Słowa kluczowe starzenie, prolidaza, fibroblast, macierz pozakomórkowa, Key words aging, prolidase, fibroblasts, extracellular matrix, collagen.

Transkrypt

1 STRESZCZENIE Mechanizm upośledzenia podziałów fibroblastów i biosyntezy kolagenu w skórze w przebiegu procesu starzenia nie jest w pełni poznany. Jednym z enzymów odgrywających ważną rolę w biosyntezie kolagenu i wzroście fibroblastów jest prolidaza [E.C ]. Przeprowadzono badania porównawcze aktywności prolidazy i zawartości zewnątrzkomórkowego (ECM) kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej poddanych eksperymentalnemu starzeniu. Wykazano, że w przebiegu tego procesu następuje jednoczesne obniżenie zawartości ECM kolagenu i aktywności prolidazy. Korelacja pomiędzy obydwoma parametrami jest dwufunkcyjna. Obniżenie aktywności prolidazy przyczynia się do obniżenia zawartości kolagenu w ECM, natomiast usunięcie zewnątrzkomórkowego kolagenu w hodowli fibroblastów upośledza aktywność prolidazy w tych komórkach. Mechanizm tego zjawiska, stanowiący przedmiot dyskusji w niniejszej pracy, polega na pobudzeniu aktywności i ekspresji prolidazy za pośrednictwem sygnału indukowanego przez receptor integrynowy (prawdopodobnie β1), pobudzony przez interakcję z kolagenem typu I. Wyniki przedstawionych badań sugerują, że obniżenie podziałów komórkowych i zawartości kolagenu w skórze w przebiegu starzenia jest wynikiem upośledzenia aktywności i ekspresji prolidazy. Słowa kluczowe starzenie, prolidaza, fibroblast, macierz pozakomórkowa, kolagen. ABSTRACT The mechanism related to the decrease number of fibroblasts in the dermis during aging and decrease in the biosynthetic capacity of existing fibroblasts to produce collagen is not known. Since prolidase [E.C ] has been found to play an important role in the recycling of proline for collagen synthesis and cell growth we performed the comparative studies on prolidase activity and extracellular collagen content in in vitro aged human skin fibroblasts. We have found that during aging of human skin fibroblasts there is the coordinate decrease of prolidase activity and extracellular collagen content. The correlation is bifunctional. Decrease in prolidase activity contributes to decrease of extracellular collagen content and removal of extracellular collagen from cultured fibroblasts contributes to decrease of fibroblast`s prolidase activity. The mechanism of this phenomenon, that is discussed in this paper, is probably due to regulation of prolidase activity and expression through signal induced by β1 integrin receptor. Extracellular type I collagen, known ligand for β1 integrin receptor, is probably responsible for the β1 integrin activation. Our results demonstrate that during in vitro aging of human skin fibroblasts there is decreased fibroblast`s prolidase activity. The phenomenon may be related to the decrease number of fibroblasts and decrease of extracellular collagen content in in vitro aging of the cells. Key words aging, prolidase, fibroblasts, extracellular matrix, collagen. Jedną z charakterystycznych zmian towarzyszących procesowi starzenia organizmu jest upośledzenie biosyntezy kolagenu i jego zawartości w tkankach [1]. Fibroblasty skóry w hodowli komórkowej syntetyzują głównie kolagen typu I i III w stosunku około 3:1 oraz o wiele mniejsze ilości kolagenu typu VI [2,3]. W przebiegu starzenia w skórze następuje obniżenie zawartości fibroblastów, wzrost populacji komórek nie dzielących się oraz obniżenie ekspresji wielu genów kodujących białka pozakomórkowe, takie jak np. kolagen [4]. Mechanizm powyższych zjawisk nie jest w pełni poznany. Obserwacje poczynione w niniejszej pracy sugerują, że obniżenie zawartości pozakomórkowego kolagenu w hodowli fibroblastów poddanych doświadczalnemu starzeniu mogą być następstwem obniżenia aktywności prolidazy w przebiegu tego procesu. Prolidaza [E.C ] jest cytoplazmatyczna egzopeptydazą katalizująca proces hydrolizy imidodipeptydów za-

2 wierających C-końcową prolinę lub hydroksyprolinę (głównie glicylo-l-prolinę lub glicylo-l-hydroksyprolinę) [5,6,7]. Enzym ten jest szeroko rozpowszechniony w tkankach ludzi i zwierząt i obficie występuje w wielu komórkach, w tym w fibroblastach [8,9]. Prolidaza katalizuje końcowy etap degradacji kolagenu i odgrywa ważną rolę w dostarczaniu proliny do procesu syntezy kolagenu [10,11] i wzrostu komórek [12]. Niedobór prolidazy jest chorobą uwarunkowana genetycznie, charakteryzującą się imidodipeptydurią, zaburzeniami metabolizmu skóry, częstymi infekcjami, upośledzeniem funkcji układu immunologicznego oraz upośledzeniem umysłowym [5,7]. W hodowli fibroblastów pochodzących od pacjentów z niedoborem prolidazy zaobserwowano wzrost degradacji kolagenu oraz obniżenie wewnątrzkomórkowej puli proliny [13]. Szereg dowodów doświadczalnych wskazuje, że prolidaza może służyć jako ważny potranslacyjny modulator syntezy i degradacji kolagenu. Zachodzi przypuszczenie, że enzym ten może odgrywać ważną rolę w procesach związanych ze starzeniem organizmu. Z tego względu podjęto badania porównawcze oceny aktywności prolidazy i zawartości kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej poddanych doświadczalnemu starzeniu. MATERIAŁY Prolina, glicylo-prolina, glicylo-hydroksyprolina, metionylo-prolina, fenyloalanylo-prolina, bakteryjna kolagenaza (typ VII), elastaza, trypsyna i podłoże Eagle`a otrzymano z Sigma Chemical, podobnie jak większość użytych odczynników. Płodowa surowica bydlęca pochodziła z Gibco, a aminokwasy (non essential aminoacids) z Quality Biologicals Inc. Płytki hodowlane pokryte kolagenem typu I, typu IV, lamininą lub fibronektyną otrzymano z Collaborative Biomedical Products. L-5 [ 3 H]-proliną (28 Ci/mmol) otrzymano z Amersham. HODOWLA KOMÓRKOWA Fibroblasty skóry ludzkiej (CRL-1474) otrzymane z American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, hodowano na płytkach Costar w podłożu Eagle`a zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 2 mm glutaminy, non essential aminoacids, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny w 37 C w atmosferze 5% CO 2. W większości doświadczeń komórki hodowano w 6. oczkowych płytkach Costar, używając 1 x 10 5 komórek w 2 ml podłoża hodowlanego na oczko i inkubowano do stanu inhibicji kontaktowej. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PROLIDAZY Aktywność prolidazy oceniono metodą Myara i wsp. [14] która opiera się na pomiarze proliny przy użyciu odczynnika Chinard`a [15]. Komórki poddano trzykrotnemu płukaniu 0.15 mol/l NaCl, zeskrobano z powierzchni płytki i odwirowano (200xg). Komórki zeskrobane z 6 oczek zawieszono w 0.3 ml 0.05 mol/l Tris-HCl, ph 7.8, poddano homogenizacji ultradźwiękowej (3 razy po 10 sekund w 0 C). Próby poddano ultrawirowaniu (80,000 x g, 15 min.) w 4 C. Supernatant użyto do pomiaru zawartości białka i aktywności prolidazy. Aktywacja prolidazy wymaga preinkubacji z jonami manganu. W tym celu 100 μl supernatantu inkubowano przez 24 godziny w temp. 370C ze 100 μl 0.05 mol/l Tris-HCl, ph 7.8, zawierającego 2 mmol/l MnCl 2. Po inkubacji reakcję zapoczątkowano przez dodatek 100 μl mieszaniny inkubacyjnej do 100 μl 94 mmol/l glicylo-proliny (Gly-Pro) do uzyskania końcowego stężenia dipeptydu 47 mmol/l. Po kolejnej inkubacji przez 1 godzinę w 37 C, reakcję przerywano przez dodatek 1 ml 0.45 mol/l kwasu trichlorooctowego. Uwolnioną prolinę oznaczano przez zmieszanie 0.5 ml mieszaniny reakcyjnej z 2 ml mieszaniny 1:1 składającej się z lodowatego kwasu octowego i odczynnika Chinarda (25 g ninhydryny w 600 ml lodowatego kwasu octowego i 400 ml 6 mol/l kwasu ortofosforowego). A następnie inkubowanie przez 10 min. w 90 C. Ilość uwolnionej proliny oznaczano kolorymetrycznie przy 515 nm i kalkulowano na podstawie krzywej kalibracyjnej sporządzonej przy użyciu standardowych roztworów proliny. Zawartość białka mierzono metodą Lowry. Aktywność enzymu przedstawiono jako ilość nanomoli proliny uwolnionej z syntetycznego substratu w ciągu 1 minuty w przeliczeniu na miligram białka zawartego w mieszaninie enzymatycznej. PREPARATYKA MACIERZY POZAKOMÓRKO- WEJ (ECM) Macierz pozakomórkową (ECM), znakowaną izotopem, pozbawioną komórek przygotowano według zmodyfikowanej metody Jones a i wsp. [16]. Komórki zawieszone w podłożu hodowlanym naniesiono w ilości 1 x 10 5 komórek/oczko w 6 oczkowych płytkach i hodowano przez 3 dni. Następnie do podłoża hodowlanego dodawano 1 μci/ml L-[5-3 H] proliny (28Ci/mmol) i inkubowano przez kolejne 3 dni. Po tym okresie komórki płukano trzykrotnie PBS, następnie PBS z 0.5% Triton X-100 przez 10 min. w celu usunięcia komórek oraz 30 min. w 0.25 mol/l NH4OH w celu usunięcia elementów szkieletu komórkowego. ECM przytwierdzoną do powierzchni płytki płukano 3 krotnie PBS. Analiza obrazu z mikroskopu świetlnego nie wykazała pozostałości komórek na płytce. ANALIZA SKŁADNIKÓW ECM ECM znakowaną 5-[ 3 H] proliną analizowano w celu określenia proporcji pomiędzy glikoproteinami, elastyną i kolagenem. Pomiaru zawartości tych składników ECM dokonano poprzez traktowanie ECM trypsyną, elastazą i kolagenozą bakteryjną. W celu zaabsorbowania elastazy zanieczyszczającej trypsynę roztwór tego enzymu (10 ml 0.05% roztworu) inkubowano z 5 mg elastyny bydlęcej przez 30 min. w 37 C. Następnie zawiesinę nierozpuszczalnej elastyny odwirowano, a supernatant użyto do dalszych doświadczeń. Enzymów użyto w stężeniu 10 μg/ml w 0.1 mol/l Tris-HCl, ph 7.6 zawierającym 10 mmol/l CaCl 2. Po inkubacji ECM w temp. pokojowej ilość radioaktywności uwolnionej w wyniku inkubacji z trypsyną, elastazą bądź kolagenazą mierzono w liczniku scyntylacyjnym. ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ BIAŁEK NA ŻELU POLIAKRYLOAMIDOWYM W OBECNO- ŚCI SDS-U Fibroblasty płukano trzykrotnie 0,15 mol/l NaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach 200 x g. Odwirowane komórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l bu-

3 foru Tris-HCl o ph 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków trzykrotnie po 10 sekund w temp. 0 C. Próby wirowano przy x g w temp. 0 C przez 30 minut. W uzyskanym supernatancie oznaczono białko metodą Lowry i użyto do dalszych doświadczeń. Zastosowano 10% żel rozdzielający, zawierający 0,4% SDS, 1,5 mol/l Tris-HCl ph 8,8; 6% żel zagęszczający zawierający 0,4% SDS, 0,5 mol/l Tris-HCl ph 6,8 oraz roztwór 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1% SDS jako bufor elektrodowy. Próbkę rozpuszczono w buforze zawierającym: 0,125 mol/l Tris-HCl ph 6,8, 3% SDS, 20% glicerolu i 0,1% błękitu bromofenolowego. Rozdział prowadzono stosując aparat Mini-PROTEAN 3 firmy Bio-Rad Laboratories. Na żel nanoszono około 20 μl próby zawierającej 20 μg białka. Elektroforeza trwała 1 godzinę przy natężeniu prądu 100 ma na żel. Po jej zakończeniu żel poddawano transferowi na nitrocelulozę i następnie barwiono 0,125% roztworem Coomassie Brilant Blue R-250 w mieszaninie: propan-2-ol, kwas octowy, woda (25:10:65, v:v:v). Odbarwiano w wodnym roztworze zawierającym 10% kwasu octowego i 10% propan-2-olu. Użyto SeeBlue 2 (Invitrogen) jako standardów mas cząsteczkowych. ANALIZA BIAŁEK METODĄ WESTERN IMMU- NOBLOT Po rozdziale elektroforetycznym żele zostały zrównoważone przez 5 minutową inkubację w 20% (v/v) metanolowym roztworze zawierającym 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/ l glicyny. Białka transferowano na nitrocelulozę o porach 0,2 μm przy użyciu zestawu Multiphor II, pod wpływem napięcia 100 ma przez 1 godzinę, według metody opisanej w podręczniku dołączonym do aparatu. Pozycje standardów oznaczano markerem S&S NC (Schleicher i Schuel), a następnie odbarwiano roztworem TBS-T (20 mmol/l bufor Tris-HCl o ph 7,4 zawierający 150 mmol/l NaCl i 0,05% Tweed 20). Niespecyficzne wiązanie białek do nitrocelulozy zablokowano poddając ją działaniu 5% roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie nitrocelulozę inkubowano z pierwszym przeciwciałem króliczym przeciw prolidazie ludzkiej w stężeniu 1:1000 w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukano w roztworze TBS-T (1 x 15 minut, 2 x 10 minut) wolno mieszając. Następnie dodawano drugie przeciwciało poliklonalne przeciw immunoglobulinie króliczej, znakowane alkaliczną fosfatazą w stężeniu 1:3000 w TBS-T i poddawano inkubacji przez 30 minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płukano TBS-T (1 x 15 minut, 4 x 10 minut) i poddawano działaniu odczynnika Sigma-Fast BCIP/NBT w celu wybarwienia immunoreaktywnego białka znakowanego fosfatazą alkaliczną. ANALIZA STATYSTYCZNA Obliczono wartości średnie z 6 pomiarów ± S.D. Wyniki poddano analizie matematycznej używając test t Studenta przy P < Fibroblasty skóry ludzkiej poddano charakterystyce pod względem aktywności prolidazy w zależności od liczby pasażu komórek. W przebiegu doświadczalnego starzenia komórek (pomiędzy pasażem 8. i 16.) dokonano pomiaru aktywności prolidazy w komórkach w stanie inhibicji kontaktowej. Jak wynika z Ryc. 1 aktywność prolidazy w komórkach pochodzących z pasaży 8-12 nie ulega zmianie. Komórki pochodzące z wyższych pasaży ( ) wykazują niższą aktywność prolidazy, tym niższą im wyższy pasaż komórek. Komórki pochodzące z 16 pasażu wykazują zaledwie 25% aktywności tego enzymu w komórkach z pasażu Obniżenie aktywności prolidazy w przebiegu starze-

4 nia komórek koreluje z obniżeniem zawartości kolagenu w ECM (Ryc. 1). Zawartość kolagenu w ECM syntetyzowanym przez komórki pochodzące z pasażu 16. stanowi zaledwie 50 % zawartości kolagenu występującego w ECM wytworzonej przez fibroblasty pochodzące z pasażu Wpływ pozakomórkowego kolagenu na aktywność prolidazy przedstawiają wyniki eksperymentu przedstawione na Ryc.2 Aktywność prolidazy mierzono w fibroblastach, których skład białek ECM zaburzono poprzez usunięcie glikoprotein (traktowanie trypsyną), elastyny (traktowanie elastazą) i kolagenu (traktowanie kolagenozą). Wyniki badań przedstawione na Ryc.2 wskazują, że 6. godzinne traktowanie komórek kolagenazą bakteryjną przyczynia się do obniżenia aktywności prolidazy około 30% wartości kontrolnych. Podobne traktowanie fibroblastów trypsyną lub elastazą nie wywoływało takiego efektu. Wiadomo, że wzrostowi gęstości komórek w hodowli towarzyszy wzrost produkcji kolagenu przez te komórki. Niniejsze badania wskazują, że wzrostowi gęstości komórek w hodowli towarzyszy również wzrost aktywności prolidazy (Ryc.3). Podobne zjawisko zaobserwowano kiedy fibroblasty inkubowano na płytkach pokrytych różnymi białkami ECM. Wyniki przedstawia Ryc. 4. Komórki o niskiej gęstości z typową niską aktywnością prolidazy, wzrastające na płytce pokrytej kolagenem typu I, typu IV lub lamininą wykazywały wzrost aktywności prolidazy. Fibronektyna nie wpływała na aktywność tego enzymu. Różnice w aktywności prolidazy obserwowane w przebiegu doświadczalnego starzenia fibroblastów nie są wynikiem zmian specyficzności substratowej enzymu. Tabela I przedstawia wyniki badań dowodzące, że fibroblasty pochodzące z pasaży 12 i 16 wykazują tę samą specyficzność substratową. Fibroblasty odgrywają ważną rolę w prawidłowym rozwoju i funkcjonowaniu niemal wszystkich tkanek i narządów człowieka. Odpowiedzialne są one za produkcję ogromnej liczby różnych składników ECM. Jednym z najważniejszych składników ECM jest kolagen. Fibroblasty skóry syntetyzują głównie kolagen typu I, III i VI [2,3]. W przebiegu starzenia fibroblasty tracą stopniowo zdolność do podziałów komórkowych [17,18]. Utrata tej zdolności koreluje ze zmianami w ekspresji bardzo wielu genów, w tym genów kolagenu różnych typów [4]. W niniejszych badaniach wykazano, że podczas starzenia fibroblastów skóry ludzkiej następuje koordynacyjne obniżenie aktywności prolidazy i zawartości pozakomórkowego kolagenu. Końcowy etap degradacji kolagen jest katalizowany przez prolidazę [EC ], cytoplazmatyczny enzym

5 katalizujący hydrolizę dipeptydów z C-końcową proliną lub hydroksyproliną [7]. Enzym ten odgrywa ważną rolę w obrocie proliny do procesu resyntezy kolagenu [10,11] i wzrostu komórek [12]. Obniżenie aktywności prolidazy w przebiegu starzenia wpływa zatem na upośledzenie podziałów fibroblastów i biosyntezy kolagenu. Zjawisko to nasuwa pytanie o mechanizm obniżania aktywności prolidazy w fibroblastach w przebiegu starzenia. Wyniki doświadczenia, które ilustruje Ryc.2 sugerują, że usunięcie kolagenu z hodowli fibroblastów w stanie inhibicji kontaktowej poprzez inkubację z kolagenazą bakteryjną przyczyniło się do obniżenia aktywności prolidazy do około 30% wartości kontrolnej. Podobne traktowanie komórek trypsyną lub elastazą nie powodowało takiego efektu. Wynik tego doświadczenia pozwala przypuszczać, że obniżenie zawartości kolagenu w ECM jest przyczyną obniżenia aktywności prolidazy. Kolagen stanowiący około 30% wszystkich białek organizmu jest niezbędny nie tylko jako białko podporowe w celu utrzymania struktury tkanki łącznej ale również jako ligand receptorów adhezyjnych. Interakcja pomiędzy receptorami adhezyjnymi komórek a białkami ECM, takimi jak kolagen, aktywuje szlaki sygnałowe w komórce przyczyniając się do regulacji ekspresji genów, różnicowania, wzrostu i wielu funkcji metabolicznych komórki [19,20,21]. Wiadomo, że w wielu tych funkcjach pośredniczą receptory integrynowe [22,23]. Prawdopodobnie interakcja receptora integrynowego z kolagenem stanowi mechanizm indukcji aktywności prolidazy. Wyniki badań przedstawione na Ryc. 3 wskazują, że wzrostowi gęstości komórek w hodowli towarzyszy zarówno wzrost aktywności jak i ekspresji prolidazy. Z literatury oraz badań własnych wiadomo, że w miarę wzrostu gęstości komórek w hodowli ich zdolność do biosyntezy kolagenu wzrasta [24]. Najwyższą zdolność do biosyntezy kolagenu wykazują fibroblasty w stanie inhibicji kontaktowej. Z tego względu należy sądzić, że wzrost aktywności prolidazy w fibroblastach o wyższej gęstości komórek w hodowli jest wynikiem wzrostu zawartości zewnątrzkomórkowego kolagenu pobudzającego receptor integrynowy. Prawdopodobnie wzrost aktywności tego enzymu jest następstwem wzrostu jego ekspresji. Dalszych dowodów popierających przedstawiona hipotezę dostarczają badania, które ilustruje Ryc. 4. Fibroblasty hodowane na płytce pokrytej różnymi białkami ECM (zwłaszcza kolagenem typu I, IV i lamininą) wykazywały wzrost aktywności prolidazy. Ciekawe, że fibronektyna stanowiąca ligand tych samych receptorów integrynowych co kolagen, nie wykazywała takiego efektu. Z uwagi jednak na fakt, że fibroblasty w hodowli syntetyzują głównie kolagen typu I, elastynę i fibronektynę [25] i nie syntetyzują kolagenu typu IV ( ważnego składnika błon podstawnych) można przypuszczać, że składnikiem ECM w hodowli fibroblastów pobudzającym aktywność prolidazy jest kolagen typu I. Sugestia ta jest poparta przez szereg poprzednich badań [26, 27] jakkolwiek istnieją prawdopodobnie mechanizmy pobudzania biosyntezy kolagenu niezależne od receptorów integrynowych i aktywności prolidazy [28]. Istnieje wiele dowodów wskazujących, że mechanizmy regulacyjne obserwowane w hodowlach komórkowych maja miejsce również in vivo [25]. W procesie starzenia skóra staje się coraz cieńsza oraz zmniejsza sie zawartość kolagenu w tej tkance [1]. Ponadto następuje obniżenie ilości fibroblastów w skórze i ich zdolności do biosyntezy kolagenu [25]. Wyniki przedstawionych badań wykazały, że w przebiegu doświadczalnego starzenia fibroblastów skóry ludzkiej następuje obniżenie aktywności prolidazy. Zjawisko to jest przyczyną obniżenia zdolności fibroblastów do podziałów komórkowych i biosyntezy kolagenu. Zachodzi przypuszczenie, że aktywatory prolidazy mogą okazać się skutecznymi środkami farmakologicznymi przeciwdziałającymi skutkom procesu starzenia skóry. 1. Shuster S, Black MM, McVitie E. The influence of age and sex on skin thickness, skin collagen and density. Br J Dermatol 1975; 93: Gay S, Martin GR, Müller PK, Timpl R, Kuhn K. Simultaneous synthesis of types I and III collagens by fibroblasts in culture. Proc Natl Acad Sci USA 1976; 73: Hatamochi A, Aumailley M, Mauch C, Chu ML, Timpl R, Krieg T. Regulation of collagen VI expression in fibroblasts. Effects of cell density, cell-matrix interactions, and chemical transformation. J Biol Chem1989; 264: Furth JJ. The steady state levels of type I collagen mrna are reduced in senescent fibroblasts. J Gerontol 1991; 46: B Myara I, Charpentier C, Lemonnier A. Minireview: Prolidase and prolidase deficiency. Life Sciences 1984; 34: Mock WL, Green PC, Boyer KD. Specificity and ph dependence for acylproline cleavage by prolidase. J Biol Chem. 1990; 265: Phang J M, Scriver CR. Disorders of proline and hydroxyproline metabolism. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The metabolic basis of inherited disease, McGraw Hill New York; 1989: Myara I, Brosset B, Lemonnier A. Tissue distribution of prolidase and prolinase activity in man and rat. Med Sci Res 1987; 15: Endo F, Tanoue A, Nakai H, Hata A, Indo Y, Titani K, Matsuda I. Primary structure and gene localization of human prolidase. J Biol Chem 1989; 264: Jackson SH, Dennies AW, Greenberg M. Iminopeptiduria. A genetic defect in recycling collagen: a method for determining prolidase in red blood cells. Canad Med Assoc J 1975; 113: Jackson SH, Heininger JA. A reassessment of the collagen reutilization theory by an isotope ratio method. Clin Chim Acta 1973; 46: Emmerson KS, Phang JM. Hydrolysis of proline dipeptides completely fulfills the proline requirement in a proline - auxotropic Chinese Hamster Ovary cell line. J Nutr 1993; 123: Chamson A, Voigtlander V, Myara I, Frey J. Collagen biosynthesis anomalies in prolidase deficiency: effect of glycyl-l-proline on the degradation of newly synthesized collagen. Clin Physiol Bioch 1989; 7: 128.

6 14. Myara I, Charpentier C, Lemonnier A. Optimal conditions for prolidase assay by proline colorimetric determination: application to imidodipeptiduria. Clin Chim Acta 1982; 125: Chinard FP. Photometric estimation of proline and ornithine. J Biol Chem 1952; 199: Jones PA, DeClerck YA. Destruction of extracellular matrices containing glycoproteins, elastin, and collagen by metastatic human tumor cells. Cancer Res 1980; 40: Martin M, El Nabout R, Lafuma C, Crechet F, Remy J. Fibronectin and collagen gene expression during in vitro aging of pig skin fibroblasts. Exp Cell Res 1990; 191: Choi AMK, Olsen DR, Cook KG, Deamond SF, Uitto J, Bruce SA. Differential extracellular matrix gene expression by fibroblasts during their proliferative life span in vitro and at senescence. J Cell Physiol 1992 ; 151: Bissel M. How does extracellular matrix direct gene expression? J Theor Biol 1981; 99: Donjacour AA, Cunha GR. Stromal regulation of epithelial function. Cancer Treat Res 1991; 53: Carey DJ. Control of growth and differentiation of vascular cells by extracellular matrix. Ann Rev Physiol 1991; 53: Akiyama SK, Nagata K, Yamada K. Cell surface receptors for extracellular matrix components. Biochim Biophys Acta 1990; 1031: Albelda SM, Buck CA. Integrins and other cell adhesion molecules. FASEB J 1990; 4: Mäkelä JK, Vuorio T, Vuorio E. Growth-dependent modulation of type I collagen production and mrna levels in cultured human skin fibroblasts. Biochim Biophys Acta 1990; 1049: Takeda K, Gosiewska A, Peterkofsky B. Similar, but not identical modulation of expression of extracellular matrix components during in vitro and in vivo aging of human skin fibroblasts. J Cell Physiol 1992; 153: Pałka JA, Phang JM. Prolidase activity in fibroblasts is regulated by interaction of extracellular matrix with cell surface integrin receptors. J Cell Biochem 1997; 67: Surażyński A, Pałka J, Wołczyński S. Phosphorylation of prolidase increases the enzyme activity. Mol Cell Biochem 2001; 220: Karna E, Miltyk W, Pałka JA. Butyrate-induced collagen biosynthesis In cultured fibroblasts is independent on α2β1 integrin signaling and undergoes through IGF-I receptor cascade. Mol Cell Biochem 2006; 286; 147.