, the most active of the series, proved to be only slightly less potent than carmustine. The presented data postulate that targeting

Transkrypt

1 STRESZCZENIE Skuteczność leków alkilujących z grupy pochodnych nitrozomocznika takich jak: karmustyna, lomustyna czy fotemustyna w leczeniu niektórych chorób nowotworowych, skłania do poszukiwania takich sposobów ich modyfikacji, aby wyeliminować lub chociaż ograniczyć niepożądane efekty ich działania. W tym celu przeprowadzono syntezę L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika, w których L-prolina jest połączona wiązaniem imidowym za pośrednictwem III-rzędowego atomu azotu z grupą karbonylową różnych pochodnych nitrozomocznika. Takie wiązanie mogłoby być hydrolizowane przez prolidazę cytoplazmatyczną egzopeptydazę, której podwyższoną aktywność obserwuje się w niektórych komórkach i tkankach nowotworowych. Przeprowadzono ocenę podatności substratowej otrzymanych nowych, L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika na działanie prolidazy i porównano ich aktywność w stosunku do innych leków alkilujących w zakresie: cytotoksyczności, biosyntezy DNA oraz syntezy kolagenu. Wykazano, że ich podatność substratowa na katalityczne działanie prolidazy jest zbliżona do naturalnego substratu tego enzymu glicylo-l-hydroksyproliny. W badaniach wykorzystywano komórki raka sutka MCF-7 i MDA-MB 231. Pomiar cytotoksyczności wykazał, że wszystkie badane związki wywierają hamujący wpływ na przeżywalność tych komórek. Wykazano również, że wszystkie otrzymane L-prolinowe pochodne nitrozomocznika hamują biosyntezę DNA oraz ABSTRACT Nitrosoureas belong to the alkylating antitumour agents and some of them have found application for the treatment of human cancer. Despite their broad antitumor activity, the clinical usefulness of nitrosoureas has been limited by delayed-onset, cumulative myelosuppression and pulmonary toxicity. In the present study, we report the synthesis and biological evaluations of four new alkylating agents utilizing L-proline derivatives as carriers of the nitrosourea cytotoxic group. We hypothesized that coupling of L-proline through imido-bond to anticancer drugs might create prodrugs which would be locally activated by tumor-associated prolidase and consequently would be less toxic to normal cells that evoke lower prolidase activity. This strategy should be of benefit particularly in case of antineoplastic prodrugs, since at least some tumour tissues evoke increased prolidase activity compared to normal tissues. In such a case the release of the drug from the prodrug would be more efficient in neoplastic tissues than in normal tissues. The novel proline-linked nitrosoureas have been synthesized and theirs cytotoxicity has been tested in both MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells. Evaluation of the cytotoxicity of these compounds employing a MTT assay and inhibition of [ 3 H]thymidine incorporation into DNA in both MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cells demonstrated that compound AB 4, the most active of the series, proved to be only slightly less potent than carmustine. The presented data postulate that targeting

2 w mniejszym stopniu hamują syntezę kolagenu, niż lek nie związany z nośnikiem. Uzyskane wyniki sugerują, że nowe L-prolinowe pochodne nitrozomocznika mogą być wykorzystane jako proleki aktywowane przez prolidazę. Wyniki naszych badań potwierdzają przypuszczenie, że wykorzystanie prolidazy jako enzymu przekształcającego prolinowe pochodne leków alkilujących w farmakologicznie aktywne leki może stanowić nową strategię w terapii chorób nowotworowych. of prolidase as a prodrug-converting enzyme may serve as a potential strategy in pharmacotherapy of neoplastic diseases. Key words: Nitrosourea compounds - chemical synthesis, Proline - analogs & derivatives, Prodrugs - chemical synthesis, Prodrugs pharmacology, Antineoplastic agents, alkylating - chemical synthesis, Antineoplastic agents, alkylating pharmacology Słowa kluczowe: Nitrozomocznika związki - synteza chemiczna, Prolina pochodne, Proleki - synteza, chemiczna, Proleki farmakologia, Środki przeciwnowotworowe alkilujące - synteza chemiczna, Środki przeciwnowotworowe alkilujące farmakologia, Linie komórkowe nowotworowe - wpływ środków chemicznych, Nowotwory sutka Jednym ze sposobów ograniczenia niepożądanych efektów działania leków przeciwnowotworowych jest łączenie aktywnej farmakologicznie cząsteczki z nieaktywnym nośnikiem za pomocą wiązania łatwo ulegającego biotransformacji w określonych warunkach [1,2]. Otrzymuje się w ten sposób proleki, często o poprawionej farmakokinetyce oraz zwiększonej selektywności wobec wybranych komórek [3,4,5]. Podwyższona aktywność prolidazy (EC ) w niektórych komórkach i tkankach nowotworowych [6] stwarza możliwość wykorzystania tego enzymu do konwersji prolinowych pochodnych leków przeciwnowotworowych w formę farmakologicznie aktywną [7,8,9]. Prolidaza jest enzymem, który katalizuje reakcję hydrolizy imidodipeptydów, w których aminokwasem C-końcowym jest prolina lub hydroksyprolina [10,11]. Acetylacja grupy α-aminowej dipeptydu Gly-Pro sprawia, że jest on oporny na działanie prolidazy. Natomiast podstawienie grupy aminowej przez CH 3 -S- nie zmienia podatności cząsteczki na działanie tego enzymu, co wskazuje, że obecność wolnej grupy aminowej nie stanowi absolutnego wymagania substratowego [10,12,13]. Postawiliśmy hipotezę, że przyłączenie L proliny, wiązaniem imidowym, do pochodnych nitrozomocznika, mogłoby prowadzić do utworzenia leków, aktywowanych przez prolidazę w komórkach nowotworowych, co w konsekwencji prowadziłoby do ograniczenia toksyczności w stosunku do komórek prawidłowych. Przeprowadzono ocenę podatności substratowej otrzymanych nowych, L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika na działanie prolidazy i porównano ich aktywność w stosunku do innych leków alkilujących w zakresie: cytotoksyczności, biosyntezy DNA oraz syntezy kolagenu w komórkach MCF-7 i MDA-MB Synteza chemiczna Syntezę L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika przeprowadzono według metody opisanej przez Ehresmann a i wsp. [14]. Ogólny schemat syntezy tych związków przedstawia Rycina 1. W pierwszym etapie do roztworu L-proliny (Sigma Chemical Co, USA) i NaOH (POCH Gliwice, Polska) w wodzie, dodawano kroplami, mieszając i chłodząc w łaźni lodowej, odpowiedni izocjanian (2-chloroetyloizocjanian, 2-bromoetyloizocjanian, 3-chloropropyloizocjanian, 4-bromofenyloizocjanian Fluka Chemie AG, Szwajcaria), w toluenie (POCH Gliwice, Polska). Reakcję prowadzono przez 1 godzinę, po czym fazę wodną oddzielono od fazy toluenowej. W drugim etapie do fazy wodnej dodano NaNO 2 (POCH Gliwice, Polska), a następnie dodawano kroplami, mieszając i chłodząc w łaźni lodowej (aby temperatura nie przekroczyła 5 C ) stężony kwas HCl (POCH Gliwice, Polska). Reakcję prowadzono przez 0,5 godziny, po czym przeprowadzono trzykrotną ekstrakcje eterem dietylowym (POCH Gliwice, Polska). Frakcję eterową wysuszono i usunięto, natomiast osad przekrystalizowano w układzie dichlorometan / heksan (POCH Gliwice, Polska). Budowę chemiczną otrzymanych związków potwierdzono przy pomocy analizy spektralnej 13 C NMR i 1 H NMR.

3 N-[N -(2-chloroetylo)-N -nitrozokarbamoilo]-l-prolina (AB 3 ): Wydajność=43%, t.t. = 147 C. 1 H-NMR (DMSO- ) : 1.92 (m, 2H, γ-ch prolina), 2.16 (m, 2H, ß-CH 2 2 prolina), 3.24 (m, 2H, -CH prolina), 3.54 (t, 2H, -CH 2 -Cl, J=6.2 Hz), 4.7 (t, 1H, α-ch prolina, J =8.24),4.20 (t, 2H, N- -CH 2 -, J=6.2 Hz), 8.21 (br, 1H, COOH). 13 C-NMR (DMSO- ) : 26.8 (γ-c prolina), 27.2 (β-c prolina), 38.6 (-CH 2 -), 42.1 (CH 2 -Cl), 46.0 ( -C prolina), 58.2 (α-c prolina), (CO), (COOH). N-[N -(2-bromoetylo)-N -nitrozokarbamoilo]-l-prolina (AB 4 ) Wydajność=34%, t.t. = 80 C. 1 H-NMR (DMSO- ) : 1.92 (m, 2H, γ-ch 2 prolina), 2.16 (m, 2H, β-ch 2 prolina), 3.24 (m, 2H, -CH prolina) 3.66 (t, 2H, N-CH 2 -, J=6.2 Hz), 3.72 (t, 2H, -CH 2 -Br, J=6.2 Hz), 4.07 (t, 1H, α-ch prolina, J=8.24), 8.21 (br, 1H, COOH). 13 C-NMR (DMSO- ) : 25.7 (CH 2 -Br), 26.8 (γ-c prolina), 27.2 (β-c prolina), 48.6 (-CH 2 -), 46.0 ( -C prolina), 58.2 (α-c prolina), (CO), (COOH). N-[N -(3-chloropropylo)-N -nitrozokarbamoilo]- -L-prolina (AB 5 ) wydajność=51%, żółty olej. 1 H-NMR (DMSO ) : 1.92 (m, 2H, γ-ch 2 prolina), 2.16 (m, 2H, ß-CH 2 prolina), 3.24 (m, 2H, -CH prolina), (m, 6H, -(CH 2 ) 3 -), 4.07 (t, 1H, α-ch prolina, J=8.24), 6.11 (br, 1H, COOH). 13 C-NMR (DMSO ) : 26.8 (γ-c prolina), 27.2 (ß-C prolina), 30.6 (-CH 2 -), 36.7 (CH 2 -Cl), 46.0 ( - -C prolina), 45.3 (N-CH 2 ), 58.2 (α-c prolina), (CO), (COOH). w podobny sposób jak komórki MCF-7. Różnicę stanowi jednak wymóg hodowli komórek MDA-MB 231 w atmosferze pozbawionej CO 2 oraz zastosowanie pożywki Leibowitz L4386, pozbawionej jonów wapniowych. Do badań wykorzystywano komórki pomiędzy 8 a 10 pasażem. N-[N -(4-bromofenylo)-N -nitrozokarbamoilo]-l- -prolina (AB6) Wydajność=76%, t.t. = 196 C. 1 H-NMR (DMSO ) : 1.92 (m, 2H, γ-ch 2 prolina), 2.16 (m, 2H, ß-CH 2 prolina), 3.24 (m, 2H, -CH prolina), 4.09 (t, 1H, α-ch prolina, J=8.24), 7.41 (d, 2H, Ar-H, J=6.97), 7.47 (d, 2H, Ar-H, J=6.99 Hz), 8.46 (br, 1H, COOH). 13 C-NMR (DMSO ) : 26.2 (γ-c prolina), 28.3 (ß-C prolina), 46.1 ( -C prolina), 58.2 (α-c prolina), (Ar), (Ar), (Ar), (Ar), (CO), (COOH) 2. BADANIA BIOLOGICZNE 2.1. Hodowle komórkowe Komórki raka piersi MCF-7 hodowano w podłożu DMEM (Gibco, USA) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej FBS (Gibco, USA), 2 mmol/l glutaminy oraz antybiotykami: 50 μg/ml streptomycyny i 50 U/ml penicyliny (Quality Biologicals Inc., USA) w temperaturze 37 C, w atmosferze zawierającej 5% CO 2. Komórki przenoszono z butelek Costar (Sigma, USA) do sześciooczkowych płytek Nunc (Wiesbaden, Niemcy) stosując bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA. Komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1 x 10 6 komórek na oczko w 1 ml pożywki hodowlanej. Po 48 godzinach pożywkę hodowlaną wymieniano na pożywkę pozbawioną czerwieni fenolowej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS), zawierającej natomiast 10% surowicę pozbawioną estrogenów (CPSR1). Do doświadczeń używano komórki, gdy w ok.80% pokrywały powierzchnię oczka płytki. Komórki raka sutka MDA-MB 231 hodowano

4 2.2. Metody badań Oznaczenie podatności substratowej na katalityczne działanie prolidazy oraz oznaczanie aktywności prolidazy w komórkach nowotworowych zostało określone kolorymetrycznie wg metody Myara [15], która opiera się na pomiarze proliny wiązanej przez odczynnik Chinarda [16]. Badanie przeżywalności komórek zostało wykonane wg metody Carmichael a z użyciem soli tetrazolinowej MTT [17]. Zahamowanie procesu syntezy DNA komórek proliferujących zostało określone przez pomiar wbudowywanej [ 3 H]-tymidyny mierzonej licznikiem scyntylacyjnym. Elektroforeza na żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu została przeprowadzona metodą Laemmli ego [18]. Po badaniu SDS-PAGE białka rozdzielone na żelach zostały przeniesione na nitrocelulozę w celu oceny ekspresji prolidazy metodą western immunoblot. Synteza kolagenu została zbadana metodą Peterkofsky ego [19], polegającą na pomiarze wbudowywanej [3H]-proliny z użyciem oczyszczonej kolagenazy C. histolyticum. Wykazano, że podatność substratowa otrzymanych L- -prolinowych pochodnych nitrozomocznika na katalityczne działanie prolidazy jest zbliżona do naturalnego substratu tego enzymu glicylo-l-hydroksyproliny (Rycina 2.). Dowiedziono również, że aktywność prolidazy w komórkach MCF-7 i MDA-MB 231, inkubowanych w obecności badanych związków, rośnie w przypadku L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika (AB 3 -AB 6 ), natomiast wykazuje nieznaczne zmiany pod wpływem karmustyny (Rycina 3.). Podobne wyniki otrzymano również podczas oceny ekspresji prolidazy metodą western immunoblot (Rycina 4.). Porównano przeżywalność komórek raka piersi MCF-7 i MDA-MB 231 potraktowanych różnymi stężeń karmustyny, hydroksymocznika oraz otrzymanych L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika. Pomiar cytotoksyczności (Tabela 1 i Tabela 2) wykazał, że wszystkie badane związki wywierają hamujący wpływ na przeżywalność komórek, porównywalny do karmustyny, przy czym silniejsze działanie obserwowano wobec komórek MDA-MB 231. Najsilniejsze działanie wykazywał związek AB 4, którego IC 50 po 24-h inkubacji wobec komórek MCF-7 wynosił 132±2 μm, a wobec komórek MDA-MB ±2 μm. Aby stwierdzić, czy spadek przeżywalności komórek jest związany ze zmniejszonym podziałem komórkowym, oceniono biosyntezę DNA poprzez pomiar wbudowywania [ 3 H]-ty- μ

5 μ midyny do DNA komórek nowotworowych (Rycina 5.). W badaniu wykazano, że biosyntezę DNA najsilniej hamował związek AB 4 (MCF-7: IC 50 = 72±2μM, MDA-MB 231: IC 50 = 95±2μM). W związku z zaobserwowanymi różnicami aktywności prolidazy w badanych komórkach w obecności karmustyny oraz związków AB 3 -AB 6 przeprowadzono ocenę biosyntezy kolagenu w komórkach MCF-7 (Rycina 6) inkubowanych przez 24 godziny w obecności różnych stężeń badanych związków. Wykazano, że w miarę wzrostu stężenia badanych związków w podłożu hodowlanym następuje upośledzenie biosyntezy kolagenu, jednak jest ono mniejsze w przypadku zastosowanych proleków, niż karmustyny. Prolidaza jest enzymem, który katalizuje reakcję hydrolizy imidodipeptydów, w których aminokwasem C-końcowym jest prolina lub hydroksyprolina. Imidodipeptydy hydrolizowane są wewnątrzkomórkowo przez prolidazę, ponieważ soki przewodu pokarmowego nie zawierają enzymów zdolnych do hydrolizy III-rzędowego wiązania amidowego [20,21,22]. Wysoka specyficzność substratowa sugeruje możliwość wykorzystania tego enzymu do konwersji prolinowych pochodnych leków przeciwnowotworowych w formę farmakologicznie aktywną [7,8,9]. Poprzednie doniesienia wskazują, że aktywność prolidazy w wybranych komórkach nowotworowych jest kilkukrotnie wyższa, niż w prawidłowej tkance [6]. W rezultacie połączenia L-proliny z różnymi pochodnymi nitrozomocznika otrzymaliśmy szereg nowych, L-prolinowych pochodnych, podatnych na katalityczne działanie prolidazy. Wyniki sugerują, że nowe, L-prolinowe pochodne nitrozomocznika można traktować jako potencjalne proleki aktywowane przez prolidazę. W badaniach analizowaliśmy kilka biologicznych aspektów działania otrzymanych proleków wobec komórek raka piersi MCF 7 i MDA MB 231. Cytotoksyczność L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika, porównywalna do cytotoksyczności karmustyny była prawdopodobnie spowodowana uwolnieniem aktywnego leku podczas hydrolizy proleku, katalizowanej przez prolidazę. Podobne zależności zauważono w badaniu biosyntezy DNA i kolagenu. Wykazano, że uzyskane proleki słabiej hamują biosyntezę kolagenu w komórkach raka piersi MCF 7, w porównaniu z karmustyną. Niższa zdolność L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika do hamowania biosyntezy kolagenu może wynikać (przynajmniej częściowo) z uwagi na dostarczanie do komórek głównego substratu do jego syntezy L-proliny [23], która zostaje odłączona od proleku w wyniku hydrolizy katalizowanej przez prolidazę. W niniejszej pracy wykazaliśmy, że prolidaza może być wykorzystywana jako enzym konwertujący proleki w formę aktywną, co może stanowić potencjalną strategię w farmakoterapii różnych chorób. Stwierdzenie, że L-prolinowe pochodne nitrozomocznika wykazują podatność na katalityczne działanie prolidazy oraz zwiększają jej aktywność w badanych komórkach, stwarza możliwość ich wykorzystania jako proleków aktywowanych przez prolidazę w farmakoterapii chorób nowotworowych. Równocześnie w tkankach nowotworowych wykazano wyższą działalność kolagenolityczną i upośledzoną biosyntezę kolagenu [24], co wpływa na powstawanie przerzutów nowotworowych. W takim przypadku, zdolność L-prolinowych pochodnych nitrozomocznika do słabszego hamowania biosyntezy kolagenu, w porównaniu z wolnym lekiem, przyniosłaby znaczne korzyści.

6 1. Wermuth C.G.: Designing prodrugs and bioprecursors. Jolles G., Woolridge K.R.H.: Drug Design: Fact or Fantasy? Academic Press. London 1984: Zagotto G., Supino R., Favini E., Moro S., Palumbo M.: New 1,4-anthracene-9,10-dione derivatives as potential anticancer agents. Farmaco 2000; 55: Connors T.A.: Prodrugs in cancer chemotherapy. Xenobiotica 1986; 16: Dubowchik G.M., Walker M.A.: Receptor-mediated and enzyme-dependent targeting of cytotoxic anticancer drugs. Pharmacol Ther 1999;83: Lowenthal R.M., Eaton K.: Toxicity of chemotherapy. Hematol Oncol Clin North Am 1996; 10: Karna E., Miltyk W., Palka J., Slodkowska J., Chyczewski L., Worowski K., Rudzinski P.: Prolidase activity and beta 1 integrin expression in moderately and poorly differentiated lung adenocarcinomas. Ann. Acad. Med. Bialostocensis 1997; 42 Suppl 1: Bielawska A., Bielawski K., Chrzanowski K., Wołczyński S.: Prolidase-activated prodrug for cancer chemotherapy: Cytotoxic activity of proline analogue of chlorambucil in breast cancer MCF-7 cells. Farmaco 2000; 55: Chrzanowski K., Bielawska A., Bielawski K., Wołczyński S., Pałka J.: Cytotoxicity and effect on collagen biosynthesis of proline analogue of melphalan as a prolidase-convertible prodrug in cultured human skin fibroblasts. Farmaco 2001; 56: Chrzanowski K., Bielawska A., Pałka J.: Proline analogue of melphalan as a prodrug susceptible to the action of prolidase in breast cancer MDA-MB 231 cells. Farmaco 2003; 58: Phang J., Scriver C., Disorders of praline and hydrohxyproline metabolism, in: Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., (Ed.) The Metabolic Basis of Inherited Disease, Mc.Graw Hill, New York, 1989: Myara I., Charpentier C., Lemonnier A.: Prolidase and prolidase deficiency. Life Sci 1984; 34: Endo F., Tanoue A., Nakai H., Hata A., Indo Y., Titani K., Matsuda I.: Primary structure and gene localization of human prolidase. J Biol Chem 1989; 264: Mock W.L., Green P.C., Boyer K.D.: Specificity and ph dependence for acylproline cleavage by prolidase. J Biol Chem 1990; 265: Ehresmann K., Zelezny O., Eisenbrand G.: Syntheses of Potentially Antineoplastic Amides and Ester sof N-[N - -(2-Chloroethyl)-N -nitrosocarbamoyl]amino Acids; Arch Pharm (Weinheim) 1984; 317: Myara I., Charpentier C., Lemonnier A.: Optimal conditions for prolidase assay by proline colorimetric determination: application to imidodipeptiduria. Clin Chim Acta 1982; 125: Chinard F.P.: Photometric estimation of proline and otnithine. J Biol Chem 1952; 199: Carmichael J., Degraff W., Gazdar A., Minna J., Mitchell J.: Evaluation of a tetrazolinium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 1987; 47: Laemmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (Lond.) 1970; 227: Peterkofsky B., Palka J., Wilson S., Takeda K., Shah V.: Elevated activity of low molecular weight insulin-like growth factor-binding proteins in sera of vitamin C-deficient and fasted guinea pigs. Endocrinology 1991; 128: Adibi S.A., Mercer D.W.: Protein digestion in human intestine as reflected in luminal, mucosal, and plasma amino acid concentrations after meals. J Clin Invest. 1973; 52: Mock WL, Green PC, Boyer KD: Specificity and ph dependence for acylproline cleavage by prolidase. J Biol Chem. 1990; 265: Myara I., Charpentier C., Lemonnier A.: Prolidase and prolidase deficiency. Life Sci 1984; 34: J ackson S., Dennis A., Greenberg M.: Iminopeptiduria. A genetic defect in recycling collagen: a method for determining prolidase in red blood cells. Can Med Assoc J 1975; 113: Karna E., Surarzynski A., Pałka J.: Collagen metabolism disturbances are accompanied by an increase in prolidase activity in lung carcinoma planoepitheliale. Int J Exp Path 2000; 81: 1-8.