I METODY MIKROSKOPOWE I HODOWLANE

Transkrypt

1 Strona 1 z 6 Laboratoryjne metody rozpoznawania grzybic Materiały kliniczne do badań: wymazy z błon śluzowych (jamy ustnej, gardła, pochwy, szyjki macicy itp.), kał, mocz, krew, PMR, płyny ustrojowe, plwocina, BAL, wycinki i bioptaty tkanek, materiały z oka i ucha, zeskrobiny skórne, paznokcie, włosy, inne. I METODY MIKROSKOPOWE I HODOWLANE 1. Preparaty mikroskopowe bezpośrednie z materiału klinicznego a) preparaty w soli fizjologicznej b) preparaty barwione: metodą Grama (metoda nie jest zalecana w przypadku grzybów) barwnikami fluorescencyjnymi np. bielą Calcofluor (Calcofluor White staining) Barwnik (biel Calcofluor) nieswoiście wiąże się z chityną i celulozą w ścianie komórkowej grzybów, co powoduje jej fluorescencję w mikroskopie fluorescencyjnym na kolor jasno zielony do niebieskiego, w zależności od użytego filtra. tuszem chińskim lub nigrozyną (uwidocznienie otoczki Cryptococcus neoformans) c) preparaty rozjaśnione: KOH, KOH/DMSO, KOH z dodatkiem bieli Calcofluor d) preparat ze skóry wykonany za pomocą taśmy klejącej wykonywany przy podejrzeniu łupieżu pstrego. 2. Posiew materiału na podłoża izolacyjne Rodzaje podłoży stosowanych w diagnostyce mikologicznej: podłoża płynne podłoża stałe z dodatkiem agaru. Hodowle grzybów prowadzone są najczęściej na podłożach stałych, które rozlewa się na szalki Petriego oraz do probówek w postaci skosów. Podstawowe podłoże do izolacji grzybów z materiałów klinicznych podłoże Sabourauda. Modyfikacje podłoża Sabourauda: - dodatek antybiotyku (np. chloramfenikol) - dodatek Aktidionu (cykloheksymid) hamuje wzrost niektórych grzybów saprotroficznych, dodawany jest do podłoży do izolacji dermatofitów.

2 Strona 2 z 6 Warunki hodowli grzybów: Hodowle próbek materiałów klinicznych prowadzi się zwykle w temperaturach 25 C ± 2 C oraz 35 C ± 2 C. Czas konieczny do uzyskania widocznego wzrostu grzybów wynosi: dla drożdży godziny, dla grzybów strzępkowych 5-7 dni, a dla grzybów wolnorosnących dermatofitów i grzybów dimorficznych 3-4 tygodnie. 3. Identyfikacja grzybów a) przesiew wyizolowanego grzyba na podłoża identyfikacyjne i różnicujące, które umożliwiają ocenę morfologii kolonii, mikromorfologii komórek grzyba, grzybni i jej tworów oraz właściwości biochemicznych: podłoża do oceny morfologii kolonii: podłoże Czapka-Doxa dla Aspergillus, Penicillium, Scopulariopsis, podłoże z ekstraktem słodowym (Malt Extract Agar) dla drożdży i grzybów strzępkowych podłoża do indukcji tworzenia chlamidospor, strzępek, pseudostrzępek u drożdży: podłoże ryżowe, podłoże kukurydziane, podłoże ziemniaczano-marchwiowo-żółciowe podłoża do indukcji tworzenia form płciowych (np. askospor) podłoża chromogenne pozwalają wykryć aktywność enzymatyczną grzybów, co odzwierciedla się w różnym zabarwieniu rosnących kolonii np. CHROMagar Candida, Becton Dickinson do wstępnej identyfikacji wybranych gatunków Candida specjalne podłoża do identyfikacji dermatofitów. b) ocena morfologii kolonii grzyba: - zabarwienie - kształt: okrągły, owalny, nieregularny, postrzępiony, gwiazdkowaty, promienisty, soczewkowaty - wzniesienie nad powierzchnię podłoża: brak, wypukła, płaska, stożkowata, o wyniosłym brzegu i zapadłym środku, kopulasta ze środkiem wzniesionym w postaci guziczka - powierzchnia kolonii: gładka, szorstka, drobno- lub gruboziarnista, pomarszczona, matowa, błyszcząca, brodawkowata, gipsowata - brzeg: równy, falisty, zatokowaty, postrzępiony, poszarpany, ząbkowany

3 Strona 3 z 6 - konsystencja: gęstej śmietany, kremowa, masłowata, sucha, lepka, błoniasta, skórzasta, ciągła, śluzowata, filcowata - wytwarzanie barwników do podłoża - zapach. c) ocena mikromorfologii grzyba: preparaty mikroskopowe z hodowli grzyba hodowla grzybów na podłożach zubożonych pod szkiełkiem nakrywkowym (technika wg Dalmau) dotyczy drożdży mikrohodowle szkiełkowe dotyczy grzybów strzępkowych (pleśnie, dermatofity). d) testy identyfikacyjne: próba filamentacji (ang. germ tube test) umożliwia szybką identyfikację gatunków Candida albicans i Candida dubliniensis, które po 2-3 godzinach inkubacji w surowicy wykazują zdolność do tworzenia wypustek (filamentów ang. germ tube), test perforacji włosa in vitro umożliwia identyfikację niektórych gatunków grzybów wywołujących grzybice powierzchniowe np. pozwala na rozróżnienie gatunku T. rubrum (nie perforuje włosów) od T. mentagrophytes (perforuje włosy), testy fermentacyjne (zymogramy) umożliwia identyfikację gatunków na podstawie zdolności grzyba do przekształcania różnych cukrów do alkoholu i dwutlenku węgla (fermentacji); testy stosowane do identyfikacji drożdży, testy asymilacyjne (auksamogramy węglowodanowe i azotowe) badają zdolność grzyba do asymilacji (przyswajania) różnych cukrów i związków azotowych jako jedynych źródeł węgla i azotu; testy stosowane do identyfikacji drożdży, badanie zdolności grzyba do produkcji ureazy na podłożu z dodatkiem mocznika i wskaźnika barwnego m. in. do odróżnienia T. rubrum (wynik ujemny) od T. mentagrophytes (wynik dodatni) i rodzaju Geotrichum (wynik ujemny) od Trichosporon (wynik dodatni), testy komercyjne do identyfikacji drożdży, np.: Api 20 C AUX test auksanograficzny, Api Candida identyfikacja w oparciu o zymogram i auksanogram, Vitek automatyczny system identyfikacyjny. 4. Oznaczanie wrażliwości grzyba na leki p/grzybicze Stosowane metody:

4 Strona 4 z 6 a) metody jakościowe i półilościowe umożliwiają stwierdzenie czy badany szczep grzyba jest na dany lek wrażliwy, słabo wrażliwy czy też oporny metoda dyfuzyjno-krążkowa testy komercyjne np. Fungitest Fungitest: umożliwia oznaczenie wrażliwości grzybów drożdżopodobnych na 6 leków p/grzybiczych: 5- fluorocytozynę (5FC), amfoterycynę B (AB), mikonazol (MCZ), ketokonazol (KET), itrakonazol (ITR), flukonazol (FLU). Test wykonuje się w studzienkach wypełnionych odwodnionymi lekami, do których podaje się zawiesinę badanego szczepu grzyba. Ocena wzrostu grzybów w studzienkach odbywa się na podstawie zmiany zabarwienia wskaźnika kolor różowy oznacza wzrost grzyba, kolor niebieski brak wzrostu grzyba. b) metody ilościowe umożliwiają określenie MIC lub MFC metody rozcieńczeniowe: w probówkach, na płytkach titracyjnych, na szalkach Petriego lub szkiełkach podstawowych o testy referencyjne o testy komercyjne np. ATB Fungus E-test. ATB Fungus 2 INT pozwala na określenie wrażliwości Candida sp. i Cryptococcus neoformans na 4 leki przeciwgrzybicze: 5-fluorocytozynę (5FC), amfoterycynę B (AMB), itrakonazol (ITR), flukonazol (FCA). Pasek ATB składa się z 16 par studzienek: - pierwsza para (bez leku) pozytywna kontrola wzrostu grzybów - pozostałe 15 par zawiera 4 leki p/grzybicze w kilku stężeniach. Poszukuje się MIC. Wzrost grzybów oceniany jest wizualnie (zmętnienie) lub automatycznie (specjalny czytnik ATB). II DIAGNOSTYKA IMMUNOLOGICZNA Zastosowanie diagnostyka grzybic inwazyjnych (narządowych, uogólnionych): kandydozy, aspergilozy, kryptokokozy oraz grzybic tropikalnych. Materiały kliniczne: zazwyczaj surowica. 1) Wykrywanie swoistych przeciwciał Odczyny immunologiczne stosowane do wykrywania p/c: odczyn immunoenzymatyczny np. Platelia Candida Ab/Ac/Ak firmy Bio-Rad do wykrywania swoistych przeciwciał anty-mannan w surowicy pacjenta odczyn hemaglutynacji biernej HEMKIT firmy Ravo Diagnostika GmbH do wykrywania przeciwciał anty-candida, anty-aspergillus odczyn precypitacji w żelu.

5 Strona 5 z 6 Klasy wykrywanych przeciwciał: IgG, IgM, IgA Wady testów wykrywających przeciwciała: częsty kontakt z grzybami (środowisko, naturalna mikrobiota) powoduje, że duży odsetek ludzi ma przeciwciała przeciwgrzybicze np. anty-candida grzybice inwazyjne występują najczęściej u osób z obniżoną odpornością, u których produkcja przeciwciał może być upośledzona wynik negatywny nie wyklucza zakażenia. 2) Wykrywanie krążących antygenów grzyba Odczyny immunologiczne stosowane do wykrywania antygenów: odczyn lateksowy odczyn immunoenzymatyczny np. testy firmy Bio-Rad: Platelia Candida Ag do wykrywania antygenu mannanowego Candida sp. w surowicy oraz Platelia Aspergillus EIA do wykrywania antygenu galaktomannanowego Aspergillus sp. w surowicy. Wykrywane antygeny grzybicze: składniki ściany komórkowej (mannan, galaktomannan, 1,3-β-D-glukan) cytoplazmatyczne (enolaza, białka szoku cieplnego). Wady testów wykrywających antygeny: pokrewieństwo antygenowe pomiędzy grzybami oraz grzybami i bakteriami wyniki fałszywie dodatnie antygeny krążące występują w ustroju człowieka w małych ilościach i są szybko z niego eliminowane testy należy powtarzać kilkakrotnie. III METODY MOLEKULARNE Metody molekularne stanowią alternatywę dla tradycyjnej diagnostyki mykologicznej opartej na analizie cech fenotypowych grzybów. Do niedawna metody te stosowane były wyłącznie w badaniach naukowych, obecnie coraz szerzej wprowadzane są do rutynowych laboratoriów mykologicznych. Na rynku dostępne są komercyjne zestawy pozwalające na wykrycie zakażeń powodowanych przez najczęstsze patogeny grzybicze tj. Candida oraz A. fumigatus.

6 Strona 6 z 6 Izolacja kwasów nukleinowych i identyfikacja grzyba może być wykonywana bez wcześniejszej izolacji mikroorganizmu bezpośrednio z próbki materiału klinicznego, ale także z hodowli grzyba na podłożach mikrobiologicznych. Metody molekularne umożliwiają identyfikację grzybów, porównanie szczepów, stwierdzenie obecności konkretnych genów np. oporności na leki. Wykorzystywane techniki molekularne: PCR i liczne jej modyfikacje, RFLP, RAPD, PFGE, AFLP, metody hybrydyzacji (np. FISH).