Wstęp. Streszczenie. Abstract

Transkrypt

1 κ κ Streszczenie Mechanizm inhibitorowego działania kamptotecyny na biosyntezę kolagenu nie jest w pełni wyjaśniony. Z niniejszych badań wynika, iż kamptotecyna (CPT) hamuje biosyntezę kolagenu oraz pobudza aktywność prolidazy, enzymu który odgrywa ważną rolę w biosyntezie kolagenu hydrolizuje imidodipeptydy dostarczając wolną L-prolinę do procesu biosyntezy tego białka. Aktywność prolidazy i biosyntezę kolagenu regulują receptory -integrynowe. Wykazano, że ekspresja podjednostki receptora integrynowego wzrasta w fibroblastach inkubowanych z CPT, w porównaniu do komórek kontrolnych. Wykazano także, że CPT pobudza ekspresję czynnika NF-κB (odpowiadającego za hamowanie ekspresji genów kolagenu) w sposób zależny od użytego stężenia i od czasu inkubacji. Różnica pomiędzy wzrostem aktywności prolidazy, a obniżeniem biosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniu CPT może wynikać zatem z przewagi inhibitorowego działania NF-κB na ekspresję genów kolagenu nad pobudzającym działaniem MAP-kinaz na aktywność prolidazy. Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działania kamptotecyny na biosyntezę kolagenu może posłużyć jako model badawczy do poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii zwłóknienia narządów. Słowa kluczowe: kamptotecyna, kolagen, fibroblasty, NFκB Abstract Although, camptothecin (CPT) is considered as a potential anticancer agent acting through inhibition of topoisomerase I, the mechanism of its effect on collagen metabolism is not known. The present study was undertaken to evaluate the mechanism of CPT - induced deregulation of collagen metabolism in cultured human skin fibroblast. It has been found that CPT strongly induced inhibition of collagen biosynthesis. The mechanism of this phenomenon was found to be independent of prolidase activity, an enzyme that plays an important role in enhancement of collagen biosynthesis at post-translational level. In fact, the enzyme activity was found to be stimulated by CPT. Increase in the enzyme activity was accompanied by increase in the expression of integrin receptor and some integrin-dependent signaling proteins, Sos, MAPK and transcription factor NF-κB. Since at least in some cell types activation of integrin induces NF-κB and this transcription factor is involved in inhibition of collagen gene transcription, therefore the mechanism of CPT-dependent inhibition of collagen biosynthesis may be related to integrin-dependent stimulation of NF-κB. The data suggest that CPT induces inhibition of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts by stimulation of NF-κB signaling. Key words: camptothecin, collagen, fibroblasts, NFκB Wstęp Badania nad metabolizmem kolagenu stanowią jeden z głównych kierunków badań nad chorobami tkanki łącznej. Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w wyjaśnieniu mechanizmów regulujących metabolizm kolagenu, wciąż brakuje skutecznej terapii zwłóknienia narządów. Jednym z czynników hamujących biosyntezę kolagenu jest kamptotecyna. Mechanizm tego procesu nie jest w pełni poznany. Kamptotecyna jest alkaloidem chinolinowym, wykazującym właściwości antymitotyczne [1, 2]. Udowodniono, że najwyższą aktywność cytotoksyczną wykazuje ona w stosunku do komórek znajdujących się w fazie przedpodziałowej cyklu komórkowego [3, 4]. Faza S cyklu komórkowego u szybko dzielących się komórek takich jak komórki nowotworowe trwa dłużej niż w przypadku komórek prawidłowych i dlatego komórki rakowe są niszczone z dużo większą skutecznością niż komórki prawidłowe [5-7]. Z tego powodu, pochodne tego alkaloidu znalazły zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej [8, 9]. NF-κB to rodzina jądrowych czynników aktywujących transkrypcję genów, obejmująca grupę regulatorów kontroli cyklu komórkowego, wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej, procesów zapalnych, apoptozy i onkogenezy. Czynniki te, w zależności od typu bodźca mają zdolność do dimeryzacji [7, 10-12]. Najdokładniej scharakteryzowanym heterodimerem jest p50/p65 stanowiący produkt genu NF-κB1 i RelA [13-19]. Rodzina NF-κB odpowiada za aktywację transkrypcji genów w odpowiedzi na sygnał pochodzący ze środowiska pozakomórkowego, wywołany obec-

2 nością: cytokin (np. TNF-α), mitogenów (np. anti-cd2, anti- CD3), bakterii (endotoksyny Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis), wirusów (np. HTLV-1, HBV), leków (np. cykloheksamid) i innych czynników np. stresu oksydacyjnego czy związków przeciwnowotworowych [19-25]. Aktywacja NF-κB zachodzi w ciągu kilku minut po ekspozycji na czynnik indukujący, zatem nie wymaga syntezy białek de novo. Proces ten polega na fosforylacji IκB (inhibitora NF-kB) co prowadzi do ich ubikwitynacji i oddysocjowania od NF-κB. Aktywny NF-κB ulega translokacji z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie pobudza transkrypcję odpowiednich genów [26-28]. Wpływ kamptotecyny na ekspresję NF-κB nie jest znany. Wysunięto przypuszczenie, że potencjalnym punktem uchwytu inhibitorowego działania tego alkaloidu na biosyntezę kolagenu może być czynnik transkrypcyjny NF-κB. Ocenie poddano ekspresję NF-κB, receptora -integrynowego oraz biosyntezę kolagenu w fibroblastach skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny. Materiały i metody MATERIAŁY L-prolina, kolagenaza bakteryjna typu VII, trypsyna, pożywka DMEM, kamptotecyna - Sigma, USA, płodowa surowica bydlęca Gibco, USA, L-5[ 3 H] prolina (28 Ci/mmol), Amersham, U.K. Przeciwciała poliklonalne królicze przeciw NFκB, β-aktynie, receptorowi β1-integrynowemu, przeciwciała drugorzędowe znakowane fosfatazą, Santa Gruz, USA. Fibroblasty American Type Culture Collection, Rockville, USA. METODY Przygotowanie hodowli fibroblastów. Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w DMEM z dodatkiem 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/l glutaminy, 50 g/ml penicyliny, 50 g/ml streptomycyny w temperaturze 37 o C, w atmosferze 5 % CO 2. Fibroblasty przenoszono z butelek Costar do 6 oczkowych płytek Costar stosując bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05 % trypsyny i 0,02 % EDTA. Komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1x10 5 komórek na oczko w 1 ml pożywki hodowlanej. Pożywkę hodowlaną wymieniano na świeżą, co 48 godzin. Fibroblasty osiągały stan inhibicji kontaktowej w 6 dniu wzrostu. W większości przypadków komórki takie użyto do dalszych doświadczeń. Do badań używano komórek pomiędzy 8 i 14 pasażem. Fibroblasty w stanie inhibicji kontaktowej płukano trzykrotnie 0,15 mol/l NaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach 200 x g, a supernatant odrzucono. Następnie, odwirowane komórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l buforu Tris-HCl o ph 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków trzykrotnie po 10 sekund w temp. 0 o C. Próby wirowano przy x g w temp. 0 o C przez 30 minut. W uzyskanym supernatancie oznaczono białko i użyto do dalszych doświadczeń. Test cytotoksyczności Pomiar cytotoksyczności przeprowadzono według metody opisanej przez Carmichael a [29]. Oceniono żywotność komórek przy użyciu soli tetrazolinowej (MTT). W żywych komórkach barwnik ten ulega konwersji do purpurowego formazonu pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz. W martwych komórkach konwersja ta nie zachodzi. Komórki w stanie inhibicji kontaktowej inkubowano w pożywce zawierającej równe stężenia badanego związku przez 24 godziny w inkubatorze z CO 2 w temp. 37 o C. Następnie podłoże usunięto, komórki przepłukano 3 x 1 ml PBS, dodano 1 ml PBS oraz 50l MTT o stężeniu 5 mg/ml i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Po tym czasie usunięto medium i dodano do komórek 1 ml 0,1 mol/l kwasu solnego w absolutnym izopropanolu. Po ok. 10 minutach, w lizacie komórek mierzono absorbancję przy 570 nm i 630 nm. Od wartości absorbancji przy 570 nm odjęto wartość absorbancji tła (630nm). Różnicę wartości absorbancji uzyskaną w hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Posłużyła ona za wartość porównawczą względem komórek inkubowanych w obecności kamptotecyny. Przeżywalność tych komórek przedstawiono jako procent wartości kontrolnej. Oznaczanie zawartości białka Białko zawarte w supernatancie homogenatów komórkowych oznaczano metodą Lowry i wsp. [30]. Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakrylamidowym z SDS Badane próby zawierające 20 g białka rozpuszczono w buforze 0,125 mol/l Tris-HCl o ph 6,8 zawierającym 3 % SDS, 20 % glicerol i 0,1 % błękit bromofenolowy. Próbki poddano rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu poliakryloamidowym złożonym z 10 % żelu zagęszczającego (zawierającego 0,4 % SDS, 1,5 mol/l bufor Tris-HCl o ph 8,8) i 6 % żelu rozdzielającego (zawierającego 0,4 % SDS, 0,5 mol/l bufor Tris-HCl o ph 6,8) w buforze elektrodowym zawierającym 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1 % SDS. Doświadczenie prowadzono przy natężeniu prądu 100 ma na żel przez godzinę w temperaturze pokojowej. Analiza białek metodą Western immunoblot Po rozdziale elektroforetycznym żele zrównoważono 5 minutową inkubacją w 20 % (v/v) metanolowym roztworze, który zawierał 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/l glicyny. Białka zostały przetransferowane na nitrocelulozę o porach 0,2 m z użyciem zestawu LKB 2117 Multiphor II, pod wpływem napięcia 100 ma w ciągu 1 godziny, zgodnie z metodą opisaną w podręczniku dołączonym do aparatu. Niespecyficzne wiązania nitrocelulozy zablokowano poddając ją działaniu 5 % roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem przeciw NF-κB lub polikolnalnym przeciwciałem przeciw receptorowi -integrynowemu lub poliklonalnalnym przeciwciałem przeciw β-aktynie w 5 % roztworze mleka beztłuszczowego w TBS-T o stężeniu 1:3000 przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukano w roztworze TBS-T (1x15 minut, 2x10 minut) wolno mieszając. W celu wykrycia analizowanych białek dodano drugie

3 Cytotoksyczność [% wartości kontrolnej] przeciwciało przeciw króliczej Fc IgG, znakowane fosfatazą alkaliczną w stężeniu 1:5000 w TBS-T i poddano inkubacji przez 30 minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płukano TBS-T (5x10 minut) i poddano działaniu odczynnika Sigma Fast BCIP/NBT aby wybarwić immunoreaktywne białko. Pomiar biosyntezy kolagenu 0 0, Kamptotecyna [ μ M] Ryc. 1. Ocena przeżywalności fibroblastów skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny (CPT). Komórki inkubowano przez 24 godziny w pożywce z dodatkiem różnych stężeń CPT. Przedstawiono wartości średnie ± S.D. Wbudowywanie 5[ 3 H]-proliny [dpm x 10-3 / mg białka] , Kamptotecyna [ μ M] Ryc. 2. Biosynteza kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej inkubowanych przez 24 godziny w pożywce z dodatkiem 0,1, 15, 50 M CPT. Przedstawiono wartości średnie ± S.D. Pomiar biosyntezy kolagenu wykonano według metody opisanej przez Peterkofsky i wsp. [31]. Fibroblasty skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej w pożywce przez 24 godziny z dodatkiem 5[ 3 H]- proliny (5 Ci/ml, 28 Ci/mmol). Komórki dwukrotnie przemyto 1 ml DPBS z 10 mmol/l proliny, następnie zawieszono je w 1,5 ml DPBS z 10 mmol/l proliny. Zawiesinę komórek poddano homogenizacji ultradźwiękami (3 x 20 s w temp. 0 o C). Białka zawarte w homogenatach wytrącono przez dodanie 1,5 ml 20% TCA z 20 mmol/l proliną. Po 5 minutach wytrącone białka odwirowano (1000 x g w temp. 4 o C przez 10 minut), supernatant odrzucono, a osad rozpuszczono w 0,6 ml 0,2 mol/l NaOH. Pobierano po 2 próby po 0,2 ml lizatu. Każdą próbę zobojętniano przez dodanie 0,16 ml 0,15 mol/l HCl i 0,1 ml 1 mol/l Tris-HCl o ph 7,2, a następnie dodano 20 l 62,5 mmol/l N-etylomaleimidu (NEM), 10 l CaCl 2 oraz 10 l DPBS z kolagenazą o stężeniu 1 mg/ml (próba badana) lub bez kolagenazy (próba kontrolna). Próby inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37 o C. Następnie dodano 0,5 ml zimnego 10% TCA i chłodzono przez 5 minut w temperaturze 0 o C. Po 5 minutach próby odwirowano, a supernatant przeniesiono do fiolek scyntylacyjnych z 4 ml płynu scyntylacyjnego. Ilość powstałego kolagenu wyrażono w dpm 5[ 3 H]-proliny wbudowanej do białek podatnych na działanie kolagenazy bakteryjnej, w przeliczeniu na g białka. Analiza statystyczn Wyniki poddano analizie statystycznej. Obliczono średnie arytmetyczne z poszczególnych pomiarów i odchylenia standardowe oraz dokonano analizy statystycznej przy użyciu testu t studenta. Za istotne statystycznie przyjęto różnice pomiędzy średnimi przy poziomie ufności p<0,05. Wyniki W celu oceny wpływu kamptotecyny na przeżywalność fibroblastów skóry ludzkiej, wykonano test cytotoksyczności metodą Carmichael a z zastosowaniem soli tetrazolinowej. Przeżywalność fibroblastów inkubowanych przez 24 godziny z różnymi stężeniami kamptotecyny (0,1, 15, 50 M) przedstawia Ryc. 1. Stwierdzono, że badane stężenia kamptotecyny nie wpływają w istotnym stopniu na przeżywalność fibroblastów. Z tego względu do dalszych doświadczeń użyto kamptotecyny w stężeniach 0,1, 15, 50 M. Następnie wykonano pomiar biosyntezy kolagenu. Badania prowadzono w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej. Fibroblasty inkubowano przez 24 godziny w podłożu zawierającym różne stężenia kamptotecyny. Wynik doświadczenia przedstawia Ryc. 2. Dodatek kamptotecyny do pożywki hodowlanej w stężeniu 0,1, 15, 50 M spowodował obniżenie biosyntezy kolagenu w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej odpowiednio o 30%, 47%, 73% w

4 A. B Kamptotecyna [μm] NF-κB β-aktyna Ryc. 3. (A) Ocena ekspresji czynnika NF-κB w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny (B) ekspresja β-aktyny w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny. A. B Czas [min] NF-κB β-aktyna Ryc. 4. Ekspresja NF-κB (A) i β-aktyny (B) w zależności od czasu inkubacji w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w pożywce hodowlanej z dodatkiem 50 mm kamptotecyny. integrynowego w homogenacie fibroblastów skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny. Badanie przeprowadzono metodą Western-immunoblot. Jednocześnie przeprowadzono analizę β-aktyny metodą Western-immunoblot w celu stwierdzenia kontroli ilości nanoszonego białka. Wykazano większą zdolność do wiązania przeciwciał przeciwko podjednostce receptora integrynowego homogenatów komórek inkubowanych z CPT w porównaniu do homogenatów komórek kontrolnych (Ryc. 5). Wskazuje to, iż kamptotecyna pobudza ekspresję receptora -integrynowego w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej. Dyskusja A. B. porównaniu do biosyntezy kolagenu zachodzącej w komórkach rosnących w pożywce hodowlanej bez CPT (kontrola). Zaobserwowano hamowanie biosyntezy kolagenu proporcjonalne do użytych stężeń alkaloidu. Uzyskane wyniki wskazują, że CPT jest inhibitorem biosyntezy kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej. Jednym z czynników odpowiedzialnych za hamowanie biosyntezy tego białka jest NF-κB. Oceniono ekspresję NF-κB w hodowli fibroblastów inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny. Wynik tego doświadczenia przedstawia Ryc. 3. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NF-κB zależny od użytego stężenia kamptotecyny. W celu potwierdzenia poprawności wykonania doświadczenia wykonano jednocześnie analizę Western-immunoblot β-aktyny. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NFκB w hodowli fibroblastów w zależności od czasu inkubacji z kamptotecyną. Najwyższą ekspresję zaobserwowano po 4 godzinach inkubacji (Ryc. 4) W regulacji aktywności NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej ważną funkcję pełni podjednostka receptora integrynowego powierzchni komórki. Z tego powodu oceniono ekspresję receptora Kamptotecyna [μm] Ryc. 5. (A) Ekspresja receptora -integrynowego w fibroblastach kontrolnych oraz inkubowanych z CPT w różnych stężeniach. (B) Ekspresja β-aktyny w fibroblastach kontrolnych oraz inkubowanych z CPT w różnych stężeniach. receptor Pomimo znacznego - integrynowy postępu jaki dokonał się w wyjaśnieniu mechanizmów regulujących metabo- β-aktyna lizm kolagenu, wciąż brakuje skutecznej terapii zaburzeń kolagenu z tkanki łącznej. Kolagen jest najobficiej występującym białkiem macierzy pozakomórkowej ssaków. Odpowiada on za utrzymanie prawidłowej struktury i integralności tkanki łącznej, odgrywa też ważna rolę w interakcji z receptorami integrynowymi powierzchni komórek, regulujących wiele procesów fizjologicznych i patologicznych: reorganizację cytoszkieletu, transport jonów, metabolizm lipidów, aktywację kinaz, ekspresję genów, regulację cyklu komórkowego, procesy różnicowania i wzrostu komórek nowotworowych jak również inwazyjność komórek nowotworowych. Z tego względu wszelkie zmiany w procesach biosyntezy i degradacji kolagenu mają potencjalny wpływ na metabolizm komórkowy [32]. Badania zespołu Czuwary-Ładykowskiej wskazujące, że kamptotecyna silnie hamuje biosyntezę kolagenu, nie wyjaśniły jednak mechanizmu inhibitorowego działania CPT. Ten przeciwnowotworowy związek zwany fazowo specyficznym może modulować cykl komórkowy, wpływając na replikację DNA (fazę S), a dokładniej na stabilizowanie kompleksu DNA topoizomeraza I (enzym biorący udział w replikacji, zmniejszający naprężenia nici DNA) i hamowanie przesuwania się widełek replikacyjnych. Zjawisko to zatrzymuje cykl w fazie S, co może prowadzić do licznych mutacji, a w efekcie do śmierci komórki [35].

5 Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, iż kamptotecyna hamuje biosyntezę kolagenu proporcjonalnie do użytych stężeń. Związek ten jednocześnie pobudza aktywność prolidazy (dane nie prezentowane). Rozbieżność między zwiększoną aktywnością prolidazy a zahamowaniem biosyntezy kolagenu nasunęła przypuszczenie, że hamowanie biosyntezy kolagenu może wynikać z indukcji innych mechanizmów. Z badań tych, wynikło również, że w regulację aktywności prolidazy i biosyntezy kolagenu zaangażowane są receptory -integrynowe [32]. Ligandem receptorów -integrynowych jest kolagen. Interakcja kolagenu z receptorem integrynowym inicjuje kaskadę wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego. Pobudzony receptor -integrynowy wywołuje autofosforylację kinazy białkowej FAK, która następnie oddziaływuje z białkami adaptorowymi Grb i Src, poprzez białka Shc i Shr. Ta interreakcja pozwala na aktywację kaskady białek Sos, Ras, Raf, a następnie kinaz MAP: ERK 1 i ERK 2, które indukują czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję wielu genów biorących udział w regulacji wzrostu komórek i ich różnicowaniu [33]. Oceniono ekspresję receptora -integrynowego w homogenacie fibroblastów skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny. Badanie przeprowadzono metodą Westernimmunoblot. Badanie wykazało większą zdolność do wiązania przeciwciał przeciwko podjednostce receptora integrynowego homogenatów komórek inkubowanych z CPT w porównaniu do komórek kontrolnych. Wskazuje to, iż kamptotecyna pobudza ekspresję receptora -integrynowego w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej. Przeprowadzone badania wykazały, że kamptotecyna pobudza ekspresję zarówno receptora -integrynowego jak i czynnika NF-κB. Ekspresja czynnika jądrowego NF-κB wzrasta proporcjonalnie do użytych stężeń CPT i czasu inkubacji, w porównaniu do komórek kontrolnych. NFκB indukuje transkrypcję genów w odpowiedzi na sygnał z zewnątrz komórki wywoływany przez cytokiny (np. TNFα), mitogeny, bakterie, wirusy, leki (np. cykloheksamid), światło UV, stres oksydacyjny, związki przeciwnowotworowe [17, 19, 20, 22]. W niektórych typach komórek zwiększona ekspresja NF-κB może zachodzić pod wpływem sygnału generowanego przez receptor -integrynowy [34]. W niniejszej pracy wykazano, że ekspresja podjednostki receptora integrynowego powierzchni komórki wzrasta w fibroblastach skóry ludzkiej inkubowanych z CPT, w porównaniu do komórek kontrolnych. Stymulacja tego receptora indukuje NF-κB, który odpowiada za hamowanie ekspresji genów kolagenu oraz pobudza kinazę MAP regulującą aktywność prolidazy. NF-κB i MAPK oddziaływają między sobą na zasadzie konkurencji [32]. Zahamowanie genów kolagenu przez NF-κB uniemożliwia biosyntezę tego białka. Zatem nasilenie aktywności prolidazy pobudzającej biosyntezę kolagenu na etapie posttranslacyjnym, a obniżeniem biosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniu CPT nie równoważy inhibitorowego działania NF-κB na ekspresję genów kolagenu. Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działania kamptotecyny poprzez receptory -integrynowe i NF-κB na biosyntezę kolagenu może służyć jako model badawczy do poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii chorób związanych z zaburzeniami metabolizmu kolagenu. Piśmiennictwo 1. Kruszewski S. Zastosowanie zjawisk fotoluminescencji w badaniach farmaceutycznych oraz w terapii i diagnostyce przeciwnowotworowej. Zakład Fizyki Medycznej; CM UMK, Wiadomości Akademickie Nr Wink M, van Wyk B. Rośliny lecznicze świata. Ilustrowany przewodnik naukowy. Briza Publications 2004, Kruszewski S, Burke T. Właściwości analogów kamptotecyny obiecujących inhibitorów topoizomerazy I, oznaczonych metodą spektroskopii fluorescencyjnej. Polish J Med Phys & Eng. 2002; 8(3): Wall M i wsp. Plant antitumor agents. The isolation and structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminate. J Am Chem Soc. 1996; 88: Kohn K, Pommier Y. Molecular and Biological Determinants of the Cytotoxic Actions of Camptothecins. Ann NY Acad Sci. 2000; 922: Liu L i wsp. Mechanism of Action of Camptothecin. Ann NY Acad Sci. 2000; 922: Yamamoto Y, Gaynor R. I-κB kinases: key regulators of the NF-κB pathway. Trends Biochem Sci 2004; 29: Omyła - Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizomerazy I unikalna grupa leków przeciwnowotworowych. Współcz Onkol ; 1: Pommier Y. Eucaryotic DNA topoisomerase I: Genome gatekeeper and its intruders camptothecins. Semin Oncol. 1996; 23: Karin M, Ben - Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquination: the control of NF-κB activity. Ann Rev Immunol. 2000; 18: Li Z i wsp. Genetic dissection of antigen receptor induced NF-κB activation. Mol Immunol 2004; 41: McKay L, Cidlowski J. Molecular control of immune/ inflammatory responses: interactions between NF-κB and steroid receptor signaling pathway. Endocrinol Rev 1999; 20: Boland MP i wsp. Danarubicin activates NF-κB and induces NF-κB dependent gene expression in HL- 60 promyelocytic and Jurkat T lymphoma cells. J Biol Chem 1997; 272: Chen F i wsp. New insights into the role of Nuclear Factor-κB in Cell Growth Regulation. Am J Pathol 2001; 159: Ghosh S i wsp. NF-κB and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Ann Rev Immunol 1998; 16: Ji GZ i wsp. Role of transforming growth factor-β1- smad signal transduction pathway in patients with hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2006; Jan 28; 12(4): Lisowska K, Witkowski J. Viral Strategies in Modulation of NF-κB. Activity Arch Immun Ther Exp, 2003, 51, Pahl HL. Activators and target genes of Rel /NF-κB transcription factors. Oncogene 1999; 18:

6 19. Wang CY i wsp. NF-κB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and ciap1 and ciap2 to suppress caspase-8 activation. Science 1998; 281: Starska K, Łukomski M. Regulacja Cyklu Komórkowego, Procesu Apoptozy, Wydzielania Cytokin i Cząsteczek Adhezyjnych w Limfocytach T i innych Komórkach Krwi Obwodowej oraz w Komórkach Nowotworowych w Mechanizmie Aktywacji toll-like receptors (TLRs) i Rodziny Cząsteczek Transkrypcyjnego Czynnika Jądrowego NF-κB. Post Biol Kom 2006; 33, (4): Baeuerle PA, Baltimore D. NF-κB: Ten years after. Cell 1996; 87: Gilmore TD i wsp. Rel/ NF-κB/I-κB proteins and cancer. Oncogene 1996; 13: Carson J i wsp. Pharmacogenomic Identification of Targets for Adjuvant Therapy with the Topoisomerase Poison Camptothecin. Cancer Res 2004; 64: Piret B, Piette J. Topoisomerase poisons activate the transcription factor NF-κB in ACH-2 and CEM cells. Nucleic Acids Research 1996; 24: Qiao L i wsp. Constitutive activation of NF-κB in human hepatocellular carcinoma: evidence of a cytoprotective role. Hum Gene Ther 2006 Mar; 17(3): Ruland J, Mak TW. From antigen to activation: specific signal transduction pathways linking antigen receptors to NF-κB. Semin Immunol 2003; 15: Rutkowski R i wsp. Właściwości biologiczne czynnika transkrypcji jądrowej NF-κB. Alergia Astma Immunologia, 2005; 10(3): Deptala A i wsp. Simple assay of activation of nuclear factor κb by laser scanning cytometry (LSC). Cytometry 1998; 33: Carmichael J i wsp. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of radiosensitivity. Cancer Res 1987; 47(4): Lowry I i wsp. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: Oyamada I i wsp. Scorbutic and fasted guinea pig sera contain an insulin-like growth factor I-reversible inhibitor of proteoglycan and collagen synthesis in chick embryo chondrocytes and adult human skin fibroblasts. Arch. Biochem. Biophys. 1990; 276(1): Miltyk W i wsp. Prolidase independent mechanism of camptothecin induced inhibition of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts. J. Biochem. 2007; 141(2): Ciesielska E. Inhibitory topoizomerazy I nowa klasa leków przeciwnowotworowych. Post Biol Kom 1998; 25(4): Pałka J. Farmakoterapia nowotworów. Inhibitory angiogenezy. Farmacja Regionu Północno-Wschodniego. 2006; 1(49): Friedland JC i wsp. α 6 β 4 -integrin activates Rac dependent p21-activated kinase 1 to drive NF-κB dependent resistance to apoptosis in 3D mammary acini. J Cell Sci 2007; 120 (Pt 20): data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: Wojciech Miltyk Samodzielna Pracownia Analizy Leków Katedra Chemii, Analizy i Technologii Środków Leczniczych Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Białystok, ul. Jana Kilińskiego 1 tel , wmiltyk@umwb.edu.pl