospletinibem (GS-9973). Do wieloośrodkowego, trwającego badania II fazy włączono pacjentów z nawracającą lub oporną przewlekłą białaczką limfocytową (chronic lymphocytic leukemia CLL, 41 pacjentów) i nawracającymi lub opornymi chłoniakami nieziarniczymi (non-hodgkin lymphoma NHL, 145 pacjentów) [30]. Uczestnicy badania otrzymują entospletinib w dawce 800 mg dwa razy dziennie. Do tej pory ogłoszono wyniki dla grupy CLL oraz dane o bezpieczeństwie dla obu grup. Dla pacjentów z CLL średni PFS wyniósł 13,8 miesiąca, a ORR 61%, jeśli wliczyć 3 pacjentów, którzy osiągnęli redukcję masy guza przy utrzymującej się leukocytozie. Poważne działania niepożądane (serious adverse events SAEs) dotyczyły 29% pacjentów. Pozostaje oczekiwać na wyniki drugiej kohorty. Inhibitory CD79B Polatuzumab vedotin to koniugat przeciwciała monoklonalnego (anty-cd79b) i monometylu auristatyny E (MMAE). Auristatyna ma mechanizm działania podobny do winkrystyny. Opublikowane w kwietniu 2015 r. wyniki badania I fazy w nawracających lub opornych CLL i NHL wykazały, że lek ma akceptowalny profil bezpieczeństwa [31]. Głównym działaniem niepożądanym pojawiającym się przy rekomendowanej dawce 2,4 mg/kg m.c. jest obwodowa neuropatia zależna od dawki kumulacyjnej, związana z blokowaniem mikrotubuli przez auristatynę. Odnotowano wysoką aktywność leku w chłoniakach B-komórkowych, co ma tym bardziej doniosłe znaczenie, że do badania zostali włączeni chorzy po wielu liniach leczenia. Obecnie trwa badanie sprawdzające efekty zastąpienia winkrystyny w schemacie R-CHOP przez polatuzumab u pacjentów z nowo zdiagnozowanym DLBCL [32]. Polatuzumab badano w próbach przedklinicznych i wczesnych próbach klinicznych w poszczególnych podtypach DLBCL. Okazało się, że jest toksyczny dla komórek w zdecydowanej większości linii komórkowych zarówno ABC, jak i GCB. Do tego niezależnie od obecności czy braku mutacji CD79B [33].

65 Leki ingerujące w mechanizmy epigenetyczne Rozdział 3 Deregulowane mechanizmy epigenetyczne stanowią ważny cel terapeutyczny, z którym w ostatnich latach wiązane są wielkie nadzieje. Celowana interwencja może dotyczyć: 1) pojedynczych deregulowanych enzymów, np. EZH2, 2) acetylacji chromatyny, 3) metylacji DNA. Inhibitory EZH2 Podtyp GCB DLBCL charakteryzuje się lepszym rokowaniem od podtypu ABC. Zdarzają się jednak nawroty. Mutacja EZH2, o której obszernie pisano w rozdziale o genetyce DLBCL, zdarza się w 22% DLBCL GCB i praktycznie nie występuje w podtypie ABC [34]. Obecnie uważa się, że jest to jedna z mutacji napędzających (tzw. driven mutations) DLBCL GCB. EZH2 odgrywa główną rolę regulatorową w komórkach DLBCL poprzez promowanie nowotworzenia wskutek wyciszenia kluczowych genów antyproliferacyjnych i supresorowych regulujących cykl komórkowy (np. CDKN1A) oraz genów napędzających końcowe różnicowanie komórek centrów rozmnażania (np. IRF4 i PRDM1). Ekspresja zmutowanego EZH2 w komórkach centrów rozmnażania prowadzi do hiperplazji tych ośrodków i prawdopodobnie w kooperacji z Bcl-2 do przyspieszenia nowotworzenia. Leki selektywnie blokujące EZH2 prowadzą do zahamowania proliferacji, zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy komórek chłoniaka. W trakcie wczesnych prób klinicznych we wszystkich podtypach DLCBL znajduje się doustny inhibitor metylotransferazy histonowej EZH2. Odkryciem ostatnich miesięcy jest to, że inhibitor EZH2 wykazuje aktywność w przypadkach o niezmutowanym genie EZH2. Mutacja EZH2 nie może więc być biomarkerem skuteczności inhibitorów EZH2. Inhibitory deacetylaz histonowych Inhibitory deacetylaz histonowych zostały zarejestrowane w leczeniu chłoniaków T-komórkowych. Do grupy tej należą następujące cząsteczki: romidepsin, panobinostat, belinostat, worinostat i mocetinostat. Obecnie trwają badania nad zastosowaniem tej grupy leków w chłoniakach B-komórkowych. W badaniu przeprowadzonym u starszych chorych z opornym lub nawrotowym DLBCL niekwalifikujących się do ASCT oceniano worinostat w połączeniu z rytuksymabem, cyklofosfamidem, etopozydem i prednizonem [35]. Worinostat zastąpił w tym schemacie toksyczną prokarbazynę. Średnia wieku pacjentów wynosiła 76 lat, włączono 30 chorych. Maksymalna tolerowana dawka worinostatu to 300 mg. Z 23 pacjentów otrzymujących tę dawkę 2 zakończyło leczenie z powodu toksyczności, 1 wycofał zgodę, 8 osiągnęło całkowitą remisję (35%), 5 osiągnęło remisję częściową (22%), a u 7 nastąpiła progresja choroby (30%). Średnie OS wyniosło 17,5 miesiąca, średni PFS 9,2 miesiąca. Pacjenci, którzy ukończyli terapię (6 cykli), raportowali poprawę QoL. Wyniki te były porównywalne z tymi z 1990 r., gdy badano schemat CEPP (cyklofosfamid, etopozyd, prednizon, prokarbazyna) z bleomycyną lub bez niej [36]. Trudno określić, jakie korzyści odnieśli pacjenci w tym badaniu z dodania worinostatu. Konieczne są dalsze badania nad zastosowaniem tej grupy leków w DLBCL. 63

66 Tomasz Chojnacki 64 Inhibitory bromodomen Bromodomeny to białka stanowiące pomost pomiędzy modyfikacjami epigenetycznymi i funkcjonowaniem aparatu transkrypcyjnego. Bromodomeny odczytują kod wynikający z modyfikacji DNA i białek histonowych w wyniku działania mechanizmów epigenetycznych i rekrutują białka odpowiedzialne za transkrypcję. Z punktu widzenia terapii celowanej na szczególną uwagę zasługuje rodzina białek BET (bromodomain and extra-terminal domain). Do rodziny tej należą białka BRD2, BRD3 i BRD4. Efektem działania tych białek jest aktywacja polimerazy RNA II. Białka BET wiążą się z regionami DNA zwanymi superenhancerami, które pełnią szczególnie ważną funkcję w komórce ukierunkowują jej różnicowanie i przekształcanie. Regiony te odpowiadają również za ekspresję onkogenów, takich jak MYC i BCL-6. Zahamowanie wiązania BRD4 do chromatyny jądrowej wywołuje efekt cytotoksyczny m.in. poprzez zahamowanie ekspresji onkogenów. Inhibitory BRD4 (JQ1, OTX015, GSK525762, CPI-0610) działają w DLBCL niezależnie od podtypu. Białkami regulowanymi przez superenhancery w DLBCL są m.in. liczne onkogeny, w tym: BCL-6, IRF-8, MYC i PAX-5, oraz łańcuchy ciężkie immunoglobulin, do których przyłączają się onkogeny. Dzięki uniwersalnemu, obecnemu we wszystkich limfoproliferacjach mechanizmowi działania inhibitory bromodomen są aktywne także w szpiczaku plazmocytowym, chłoniaku Burkitta, przewlekłej białaczce limfocytowej i ostrej białaczce limfoblastycznej. Toczy się obecnie wiele badań I i II fazy oceniających rolę tych leków w limfoproliferacjach. Ostatnie badania pokazują, że inhibitory BRD4 mogą działać synergistycznie z inhibitorami EZH2 i inhibitorami HDAC [37]. Inhibitory BCL-2 Rodzina białek BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma 2) jest kluczowym regulatorem procesu apoptozy. Składają się na nią białka zarówno proapoptotyczne, jak i promujące przeżycie, a przesunięcie balansu w stronę tych ostatnich pozwala wytłumaczyć, dlaczego komórki nowotworowe są w stanie uniknąć apoptozy. Nadekspresja BCL-2 dotyczy ok. 80% limfoproliferacji i powoduje oporność na wiele nowych leków. W celu przezwyciężenia oporności i poprawy wyników leczenia, należy pomyśleć o zahamowaniu BCL-2. Jest to białko uczestniczące w patogenezie wielu schorzeń limfoproliferacyjnych: t(14;18) jest rearanżacją definiującą chłoniaka grudkowego (follicular lymphoma FL), ale zdarzającą się również w 30% DLBCL (przede wszystkim GCB), amplifikacje regionu 18q21 są częste w chłoniaku z komórek płaszcza (mantle cell lymphoma MCL) i DLBCL ABC i negatywnie korelują z OS, nadekspresje BCL-2 spotykane w ostrych i przewlekłych białaczkach, gdzie są skutkiem braku micro-rnas mir-15a oraz mir-16-1, które negatywnie regulują ekspresję BCL-2, nadekspresje BCL-2 zdarzają się również w chłoniakach B-komórkowych i ich wystąpienie związane jest z gorszym rokowaniem. Potencjał terapeutyczny BCL-2 został odkryty wraz ze zsyntetyzowaniem cząsteczki o nazwie navitoclax (ABT-263), która jest selektywnym inhibitorem BCL-2 i BCL-2-like (BCL-XL) mimetykiem BH3. Molekuła ta wykazywała skuteczność w BCL-2-zależnych

67 Rozdział 3 nowotworach, jednakże znacznym ograniczeniem jej zastosowania była małopłytkowość związana z hamowaniem BCL-XL. Jej następcą jest cząsteczka o nazwie ABT-199, będąca doustnym selektywnym inhibitorem BCL-2, która jest pozbawiona działania obniżającego poziom płytek krwi. Obecnie trwają również badania nad nową cząsteczką o nazwie ABT-737. Najbardziej zaawansowane są badania III fazy nad inhibitorami BCL-2 w przewlekłej białaczce limfocytowej. W badaniu I fazy, do którego włączono pacjentów z różnymi limfoproliferacjami, ORR wyniósł 48% [38]. Na leczenie odpowiedziało 9/12 pacjentów z MCL, 3/11 z FL, 3/9 z DLBCL, 3/4 z makroglobulinemią Waldenströma, 1/2 z chłoniakiem strefy brzeżnej, 0/1 z PMBCL i 0/1 ze szpiczakiem plazmocytowym. Należy zaznaczyć, że wszystkie odpowiedzi w DLBCL i FL były obserwowane przy wyższych dawkach leku, tj. 600 mg (3/8 DLBCL 38%, 3/6 FL 50%). Te zachęcające wyniki spowodowały, że ABT-199 jest obecnie testowane w wielu badaniach w nawrotowych lub opornych chłoniakach. W jednym z nich, przedstawionym na ASH w 2014 r., ABT-199 badano w połączeniu z bendamustyną i rytuksymabem [39]. Żaden pacjent nie przerwał leczenia z powodu toksyczności chemioterapii, 11 pacjentów (42%) ukończyło leczenie 6 cykli. Do najczęstszych działań niepożądanych należały: nudności (65,4%), niedokrwistość i leukopenia (42,3%), biegunka (38,5%), małopłytkowość (34,6%), hipertriglicerydemia (30,8%), wymioty (26,9%) oraz hipokaliemia (26,9%). Gorączka neutropeniczna wystąpiła u 11,5% chorych. Nie obserwowano interakcji pomiędzy ABT-199 a bendamustyną. Trwa analiza interakcji pomiędzy ABT-199 a rytuksymabem. Pięciu pacjentów (19,2%) osiągnęło CR, a 11 (42,3%) PR, ORR wyniosło 61,5% dla wszystkich chłoniaków i 37,5% (3/8) w grupie DLBCL. Obecnie planowane jest badanie II fazy nad ABT-199 w kombinacji z bendamustyną i rytuksymabem. Ma ono jednak dotyczyć chłoniaka grudkowego. Toczy się również badanie nad ABT-199 w połączeniu z CHOP i rytuksymabem lub obinutuzumabem [40]. Wykazano, że ABT-199 działa synergistycznie z wieloma lekami ukierunkowanymi na cele molekularne, o czym można przeczytać poniżej. Danych na temat działania leku w DLBCL jest jednak stanowczo zbyt mało, aby można było wyciągnąć z nich wnioski dotyczące jego skuteczności w tej chorobie. Nie ma mowy, aby wnioskować, którzy pacjenci (ABC czy GCB) osiągną największe korzyści. Nie ma również możliwości określenia, czy pacjenci ze zmutowanym BCL-2 mają lepsze wyniki leczenia od chorych z niezmutowanym genem. Z ABT-199 wiązane są jednak wielkie nadzieje, przede wszystkim na przełamanie oporności chłoniaka na inne nowe leki. Stąd badania nad synergizmem ABT-199 i innych leków stosowanych w leczeniu DLBCL, o czym więcej można przeczytać w podrozdziale poświęconym interakcjom lekowym. Inhibitory kinaz PIM Rodzina kinaz PIM (proviral insertion in murine) składa się z trzech izoform: Pim-1, Pim-2 i Pim-3. W komórkach hematopoetycznych występują izoformy 1 i 2, podczas gdy ekspresja Pim-3 jest wysoka w mózgu i nerkach. Odgrywają one istotną rolę w regulacji proliferacji, przeżycia i migracji komórek. Są one efektorem takich onkogenów, 65

68 Tomasz Chojnacki jak: ABL, JAK2 i FLT3. Chronią przed apoptozą poprzez fosforylację białek proapoptotycznych, takich jak białko Bad (z rodziny BCL-2), Mdm2 (ligaza ubikwitynowa odpowiedzialna za degradację p53) oraz poprzez podtrzymywanie aktywacji NF-κB (ochrona RelA/p65 przed degradacją). Inhibicja Pim-1 skutkuje indukcją apoptozy. Ponadto kinazy Pim fosforylują inhibitory CDK (cyclin-dependent kinase) p21 i p27, wpływając na proliferację i przeżycie komórek. Poprzez fosforylację SOCS-1, regulatora szlaku JAK/ STAT, odgrywają rolę w powstawaniu nowotworu. Do wpływu na cykl komórkowy za pośrednictwem STAT3 potrzebna jest (oprócz Pim) ekspresja c-myc. Kinazy Pim fosforylują również białka histonowe, odgrywając rolę m.in. w produkcji BRD4. Niezależnie od szlaku PI3K/AKT/mTOR fosforylują represory transkrypcji, takie jak 4EBP1. Nadekspresja Pim jest obserwowana w wielu nowotworach hematologicznych: w ostrej białaczce szpikowej (acute myeloid leukemia AML), szpiczaku plazmocytowym (multiple myeloma MM) i w chłoniakach. Nadekspresja tych kinaz występuje prawie w połowie przypadków DLBCL, częściej w podtypie ABC. Powstało wiele cząsteczek będących inhibitorami Pim. Niektóre z nich, np. LGB321, AZD1208, AZD1897, są testowane w badaniach klinicznych. LGB321 wykazuje największą aktywność w szpiczaku i właśnie w tej chorobie jest testowany, podczas gdy AZD1897 jest badany u chorych na AML, podobnie jak AZD1208. Na uwagę zasługuje również SEL24-B58, który hamuje wszystkie trzy kinazy już w niewielkim stężeniu. Poprzez zmniejszenie ekspresji MCL-1 wykazuje synergizm z inhibitorami BCL-2. Działa również synergistycznie z inhibitorem JAK1/2 (Cyt387) w ostrej białaczce limfoblastycznej. Na wyniki tych badań trzeba jednak poczekać. Na razie nie znaleziono żadnego biomarkera, który pozwoliłby zidentyfikować pacjentów lepiej odpowiadających na to leczenie. Nie wiadomo również, czy leki te powinny być stosowane w monoterapii czy w kombinacjach. Badania przedkliniczne pokazują, że działają w monoterapii, ale lepsze efekty daje ich zestawienie z innymi molekułami, np. z inhibitorami PI3K/AKT/mTOR. Inhibitory XPO-1 Eksportyna 1 (XPO-1), znana również jako CMR-1 (chromosome maintenance protein 1), jest członkiem rodziny karioferyn β. Karioferyny odpowiadają za transport białek i RNA przez kompleksy porów jądrowych. W ten sposób regulują wzrost i różnicowanie komórki. Eksportyna 1 często ulega nadekspresji w wielu nowotworach hematologicznych i niehematologicznych. Grupa leków hamujących transport przezbłonowy zależny od XPO-1 nazywa się SINE (selective inhibitors of nuclear export). Są to małe cząsteczki o budowie opartej na leptomycynie B (LMB). Przyłączają się one nieodwracalnie do Cys528 miejsca wiążącego ładunek i blokują interakcję pomiędzy XPO-1 i ładunkiem. Badania przedkliniczne i kliniczne pokazały, że inhibitory XPO-1, takie jak KPT-251, KPT-276 i KPT-330 (selineksor), wykazują silną aktywność przeciwnowotworową w: AML, T-komórkowej ostrej białaczce limfoblastycznej (acute lymphoblastic leukemia ALL), MCL, CLL, prawdopodobnie w wyniku zmiany komórkowej lokalizacji p53, IκBα i/lub FoxO3a. Trwa obecnie badanie kliniczne oceniające skuteczność selineksoru w CLL i chłoniakach agresywnych [41]. 66

69 Nowe przeciwciała i koniugaty lek przeciwciało skierowane przeciwko antygenom na powierzchni komórki Rozdział 3 Po olbrzymim sukcesie rytuksymabu w ślad za nim rozwijane są inne przeciwciała przeciwko receptorom powierzchniowym. Wiele z nich jest w fazie badań klinicznych u pacjentów z chłoniakami. Obinutuzumab Obinutuzumab to obiecujące przeciwciało anty-cd20 typu 2 stworzone za pomocą glikoinżynierii. Przeciwciała typu 2 cechują się większym powinowactwem do CD20 oraz nieco odmiennym mechanizmem działania. Poza dotychczas znanymi mechanizmami śmierci komórki wskutek działania przeciwciał, czyli cytotoksycznością zależną od przeciwciał (antibody-dependent cell cytotoxicity ADCC), cytotoksycznością zależną od dopełniacza (complement-dependent cytotoxicity CDC), przeciwciało typu 2 indukuje apoptozę na drodze tzw. bezpośredniej śmierci komórki. Zachodzi ona niezależnie od BCL-2 i aktywacji kaspaz. Ponadto fragment Fc zawiera mniejszą ilość fukozy, co zwiększa powinowactwo do receptora FcyRIIIa i co za tym idzie ok. 100-krotnie zwiększa potencjał ADCC. Obinutuzumab okazał się dobrze tolerowany w badaniach I fazy. Najczęstszym działaniem niepożądanym była reakcja związana z infuzją, obserwowana zazwyczaj podczas pierwszego podania i ustępująca w trakcie leczenia. Do badania fazy II o nazwie GAUGUIN zostali włączeni pacjenci z indolentnymi i agresywnymi nawracającymi lub opornymi chłoniakami. Ponad połowa pacjentów była oporna na rytuksymab. W grupie chłoniaków indolentnych ORR wyniosło 55% koniugaty lek przeciwciało brentuksymab vedotin polatuzumab vedotin inotuzumab ozogamicin przeciwciała monoklonalne rytuksymab obinutuzumab ofatumumab epratuzumab lucatumumab limfocyt T przeciwciała bispecyficzne blinatumomab komórka chłoniaka Rycina 2. Przeciwciała przeciwko antygenom powierzchniowym limfocytu [za: Grover NS, Park SI. Novel Targeted Agents in Hodgkin and Non-Hodgkin Lymphoma Therapy. Pharmaceuticals 2015; 8: ] 67

70 Tomasz Chojnacki podczas leczenia wyższymi dawkami 1600 mg w dniach 1. i 8. cyklu I oraz 800 mg w dniu 1. cykli I VIII. W grupie chłoniaków agresywnych ORR wyniosło 32% w grupie leczonej tymi dawkami obinutuzumabu. Bazując na tych wynikach, stworzono badanie fazy Ib GAUDI, w którym oceniano bezpieczeństwo i skuteczność obinutuzumabu w połączeniu z CHOP i FC (fludarabina + cyklofosfamid) u pacjentów z chłoniakiem grudkowym. Również to badanie potwierdziło dobrą tolerancję takiego leczenia i przyniosło obiecujące wyniki. Kolejnym badaniem było badanie III fazy o nazwie GADOLIN. U 396 pacjentów z chłoniakami CD20+ opornymi na rytuksymab porównano skuteczność bendamustyny i bendamustyny w skojarzeniu z obinutuzumabem. Pacjenci, którzy podczas leczenia skojarzonego nie mieli progresji, otrzymywali terapię podtrzymującą obinutuzumabem przez 2 lata. Oceniane przez badacza PFS w grupie bendamustyny wyniosło 14 miesięcy, a w grupie obinutuzumabu 29 miesięcy. Oceniane obiektywnymi badaniami radiologicznymi PFS wyniosło 14,9 miesiąca w grupie bendamustyny w monoterapii i nie zostało jeszcze osiągnięte w grupie obinutuzumabu. Obecnie trwa badanie II fazy porównujące rytuksymab i obinutuzumab w pierwszej linii w nawracających lub opornych chłoniakach indolentnych (NCT ) oraz badanie III fazy porównujące obinutuzumab w kombinacji z chemioterapią z rytuksymabem w skojarzeniu z chemioterapią u pacjentów z zaawansowanymi chłoniakami indolentnymi (NCT ). W badaniu fazy Ib/II GALEN badany jest obinutuzumab w skojarzeniu z lenalidomidem w opornych lub nawrotowych FL, MCL i DLBCL. Brentuksymab vedotin Brentuksymab vedotin (BV) to przeciwciało anty-cd30 stosowane w leczeniu chłoniaków T-komórkowych i chłoniaka Hodgkina. Wykazuje ono jednak aktywność również w DLBCL. Wyniki cząstkowe badania II fazy testującego BV w połączeniu z R-CHOP w pierwszej linii leczenia u pacjentów z DLBCL pośredniego wysokiego lub wysokiego ryzyka są obiecujące ORR wyniosło 97%, CR stwierdzona za pomocą PET-CT wystąpiła u 80% chorych. Remisję osiągnął większy odsetek chorych z chłoniakiem CD30+ w porównaniu z CD30 [42]. Dlatego badanie zostało zmodyfikowane i toczy się obecnie tylko u pacjentów wykazujących powierzchniową ekspresję CD30 (NCT ). Tabela 2. Różnice pomiędzy obinutuzumabem a rytuksymabem Obinutuzumab Rytuksymab Typ mab anty-cd20 II I Wytworzone metodą glikoinżynierii tak nie ADCC Bezpośrednia śmierć komórki CDC +/ + 68

71 Rozdział 3 Tabela 3. Inne przeciwciała anty-cd20 i ich właściwości Ofatumumab Weltuzumab Obinutuzumab Charakterystyka przeciwciała humanizowane, wiążące się z innym epitopem niż R II generacja, różni się od R jednym aminokwasem II generacja, wytworzone metodą glikoinżynierii Mechanizm działania CDC, ADCC jak rytuksymab (większa zdolność wiązania z antygenem) ADCC, bezpośrednia śmierć komórki Cechy szczególne aktywny w oporności na fludarabinę i alemtuzumab oraz w oporności na fludarabinę u pacjentów z bulky disease zmniejsza liczbę krążących komórek białaczkowych większa siła działania dzięki unikalnemu mechanizmowi działania; nadzieje wynikające z możliwości synergii działania z nowymi małymi molekułami Tabela 4. Zestawienie badań klinicznych z przeciwciałami anty-cd20 i lenalidomidem ORR GA-101 LEN R² GALEN FL 50% (GAUGUIN) 27% (Witzig, JCO 2009) 85% (Dutia, EHA 2010)? MCL 27% (GAUGUIN) 42% (Witzig, Ann Oncol 2011) 57% (Wang, Lugano 2011)? DLBCL 28% (GAUGUIN) 35% (Witzig, Ann Oncol 2011) 35% (Zinzani, 2011)? Epratuzumab Epratuzumab jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-cd22. W badaniach fazy I/II oceniano bezpieczeństwo i skuteczność leku u 56 pacjentów z nawracającymi lub opornymi agresywnymi chłoniakami, przy czym 35 spośród nich stanowili chorzy z DLBCL. Dla DLBCL ORR wyniosło 15% przy zachowaniu dobrego profilu bezpieczeństwa [43]. W innym badaniu ORR wyniosło 47% wśród pacjentów z agresywnymi chłoniakami (30 na 64 chorych, 14 CR) [44]. W kolejnym badaniu sprawdzano skuteczność epratuzumabu w I linii w połączeniu z R-CHOP u nieleczonych wcześniej pacjentów z CD22+ DLBCL, ORR wyniosło 96%, w tym 74% CR [45]. W badaniu wykazano poprawę efektów leczenia w porównaniu z R-CHOP, jednak kosztem wysokiego odsetka neutropenii w stopniu 3 i 4 (85%). Nie jest natomiast znana skuteczność epratuzumabu u pacjentów CD22-negatywnych. 69

72 Tomasz Chojnacki W badaniach klinicznych uwzględniono też kolejne leki będące przeciwciałami anty-cd22 skoniugowanymi z cytotoksycznym antybiotykiem kalicheamycyną lub aurystatyną (pinatuzumab). Porównywano je w zestawieniu z rytuksymabem z RB lub R-Gem. Badanie zostało jednak przerwane z powodu nieosiągnięcia pierwszorzędowego celu, czyli poprawy OS. 70 Przeciwciała anty-cd19 CD19 jest obecne na komórkach B już we wczesnych stadiach rozwoju i to zarówno na zdrowych limfocytach, jak i komórkach chłoniakowych. MEDI-551 jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym klasy IgG skierowanym przeciwko antygenowi CD19. W badaniach I i II fazy wykazano dobry profil bezpieczeństwa i umiarkowaną skuteczność w limfoproliferacjach [46]. Obecnie trwa badanie II fazy porównujące MEDI-551 z rytuksymabem w kombinacji z chemioterapią ratunkową u pacjentów z nawracającym lub opornym DLBCL (NCT ). Trwają również badania nad drugą cząsteczką anty-cd19 sprzężoną z inhibitorem tubulin DM4 SAR3419. Ustalono, że optymalnym sposobem jego podawania są 4 cotygodniowe iniekcje, a następnie 4 podania co 2 tygodnie. Odpowiedź w postaci zmniejszenia guza wystąpiła u 74% pacjentów, z których prawie połowa była oporna na rytuksymab, PR i CR wystąpiły u 6/35 pacjentów. Kolejną molekułą będącą przeciwciałem anty-cd19 sprzężoną z MMAF (monomethyl auristatin F) jest SGN-CD19A. MMAF działa toksycznie na mikrotubule. Do badania I fazy zostało włączonych 44 pacjentów, z czego 89% stanowili chorzy z nawrotowym lub opornym DLBCL. ORR wyniosło 30%, z czego 16% to CR [47]. Ponad połowa pacjentów miała zmiany w rogówce, które jednak odpowiadały na leczenie glikokortykosteroidami i modyfikację dawki. Badanie to ciągle trwa. Inne podejście do leczenia reprezentuje bispecyficzne przeciwciało CD19/CD3 blinotumomab. Celem jest sprzęganie ze sobą cytotoksycznych komórek T CD3+ i limfocytów CD19+ i doprowadzenie w ten sposób do lizy nowotworowych komórek B. Badania I fazy zostały przeprowadzone u pacjentów z FL, MCL i CLL i wykazały aktywność leku we wszystkich jednostkach. Do najczęstszych działań niepożądanych należały: gorączka, limfopenia, leukopenia, dreszcze i rosnący poziom białka C-reaktywnego. Zdarzały się również powikłania z ośrodkowego układu nerwowego, takie jak: encefalopatia, zaburzenia mowy, drżenia i dezorientacja. Mijały one po odstawieniu leku. Badanie II fazy przeprowadzono u chorych z nawrotowym lub opornym DLBCL. ORR wyniosło 43%, a czas trwania odpowiedzi 11,6 miesiąca [48]. Lek wykazał się natomiast dużą skutecznością w ALL. W populacji pacjentów z nawrotem lub opornością na wcześniejsze leczenie uzyskano 43% CR, co skłoniło FDA do przyspieszonego zaakceptowania blinotumomabu w leczeniu nawrotowej lub opornej Philadelphia-ujemnej ALL. Obecnie trwające badania dotyczą jednak w większości chłoniaków agresywnych, a ich rezultaty są oczekiwane z niecierpliwością. Powstanie przeciwciał bispecyficznych wprowadza nas na nowe, nieznane dotąd pole, gdzie immunoterapia stymuluje organizm pacjenta do ataku na komórki chłoniaka przy użyciu własnego systemu odpornościowego. Niedaleko stąd już do kolejnej metody, a mianowicie terapii z użyciem komórek T CAR (chimeric antigen receptor

73 Rozdział 3 T-cell therapy). Polega ona na użyciu do walki z nowotworem autologicznych komórek T, poddanych wcześniej inżynierii genetycznej. Dzięki tym przeróbkom na swojej powierzchni mają one receptory o powinowactwie do antygenów powierzchniowych komórek nowotworowych, np. CD19. W najbliższych latach spodziewane są publikacje wielu badań nad zastosowaniem komórek CAR w terapii chłoniaków. Przeciwciała przeciwko białkom immunologicznych punktów kontrolnych (immune checkpoint proteins) Wiadomo, że układ immunologiczny odgrywa znaczącą rolę w walce z rakiem. Komórki nowotworowe wysyłają często sygnały, które hamują immunologiczną odpowiedź przeciwnowotworową. Okres dynamicznego rozwoju przeżywają obecnie nowe leki, które blokują szlaki kontroli immunologicznej przyczyniające się do immunotolerancji komórek nowotworowych. Badania dotyczą przede wszystkim białka wiążącego cytotoksyczne limfocyty T CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) i układu programowanej śmierci komórki PD-1 (programmed cell death-1). Leki celujące w te układy okazały się skuteczne w wielu guzach litych, a obecnie są badane w nowotworach hematologicznych. Ipilimumab CTLA-4 jest członkiem rodziny CD28/immunoglobuliny i odgrywa ważną rolę w regulacji szlaków odpowiedzi immunologicznej poprzez hamowanie funkcji regulatorowych limfocytów T. Prowadzi to do osłabienia odpowiedzi immunologicznej. CTLA-4 było pierwszym receptorem wchodzącym w skład immunologicznych punktów kontrolnych, który stał się targetem nowych leków. Ipilimumab jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko CTLA-4. Jego skuteczność pierwotnie udowodniono w guzach litych, a najlepszym przykładem jest czerniak. W badaniu I fazy z wykorzystaniem ipilimumabu w nawrotowym lub opornym chłoniaku B-komórkowym odsetek odpowiedzi wyniósł 11% (2/18 pacjentów, jeden z DLBCL uzyskał CR, jeden z FL uzyskał PR) [49]. Wyniki nie są rewelacyjne, ale na uwagę zasługuje fakt, że odpowiedzi te były bardzo trwałe u pacjenta z FL 19 miesięcy, natomiast u chorego z DLBCL aż 31 miesięcy. Skłoniło to badaczy do kontynuowania testów z użyciem tego leku w limfoproliferacjach. Obecnie trwa badanie I fazy z kombinacją ipilimumabu z rytuksymabem u pacjentów z R/R chłoniakami z komórek B (NCT ). PD-1 to kolejny negatywny regulator funkcji limfocytów T. Poprzez wiązanie z ligan dami PD-L1 i PD-L2 hamuje on szlaki komórkowe, które aktywują komórki T. Mamy obecnie wiele przeciwciał monoklonalnych blokujących zarówno PD-1, jak i PD-L1. Doskonałym przykładem choroby, w której układ immunologiczny i podścielisko odgrywa szczególnie znaczącą rolę, jest chłoniak Hodgkina. Jest on idealnym celem dla terapii anty-pd-1. Rearanżacje 9p24.1 w tej chorobie powodują nadekspresję ligandów PD-1 na komórkach Reed-Sternberga (RS), a pośrednikiem w tej reakcji jest konstytutywnie aktywny szlak JAK2/STAT. Dodatkowo ekspresję ligandów PD-1 zwiększa infekcja EBV. 71

74 Tomasz Chojnacki 72 Pidilizumab Pidilizumab to humanizowane przeciwciało anty-pd-1. W badaniach I fazy m.in. u pacjentów z limfoproliferacjami wykazano dobrą tolerancję leku i umiarkowaną skuteczność, wliczając w to jeden przypadek CR w FL [50]. Badanie II fazy objęło pacjentów z DLBCL po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych (ASCT) [51]. Hipoteza wysunięta przez badaczy była nader ciekawa: wczesne potransplantacyjne zablokowanie PD-1 może zapobiegać spadkowi ilości przeciwnowotworowych limfocytów T i powodować eradykację minimalnej choroby resztkowej (MRD). Do badania włączono 66 pacjentów. Otrzymali oni 3 dawki pidilizumabu, począwszy od 1 3 miesięcy po ASCT. Szesnastomiesięczne PFS wyniosło 70% z PET -dodatnią chorobą przed transplantacją. Z pacjentów, którzy mieli mierzalną chorobę po ASCT, na leczenie odpowiedziało 51%, a 34% uzyskało CR. Nie odnotowano przy tym poważnych zdarzeń niepożądanych. Obecnie trwa badanie z użyciem pembrolizumabu po ASCT u pacjentów z R/R DLBCL i klasycznym HL (NCT ). Niwolumab Niwolumab jest kolejnym humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko PD-1. Również ono okazało się skuteczne w guzach litych. Ostatnio opublikowano wyniki badania I fazy u pacjentów z R/R nowotworami hematologicznymi (HL, chłoniaki z komórek B i T, MM). Pacjenci z HL byli wcześniej leczeni 4 5 liniami terapii, u 78% z nich choroba nawróciła po BV, u 78% po ASCT, ORR wyniósł 87%, uzyskano 17% CR [52]. U pozostałych 3 pacjentów odnotowano SD. Wiele z tych remisji okazało się trwałe. Niedawno opublikowano także wyniki tego badania dotyczące pozostałych limfoproliferacji [53]. Była to również grupa pacjentów po ciężkim leczeniu. ORR dla chłoniaków B-komórkowych wyniosło 28%, CR 7%. Dla samego DLBCL ORR było nieco wyższe 36%, dla FL 40%. Dla chłoniaków z komórek T ORR wyniosło 17%, dla chłoniaka z obwodowych limfocytów T 40% (PTCL). Obecnie trwają badania nad skutecznością niwolumabu w R/R FL (NCT ) i R/R DLBCL (NCT ). Pembrolizumab Kolejnym przeciwciałem anty-pd-1 jest pembrolizumab. KEYNOTE-013 to badanie oceniające bezpieczeństwo i skuteczność tej cząsteczki w nowotworach hematologicznych. Opublikowano wyniki dla chorych z HL, podobnie jak w przypadku niwolumabu po ciężkim leczeniu. ORR wyniosło 53%, a CR wystąpiła u 20% [54]. Z ramienia dotyczącego chłoniaków B-komórkowych jeszcze nie opublikowano żadnych wyników. Trwają również badania z pembrolizumabem w konsolidacji po ASCT w DLBCL i HL (NCT ), a także w kombinacji z rytuksymabem w nawracającym FL (NCT ), w R/R klasycznym HL (NCT ) oraz w kombinacji z chemioterapią w zaawansowanych chłoniakach (NCT ). Rozpoczęło się również badanie oceniające pembrolizumab z R-CHOP u nieleczonych wcześniej pacjentów z DLBCL [55].

75 Rozdział 3 Badane są też inne przeciwciała skierowane przeciwko immunologicznym punktom kontrolnym. W I fazie m.in. w chłoniakach badany jest lek będący przeciwciałem przeciw LAG-3 (lymphocyte-activation-gene-3) (NCT ). Przeciwciało anty-pdl-1 (MPDL3280A) oceniane jest w kombinacji z obinutuzumabem w R/R FL i R/R DLBCL (NCT ). Interakcje pomiędzy nowymi lekami Interakcje pomiędzy nowymi lekami, jak również nowych leków z tymi klasycznymi są dopiero odkrywane. Istnieje wiele różnych mechanizmów i rodzajów interakcji, np. synergizm, antagonizm, ale również np. skumulowana toksyczność. Poniżej przedstawione zostaną niektóre znane interakcje. Część oddziaływań pomiędzy nowymi lekami została też omówiona wcześniej. Synergistyczne działanie ibrutinibu i lenalidomidu Lenalidomid w monoterapii tylko częściowo blokuje ekspresję IRF-4 i SPIB. Większą toksyczność dla komórki DLBCL ABC można osiągnąć, zmniejszając zależną od NF-κB ekspresję IRF-4. Leczenie ibrutinibem zmniejsza ekspresję IRF-4, ale gdy zastosuje się go w połączeniu z lenalidomidem, IRF-4 staje się niewykrywalne [56]. Kombinacja ta powoduje również większy wzrost aktywności interferonu i fosforylacji STAT1 niż sam lenalidomid. Podobne eksperymenty były również prowadzone z użyciem leku o symbolu MLN120B, który jest inhibitorem IKKβ. Można sobie wyobrazić podobną synergię pomiędzy lenalidomidem a innymi lekami blokującymi sygnał z BCR, takimi jak inhibitory SYK (fosfamatinib), inhibitory PI3K (idelalisib, duvelisib), inhibitory MALT1, a także z lekami blokującymi degradację IκBα, np. bortezomib. Obecnie toczy się badanie II fazy badające ibrutinib i lenalidomid w połączeniu z DA-EPOCH-R. Synergizm pomiędzy ibrutinibem i inhibitorami mtorc1/2 Dane na temat możliwego synergistycznego działania tych dwóch cząsteczek pochodzą z badań przedklinicznych. Dotyczą one w zasadzie tylko podtypu ABC. U podłoża skuteczności tego połączenia mają leżeć dwa mechanizmy: wspólne blokowanie translacji zależnej od 4EBP1 oraz cap, hamowanie autokrynnej pętli NF-κB/IL-10/STAT3. Hamowanie obu tych szlaków jest niezbędne do inicjacji procesu apoptozy [57]. Połączenie inhibitora mtor (AZD2014) z ibrutinibem znamiennie bardziej zmniejsza fosforylację 4EBP1 niż monoterapia AZD2014 lub ibrutinibem. 4EBP1 jest regulatorem translacji zależnej od cap. Działa poprzez interakcję z eif4e. Fosforylacja 4EBP1 hamuje tę interakcję i umożliwia połączenie się eif4e z eif4g, a co za tym idzie inicjację translacji. Efektem redukcji translacji jest indukcja apoptozy poprzez zahamowanie rozpadu kaspazy-3. Fosforylacja STAT3, której mediatorem jest kinaza JAK, jest hamowana przez ibrutinib w połączeniu z AZD2014 nie bardziej niż ibrutinib w pojedynkę. Fosforylacja JAK-STAT3 odbywa się za pośrednictwem cytokin IL-6 i IL-10. Zarówno ibrutinib, 73

76 Tomasz Chojnacki jak i AZD2014 zmniejszają sekrecję IL-10 poprzez hamowanie ekspresji genu IL-10. Zmniejsza to fosforylację IκBα, przez co hamuje NF-κB. Zahamowanie aktywacji STAT3 jest wynikiem zmniejszenia aktywności NF-κB. Do zapoczątkowania procesu apoptozy niezbędne jest wystąpienie obu tych mechanizmów jednocześnie. Udowodniono to doświadczalnie. Dodanie egzogennej IL-10 do komórek skierowanych na drogę apoptozy nie zapobiega apoptozie. Dodanie do takich komórek tylko 4EBP1 ma większe znaczenie w zapobieganiu apoptozie, jednak nadal większość komórek kieruje się na drogę apoptozy. Dopiero dodanie obu tych molekuł jednocześnie chroni przed apoptozą. Wyniki tych doświadczeń zostały potwierdzone na modelach mysich. Podobny efekt ma połączenie ibrutinibu z inhibitorem PI3K [58]. Synergistyczne działanie ibrutinibu i inhibitorów BCL-2 Synergizm pomiędzy tymi dwoma lekami wykazano w licznych badaniach w DLBCL, chłoniaku z komórek płaszcza i w przewlekłej białaczce limfocytowej. Połączenie obu tych leków ujawnia mechanizm prowadzący do apoptozy, który nie występuje, gdy są one podawane osobno. Apoptoza jest w tym przypadku zapoczątkowana przez białka p53 i BIM. Ponadto ibrutinib w monoterapii hamuje ekspresję MCL-1. W kombinacji ABT-199 zmniejsza dodatkowo ekspresję BCL-2 i BCL2L1 [59]. Bardziej efektywnie zmniejsza to potencjał błony mitochondrialnej i zwiększa rozpad polimerazy poly-adp-rybozy (PARP), prowadząc do apoptozy. Synergizm pomiędzy inhibitorami PI3K/AKT/mTOR i inhibitorami BCL-2 Wiadomo, że agresywne chłoniaki nie odpowiadają na leczenie inhibitorami PI3K w monoterapii. Wiadomo również, że w podtypie ABC obiecujące jest połączenie inhibitorów PI3K i BTK. Wysunięto teorię, że nadekspresja BCL-2 może ograniczać skuteczność inhibitorów PI3K w GCB. W doświadczeniach na liniach komórkowych wykazano, że kombinacja inhibitora PI3K/mTOR z inhibitorem BCL-2 jest skuteczna w przypadkach opornych na monoterapię inhibitorem BCL-2. Odkryto 2 mechanizmy tej synergii. Po pierwsze leki hamujące szlak PI3K/AKT/mTOR zmniejszają ekspresję białka MCL-1, które w przypadku wysokiej ekspresji ogranicza skuteczność inhibitorów BCL-2 poprzez działanie przeciwstawne. Istnieje jednak mechanizm synergii niezależnej od down-regulation MCL-1. Supresja AKT powoduje akumulację w mitochondriach proapoptotycznych molekuł BAD i BIM, co zwiększa potencjał inhibitorów BCL-2 [60]. Zdolność do modulowania ekspresji BIM przez hamowanie aktywacji AKT przypisuje się czynnikowi transkrypcyjnemu FOXO. Inhibitory AKT zdecydowanie zwiększają ekspresję FOXO. Obecność zmutowanej formy AKT nie tylko zwiększa jednak aktywację szlaku PI3K/AKT/mTOR, ale powoduje oporność na inhibitory AKT. Mutacja AKT zmniejsza ekspresję FOXO i blokuje rekrutację BIM i BAD w mitochondriach pod wpływem inhibitorów AKT. W ten sposób znosi synergię pomiędzy nimi a inhibitorami BCL-2. 74

77 Rozdział 3 Cząsteczką zmniejszającą ekspresję MCL-1 jest danaciclib. Nie był on jeszcze wykorzystany w badaniach klinicznych, dlatego nie został opisany powyżej. Danaciclib jest inhibitorem cyklinozależnej kinazy CDK-9, a inhibicja CDK-9 powoduje zahamowanie ekspresji MCL-1. Zwiększa to znacząco potencjał inhibitorów BCL-2 [61]. Synergistyczne działanie inhibitorów BCL-2 i inhibitorów proteasomów Badania na liniach komórkowych pokazały, że najskuteczniejszym połączeniem inhibitora BCL-2 (w tym przypadku ABT-737) z innym lekiem jest kombinacja ABT-737 z inhibitorem proteasomów (bortezomib, karfilzonib). W doświadczeniu powodowała ona śmierć ponad 50% komórek poddanych działaniu tych leków [62]. O inhibitorach proteasomów wiadomo, że ingerują w wiele mechanizmów wewnątrzkomórkowych. Poza hamowaniem szlaku NF-κB regulują one cykl komórkowy poprzez akumulację p21/p27, zwiększają ekspresję p53 oraz co najbardziej istotne w kontekście ABT-737 zwiększają ekspresję proapoptotycznych członków rodziny BCL-2. Jest to działanie synergistyczne z inhibitorami BCL-2, które hamują antyapoptotyczne białko tej rodziny, czyli BCL-2. Antagonistyczne działanie leków hamujących sygnał z BCR i rytuksymabu Istnieją doniesienia, że cząsteczki blokujące sygnał z receptora B-komórkowego, takie jak ibrutinib, iselalisib i inhibitor SYK (R406), mogą osłabiać działanie rytuksymabu poprzez: zmniejszenie ekspresji CD20 na powierzchni komórek chłoniaka, zmniejszenie aktywności cytotoksycznej zależnej od dopełniacza (CDC), jednego z głównych mechanizmów działania rytuksymabu [63]. Czy problem jest na tyle istotny, aby wpływał na wyniki leczenia, dowiemy się najprawdopodobniej po opublikowaniu danych z badań, w których stosowano te inhibitory w połączeniu z cząsteczkami anty-cd20. Zbierane są dane na temat wielu innych interakcji. Połączenie idelalisibu z lenalidomidem okazało się zbyt toksyczne, badany jest synergizm pomiędzy ibrutinibem a przeciwciałami anty-pd-1. Znany jest również fakt, że inhibitory JAK zmniejszają ekspresję ligandu PD-1 (PD-L1) na powierzchni komórek. Podsumowanie Analiza z zastosowaniem sekwencjonowania całego genomu ujawniła zaskakującą molekularną różnorodność i zarazem złożoność zaburzeń molekularnych w DLBCL. Wiemy już, że rozwój medycyny spersonalizowanej w DLBCL wymaga nie tylko identyfikacji mutacji odpowiedzialnych za nowotworzenie i progresję choroby (tzw. driven mutations). Konieczna jest również identyfikacja współistniejących z nimi mutacji, które mogą warunkować np. oporność na dany lek. Kolejnym małym krokiem do celu jest na razie poznanie odpowiedzi na pytanie, jak skutecznie leczyć chorych z DLBCL, którzy nie odpowiedzieli na pierwszą linię 75

78 Tomasz Chojnacki leczenia. W pracy tej zostało przedstawionych kilku kandydatów mających szansę już niedługo wejść do standardu postępowania w drugiej linii, a nawet w pierwszej linii, czego najbliżej chyba jest lenalidomid w podtypie ABC DLBCL. Kolejnym wielkim wyzwaniem jest stworzenie takich kombinacji leków, które będą możliwe do zastosowania ze względu na dobre wyniki, profil bezpieczeństwa, ale również efektywność kosztową. Obecnie wydaje się, że w dążeniu do tego celu dysponujemy zbyt wieloma możliwymi kombinacjami leków, zbyt małą liczbą pacjentów i zbyt małą ilością czasu. Konieczne jest, aby najbardziej efektywne kombinacje były wyłaniane z badań przedklinicznych i przekładane na badania kliniczne. Konieczne jest również znalezienie biomarkerów odpowiedzi na leczenie, które pozwoliłyby np. wyeliminować z tej układanki kilka cząsteczek, które z całą pewnością u danego pacjenta nie zadziałają. Nade wszystko potrzebne jest opracowanie panelu badań, które powinny być wykonane u każdego pacjenta z rozpoznanym DLBCL przed wyborem odpowiedniego leczenia. Na taki panel muszą się składać: markery aktywacji głównych szlaków metabolicznych w komórce, jak również szlaków wyrównawczych (kompensacyjnych), aktywowanych w przypadku zablokowania głównego szlaku, mutacje warunkujące oporność na lek, który może zablokować aktywne sygnały na szlakach komórkowych. Dopiero takie postępowanie będzie miało znamiona medycyny spersonalizowanej. Jednym zdaniem: dużo już wiemy, ale do pełnego zwycięstwa nad DLBCL jeszcze daleka droga. 76 Piśmiennictwo 1. Recher C, Coiffer B, Haioun C i wsp. Intensified chemotherapy with ACVBP plus rituximab versus standard CHOP plus rituximab for the treatment of diffuse large B-cell lymphoma: an open-label, randomized phase 3 trial. Lancet 2011; 378: Cunningham D, Hawkes EA, Jack A i wsp. Rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisolone in patient with newly diagnosed diffuse large B-cell non-hodgkin lymphoma: a phase 3 comparison of dose intensification with 14-day versus 21-day cycles. Lancet 2013; 381: Gisselbrecht C, Glass B, Mounier N i wsp. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Cllin Oncol 2010; 27: Crump M, Kuruvilla J, Couban S i wsp. Randomised comparison of gemcitabine, dexamethasone, and cisplatin versus dexamethasone, cytarabin, and cisplatin chemotherapy before autologous stem-cell transplantation for relapsed and refractory aggressive lymphomas: NCIC-CTG LY.12. J Clin Oncol 2014; 32: Thieblemont C, Briere J, Mounier N i wsp. The germinal center/activated B-cell subclassification has a prognostic impact for response to salvage therapy in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma: a bio-coral study. J Clin Oncol 2011; 29: Lenz G, Wright G, Dave SS i wsp. Stromal gene signatures in large-b-cell lymphomas. N Engl J Med 2008; 359: Wilson WH, Jung SH, Porcu P i wsp. A Cancer and Leukemia Group B multi-center study of DA-EPOCHrituximab in untreated diffuse large B-cell lymphoma with analysis of outcome by molecular subtype. Haematologica 2012; 97: Dunleavy K, Pittaluga S, Czuczman MS. Differential efficacy of botezomib plus chemotherapy within molecular subtypes of diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2009; 113: Offner F, Samoilova O, Osmanov E. Frontline rituximab, cyclophosphamide, doxorubicin, and prednisone with bortezomib (VR-CAP) or vincristine (R-CHOP) for non-gcb DLBCL. Blood 2015; 126:

79 Rozdział Davis RE, Ngo VN, Lenz G i wsp. Chronic active B-cell-receptor signalling in diffuse large B-cell lymphoma. Nature 2010; 463: Wilson WH, Gerecitano JF, Goy A i wsp. The Bruton s tyrosine kinase (BTK) inhibitor, ibrutinib (PCI-32765), has preferential activity in the ABC subtype of relapsed/refractory de novo diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL): interim results of a multicenter, open-label, phase 2 study [abstract]. Blood 2012; 120: a Hendricks RW, Yuvaraj S, Kil LP. Targeting Bruton s tyrosine kinase in B cell malignancies. Nature Reviews 2014; 14: US National Library of Medicine. ClinicalTrials.gov [online], NCT (2013). 14. Zhang LH, Kosek J, Wang M i wsp. Lenalidomide efficacy in activated B-cell like subtype diffuse large B-cell lymphoma is dependent upon IRF4 and cereblon expression. Br J Hematol 2013; 160: Hernandez-Ilizaliturri FJ, Deeb G, Zinzani PL i wsp. Higher response to lenalidomide in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma in nongerminal center b-cell-like than in germinal center B-cell-like phenotype. Cancer 2011; 117: Nowakowski GS, LaPlant B, Macon WR. Lenalidomide combined with R-CHOP overcomes negative prognostic impact of non-germinal center B-cell fenotype in newly diagnosed diffuse large B-cell lymphoma: a phase II study. J Clin Oncol 2015; 33: Kahl B, Byrd JC, Flinn IW i wsp. Clinical safety and activity in a phase I study of CAL-101, an isoformselective inhibitor of phosphatydylo3-kinase p110 {delta}, in patients with relapsed or refractory non- Hodgkin lymphoma. Blood 2010; 116: abstract Ezell SA, Mayo M, Bihani T. Synergistic induction of apoptosis by combination of BTK and dual mtorc1/2 inhibitors in diffuse large B cell lymphoma. Oncotarget 2014; 5: Witzig TE, Reeder CB, LaPlant BR, i wsp. A phase II trial of the oral mtor inhibitor everolimus in relapsed aggressive lymphoma. Leukemia 2011; 25: US National Library of Medicine. ClinicalTrials.gov [online], NCT (2013). 21. US National Library of Medicine. ClinicalTrials.gov [online], NCT (2013). 22. Robertson MJ, Kahl BS, Vose JM i wsp. Phase II study of enzastaurin, a protein kinase C β inhibitor, in patients with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol 2007; 25: Hainsworth JD, Arrowsmith E, McCleod M i wsp. Randomized phase II study of R-CHOP plus enzastaurin versus R-CHOP in the first line treatment of patients with intermediate and high-risk diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) preliminary analysis [abstract]. Ann Oncol 2011; 22 (Suppl. 4): a Naylor TL, Tang H, Ratsch BA i wsp. Protein kinase C inhibitor sotrastaurin selectively inhibits the growth of CD79 mutant diffuse large B-cell lymphomas. Cancer Res 2011; 71: US National Library of Medicine. ClinicalTrials.gov [online], NCT (2013). 26. Nagel D, Spranger S, Vincendeau M i wsp. Pharmacologic inhibition of MALT1 protease by phenothiazines as a therapeutic approach for the treatment of aggressive ABC DLBCL. Cancer Cell 2012; 22: US National Library of Medicine. ClinicalTrials.gov [online], NCT (2013). 28. Younes A, Romaguera J, Fanale M i wsp. Phase I study of a novel oral Janus kinase 2 inhibitor, SB1518, in patients with relapsed lymphoma: evidence of clinical and biologic activity in multiple lymphoma subtypes. J Clin Oncol 2012; 30: Friedberg JW, Sharman J, Sweetenham J i wsp. Inhibition of Syk with fosfamatinib disodium has significant clinical activity in non-hodgkin lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Blood 2010; 115: Sharman J, Hawkins M, Kolibaba K. An open-label phase 2 trial of entospletinib (GS-9973), a selective spleen tyrosine kinase inhibitor, in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2015; 125: Palanca-Wessels MC, Czuczman M, Salles G i wsp. Safety and activity of the anti-cd79b antibody-drug conjugate polatuzumab vedotin in relapsed or refractory B-cell non-hodgkin lymphoma and chronic lymphocytic leukaemia: a phase 1 study. Lancet Oncol 2015; 16: A Study of DCDS4501A in Combination With Rituximab, Cyclophosphamide, Doxorubicin and Prednisone in Patients With B-Cell Non-Hodgkin s Lymphoma Clinicattrial.gov: NCT Pfeifer M, Zheng B, Erdmann T i wsp. Anti-CD22 and anti-cd79b antibody drug conjugates are active in different molecular diffuse large B-cell lymphoma subtypes. Leukemia 2015; 29: Morin RD, Johnson NA, Severson TM i wsp. Somatic mutations altering EZH2 (Tyr641) in follicular and diffuse large B cell lymphomas of germinal center origin. Nat Genet 2010; 42: Straus DJ, Hamlin PA, Matasar MJ i wsp. Phase I/II trial of vorinostat with rituximab, cyclophosphamide, etoposide and prednisone as palliative treatment for elderly patients with relapsed or refractory diffuse 77

80 Tomasz Chojnacki large B-cell lymphoma not eligible for autologous stem cell transplantation. Br J Haematol 2015; 168: Chao NJ, Rosenberg SA, Horning SJ. CEPP(B): an effective and well-tolerated regimen in poor-risk, aggressive non-hodgkin s lymphoma. Blood 1990; 76: Trabucco SE, Gernstein RM, Evens AM i wsp. Inhibition of bromodomain proteins for the treatment of human diffuse large B-cell lymphoma. Clin Cancer Res 2014; 21: Davids MS, Seynour JF, Gerecitano JF i wsp. Phase I study of ABT-199 (GDC-0199) in pateints with relapsed/refractory (R/R) non-hodgkin lymphoma (NHL): Responses observed in diffuse large B-cell (DLBCL) and follicular (FL) at higher cohort doses. ASCO 2014 Annual Meeting. J Clin Oncol 2014; 32 (suppl.): Abstract de Vos S, Flowers CR, Wang D i wsp. The BCL-2 Inhibitor ABT-199 (GDC-0199) in Combination with Bendamustine and Rituximab in Patients with Relapsed or Refractory Non-Hodgkin s Lymphoma. ASH Blood 2014; 124: Abstract A Phase Ib, Open-Label Study Evaluating The Safety And Pharmacokinetics Of GDC-0199 (ABT-199) In Combination With Rituximab (R) or Obinutuzumab (G) Plus Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine And Prednisone (Chop) In Patients With B-Cell Non-Hodgkins Lymphoma (NHL) and DLBCL. Clinical Trials NCT Testing Selinexor and Ibrutinib in Relapsed or Refractory Chronic #CLL or Aggressive NH Lymphoma Bartlett NL, Farber CM, Yasenchak CA i wsp. Updated results of a phase II trial of brentuximab vedotin combined with R-CHOP in frontline treatment of patients (Pts) with high-intermediate/high-risk diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). J Clin Oncol 2015; 33 (ASCO Meeting Abstracts): Abstract Leonard JP, Coleman M, Ketas J i wsp. Combination antibody therapy with epratuzumab and rituximab in relapsed or refractory non-hodgkin s lymphoma. J Clin Oncol 2005; 23: Strauss SJ, Morschhauser F, Rech J i wsp. Multicenter phase II trial of immunotherapy with the humanized anti-cd22 antibody, epratuzumab, in combination with rituximab, in refractory or recurrent non- Hodgkin s lymphoma. J Clin Oncol 2006; 24: Micallef IN, Maurer MJ, Wiseman GA i wsp. Epratuzumab with rituximab, cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone chemotherapy in patients with previously untreated diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2011; 118: Ogura M, Ando K, Uike N i wsp. Safety profile and clinical response to MEDI-551, a humanized monoclonal anti-cd19, in a phase 1/2 study in adults with relapsed or refractory advanced B-cell malignancies. Blood 2013; 122: Moskowitz CH, Forero-Torres A, Shah BD i wsp. Interim analysis of a phase 1 study of the antibody-drug conjugate SGN-CD19A in relapsed or refractory B-lineage non-hodgkin lymphoma. Blood 2014; 124: Viardot A, Goebeler M, Hess G i wsp. Treatment of relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma with the bispecific T-cell engager (BiTE ) antibody construct blinatumomab: Primary analysis results from an open-label, phase 2 study. Blood 2014; 124: Ansell SM, Hurviitz SA, Kooenig PA i wsp. Phase I study of ipilimumab, an anti-ctla-4 monoclonal antibody, in patients with relapsed and refractory B-cell non-hodgkin lymphoma. Clin Cancer Res 2009; 15: Berger R, Yang JC, Sherry RM i wsp. Phase I safety and pharmacokinetic study of CT-011, a humanized antibody interacting with PD-1, in patients with advanced hematologic malignancies. Clin Cancer Res 2008; 14: Armand P, Nagler A, Weller EA i wsp. Disabling immune tolerance by programmed death-1 blockade with pidilizumab after autologous hematopoietic stem-cell transplantation for diffuse large B-cell lymphoma: Results of an international phase II trial. J Clin Oncol 2013; 31: Ansell SM, Lesokhin AM, Borello I i wsp. PD-1 blockade with nivolumab in relapsed or refractory Hodgkin s lymphoma. N Engl J Med 2015; 372: Lesokhin AM, Ansell SM, Armand P i wsp. Preliminary results of a phase I study of nivolumab (BMS ) in patients with relapsed or refractory lymphoid malignancies. Blood 2014; 124: Moskowitz CH, Ribrag V, Michot J i wsp. PD-1 blockade with the monoclonal antibody pembrolizumab (MK-3475) in patients with classical hodgkin lymphoma after brentuximab vedotin failure: Preliminary results from a phase 1b study (KEYNOTE-013). Blood 2014; 124: Testing Pembrolizumab (pd1 antibody) with R-CHOP for Previously Untreated DLBC Lymphoma; dostępne na: Yang Y, Shaffer AL 3rd, Tolga Emre NC i wsp. Exploiting synthetic lethality for the therapy of ABC diffuse large B-cell lymphoma. Cancer Cell 2012; 21: Ezell SA, Mayo M, Bihani T i wsp. Synergistic induction of apoptosis by combination of BTK and dual mtorc1/2 inhibitors in diffuse large B cell lymphoma. Oncotarget 2014; 5:

81 Rozdział Mathews Griner LA, Guha R, Shinn P i wsp. High-throughput combinatorial screening identi es drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111: Portell CA, Axelrod MJ, Brett LK i wsp. Synergistic cytotoxicity of ibrutinib and the BCL2 antagonist ABT- 199 in mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia: Molecular analysis reveals mechanisms of target interactions. Clin Cancer Res 2015; 21: Abstract B Lee JS, Tang SS, Ortiz V i wsp. MCL-1-independent mechanisms of synergy between dual PI3K/ mtor and BCL-2 inhibition in diffuse large B cell lymphoma. Oncotarget 2015; 6: Li L, Pongtornpipat P, Tiutan T i wsp. Synergistic induction of apoptosis in high-risk DLBCL by BCL2 inhibition with ABT-199 combined with pharmacologic loss of MCL1. Leukemia 2015; 29: Paoluzzi L, Gonne M, Bhagat G i wsp. The BH3-only mimetic ABT-737 synergizes the antineoplastic activity of proteasome inhibitors in lymphoid malignancies. Blood 2008; 112: Bojarczuk K, Siernicka M, Dwojak M. B-cell receptor pathway inhibitors affect CD20 levels and impair antitumor activity of anti-cd20 monoclonal antibodies. Leukemia 2014; 28:

82

83 ROZDZIAŁ 4 ROLA PRZESZCZEPIENIA KRWIOTWÓRCZYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH STAN WIEDZY NA 2015 ROK Piotr Rzepecki Chociaż początki przeszczepiania komórek krwiotwórczych sięgają lat 50. XX wieku, prawdziwy postęp dokonał się w ciągu ostatnich 30 lat. Przeszczepienie autologicznych bądź alogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej lub szpiku kostnego znajduje szerokie zastosowanie w leczeniu wielu chorób. Dotyczy to przede wszystkim patologii układu krwiotwórczego, tj.: niedokrwistości aplastycznej, ostrych białaczek szpikowych i limfoblastycznych, a ponadto zespołów mielodysplastycznych, chłoniaków nieziarniczych, ziarnicy złośliwej oraz przewlekłej białaczki szpikowej. U wielu chorych ta metoda terapii, zastosowana zgodnie z ustalonymi wskazaniami, umożliwia wyleczenie lub znaczne przedłużenie życia. Obecnie transplantacje komórek krwiotwórczych są wykonywane nie tylko ze wskazań hematologicznych. Znalazły również miejsce w leczeniu niedoborów odpornościowych, genetycznie uwarunkowanych schorzeń metabolicznych i guzów litych. Główne przyczyny niepowodzeń tej formy terapii stanowią: nawrót choroby nowotworowej, zakażenia z powodu zaburzeń odporności, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (graft versus host disease GvHD) i choroba obturacyjna drobnych żył wątrobowych [1 6]. Definicje przeszczepienia macierzystych komórek krwiotwórczych Przeszczepienie szpiku kostnego to zabieg polegający na podaniu pacjentowi preparatu zawierającego komórki macierzyste hematopoezy (krwiotworzenia), które są w stanie odtworzyć jego układ krwiotwórczy, który został zniszczony lub uszkodzony w czasie wcześniejszej chemioterapii i/lub radioterapii (przeszczepienie autologicz 81

84 Piotr Rzepecki ne), albo zastąpić patologiczną hematopoezę chorego (np. w przebiegu białaczki) komórkami hematopoetycznymi osoby zdrowej (przeszczepienie alogeniczne). Pod potocznym pojęciem przeszczep szpiku mieści się także przetoczenie macierzystych komórek hematopoetycznych izolowanych z krwi obwodowej w czasie zabiegu zwanego leukaferezą po ich wcześniejszej mobilizacji z użyciem cytokin lub cytostatyków [2 4]. Rodzaje przeszczepień macierzystych komórek krwiotwórczych Przeszczepienia możemy podzielić ze względu na źródło komórek macierzystych lub rodzaj dawcy komórek. Przeszczepienia w zależności od źródła komórek: przeszczepienie szpiku kostnego (bone marrow transplantation BMT) przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych pobranych od dawcy poprzez wielokrotne nakłuwanie i aspirację szpiku z talerzy kości biodrowych, przeszczepienie komórek macierzystych izolowanych z krwi obwodowej (peripheral blood stem cells transplantation PBSCT) przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych pobranych od dawcy poprzez separację komórek krwiotwórczych z krwi obwodowej za pomocą specjalnego separatora, przeszczepienie komórek macierzystych izolowanych z krwi pępowinowej (cord blood stem cells transplantation) przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych, które uzyskano z kilku jednostek krwi pępowinowej [7]. Przeszczepienia w zależności od dawcy materiału przeszczepowego: przeszczepienie autologiczne polega na podaniu własnych komórek macierzystych z krwi obwodowej lub szpiku pobranych od pacjenta przed rozpoczęciem leczenia. Ma działanie mieloablacyjne (lub submieloablacyjne). Tego typu przeszczepy są generalnie bezpieczniejsze (nie ma GvHD), więc można je wykonywać u pacjentów starszych (do 65. roku życia). Ze względu na ryzyko zanieczyszczenia przeszczepianego szpiku komórkami nowotworowymi oraz brak korzystnej reakcji przeszczep przeciwko białaczce (graft versus leukemia GvL) wyniki leczenia tą metodą białaczek i innych nowotworów hematologicznych są nieco gorsze niż w przypadku przeszczepów alogenicznych. W ramach programów badawczych prowadzi się próby oczyszczania preparatów komórkowych z resztkowej populacji komórek nowotworowych. Można tego dokonać na dwa sposoby: za pomocą selekcji pozytywnej komórek macierzystych (najczęściej z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych przeciwko antygenowi CD-34 za pomocą immu noabsorpcji magnetycznej) lub selekcji negatywnej, która wykorzystuje różne metody eliminowania z preparatu komórkowego komórek nowotworowych (np. zastosowanie cytotoksycznych przeciwciał przeciw antygenom specyficznym dla komórek nowotworowych) [7]; przeszczepienie syngeniczne przeszczepienie szpiku lub komórek macierzystych z krwi obwodowej od bliźniaka homozygotycznego (jednojajowego). Nie występuje reakcja GvL i GvHD. Jedyną różnicą mogącą mieć znaczenie kliniczne w porów 82

85 Rozdział 4 naniu z przeszczepieniem autologicznym jest to, że nie należy się obawiać zanieczyszczenia materiału przeszczepowego komórkami nowotworowymi [7]; przeszczepienie alogeniczne przeszczep (materiał przeszczepowy) pochodzi od osoby niebędącej bliźniakiem homozygotycznym biorcy. Wyróżnia się: przeszczepienie od dawcy rodzinnego w praktyce jest możliwe przeszczepienie szpiku jedynie od rodzeństwa (sibling donor), gdyż tylko wtedy istnieje szansa na odpowiednią zgodność antygenów zgodności tkankowej (major histocompatibility complex MHC). Przeszczepy od innych członków rodziny (rodziców, dzieci, innych krewnych) są w praktyce możliwe jedynie w małych, zamkniętych populacjach mających ujednoliconą pulę genową wskutek długotrwałego krzyżowania się osobników spokrewnionych. Najczęściej wystarcza zgodność w zakresie antygenów HLA-A, HLA-B (MHC klasa I) i HLA-DR (MHC klasa II). Oznacza to, że dawca i biorca muszą być zgodni w zakresie 6 alleli (dwie kopie każdego z wymienionych genów). Niekiedy, przy braku innego dawcy, dopuszcza się niezgodność w obrębie jednego allela (tzw. mismatched family donor) [8, 9]; przeszczepienie od dawcy niespokrewnionego tego typu przeszczepienia wykonuje się w przypadku braku zgodnego dawcy rodzinnego. Dawcy niespokrewnionego szuka się w krajowych i zagranicznych bankach szpiku, które de facto są jedynie bazami danych zawierającymi informacje o potencjalnych dawcach i ich antygenach HLA. Proces wyszukiwania dawcy jest długotrwały i kosztowny, gdyż banki dysponują jedynie profilami antygenowymi uzyskanymi metodami o małej rozdzielczości i wstępnie wyznaczeni kandydaci na dawców wymagają dodatkowego badania. W Polsce za wyszukiwanie dawców niespokrewnionych odpowiada Poltransplant [1]. Typowy dawca rodzinny to identyczny w 6 allelach transplantacyjnych brat lub siostra. Szczególnym przypadkiem jest dawca syngeniczny, kiedy pacjent ma bliźniacze rodzeństwo. Każdy inny dawca spokrewniony (np. haploidentyczny, z połową zgodnych alleli: matka lub ojciec) lub dawca niespokrewniony (marrow unrelated donor MUD) nazywany jest dawcą alternatywnym. Przeszczepienia w zależności od zastosowanego wcześniej leczenia (kondycjonowania): przeszczepienie poprzedzone schematem kondycjonującym mieloablacyjnym poprzedzone terapią (chemioterapią i/lub radioterapią), która ma na celu zniszczenie resztkowej choroby nowotworowej, ale przy takiej chemioterapii dochodzi do całkowitego zniszczenia układu krwiotwórczego biorcy. Przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych (autologiczne lub alogeniczne) jest przede wszystkim potrzebne do tego, aby pacjent mógł przeżyć procedurę przeszczepową. Ze względu na toksyczność stosowanych w tym wskazaniu schematów chemioterapii i/lub radioterapii takie przeszczepienia przeprowadza się jedynie u pacjentów młodszych (do 50. roku życia) lub w bardzo dobrym stanie ogólnym [7]; przeszczepienie poprzedzone schematem kondycjonującym niemieloablacyjnym (poprzedzone zredukowanym kondycjonowaniem) podana chemioterapia (lub radioterapia) nie niszczy komórek nowotworowych ani układu krwiotwórczego biorcy. Jej zadaniem jest jedynie spowodowanie głębokiej immunosupresji, która uniemożliwia 83

86 Piotr Rzepecki odrzucenie przeszczepu. Za zniszczenie układu krwiotwórczego biorcy i resztkowej choroby nowotworowej odpowiadają limfocyty T dawcy zawarte w przeszczepianym materiale. Ta metoda może być więc stosowana jedynie w przypadku przeszczepów alogenicznych. Pacjent przechodzi przez okres chimeryzmu częściowego (tzw. mieszanego), kiedy jego układ krwiotwórczy składa się z dwóch populacji komórek własnych i pochodzących od dawcy. Dopiero osiągnięcie etapu chimeryzmu całkowitego, kiedy cała hematopoeza pochodzi od komórek macierzystych dawcy, oznacza przyjęcie się przeszczepu. Wówczas rozwija się również reakcja GvL lub przeszczep przeciwko guzowi (graft versus tumor GvT), która polega na tym, że pochodzące od dawcy limfocyty T eliminują resztkowe komórki nowotworowe. W celu wzmocnienia tej reakcji i przyspieszenia osiągnięcia całkowitego chimeryzmu pacjentowi po przeszczepie podaje się infuzje limfocytów dawcy (donor lymphocyte infusion DLI). Ze względu na mniej agresywne kondycjonowanie przeszczepienia niemieloablacyjne mogą być wykonywane u pacjentów nieco starszych nawet do roku życia. Ryzyko związane z chemioterapią i radioterapią jest mniejsze, jednak ryzyko GvHD takie samo lub nawet wyższe (zwłaszcza po zastosowaniu DLI) niż przy tradycyjnym przeszczepieniu alogenicznym. Dlatego często używana w przeszłości nazwa minialoprzeszczep w odniesieniu do tej metody leczenia jest błędna [7]. Rola kondycjonowania Przeszczepienie autologicznych komórek krwiotwórczych: zniszczenie choroby zasadniczej w chorobach nowotworowych ( wysokodawkowa chemioterapia wspomagana przetoczeniem własnych komórek krwiotwórczych ), immunoablacja w chorobach z autoimmunizacji. Przeszczepienie alogenicznych komórek krwiotwórczych: zniszczenie choroby zasadniczej, przygotowanie organizmu biorcy do przyjęcia przeszczepu komórek krwiotwórczych: - opróżnienie niszy szpikowej, - wywołanie dostatecznej immunosupresji. Etapy procedury przeszczepienia macierzystych komórek krwiotwórczych Procedura przeszczepowa rozpoczyna się już w chwili rozpoznania choroby i wstępnego zakwalifikowania chorego do transplantacji auto- lub alogenicznej. Można wyróżnić cztery etapy: 1) fazę indukcji (inducion phase) konwencjonalne dawki chemioterapii są używane, aby usunąć z krwi krążące komórki nowotworowe i w celu zmniejszenia masy guza; 2) fazę mobilizacji i pobierania komórek do celów transplantacyjnych (mobilization/harvesting phase) w okresie tym wykorzystuje się czynniki wzrostu kolonii granulocytów (G-CSF) i konkretne typy chemioterapeutyków do mobilizacji chorych do transplantacji autologicznej. Takie postępowanie prowadzi do prolifera 84

87 Rozdział 4 cji i mobilizacji komórek macierzystych od szpiku do krwi. Sam czynnik wzrostu wykorzystuje się do mobilizacji dawców do transplantacji alogenicznej. Krążące komórki macierzyste są następnie zbierane za pomocą procedury zwanej aferezą. W przypadku pobierania szpiku jako materiału przeszczepowego można wykorzystywać czynniki wzrostu. Metodę pobierania szpiku, w której wykorzystuje się czynnik wzrostu G-CSF, nazywa się rich bone marrow; 3) fazę kondycjonowania (conditioning phase) w której wykorzystuje się TBI, czyli napromieniowanie całego ciała, i/lub megadawki cytostatyków do zniszczenia resztkowych komórek nowotworowych oraz szpiku chorego w celu przygotowania do zagnieżdżania komórek macierzystych w jamkach szpikowych. W przypadku schematów niemieloablacyjnych kondycjonowanie ma na celu wykorzystanie immunosupresyjnego działania niektórych cytostatyków, aby umożliwić prawidłowe przyjęcie funkcji nowego układu krwiotwórczego. Na koniec tej fazy dochodzi do infuzji komórek krwiotwórczych; 4) fazę wszczepienia (engraftment phase), którą dzieli się na 3 okresy: pierwszy wczesnej odnowy (early recovery) umownie jest to czas do 30 dni od podania przeszczepu. W tym okresie stwierdza się neutropenię, niekiedy uszkodzenia śluzówek i jamy ustnej, często dochodzi do zakażeń i spowodowanych nimi gorączek; drugi pośredni (mid-recovery) umownie określa się ten okres na dni od podania przeszczepu. W tym czasie występuje zaburzenie odporności komórkowej. Pojawia się ostra lub przewlekła postać GvHD. Stwierdza się też stany gorączkowe spowodowane zarówno przez GvHD, jak i infekcje bakteryjne, wirusowe, grzybicze, ale także oportunistyczne; trzeci późnej odnowy (late recovery) to okres po ponad 100 dniach od podania przeszczepu. Charakteryzuje się zaburzeniami odporności humoralnej i komórkowej i występowaniem wynikających z tego zakażeń. Niekiedy w tym okresie rozwija się przewlekła GvHD. Okres ten może się utrzymywać przez rok lub dłużej [7 10]. Wskazania do przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B Europejska Grupa ds. Przeszczepiania Krwi i Szpiku (European Group for Blood and Marrow Transplantation EBMT) wyróżnia cztery rodzaje wskazań do przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych: 1) rutynowe (routine R), określane również jako standardowe (standard of care S) kiedy wykonanie przeszczepienia jest w danej sytuacji składową rutynowego postępowania leczniczego; 2) opcja kliniczna (clinical option CO) wskazania do przeszczepienia z nadzorem badawczym, czyli sytuacja, kiedy istnieją jeszcze pewne wątpliwości, czy przeszczepienie jest najlepszym postępowaniem, ale jest postępowaniem co najmniej równorzędnym. Europejska Grupa ds. Przeszczepiania Krwi i Szpiku ma dla każdej z tych sytuacji protokół badań klinicznych i chorzy leczeni w ośrodkach należących do EBMT powinni być zgłaszani i leczeni 85

88 Piotr Rzepecki zgodnie z tymi protokołami. Jest to jednak sytuacja, w której istnieje już wiele dowodów na to, że przeszczepienie jest leczeniem skutecznym; 3) rozwojowe (developmental D) wskazania do przeszczepienia w warunkach eksperymentu klinicznego, czyli sytuacja, kiedy w grę wchodzi nowa jednostka chorobowa lub nowa forma zabiegu, co do których istnieją poważne przesłanki, że będą skuteczne, ale dowody trzeba dopiero zgromadzić; 4) na ogół nierekomendowane (not generally recommended NR) z reguły brak wskazań; określa sytuacje, w których zwykle nie podejmuje się ryzyka zabiegu, gdyż nie równoważą go osiągalne korzyści. Trzeba pamiętać, że dotyczy to tylko zwykłych zabiegów, ponieważ możliwe jest zastosowanie innej formy zabiegu, która okaże się skuteczna, i taka nowa forma znajdzie się wtedy w kategorii rozwojowej, czyli D. Ostateczną decyzję o wykonaniu zabiegu zawsze podejmuje kierownik ośrodka przeszczepiającego, gdyż to on ponosi odpowiedzialność za wynik zabiegu. On też decyduje o tym, czy kierowany przez niego zespół jest w stanie podjąć się zabiegu w danej konkretnej sytuacji i może zdyskwalifikować chorego, który zgodnie z tabelą mieści się w kategorii R, a zakwalifikować chorego z kategorii NR. W tej ostatniej sytuacji powinien jednak zgodnie z ustawą o zawodzie lekarza wykonywać zabieg w formule prawnej eksperymentu leczniczego, tj. eksperymentu mającego na celu próbę ratowania chorego pozbawionego innej możliwości ratunku. Ta formuła prawna wymaga uzyskania zgody odpowiedniej komisji bioetycznej na wykonanie zabiegu u danego chorego. Tabela 1. Wskazania do przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B w 2015 r. wg Europejskiej Grupy ds. Przeszczepiania Krwi i Szpiku (EBMT) [11] Choroba Stadium Zabieg ID-alloHT Zabieg MUD Zabieg Alt-alloHT Zabieg Auto-HT Chłoniak rozlany z dużych komórek B CR1 (pośrednio wysokie lub wysokie ryzyko w momencie rozpoznania wg aaipi) chemiowrażliwy nawrót, CR 2 chemiowrażliwy nawrót po niepowodzeniu auto-ht choroba oporna na leczenie GNR GNR GNR CO CO CO D S S S CO GNR CO CO D CO ID-alloHT przeszczepienie komórek krwiotwórczych od brata lub siostry identycznego w HLA; MUD w pełni zgodny w antygenach transplantacyjnych dawca niespokrewniony; Alt-alloHT przeszczepienie komórek krwiotwórczych od dawcy alternatywnego, tj. dawcy spokrewnionego lub niespokrewnionego, nie w pełni zgodnego w HLA; Auto-HT przeszczepienie autologiczne, CR remisja całkowita (i jej kolejny numer); aaipi Międzynarodowy Wskaźnik Rokowniczy skorygowany dla wieku; S standardowe wskazanie do przeszczepienia; CO wskazanie do przeszczepienia z nadzorem badawczym opcja kliniczna; D wskazanie do przeszczepienia w ramach eksperymentu klinicznego; GNR bez wskazań 86

89 Rozdział 4 Tabela 2. Wskazania do przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B w 2015 r. wg National Comprehensive Cancer Network (NCCN) [12] Choroba Stadium Zabieg ID-alloHT Zabieg MUD Zabieg Alt-alloHT Zabieg Auto-HT Chłoniak rozlany z dużych komórek B CR1 (pośrednio wysokie lub wysokie ryzyko w momencie rozpoznania wg aaipi) GNR GNR GNR CO CR1 double-hit GNR GNR GNR CO chemiowrażliwy nawrót, CR 2 chemiowrażliwy nawrót po niepowodzeniu auto-ht choroba oporna na leczenie CO CO D S S S CO GNR CO CO D CO Objaśnienia pod tabelą 1 Tabela 3. Wskazania do przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B w 2015 r. wg European Society for Medical Oncology (ESMO) [13] Choroba Stadium Przeszczepienie alogenicznych komórek krwiotwórczych Przeszczepienie autologicznych komórek krwiotwórczych Chłoniak rozlany z dużych komórek B CR1 (pośrednio wysokie lub wysokie ryzyko w momencie rozpoznania wg aaipi) GNR CO chemiowrażliwy nawrót, CR = 2 CO S chemiowrażliwy nawrót, CR 2 S CO chemiowrażliwy nawrót po niepowodzeniu auto-ht S GNR choroba oporna na leczenie CO CO Objaśnienia pod tabelą 1 87

90 Piotr Rzepecki Tabela 4. Międzynarodowy Wskaźnik Rokowniczy skorygowany dla wieku (age-adjusted International Prognostic Index aaipi) [14] Stan sprawności według WHO > 1 Stan zaawansowania Stężenie LDH w surowicy > II > normy Grupy ryzyka Ryzyko Liczba czynników Chorzy (%) Przeżycie 5-letnie (%) niskie niskie średnie wysokie średnie wysokie WHO (World Health Organization) Światowa Organizacja Zdrowia, LDH (lactate dehydrogenase) dehydrogenaza mleczanowa Tabela 5. Chłoniak rozlany z dużych komórek B double-hit [15, 16] Rodzaj nieprawidłowości translokacja genu MYC+, genu BCL2, rzadziej BCL6 translokacja trzech genów triple hit Sposób wykrywania nieprawidłowości FISH, klasyczna cytogenetyka FISH, klasyczna cytogenetyka Double expressors diffuse large B-cell lymphoma zwiększenie ekspresji białek MYC i BCL2, która nie jest w uchwytny sposób powiązana z rearanżacją odpowiednich genów metoda immunohistochemiczna: 40% komórek MYC+ i 50 70% BCL2+ FISH (fluorescent in situ hybridization) fluorescencyjna hybrydyzacja in situ Wskazania podsumowanie [11 13] 1. Przeszczepienie autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych (auto- -HSCT) pozostaje leczeniem z wyboru chemiowrażliwego nawrotu (również w erze rytuksymabu). 2. Auto-HSCT w CR1 w wybranych przypadkach pozostaje opcją kliniczną (CO), a nie standardem (S), gdyż w kilku badaniach klinicznych III fazy nie wykazano wpływu na całkowity czas przeżycia (overall survival OS). 3. Auto-HSCT w chorobie chemioopornej może wydłużyć życie chorych. 4. W przypadku nawrotu po auto-hsct wykonuje się przeszczepienie alogenicznych komórek macierzystych krwiotworzenia (allo-hsct). Długotrwałą kontrolę choroby uzyskuje się u 40% chorych, zwłaszcza w chorobie chemiowrażliwej. 5. Rzeczywista rola allo-hsct powinna zostać ustalona w badaniach klinicznych. 88

91 Rozdział 4 Tabela 6. Rola przeszczepienia autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B w pierwszej remisji całkowitej Badanie PFS/EFS OS HOVON p = NS p = NS EORTC p = NS p = NS GELA p = 0,01 p < 0,01 GHGLSG p = NS p = NS ITALY p = NS p = NS MILAN INT p < 0,01 p = NS GOELAMS (wysokie ryzyko wg IPI) p < 0,01 p < 0,01 GELA (wysokie ryzyko wg IPI) p < 0,02 p = 0,04 US intergroup p = 0,005 p = NS US intergroup (wysokie ryzyko wg IPI) p = 0,001 p = 0,01 PFS (progression-free survival) czas przeżycia wolny od progresji, EFS (event-free survival) czas przeżycia wolny od zdarzeń, OS (overall survival) przeżycie całkowite, IPI (International Prognostic Index) Międzynarodowy Wskaźnik Rokowniczy Poszukiwanie czynników prognostycznych po zastosowaniu przeszczepienia alogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych (allo-hsct) [17] Do koreańsko-japońskiego badania, gdzie wskazaniem do przeszczepienia alogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych były nawrót lub progresja choroby po przeszczepieniu autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych, włączono 30 chorych (mediana wieku 39 lat, zakres: lat). Najważniejsze wyniki badania: 5-letnie przeżycie wolne od zdarzeń (event-free survival EFS) i OS po allo-hsct wyniosły 37,9% i 42,6%, śmiertelność niezwiązana z nawrotem (non-relapse mortality NRM) 5 chorych (16,7%), analiza wieloczynnikowa, wpływ na EFS: liczba uprzednio stosowanych chemioterapii (linie) 5 (p = 0,010), chemiooporność choroby (p = 0,007); analiza wieloczynnikowa, wpływ na OS: chemiooporność choroby (p = 0,024), ECOG 2 (p = 0,005); analiza wieloczynnikowa, wpływ na NRM: liczba uprzednio stosowanych chemioterapii (linie) 5 (p = 0,042), chemiooporność choroby (p = 0,009), ECOG 2 (p < 0,001). Autorzy badania stwierdzili, że przeszczepienie alogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych stanowi dobrą opcję terapeutyczną w nawrocie i w progre 89

92 Piotr Rzepecki sji choroby po przeszczepieniu autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych, a najlepszymi kandydatami są chorzy, którzy: otrzymali < 5 linii chemioterapii, z chorobą chemiowrażliwą, w stanie sprawności ECOG < 2. Czy warto stosować pozytywną selekcję autologicznych komórek macierzystych krwiotworzenia (CD34+)? [18] W 2015 r. Tilly i wsp. opublikowali wyniki badania, które miało na celu poznanie roli pozytywnej selekcji komórek CD34+ przed przeszczepieniem autologicznym. Do badania włączyli 62 chorych z zaawansowanym chłoniakiem z komórek płaszcza (mantle cell lymphoma MCL; 53% badanych) lub nawrotowym DLBCL (47% badanych) 31 z pozytywną selekcją CD34+ i 31 chorych bez pozytywnej selekcji CD34+. Mediany czasu do rekonstytucji układu krwiotwórczego w zakresie liczby granulocytów podzielonych (bezwzględna liczba neutrofili; absolute neutrophil count ANC) i płytek krwi (platelet PLT) wyniosły 12 i 16 dni w przypadku chorych z selekcją CD34+ i 11 dni (p < 0,001) oraz 14 dni (p = 0,012) u chorych bez selekcji. Nie obserwowano różnic w toksyczności w trakcie realizacji procedury przeszczepieniowej. Pięcioletni czas wolny od progresji (progression-free survival PFS) dla chorych z pozytywną selekcją CD34+ vs bez selekcji wyniósł 67% i 39% (p = 0,016). Pięcioletni OS wyniósł 86% i 54% (p = 0,007). Autorzy badania stwierdzili, że w badanej grupie chorych przeszczepienie autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych z pozytywną selekcją CD34+ poprawia PFS i OS bez zwiększenia toksyczności. Kondycjonowanie rekomendacje Europejskiej Grupy ds. Przeszczepiania Krwi i Szpiku [19] A. Reżimy mieloablacyjne Chłoniaki BEAM ± ATG: BCNU: 300 mg/m 2 p.c. etopozyd: mg/m 2 p.c. ARA-C: mg/m 2 p.c. melfalan: mg/m 2 p.c. CBV ± ATG: cyklofosfamid (4,8 7,2 g/m 2 p.c.) BCNU: mg/m 2 p.c. etopozyd: mg/m 2 p.c. busulfan (16 mg/kg) + cyklofosfamid ( mg/kg) ± ATG cyklofosfamid (120 mg/kg) + TBI 12 Gy ± ATG 90

93 Rozdział 4 B. Reżimy niemieloablacyjne Tylko schematy chemio- lub radiochemioterapii zawierające leki w dawkach jak niżej lub mniejszych powinny być klasyfikowane jako niemieloablacyjne (reduced intensity conditioning transplants RIC HSCT). Chłoniaki busulfan 8 mg/kg m.c. ± TBI 6 Gy ± analogi puryn ± ATG cyklofosfamid 60 mg/kg m.c. ± TBI 6 Gy ± analogi puryn ± ATG TBI 6 Gy ± analogi puryn ± ATG melfalan 140 mg/m 2 p.c. + fludarabina melfalan mg/m 2 p.c. ± analogi puryn ± Campath 1H TBI 2 Gy + fludarabina 90 mg/m 2 p.c. Wybór kondycjonowania [20] Swierdlow przeprowadził badanie dotyczące wpływu różnego kondycjonowania na przeżycia chorych z DLBCL. Do badania włączono 56 chorych po auto-hsct leczonych schematem BEAM/BEAC karmustyna, etopozyd, arabinozyd cytozyny, melfalan lub cyklofosfamid vs kondycjonowanie z busulfanem (Bu). Chorzy z Bu cechowali się niższą śmiertelnością związaną z chorobą, częściej obserwowano CR po auto-hsct w przypadkach wcześniejszej PR lub chemiooporności. Oszacowane 2-letnie EFS wyniosło 59,3% vs 15,0% i OS 70,2% vs 42,0% na korzyść kondycjonowania z Bu. U chorych z DLBCL wysokiego ryzyka w CR1 kondycjonowanie z Bu korzystnie wpływało na EFS (p = 0,004) i OS (p = 0,053). Autor badania stwierdził, że przeżycia w grupie chorych z nawrotem lub chemioopornych nie różniły się w zależności od kondycjonowania. Chemioterapia BEAM (karmustyna, etopozyd, arabinozyd cytozyny, melfalan) stanowi standardowe kondycjonowanie przed podaniem przeszczepu w leczeniu chłoniaków. Nowości w kondycjonowaniu [21 27] Bendamustyna (BEN) jest cytostatykiem o strukturalnych i funkcjonalnych cechach leków alkilujących i analogów purynowych. Ma strukturę benzimidazolu z przyłączoną grupą bis(2-chloroetylo)aminową oraz łańcuchem kwasu masłowego. Łączy właściwości leków alkilujących i analogów puryn. Alkilacja grup funkcyjnych DNA prowadzi do powstania wiązań krzyżowych, głównie między nukleotydami guaninowymi. W konsekwencji dochodzi do zaburzenia czynności macierzy DNA, zaburzenia syntezy i naprawy DNA. Mechanizm działania BEN wynika bezpośrednio z unikatowej budowy chemicznej leku i z jednej strony jest związany z wywoływaniem katastrofy mitotycznej, z drugiej natomiast z indukowaniem apoptozy. Bendamustyna wykazuje niewielką oporność krzyżową z innymi lekami cytotoksycznymi lub jej nie wykazuje. Nie istnieje pełna oporność krzyżowa między BEN a antracyklinami, związkami 91

94 Piotr Rzepecki alkilującymi lub rytuksymabem. W wielu dotychczasowych badaniach klinicznych potwierdzono skuteczność tego leku w terapii nowotworów układu chłonnego. W 2011 r. grupa włoskich badaczy wskazała na rolę BEN zastosowanej w skojarzeniu z etopozydem, cytarabiną i melfalanem (BeEAM) jako leczenia kondycjonującego przed przeszczepieniem autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych u chorych na oporne i nawrotowe chłoniaki. Ustalono dawkę BEN na 200 mg/m 2 p.c. podawaną w dniach 7. i 6. U wszystkich chorych uzyskano przyjęcie się przeszczepu: ANC > 0,5 G/l i PLT > 20 G/l odpowiednio w dniach (mediana) +10. i +13. Śmiertelność związana z transplantacją w dniu wyniosła 0%. W 18-miesięcznym okresie obserwacji (mediana) 81% chorych (35 z 43 chorych) pozostawało w całkowitej remisji (complete remission CR). Typ choroby stanowiącej wskazanie do transplantacji [chłniaki nieziarnicze (non-hodgkin lymphoma NHL) vs chłniak Hodgkina (Hodgkin lymphoma HD)] i stan nowotworu w momencie zastosowania kondycjonowania (chemiowrażliwość vs chemiooporność) miały statystycznie istotny wpływ na czas wolny od choroby (disease-free survival DFS) (p = 0,01, p = 0,007). Khouri i wsp. w badaniu I i II fazy oceniali bezpieczeństwo i skuteczność różnych dawek BEN (70, 90, 110 i 130 mg/m 2 p.c./dobę przez 3 dni) w połączeniu z fludarabiną i rytuksymabem (BFR). Ten niemieloablacyjny schemat był oceniany u chorych z nawrotowymi chłoniakami (n = 41) i przewlekłą białaczką limfocytową (n = 15). W 1. fazie BEN zastosowano u 10 pacjentów i u żadnego z nich nie wystąpiła toksyczność zależna od dawki leku. W 2. fazie badania 46 chorych otrzymało BEN w dawce maksymalnej 130 mg/m 2 p.c./dobę przez 3 dni. Wśród wykonanych transplantacji było 54% przeszczepień od dawców rodzinnych i 46% od dawców niespokrewnionych. U 55% chorych nie wystąpiła ciężka neutropenia, a 88% pacjentów nie wymagało przetoczenia masy płytkowej. Częstość występowania ostrej GvHD w stopniu II IV Tabela 7. Chemioterapia BeEAM (bendamustyna, etopozyd, arabinozyd cytozyny, melfalan) Lek Dawka dobowa Dni bendamustyna 200 mg/m 2 p.c. 7., 6. etopozyd 200 mg/m 2 p.c. 5., 4., 3., 2. arabinozyd cytozyny 400 mg/m 2 p.c. 5., 4., 3., 2. melfalan 140 mg/m 2 p.c. 1. Tabela 8. Chemioterapia BFR (bendamustyna, fludarabina, rytuksymab) Lek Dawka dobowa Dni rytuksymab 375 mg/m 2 p.c. 13. rytuksymab 1000 mg/m 2 p.c. 6., +1., +8. fludarabina 30 mg/m 2 p.c. 5., 4., 3. bendamustyna 130 mg/m 2 p.c. 5., 4., 3. 92

95 Rozdział 4 wyniosła 11%. Dwuletnie prawdopodobieństwo rozwoju przewlekłej GvHD (extensive chronic GvHD) wyniosło 26%. W okresie obserwacji (mediana) 26 miesięcy (zakres 6 50 miesięcy) wskaźniki OS i PFS wyniosły odpowiednio 90% i 75%. Z przytoczonych badań wynika, że zastosowanie BEN w kondycjonowaniu przed podaniem przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych z powodu chłoniaków charakteryzuje się bardzo korzystnym profilem bezpieczeństwa oraz znaczną skutecznością. Przyszłe badania określą rolę BEN w transplantologii komórek krwiotwórczych. Wrażliwość nowotworów układu krwiotwórczego i chłonnego na efekt przeszczep przeciwko chorobie analiza EBMT [28] W procedurze przeszczepienia autologicznych komórek krwiotwórczych siła działania przeciwko chorobie stanowiącej wskazanie do wykonania transplantacji opiera się na zastosowaniu wysokodawkowej chemio- bądź chemioradioterapii. Natomiast przy transplantacji alogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych poza ww. efektem pojawia się nowy sprzymierzeniec, jakim są przeszczepione i nowo powstające w organizmie biorcy limfocyty dawcy. Mogą one wywierać dwa przeciwstawne działania: chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) oraz efekt przeszczep przeciwko chorobie (GvT). Jak oszacować prawdopodobieństwo rozwoju tego pożądanego działania przeszczepionych limfocytów? Kolejną próbę udzielenia odpowiedzi na to pytanie przedstawiono w analizie EBMT w roku Badanie zostało oparte na hipotezie, że ocena korelacji pomiędzy wystąpieniem GvHD a nawrotem choroby będącej powodem wykonania transplantacji może być surogatem prawdopodobieństwa rozwoju efektu GvT, innymi słowy oceniać wrażliwość schorzenia na działanie przeszczepionych, aloreaktywnych limfocytów. W latach autorzy opracowania ocenili transplantacji (pierwszych) alogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych. U chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (myelosis leukaemica chronica CML) stwierdzono ewidentny spadek ryzyka nawrotu nowotworu, proporcjonalnie do stopnia ciężkości rozwijającej się po transplantacji ostrej bądź przewlekłej GvHD. Podobne wyniki uzyskano, oceniając pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną i zespołami mieloproliferacyjnymi BCR/ABL-ujemnymi. Korelację w stopniu pośrednim między GvHD a ryzykiem nawrotu stwierdzono w zespołach mielodysplastycznych i chorobach limfoproliferacyjnych. Natomiast u pacjentów z ostrą białaczką szpikową i dyskrazjami plazmocytów obserwowano tylko słabą zależność pomiędzy pojawieniem się GvHD a ryzykiem nawrotu. Z wyjątkiem dyskrazji plazmocytów, w pozostałych jednostkach chorobowych współczynnik ryzyka nawrotu obniżał się do wartości bliskich zeru w okresie obserwacji do 48 miesięcy po podaniu przeszczepu. Uzyskane wyniki potwierdzają istnienie silnego wpływu wystąpienia GvHD na pojawienie się efektu GvT. Ta korelacja jest odmienna w różnych nowotworach 93

96 Piotr Rzepecki układu krwiotwórczego i chłonnego. Równocześnie stwierdzenie zmniejszenia liczby nawrotów po przeszczepieniu w różnych nowotworach pomimo istnienia w tych schorzeniach niskiej korelacji GvHD/GvT wskazuje, że efekt GvT może wystąpić pomimo braku pojawienia się objawów GvHD. To zjawisko jest obserwowane zwłaszcza u pacjentów z ostrą białaczką szpikową. Mobilizacja autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych z zastosowaniem pleryksaforu na podstawie doniesień z EHA 2015 [29, 30] Pleryksafor jest pochodną bicyklamową, odwracalnym antagonistą receptora chemokinowego CXCR4. Blokuje wiązanie ligandu macierzystego, zrębowego czynnika 1a (SDF-1a, inna nazwa CXCL12). Przyjęto następujący mechanizm zwiększenia leukocytozy i liczby krążących macierzystych komórek progenitorowych: po podaniu pleryksaforu następuje zerwanie wiązania natywnego ligandu z receptorem chemokinowym CXCR4, co prowadzi do uwolnienia do krwi krążącej komórek dojrzałych i multipotencjalnych. Po podaniu pleryksaforu dochodzi do mobilizacji prawidłowych funkcjonalnie komórek CD34+ zdolnych do przejęcia funkcji krwiotwórczej i repopulacji hematopoetycznej. Na EHA 2015 przedstawiono aktualizację wyników mobilizacji autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych z użyciem pleryksaforu wg protokołu obowiązującego od 2009 r. w Mayo Clinic (USA). Powszechnie wiadomo, że zastosowanie pleryksaforu zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania wystarczającej liczby autologicznych komórek macierzystych krwiotworzenia do bezpiecznego przeprowadzenia transplantacji. Wysoka ocena pleryksaforu pozwala jednak na jego zastosowanie tylko w określonych sytuacjach klinicznych. Algorytm postępowania obowiązujący od 2009 r. w Mayo Clinic zakłada wykorzystanie pleryksaforu, gdy po zastosowaniu G-CSF jako jedynej formy mobilizacji: liczba komórek CD34+ w dniu 4. wynosi < 10/µl w przypadku pojedynczej transplantacji, liczba komórek CD34+ w dniu 4. wynosi < 20/µl w przypadku chęci przeprowadzenia > 1 transplantacji, liczba uzyskanych komórek CD34+ w 1. dniu separacji wynosi < 1,5 mln/kg m.c., liczba uzyskanych komórek CD34+ w następnych dniach separacji wynosi < 0,5 mln/ kg m.c. Celem mobilizacji jest uzyskanie liczby komórek CD34+ w zakresie 3 5 mln/kg m.c. Pożądana wartość zależy od choroby stanowiącej powód wykonania przeszczepienia autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych. Opracowano wyniki 1080 mobilizacji wykonanych w latach u 1068 chorych, w tym u 548 ze szpiczakiem plazmocytowym (MM 51%), 327 z chłoniakami nieziarniczymi (NHL 30%), 144 z pierwotną amyloidozą lub chorobą depozytową łańcuchów lekkich (AL/LCD 13%) i 61 z chorobą Hodgkina (HD 6%). Ponad połowa (55%) chorych wymagała zastosowania pleryksaforu (MM 58%, NHL 61%, AL/LCD 35%, HL 46%). U większości pacjentów (77%) pleryksafor był 94

97 Rozdział 4 włączany po 4. dniu z powodu suboptymalnych kolekcji krwiotwórczych komórek macierzystych. Mediana dni zastosowania pleryksaforu wyniosła 2. Spośród chorych 42% wymagało zastosowania pleryksaforu przez ponad 2 dni, a 23% przez ponad 3 dni. Chorzy z NHL statystycznie istotnie częściej wymagali zastosowania pleryksaforu w porównaniu z innymi pacjentami: 50% NHL vs 41% MM, 40% HL i 23% AL/ LCD; p = 0,004. Mediana liczby uzyskanych CD34+ wyniosła 7,4 mln/kg m.c. (zakres 5,2 9,9 mln). U 9 (mniej niż 1%) i 22 (2%) chorych uzyskano poniżej 2 i 2,5 mln CD34+/kg m.c. U chorych z NHL statystycznie istotnie częściej uzyskano nieoptymalną liczbę CD34+, tj. poniżej 2,5 mln/kg m.c.: 4% NHL vs 1% MM, 2% AL/LCD i 0% HL, p = 0,002. Mediana liczby dni aferezy wyniosła 2 i była wyższa u chorych z NHL, p = 0,002. Mediana liczby komórek CD34+ uzyskanych w trakcie jednej separacji wyniosła 3,6 mln/kg m.c. i była wyższa u chorych z MM i AL/LCD vs NHL i HD (p < 0,001). Mediany czasu do przyjęcia się przeszczepu w zakresie ANC i PLT wyniosły odpowiednio 14 i 13 dni. Nie obserwowano różnic w czasie do uzyskania ANC > 0,5 G/l, natomiast czas do uzyskania liczby płytek krwi > 20 G/l bez konieczności transfuzji był dłuższy u chorych wymagających zastosowania pleryksaforu. W podsumowaniu autorzy doniesienia podkreślają skuteczność pleryksaforu w grupie ponad 1000 chorych i w okresie stosowania wynoszącym ponad 4 lata. Liczba nieefektywnych mobilizacji była niska. Spośród chorych 45% nie wymagało podania pleryksaforu, co potwierdza zasadność wdrożenia ww. algorytmu wskazań w odniesieniu do zastosowania leku w celu obniżenia kosztów mobilizacji. W trakcie trwania EHA 2015 przedstawiono również wyniki badania III fazy, z randomizacją, przeprowadzonego metodą podwójnie ślepej próby i z użyciem placebo oceniającego zastosowanie pleryksaforu z G-CSF vs placebo + G-CSF w celu uzyskania 5 mln komórek CD34+ u chorych na chłoniaki nieziarnicze, kwalifikowanych do przeszczepienia autologicznych krwiotwórczych komórek macierzystych w Chinach. Udowodniono, że zastosowanie schematu pleryksafor + G-CSF vs placebo + G-CSF statystycznie istotnie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania optymalnej i minimalnej liczby komórek CD34+ koniecznych do transplantacji. Pleryksafor również w populacji chińskiej okazał się lekiem bezpiecznym i dobrze tolerowanym. Piśmiennictwo 1. Centralny Rejestr Niespokrewnionych Dawców Szpiku i Krwi Pępowinowej. 2. Dmoszyńska A, Robak T. Podstawy hematologii. Wydawnictwo Czelej, Lublin Benito AI, Gonzales-Vincent M, Garcia F i wsp. Allogenic peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) from HLA-identical sibling donors in children with hematological diseases: a single center pilot study. Bone Marrow Transplant 2001; 28: Onkologia kliniczna. Krzakowski M (red.). Wydanie II rozszerzone. Borgis Wydawnictwo Medyczne, Warszawa Barat B, Anna M. Metabolic biotinylation of recombinant antibody by biotin ligase retained in the endoplasmic reticulum. Biomol Eng 2007; 24: DeChancie J, Houk KN. The origins of femtomolar protein-ligand binding: hydrogen bond cooperativity and desolvation energetics in the biotin-(strept) avidin binding site. J Am Chem Soc 2007; 129: Appelbaum FR, Forman SJ, Negrin RS i wsp. (red.). Thomas Hematopoietic Cell Transplantation. Wiley- Blackwell, Hoboken Apperley J, Carreras E, Gluckman E i wsp. The 2012 revised edition of the EBMT-ESH Handbook on Haemopoietic Stem Cell Transplantation. Chugai Sanofi Aventis, Genua

98 Piotr Rzepecki 9. Mehta J, Singhal S, Gee AP i wsp. Bone marrow transplantation from partially HLA-mismatched family donors for acute leukemia: single-center experience of 201 patients. Bone Marrow Transplant 2004; 33: Antin JH, Raley DY. Manual of Stem Cell and Bone Marrow Transplantation. Cambridge Medicine, Sureda A, Bader P, Cesaro S i wsp. Indications for allo- and auto-sct for haematological diseases, solid tumours and immune disorders: current practice in Europe, Bone Marrow Transplant 2015; 50: NNCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Non-Hodgkin`s Lymphomas; version org 13. Tilly H, Gomes da Silva M, Vitolo U i wsp. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL): ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2015; 26 Suppl 5: v The International Non-Hodgkin s Lymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model for aggressive non-hodgkin s lymphoma. N Engl J Med 1993; 329: Swerdlow SH. Diagnosis of double-hit diffuse large B-cell lymphoma and B-cell lymphoma unclassifiable, with features intermediate between DLBCL and Burkitt lymphoma: when and how, FISH versus IHC. Hematology 2014; 2014: Petrich AM, Gandhi M, Jovanovic B i wsp. Impact of induction regimen and stem cell transplantation on outcome in double-hit lymphoma: a multicenter retrospective analysis. Blood 2014; 124: Ji-Won K, Sung-Won K, Kohei T i wsp. Allogeneic stem cell transplantation in patients with de novo diffuse large B-cell lymphoma who experienced relapse or progression after autologous stem cell transplantation: a Korea-Japan collaborative study. Ann Hematol 2014; 93: Berger MD, Branger G, Leibundgut K i wsp. CD34+ selected versus unselected autologous stem cel transplantation in patients with advanced-stage mantle cel and diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia Research 2015; 39: Rzepecki P, Skrzyński W, Olszewska-Szopa M. Wspólnie damy radę chemioterapia, przeszczepianie krwiotwórczych komórek macierzystych. Medical Education Sp. z o.o., Warszawa Shin HJ, Lee WS, Lee HS i wsp. Busulfan-containing conditioning regimens are optimal preparative regimens for autologous stem cell transplant in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma 2014; 55: Visani G, Malerba L, Stefani PM i wsp. BeEAM (bendamustine, etoposide, cytarabine, melphalan) before autologous stem cell transplantation is safe and effective for resistant/relapsed lymphoma patients. Blood 2011; 118: Khouri IF, Wei W, Korbling M i wsp. BFR (bendamustine,fludarabine, and rituximab) allogeneic conditioning for chronic lymphocytic leukemia/lymphoma: reduced myelosuppression and GVHD. Blood 2014; 124: Rummel MJ, Al-Batran SE, Kim SZ i wsp. Bendamustine plus rituximab is effective and has a favorable toxicity profile in the treatment of mantle cell and low-grade non-hodgkin s lymphoma. J Clin Oncol 2005; 23: Fischer K, Cramer P, Busch R i wsp. Bendamustine in combination with rituximab for previously untreated patients with chronic lymphocytic leukemia: a multicenter phase II trial of the German Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group. J Clin Oncol 2012; 30: Damaj G, Gressin R, Bouabdallah K i wsp. Results from a prospective, open-label, phase II trial of bendamustine in refractory or relapsed T-cell lymphomas: the BENTLY trial. J Clin Oncol 2013; 31: Ohmachi K, Niitsu N, Uchida T i wsp. Multicenter phase II study of bendamustine plus rituximab in patients with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol 2013; 31: Rummel MJ, Niederle N, Maschmeyer G i wsp. Study group indolent Lymphomas (StiL). Bendamustine plus rituximab versus CHOP plus rituximab as first-line treatment for patients with indolent and mantlecell lymphomas: an open-label, multicentre, randomised, phase 3 noninferiority trial. Lancet 2013; 381: Stern M, de Wreede LC, Brand R i wsp. Sensitivity of hematological malignancies to graft-versus-host effects: an EBMT megafile analysis. Leukemia 2014; 28: Ferzoco RM, Micallef IN, Winters J i wsp. Updated results of the Mayo Clinic risk adapter algorithm for peripheral blood stem cell mobilization utilizing G-CSF and plerixafor. Haematologica 2015; 100 (Suppl 1): Zhu J, Huang H, Chen H i wsp. A phase 3, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of plerixafor + G-CSF vs placebo+ G-CSF to mobilize 5 x 10^6 CD34+ cells/kg in Chinese NHL patients for autologous transplantation. Haematologica 2015; 100 (Suppl 1):

99

100 ISBN: