Techniki w badaniu biochemicznym surowicy

Transkrypt

1 Techniki w badaniu biochemicznym surowicy Kolorymetria, nefelometria, refraktometria Oznaczanie ilościowe: stężenia, aktywności Badanie produktów i substratów. Badania czynnościowe Profile narządowe Lokalizacja enzymów Lokalizacja w tkankach ALT wątroba (psy, koty) AST wątroba, serce (psy, koty), mięśnie LDH wątroba, serce (psy), mięśnie (koty) ALP jelita (psy), wątroba, kości, nerka (psy, koty) GGT nerka, wątroba, trzustka (psy) CK mięśnie, serce Lokalizacja w komórkach Cytoplazma: ALT, AST1, LDH, SDH, CK Mitochondria: AST2 Błony komórkowe: GGT, ALP Ziarnistości cytoplazmatyczne: amylaza, lipaza, trypsyna W okresie nasilania choroby większy wzrost AST W okresie zdrowienia wyższa aktywność ALT W chorobach przewlekłych wartości niskie Izoenzymy ALP w tkankach kostny (BALP) wątrobowy (LALP) nerkowy (niespecyficzny, tkankowy TALP) łożyskowy jelitowy (IALP) stymulowany poziomem glikokortykosteroidów (CALP) 1

2 Czynniki wpływające na aktywność ALP dieta węglowodany redukujące, reagując z aminokwasami także enzymatycznymi, obniżają ich aktywność płeć u suk w ciąży występuje izoenzym łożyskowy rasa wyjątkowo u terierów szkockich notowana jest wyższa aktywność fosfatazy zasadowej Rozdział izoenzymów ALP Termostabilność BALP inaktywacja w temp C w ciągu 6 min. LALP słabiej CALP odporna Uwagi: 1. Próba wymaga przestrzegania czasu inkubacji (bywa też stosowana w wersji 65 0 C przez 2 min). 2. Konieczna stała kontrola temperatury (termostat wodny), przerwanie reakcji w łaźni lodowej i natychmiastowe oznaczenie aktywności. 3. Ślady hemolizy wykluczają próbkę z oznaczenia ALP. 4. Na poziom oznaczonego CALP ma wpływ ph krwi, stężenie białka całkowitego oraz rodzaj stosowanego substratu. 5. Oznaczenia należy wykonywać zawsze w tym samym laboratorium! Rozdział izoenzymów ALP Inne metody Elektroforeza na octanie celulozy (metoda jakościowa) Rozdział metodą immunologiczną przy pomocy mab Inaktywacja Lβ fenyloalanina (inaktywująca BALP) Lhomoarginina (głównie LALP) Lleucyna (IALP) mleczan rywanolu (wytrąca LALP) lewamizol (4,2 mm) (LALP i BALP)! 2

3 Interpretacja wyników BALP BALP jest obecny w osteoblastach zależność między aktywnością w surowicy a wzrostem kości wzrost w kostniakomięsaku typu osteoblastycznego, nie zawsze w innych nowotworach kości (max. 23x) wzrost w nerkowej nadczynności przytarczyc nie stwierdza się wzrostu aktywności BALP przy złamaniach i uszkodzeniach mechanicznych kości Interpretacja wyników LALP LALP jest obecny w komórkach śródbłonków i hepatocytach wzrost przy uszkodzeniu komórek drógżółciowych przy uszkodzeniu wątroby wywołanym glikokortykosteroidami gromadzeniem się miedzi stłuszczeniem wątroby pierwotnymi i wtórnymi nowotworami wątroby zespoleniem obocznym wrotnogłównym martwicą uszkodzenie hepatocytów powoduje wzrost aktywności ALT i wyniki oznaczeń obu enzymów tworzą pełny obraz zmian! Interpretacja wyników CALP CALP wytwarzany jest w komórkach wątroby sąsiadujących z kanalikamiżółciowymi Wzrost aktywności u psów po glikokortykosteroidach w spontanicznym lub jatrogennym hiperadrenokortykoizmie diagnozowanie zespołu Cushinga w termicznej inaktywacji usuwany jest BALP i LALP aktywność CALP daje wynik zbliżony do wyniku przed inaktywacją test lewamizolowy monitorowanie leczenia przy nowotworach, w tym wątroby (jako efekt stresu i wydzielania przez organizm glikokortykosteroidów) w chorobach przewlekłych np. w cukrzycy czy zapaleniu wątroby, kiedy poziom CALP a nie LALP określa stopień zaawansowania choroby 3

4 Ocena gospodarki węglowodanowej Badania krwi Stężenie glukozy Stężenie glikowanych białek Badania moczu Stężenie glukozy Stężenie związków ketonowych Badania czynnościowe Test obciążania glukozą Test tolerancji insuliny Krzywa cukrowa w kontroli leczenia Test obciążania glukagonem Zabezpieczenie próbek i czas ich przechowywania Krew Osocze (z EDTA2K i NaF) oddzielenie erytrocytów do 60 min ( 7%) czas przechowywania do 24 godziny w 4 0 C Pełna (z EDTA2K i NaF) oznaczać bezpośrednio po pobraniu Surowica czas przechowywania do 2 tyg. w 12 0 C Mocz oznaczać bezpośrednio po pobraniu Wartości referencyjne glukozy osocza krwi żylnej PIES KOT mg/dl mg/dl 3,9 6,1 mmol/l 5,9 10 mmol/l Wyniki fałszywie dodatnie: po jedzeniu do 20% w wyniku stresu u kotów do ponad 300 mg/dl Do porównywania wyników oznaczenia zawsze stosować ten sam rodzaj próbek! 4

5 Hemoglobina glikozylowana Jest mieszaniną pochodnych hemoglobiny glikozylowanych przy różnych aminokwasach: HbA 1C i HbA 1 Glikozylacja jest procesem nieodwracalnym i HbA usuwana jest z krwi przy rozpadzie erytrocytów. Czas półtrwania 120 dni glikemia sprzed 45 tygodni Stężenie HbA 1C jest skorelowane z wysokością i czasem hiperglikemii dlatego nazywana jest pamięcią poziomu glikemii. Frakcja HbA 1C nadaje się do oznaczeń ilościowych (krew z EDTA, analizator) Wartości prawidłowe: pies 46%, kot <3% Fruktozamina Glikozylowana albumina i γglobulina Zakres wartości w dobrze kontrolowanej cukrzycy: u psów poniżej 300 (250320) µmol/l, u kotów poniżej 400 (146271) µmol/l Czas półtrwania białek: 12 tygodnie Na wyniki ma wpływ: Różny skład białek, w tym białka ostrej fazy i przemiana białkowa w nadczynności tarczycy Stan nawodnienia Bilirubinemia Hemoliza Badania czynnościowe Test obciążania glukozą (test tolerancji glukozy)1 Przez 12 godzin nie podawać wody Podać sondą 3 ml/kg mc. 40% glukozy Po 2 godz. oznaczyć stężenie glukozy we krwi włośniczkowej Interpretacja Prawidłowa tolerancja glukozy <130 mg/dl Obniżona tolerancja glukozy mg/dl Cukrzyca >180 mg/dl 5

6 Badania czynnościowe Test obciążania glukozą (test tolerancji glukozy)2 Podać sondą 1,75g/kg mc. 25% glukozy Pobrać krew w 30, 60, 90, 120 i 180 min Powrót do normy w 60 min min 60 min 90 min 120 min 180 min Badania czynnościowe Test tolerancji insuliny Podać małą dawkę (0,4 U/kg) krótkodziałajacej insuliny Pobrać krew w 30, 60 i 90 min. Oznaczyć stężenie glukozy Po 30 min obniżenie stężenia glukozy o 5070% a po 60 powrót do wartości wyjściowych min 60 min 90 min Badania czynnościowe Krzywa cukrowa w leczeniu insuliną Oznaczenie wyjściowego stężenia glukozy w osoczu na czczo przed podaniem insuliny Oznaczanie stężenia glukozy w odstępach co 2 godziny przez 12 godzin od momentu podania insuliny i nakarmienia 350 Interpretacja krzywej: 300 Szczyt działania insuliny Najniższe stężenie glukozy mg/dl Różnica między najwyższym i najniższym stężeniem glukozy nie powinna przekraczać u psów 200, u kotów 300 mg/dl godz godz godz godz godz godz 6

7 Badania czynnościowe Test obciążania glukagonem 12godzinna głodówka glukagon dożylnie w dawce 0,03 mg/kg mc. krew do badania stężenia glukozy pobierana jest przed testem oraz po 15, 30, 60 i 90 minutach od podania glukagonu. Interpretacja Wynik prawidłowy przy pierwszym pobraniu (po 15 minutach) około 200 mg/dl, a po 60 minutach około 100 mg/dl. Przy obniżonej zdolności wątroby do magazynowania glikogenu już po pierwszych minutach stężenie glukozy po teście jest równe stężeniu przed testem. Ocena gospodarki hormonalnej Insulina Niskie stężenie (do 25 µu/ml) oznacza cukrzycę typu I Prawidłowe (26 µu/ml) lub wysokie stężenie (powyżej 27 µu/ml) cukrzyca typu II Insulina/Glu=I/Glu [mmol]1,7>30 oznacza wyspiaka Kortyzol (0,54 µg/dl) test stymulacji ACTH (po 30 min. wzrost 2,5x, po 60 min powrót do normy) IGF1 (insulinopodobny czynnik wzrostu) 570 nmol/l TLI (czynnik trypsynopodobny, do oznaczenia po 6godz. głodówce, znieczulenie nie wpływa na wynik) T 3 (50160 ng/dl), r T 3 (1945 ng/dl) i T 4 (14 µg/dl) Estrogeny i progesteron Techniki w badaniu moczu 7

8 Uzyskanie materiału Wskazania i przeciwwskazania, ilość Środkowy strumień moczu Sposób pobrania i zakres badań (przechowywanie) URICULT Flora bakteryjna fizjologiczna:staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, Corynebacterium, Enterobacteriaceae Flora bakteryjna patologiczna: Enterobacteriaceae (Proteus), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis Mocz cewnikowany (nie z worka cewnikowego!!) Wymaz z cewki moczowej (do wymazówki, po godzinie od oddania moczu, w podłożu transportowym do 6 godzin) U psów w kierunku od ciała, z cewki do 1 cm U suk po ucisku ujścia cewki, z cewki do 1 cm Badanie fizyczne Dobowa ilość Przewlekłe zapalenie nerek poliuria, oliguria, anuria ostre zapalenie nerek Pies: 2540 ml/kg/doba Kot: 2230 ml/kg/doba Ciężar właściwy Pies: 1,0161,045 Kot: 1,0251,060 Wzrost: ostre zapalenie nerek, obfite krwotoki, gorączka Obniżenie: moczówka prosta, zwyrodnienie nerek, przewlekłe śródmiąższowe zapalenie nerek, odmiedniczkowe zapalenie nerek Oznaczenie Cw. jest pierwszym wskaźnikiem w ocenie stopnia uszkodzenia nerek Psy: 1,025 1,030 wystarczy 1/3 funkcjonujących nefronów, 1/4 zapobiega mocznicy Koty: 1,035 1,040 wystarczy 1/4 nefronów, ale objawy mocznicy mogą być wcześniej! Znaczne wahania w ciągu doby Badanie fizyczne Barwa: zagęszczenie domieszki pożywienie leczenie Ilość i barwa piany Przejrzystość Zapach 8

9 Odczyn Badanie chemiczne Zmiana z kwaśnego (>6) na obojętny i zasadowy: fosfaturia bakteryjna fermentacja moczu rozpad tkanek w układzie moczowym Proteinuria Uszkodzenie błony podstawnej kłębuszków Upośledzona resorpcja zwrotna białek w kanalikach Stany zapalne układu moczowego Krwotoki z dróg moczowych Zwiększony rozpad białek ustrojowych Badanie chemiczne Hematuria Hemoglobinuria nerkowa ostre zapalenie nerek ropne zapalenie nerek skazy krwotoczne pozanerkowa zapalenie dróg moczowych kamica dróg moczowych nowotwory Badanie chemiczne Glukozuria Kenonuria fizjologiczna ciąża strach zdenerwowanie patologiczna cukrzyca upośledzenie czynności kanalika bliższego cukrzyca kwasica Mioglobinuria Wzrost wydalania powyżej 2 mg/l Ostra lub przewlekła niewydolność nerek Zmiana barwy i wałeczki nerkowe mioglobinowe 9

10 Składniki upostaciowane i nieupostaciowane osadu moczowego Częstość występowania kamieni moczowych u kotów Szczawian wapnia: 49% Fosforan wapnia: 12,6% Trójfosforan amonowomagnezowy: 4,6% Rozpuszczalność chemicznych składników moczu Osad Kwas moczowy Moczany Fosforan wapniowy Trófosforan amonowomagnezowy Szczawian wapniowy Cystyna Tyrozyna Leucyna Bilirubina Cholesterol Sulfonamidy Tłuszcz 60 0 C 10% k.oct. 12,5% HCl 15% KOH Eter Aceton 10