(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/002826

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/12 ( ) C07K 14/025 ( ) C12N 7/04 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Kompozycja szczepionkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie mieszaniny HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV VLP oraz stabilizowana kompozycja szczepionkowa (30) Pierwszeństwo: , GB, (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/05 (72) Twórca(y) wynalazku: MARTINE ANNE CECILE WETTENDORFF, Rixensart, BE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionkowa, sposób jej wytwarzania, zastosowanie mieszaniny HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV VLP do wytwarzania szczepionki oraz stabilizowana kompozycja szczepionkowa. Wynalazek dotyczy zatem szczepionek przeciw HPV zawierających cząstki wiruso-podobne (VLP) zawierające białka wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV). Wirusy brodawczaka są niewielkimi onkogennymi wirusami DNA, które wykazują wysoką specyficzność gatunkową. Jak dotychczas opisano ponad 100 indywidualnych genotypów wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV). HPV są ogólnie specyficzne względem powierzchni skóry (np. HPV-1 i -2) lub błon śluzowych (np. HPV-6 i -11) i zazwyczaj wywołują łagodne guzy (brodawki), które utrzymują się przez okres kilku miesięcy lub lat. Takie łagodne guzy mogą być niepokojące dla pacjentów, ale zazwyczaj nie zagrażają życiu, z paroma wyjątkami. Niektóre HPV są także związane z rakami. Najsilniejszy pozytywny związek pomiędzy HPV a rakiem u ludzi stwierdzono w przypadku HPV-16 i HPV-18 i raka szyjki macicy. Rak szyjki macicy jest najpowszechniejszym nowotworem w krajach rozwijających się, przy około nowych przypadków pojawiających się na świecie co roku. Obecnie istnieje techniczna możliwość czynnej walki z pierwotnymi zakażeniami HPV-16, a nawet istniejącymi już rakami zawierającymi HPV-16, za pomocą szczepionek. Prace przeglądowe na temat perspektyw profilaktycznego i terapeutycznego szczepienia przeciw HPV-16, patrz Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) i Hagenesee M. E., Infections in Medicine (7) , Pomimo występowania niewielkiej zmienności wszystkie opisane genomy HPV zawierają co najmniej osiem genów wczesnych, E1 do E8 oraz dwa geny późne L1 i L2. Ponadto górny region regulatorowy niesie sekwencje regulatorowe, które wydają się kontrolować większość procesów transkrypcyjnych genomu HPV. Szczepionki oparte na HPV L1 ujawniono w WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 i WO 94/ Taka szczepionka może zawierać antygen L1 jako monomer, kapsomer lub cząstkę wiruso-podobną. Sposoby wytwarzania VLP są dobrze znane w dziedzinie wynalazku i obejmują rozwiązania rozkładania-ponownego składania VLP, które zapewniają zwiększoną jednorodność, np. jak opisano w WO i US Takie cząstki mogą dodatkowo zawierać białka L2. Szczepionki oparte na L2 opisano np. w WO 93/ Inne szczepionki HPV są oparte na wczesnych białkach, takich jak E7, lub białkach fuzyjnych, takich jak L2-E7. Pomimo prac badawczych nad szczepionkami HPV nadal brak jest szeroko skutecznej szczepionki przeciw rakowi szyjki macicy. Obecnie opracowano ulepszoną szczepionkę przeciw wirusowi brodawczaka ludzkiego. Wynalazek dotyczy kompozycji szczepionkowej charakteryzującej się tym, że zawiera VLP zawierające białka L1 lub funkcyjne pochodne białka L1 z genotypów HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45. Korzystna jest szczepionka, która zawiera mieszaninę HPV 16 VLP, HPV 18 VLP, HPV 31 VLP i HPV 45 VLP, przy czym każda VLP zawiera białka L1 lub funkcyjne pochodne białka L1 z tylko jednego genotypu HPV. Korzystna jest szczepionka, która zawiera VLP będące VLP wyłącznie z L1, zawierającymi białko L1 HPV lub funkcyjne pochodne białka L1 i niezawierającymi innego białka HPV. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, która zawiera VLP składające się zasadniczo tylko z białek HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, w której co najmniej jedno białko L1 jest skróconym białkiem L1. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, która jest kompozycją z VLP zawierającą białko L1 lub jego funkcyjną pochodną z dodatkowego genotypu HPV. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, w której dodatkowa VLP zawiera białko L1 lub funkcyjną pochodną białka L1, wybrane z HPV 33, 52, 53, 58, 35, 56 i 59. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, która jest co najmniej w 60% skuteczna w profilaktyce raka szyjki macicy. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, która dodatkowo zawiera adiuwant. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, która jako adiuwant zawiera sól glinu. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, w której sól glinu stanowi wodorotlenek glinu. Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, która dodatkowo zawiera 3D-MPL.

3 PL B1 3 Korzystna jest kompozycja szczepionkowa, w której VLP zawierają białka L1, które nie są chimeryczne. Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania szczepionki, charakteryzującego się tym, że VLP zawierające białka L1 lub funkcyjne pochodne białka L1 łączy się z HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45, z wytworzeniem szczepionki określonej powyżej. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania mieszaniny HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45 VLP zawierających białko L1 lub jego funkcyjną pochodną do wytwarzania szczepionki do profilaktyki lub leczenia zaburzenia związanego z zakażeniem HPV. Wynalazek dotyczy także kompozycji szczepionkowej zdefiniowanej powyżej do profilaktyki zakażenia HPV lub leczenia choroby związanej z zakażeniem HPV. Wynalazek dotyczy również stabilizowanej kompozycji szczepionkowej, charakteryzującej się tym, że zawiera szczepionkę zdefiniowaną powyżej, w której VLP z HPV 16, 18, 31 i 45 są zaadsorbowane na wodorotlenku glinu przed zmieszaniem. Korzystnie kompozycja szczepionkowa, sposób albo zastosowanie według wynalazku, charakteryzują się tym, że odpowiedź immunologiczna przeciw danemu typowi VLP w szczepionce wynosi co najmniej 50% odpowiedzi na taki sam typ VLP mierzonej indywidualnie. Wynalazek może być przydatny do wytwarzania szczepionki do zapobiegania rakowi szyjki macicy. Możliwy jest zatem sposób zapobiegania rakowi szyjki macicy, przez podawanie pacjentowi z ryzykiem wystąpienia raka szyjki macicy skutecznej ilości szczepionki, jak opisano powyżej, takiej jak szczepionka zawierająca mieszaninę HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45 VLP. VLP stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą być wytworzone albo z pełnej długości białka HPV L1 albo z pewnych pochodnych L1 sposobami znanymi w dziedzinie wynalazku, przykładowo ujawnionymi w publikacji WO 99/13056, którą wprowadza się tu jako pozycję literaturową. Korzystne jest, aby białko L1 stosowane do wytworzenia VLP było skróconym białkiem L1. Korzystnie co najmniej jedna z VLP zawiera skrócone białko L1 oraz korzystnie wszystkie białka L1 w skojarzonej szczepionce są skróconymi białkami L1. Korzystnie skrócenie usuwa sygnał lokalizacji jądrowej. Korzystnie skrócenie jest skróceniem C-końcowym. Korzystnie skrócenie C-końcowe usuwa mniej niż 50 aminokwasów, korzystniej mniej niż 40 aminokwasów. Najkorzystniej C-końcowe skrócenie usuwa 34 aminokwasy z HPV 16 i 35 aminokwasów z HPV 18. Skrócone białka L1 są odpowiednio funkcyjnymi pochodnymi białka L1. Funkcyjne pochodne białka L1 są zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej (jeżeli jest to wymagane przy odpowiednim adiuwantowaniu), która to odpowiedź immunologiczna jest w stanie rozpoznać VLP zawierające pełnej długości białko L1 i/lub typ HPV z którego pochodzi białko L1. VLP stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą także zawierać inne typy funkcyjnych pochodnych białek, w tym pełnej długości mutanty i skrócone białka L1 HPV, takie jak mutanty delecyjne, substytucyjne lub insercyjne. Odpowiednie pochodne zawierają także sekwencje z optymalizacją kodonów. Białkiem L1 lub pochodną może być także białko fuzyjne, takie jak fuzja białka L1 z L2 lub wczesnym białkiem. Korzystnie białka fuzyjne zawierają białka z tylko jednego genotypu HPV. VLP stworzone z chimerycznych białek L1, w których białka L1 z jednego genotypu są połączone z białkami L1 innych genotypów nie są korzystne. Białko L1 lub jego funkcyjna pochodna jest korzystnie zdolne do wytworzenia VLP, a wytworzenie VLP można zbadać znanymi metodami, takimi jak mikroskopia elektoronowa i dynamiczne rozpraszanie światła. Korzystnie polidyspersyjność VLP jest niższa niż 0,15, korzystniej niższa niż 0,1 a najkorzystniej niższa niż 0,08 przy pomiarze za pomocą Malvern Zetasizer 3000HS w warunkach tutaj opisanych. Stosowanie tu poniżej określenia białko" lub odniesienie do specyficznego białka, np. L1", obejmuje odniesienie do funkcyjnych pochodnych białka, chyba że wskazano inaczej, lub co innego w sposób oczywisty wynika z kontekstu. W korzystnej postaci szczepionka według wynalazku zawiera tylko cztery typy VLP: HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45 VLP. Korzystnie VLP są VLP wyłącznie z L1 z każdego z tych czterech genotypów. Alternatywnie szczepionka może wykazywać dodatkową ważność HPV, tworząc szczepionkę pięcioważną. Korzystnie dodatkowa ważność dotyczy VLP zawierającego białko L1 lub jego funkcyjną pochodną, jak powyżej, z jednego lub większej liczby HPV 52, 53, 58, 33, 35, 56 i 59. Korzystnie piątym genotypem jest HPV 33, gdy szczepionka jest do stosowania w Ameryce Południowej lub HPV 52, 53 lub 58 gdy szczepionka jest do stosowania w Azji.

4 4 PL B1 Możliwe są również szczepionki wykazujące 2 lub większą liczbę dodatkowych ważności dostarczając szczepionkę z 6 lub większą liczbą genotypów. W jednej korzystnej postaci połączenie nie zawiera VLP z genotypów HPV 6a, 6b lub HPV 11. Korzystnie szczepionka jest skuteczna co najmniej w 55% w profilaktyce raka szyjki macicy, korzystniej w 60%, 65%, 70%, 75%, korzystnie w 80% lub jeszcze bardziej skuteczna w profilaktyce raka szyjki macicy. Aby uniknąć wątpliwości, % skuteczność w profilaktyce raka szyjki macicy oznacza ochronę przeciw wszystkim rakom szyjki macicy wywołanym zakażeniem HPV i nie oznacza ochrony przed rakiem wywołanym tylko przez jeden genotyp. Profilaktykę można zasadniczo ocenić po roku od początkowego szczepienia, jednakże korzystne szczepionki są równie skuteczne po 2, 3, 4, 5 i większej liczbie lat. % skuteczności można zwiększyć przez wybranie odpowiednich genotypów HPV dobierając preparat szczepionki do specyficznych obszarów geograficznych. Korzystnie połączenie VLP w szczepionce nie zmniejsza immunogenności każdego typu VLP. W szczególności korzystne jest aby nie było zakłócających oddziaływań pomiędzy VLP HPV w połączeniu zgodnym z wynalazkiem, tak aby skojarzona szczepionka VLP według wynalazku była zdolna wywołać skuteczną ochronę przeciw zakażeniu przez każdy z genotypów HPV reprezentowanych w szczepionce. Dogodnie odpowiedź immunologiczna przeciw danemu typowi VLP w połączeniu wynosi co najmniej 50% odpowiedzi immunologicznej przeciw VLP tego samego typu gdy jest ona mierzona indywidualnie, korzystnie 100% lub zasadniczo 100%. W przypadku odpowiedzi na HPV 16 i HPV 18 VLP, skojarzona szczepionka według wynalazku korzystnie stymuluje odpowiedź immunologiczną, która wynosi co najmniej 50% odpowiedzi wywołanej przez skojarzoną szczepionkę HPV 16/HPV 18 VLP. Dogodnie odpowiedź immunologiczna wytworzona przez szczepionkę według wynalazku ma poziom, przy którym nadal obserwowany jest efekt ochronny każdego typu VLP. Odpowiedź immunologiczna może być dogodnie mierzona przykładowo na podstawie odpowiedzi przeciwciał, jak tutaj zilustrowano. Szczepionkę według wynalazku można stosować do leczenia lub profilaktyki zakażenia i/lub choroby wywołanej HPV. Przykładowo, szczepionkę można stosować terapeutycznie do zmniejszenia obciążenia wirusem i/lub zakażenia, prowadzących do raka szyjki macicy lub następstw CIN III. Wynalazek zatem dotyczy szczepionki według wynalazku do stosowania w leczeniu terapeutycznym chorób związanych z zakażeniem HPV lub w profilaktyce zakażenia lub choroby. Możliwe jest także stosowanie połączenia VLP do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw HPV 16, 18, 31 i 45. Szczepionkę według wynalazku można dodatkowo formułować z VLP, które umożliwiają ochronę przeciw brodawkom genitalnym, tak jak z VLP zawierającymi białko L1 z genotypów HPV 6a, 6b i/lub HPV 11. Korzystnie VLP zawierają tylko białko L1 HPV oraz nie zawierają białka L2 lub jego fragmentu. Szczepionki według wynalazku mogą zawierać inne białka lub fragmenty białek dodatkowo oprócz białka L1 lub jego pochodnej. Białka/peptydy można stosować w postaci chimerycznej z białkiem L1 w VLP, zamknięte w VLP lub współ-formułowane w mieszaninie z VLP. Inne białka lub peptydy można także podawać jednocześnie ze szczepionką według wynalazku. Do szczepionki można dodać białko L2 HPV lub pochodną L2, taką jak peptyd L2, np. ujawniony w K. Kawana i in., Vaccine 19, (2001) str Dodatkowo szczepionkę według wynalazku można formułować ze wczesnymi antygenami HPV, takimi jak E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8 lub ich immunologicznie aktywne pochodne. Przy stosowaniu w postaci chimerycznej korzystne jest zastosowanie immunogennego fragmentu wielkości około aminokwasów wczesnego antygenu. Dodatkowo szczepionkę można także formułować lub podawać jednocześnie z antygenami innymi niż HPV. Dogodnie antygeny te mogą umożliwiać ochronę przeciw innym chorobom, najkorzystniej przeciw chorobom przenoszonym drogą płciową, takim jak wirus opryszczki, Chlamydia i HIV. Korzystne jest aby szczepionka zawierała gd lub jego skróconą formę z HSV, korzystnie białko gd2t opisane w WO 99/ W ten sposób szczepionka zapewnia ochronę przeciw zarówno HPV, jak i HSV. Korzystne antygeny HIV opisano w WO/ i WO/ Zgodnie z wynalazkiem można zastosować mieszaninę VLP zawierających białka kapsydowe z HPV 16, 18, 31 i 45, takich jak VLP wyłącznie z L1. W szczególnie korzystnej postaci wynalazek dotyczy szczepionki zawierającej mieszaninę HPV 16 VLP, HPV 18 VLP, HPV 31 VLP i HPV 45 VLP. Przykładowo, odniesienie tutaj do HPV 16 VLP", jest odniesieniem do L1 VLP, przy czym białko L1 lub pochodna L1 jest z HPV 16. Zatem ogólnie taka sama nomenklatura dotyczy innych opisanych tu VLP, takich jak HPV 18, HPV 31 i HPV 45 VLP.

5 PL B1 5 Korzystnie każda VLP zawiera białko L1 z tylko jednego genotypu HPV. Taką szczepionkę można formułować przez wytwarzanie poszczególnych VLP z HPV 16, 18, 31 i 45, a następnie łączenie takich VLP. Korzystnie w VLP nie ma innych niż L1 białek HPV. Korzystne są także VLP zawierające białka z tylko jednego genotypu HPV, takie jak VLP z L1 i L2 z HPV 16. Jednak w alternatywnej postaci VLP mogą być mieszanymi VLP, mieszana VLP zawiera białko L1 z jednego genotypu w połączeniu z białkiem L1 z drugiego genotypu, przy czym różne białka L1 nie są chimerycznymi białkami L1, ale są połączone ze sobą w tej samej strukturze kapsydu z wytworzeniem immunogennych VLP. Korzystne połączenia obejmują jakąkolwiek kombinację genotypów 16, 18, 31 i 45, przykładowo szczepionka może obejmować mieszane HPV 16/HPV 18 VLP w połączeniu z mieszanymi HPV31/HPV45 VLP lub mieszane 16/31 VLP w połączeniu z mieszanymi 18/45 VLP. Uwzględnia się także połączenia więcej niż dwóch genotypów L1 w jednej VLP. Mieszane VLP można wytwarzać przez osobną ekspresję poszczególnych białek L1, a następnie łączenie ich, z wytworzeniem VLP, jak tutaj przedstawiono przykładowo. Alternatywnie wiele białek L1 może być eksprymowanych w tej samej komórce, z jednego lub większej liczby konstruktów DNA. Przykładowo, wieloma konstruktami DNA można transformować lub transfekować komórki gospodarzy, przy czym każdy wektor koduje inne białko L1. Alternatywnie można stosować pojedynczy wektor zawierający wiele genów L1, kontrolowanych przez wspólny promotor lub wiele indywidualnych promotorów. Gdy jest to stosowne, do wektora można także wprowadzić elementy IRES. W wyniku takich strategii ekspresji wspólnie eksprymowane białka L1 można wspólnie oczyszczać, a następnie wytwarzać VLP albo mieszane VLP mogą tworzyć się samorzutnie, które następnie mogą być oczyszczane. Gdy stosuje się mieszane VLP, korzystny sposób wytwarzania mieszanych VLP obejmuje przygotowanie białek L1 do VLP lub ich pochodnych, takich jak białka L1, z różnych genotypów wirusa brodawczaka, mieszanie białek, gdy jest to konieczne, oraz złożenie białek z wytworzeniem mieszanych VLP. Białka L1 mogą być przed zmieszaniem w postaci surowego ekstraktu, mogą być częściowo oczyszczone lub oczyszczone. Korzystnie białka są co najmniej częściowo oczyszczone przed połączeniem. Ewentualnie po złożeniu można przeprowadzić dalsze oczyszczanie mieszanych VLP. Gdy stosuje się dodatkowe antygeny można je dodać, gdy jest to stosowne. W jednej postaci mieszane VLP można wytworzyć przez rozłożenie dwóch lub większej liczby VLP, a następnie połączenie składników rozłożonych VLP w dowolnym momencie przed ponownym złożeniem. Rozwiązanie to jest odpowiednie gdy VLP tworzą się samorzutnie gdy eksprymowane jest białko L1, co występuje, np. w niektórych szczepach drożdży. Gdy ekspresja białka L1 nie prowadzi do samorzutnego tworzenia VLP, preparaty białek L1 lub kapsomery można łączyć przed złożeniem w VLP. Złożenie VLP ogólnie osiąga się przez usunięcie środka redukującego. Zatem przy wytwarzaniu mieszanej VLP, mieszanie białek korzystnie prowadzi się przed usunięciem środka redukującego z mieszaniny białek. Korzystnie wytwarzanie mieszanych VLP obejmuje etap wytwarzania mieszanego VLP z mieszaniny zdysocjowanych białek L1 przez usunięcie środka redukującego z mieszaniny w warunkach, które umożliwiają wytworzenie VLP. Korzystnie proces ponownego składania wynika z usunięcia środka redukującego, takiego jak -merkaptoetanol. Jednak wiadomo, że wytworzenie VLP zależy od ph, jonów metali i stopnia zasolenia, a także obecności środka redukującego. Zatem w pewnych okolicznościach można założyć, że VLP mogą powstać w obecności środka redukującego. Dla realizacji wynalazku istotne jest tylko to, że mieszanie białek z różnych genotypów prowadzi się przed zmianą na warunki środowiska, które umożliwiają wytworzenie mieszanych VLP, niezależnie czy jest to ph, jony metalu, stopień zasolenia, środowisko redukujące lub połączenie tych czynników. Gdy stosuje się mieszane VLP, korzystnie składniki VLP miesza się w proporcjach, w których są one wymagane w końcowej mieszanej VLP. Przykładowo z zastosowaniem takich samych ilości częściowo oczyszczonych białek L1 z HPV 16 i HPV 18 uzyskuje się mieszaną VLP z praktycznie równymi ilościami każdego z białek. Roztwory szczepionkowe zawierające mieszane VLP można stabilizować preparatami znanymi w dziedzinie wynalazku, takimi jak ujawnione w publikacjach WO 98/44944, WO W przypadku wszystkich szczepionek według wynalazku korzystne jest aby szczepionka była stosowana do szczepienia dorastających dziewczynek w wieku 10-15, korzystnie lat. Szcze-

6 6 PL B1 pionkę można także podawać kobietom po nieprawidłowym teście Papanicolau lub po operacji usuwającej uszkodzenie wywołane przez HPV. Korzystnie szczepionkę podaje się zgodnie ze schematem 2 lub 3 dawek, np. odpowiednio zgodnie ze schematem obejmującym dawki w miesiącu 0, 1 lub w miesiącu 0, 1 i 6. Dogodnie schemat szczepienia obejmuje szczepienie przypominające po 5 do 10 latach, korzystnie 10 latach. Korzystnie szczepionka jest płynnym preparatem szczepionki, jednakże szczepionka może być liofilizowana i roztwarzana przed podaniem. Szczepionki według wynalazku mogą także zawierać adiuwanty w połączeniu z VLP. Dogodnie VLP stosowane zgodnie z wynalazkiem są stosowane w połączeniu z glinem i korzystnie adsorbuje się je lub częściowo adsorbuje na adiuwantach na bazie glinu. Korzystne są także adiuwanty, które stymulują odpowiedź typu Th1, takie jak 3DMPL lub QS21. Korzystnie adiuwantem jest sól glinu, korzystnie w połączeniu z 3DMPL, tak jak fosforan glinu i 3D-MPL. Korzystnym adiuwantem jest wodorotlenek glinu, przy czym połączenie wodorotlenku glinu z 3D-MPL jest szczególnie korzystne. Gdy VLP są zaadsorbowane na adiuwantach zawierających glin, adiuwant korzystnie dodaje się przed zmieszaniem VLP, z wytworzeniem końcowego produktu szczepionki. Szczepionka może także zawierać glin lub związek glinu jako stabilizator oraz wynalazek dotyczy także stabilizowanej szczepionki skojarzonej, w której VLP są zaadsorbowane na soli glinu. Dogodnie VLP są bardziej stabilne w czasie po zaadsorbowaniu na soli glinu niż przy braku glinu. Korzystnie stabilizowane VLP są otrzymywane lub otrzymuje się je metodami według przykładu 1 części C3. Szczepionki według wynalazku można podawać którąkolwiek z różnych dróg podawania, tak jak doustnie, domiejscowo, podskórnie, dośluzówkowo (zazwyczaj dopochwowo), dożylnie, domięśniowo, donosowo, podjęzykowo, śródskórnie lub w czopkach. Korzystne jest podawanie domięśniowe i śródskórne. Dawka VLP i innych białek będzie się różnić zależnie od stanu, płci, wieku i masy ciała pacjenta, drogi podawania oraz HPV szczepionki. Ilość może także się różnić zależnie od liczby typów VLP. Dogodnie podaje się ilość VLP odpowiednią do wytworzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Dogodnie każda dawka szczepionki zawiera g każdego z VLP, korzystnie 5-80 g, korzystniej 5-30 g każdego VLP, najkorzystniej 5-20 g każdego VLP, przy czym ilość 5 g, 6 g, 10 g, 15 g lub 20 g jest szczególnie korzystna. Wieloważną szczepionkę według wynalazku korzystnie wytwarza się przez połączenie oczyszczonych L1 VLP. Sposoby wytwarzania L1 VLP są dobrze znane w dziedzinie wynalazku i obejmują np. sposoby podane w WO , WO , WO 00/09671 i US Dogodnie VLP stosowane zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać przez rozkładanie i ponowne składanie VLP, w celu dostarczenia jednorodnych i czystych VLP. Przykłady odpowiednich sposobów podano w WO , US i WO Korzystne VLP przygotowuje się z komórek owadzich, takich jak komórki Sf9 lub Hi-5, jednak można także stosować dowolne odpowiednie komórki, takie jak komórki E. coli lub komórki drożdży, np. S. cerevisiae, S. pombe lub Pichia sp. Korzystnie oczyszczanie VLP po ekspresji L1 obejmuje jeden lub większą liczbę etapów chromatografii anionowymiennej (dimetyloaminoetyl - DMAE), chromatografii anionowymiennej (trimetyloaminoetyl - TMAE), chromatografii na hydroksyapatycie, filtracji, takiej jak nanofiltracja lub ultrafiltracja albo chromatografia oddziaływań hydrofobowych. Korzystnie podczas oczyszczania stosuje się co najmniej jeden etap chromatografii anionowymiennej, a korzystniej co najmniej dwa etapy chromatografii anionowymiennej. Korzystnie przed zmieszaniem białek przeprowadza się co najmniej jeden etap chromatografii anionowymiennej. Ewentualnie można zastosować etap naświetlania UV. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady i figury, przy czym: Fig. 1 przedstawia mieszane VLP w porównaniu z HPV 16 VLP zbadane metodą EM; Fig. 2 i 3 przedstawiają rozkład wielkości mieszanych VLP; Fig. 4 przedstawia odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 16 w mieszanej skojarzonej szczepionce przeciw HPV 16, 18, 31, 45 względem kontroli HPV 16; Fig. 5 przedstawia odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 18 w mieszanej skojarzonej szczepionce przeciw HPV 16, 18, 31, 45 względem kontroli HPV 18; Fig. 6 przedstawia odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 31 w mieszanej skojarzonej szczepionce przeciw HPV 16, 18, 31, 45 względem kontroli HPV 31; oraz

7 PL B1 7 Fig. 7 przedstawia odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 45 w mieszanej skojarzonej szczepionce przeciw HPV 16, 18, 31, 45 względem kontroli HPV 45. P r z y k ł a d 1 Szczegółowo opisano połączenie HPV 16 i HPV 18 L1 VLP. Białka L1 z innych genotypów HPV można łatwo wytwarzać podobnymi metodami, już znanymi w dziedzinie wynalazku. A. Wytwarzanie HPV 16/18 L1 VLP Proces wytwarzania HPV 16 i HPV 18 VLP przeprowadzono z użyciem zwykłych protokołów, patrz np. WO Białka HPV16/18 eksprymowano w komórkach Trichoplusia ni (High Five ) (przy gęstości ~ komórek/ml) zakażonych rekombinowanym bakulowirusem (MOI 0,3) kodującym interesujący gen L1 HPV 16 lub 18. Komórki zebrano po około 72 godzinach po zakażeniu. B. Zbieranie komórek/ekstrakcja antygenu Antygen (L1-16/18) wyekstrahowano z komórek Hi5 sposobem obejmującym trzy etapy zagęszczania, ekstrakcji, klarowania. W etapie zagęszczania usunięto do 90% pożywki hodowlanej i przeprowadzono go drogą filtracji z przepływem stycznym. Etap ekstrakcji przeprowadzono z użyciem hipotonicznego buforu (Tris 20 mm, ph 8,5). Do przeprowadzenia ekstrakcji zastosowano objętość równą objętości hodowli. Zastosowano czas kontaktu co najmniej pół godziny przy łagodnym mieszaniu. Klarowanie przeprowadzono drogą filtracji z przepływem stycznym. C. Oczyszczanie Proces oczyszczania przeprowadzono w temperaturze pokojowej. W przypadku obydwu antygenów L1-16/18 do ekstraktu dodano -merkaptoetanol (4% wag.), aby rozłożyć VLP do kapsomerów. Glicerol dodano do uzyskania stężenia 10% (wag.) bezpośrednio przed dodaniem -merkaptoetanolu. Wszystkie użyte bufory przesączono na filtrach 0,22 m przed przechowywaniem w 2-8 C. Przed każdym etapem oczyszczania matryce żelowe oczyszczano i równoważono odpowiednim buforem przed naniesieniem próbki. Warunki oczyszczania podano dla oddzielnego oczyszczania L1 z obydwu HPV 16 i 18. Schematy te są w dużej mierze podobne i obejmują etapy: chromatografii anionowymiennej (dimetyloaminoetyl - DMAE), chromatografii anionowymiennej (trimetyloaminoetyl - TMAE), chromatografii na hydroksyapatycie, nanofiltracji (Planova), ultrafiltracji, chromatografii oddziaływań hydrofobowych (z użyciem oktylosefarozy) w przypadku HPV 18 lub chromatografii anionowymiennej (DEAE) w przypadku HPV 16; oraz filtracji sterylizującej. Opis szczegółowy C1. Oczyszczanie antygenu L1-18 Chromatografia anionowymienna (DMAE) Sklarowany ekstrakt (stężenie białka ~ 1 g/ml, przy zawartości białka L1 ~ 150 mg/ml) wprowadzono do kolumny anionowymiennej (dimetyloaminoetyl). Elucję przeprowadzono z użyciem buforu (Tris 20 mm, NaCl 200 mm, 4% -merkaptoetanol (BME)), ph 7,9 ± 0,2. Antygen wyeluowano buforem w ilości odpowiadającej pięciu objętościom kolumny i profil elucji monitorowano przy 280 nm. Chromatografia anionowymienna (TMAE) Eluat z pierwszego etapu rozcieńczono 1 objętością H 2 O/BME 4%. Rozcieńczony eluat wprowadzono do drugiej kolumny anionowymiennej (trimetyloaminoetyl). Elucję przeprowadzono z użyciem buforu (20 mm Tris, NaCl 200 mm, 4% BME), ph 7,9 ± 0,2. Antygen wyeluowano buforem w ilości odpowiadającej około czterem objętościom kolumny i profil elucji monitorowano przy 280 nm. Chromatografia na hydroksyapatycie Eluat z etapu TMAE wprowadzono do kolumny z hydroksyapatytem (HA). Po wprowadzeniu próbki żel przemyto około 2,5 objętości kolumny buforu (NaH 2 PO mm, NaCl 30 mm, 4% BME), ph 6,0 ± 0,2. Nanofiltracja (Planova) Eluat z HA rozcieńczono w celu osiągnięcia następujących warunków: bufor (NaH 2 PO 4 25 mm, NaCl 10 mm, 4% BME), ph 7,5 ± 0,2. Następnie przesączono go na wstępnym filtrze 0,2 m i na filtrze Planova 15N 0,12 m 2. Filtrację prowadzono przy stałym ciśnieniu 20 kpa ± 2 kpa.

8 8 PL B1 Ultrafiltracja Ultrafiltrację prowadzono w układzie do ultrafiltracji z przepływem stycznym wyposażonym w membrany polieterosulfonowe (kaseta Centramate 0,1 m 2, 100 kd). Eluat z filtra Planova wstępnie doprowadzono do następujących warunków: (NaH 2 PO mm, NaCl 30 mm, 4% BME), ph 6,0 ± 0,2; a następnie wprowadzono do układu, zagęszczono pięciokrotnie i diafiltrowano przy ciągłym wstrzykiwaniu ~10 objętości początkowych buforu (NaH 2 PO 4 20 mm, NaCl 500 mm), ph 6,0 ± 0,2. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (oktylosefaroza) Przesącz ultrafiltracyjny wprowadzono do kolumny z oktylosefarozą. Ten etap chromatografii prowadzono w trybie ujemnym z użyciem około pięciu objętości kolumny buforu (Na 3 PO 4 20 mm, NaCl 500 mm), ph 6,0 ± 0,2. Filtracja sterylizująca Roztwór oczyszczonego antygenu L1-18 wysterylizowano przez przesączenie przez membranę 0,22 m. C2. Oczyszczanie antygenu L1-16 Chromatografia anionowymienna (DMAE) Sklarowany ekstrakt wprowadzono do kolumny anionowymiennej (dimetyloaminoetyl). Elucję przeprowadzono z użyciem buforu (Tris 20 mm, NaCl 180 mm, 4% BME), ph 7,9 ± 0,2. Antygen wyeluowano około czterema objętościami kolumny i profil elucji monitorowano przy 280 nm. Chromatografia anionowymienna (TMAE) Eluat z pierwszego etapu rozcieńczono 1 objętością H 2 O/BME 4%. Rozcieńczony eluat wprowadzono do drugiej kolumny anionowymiennej (trimetyloaminoetyl). Elucję przeprowadzono z użyciem buforu (20 mm Tris, NaCl 180 mm, 4% BME), ph 7,9 ± 0,2. Antygen wyeluowano około pięcioma objętościami kolumny i profil elucji monitorowano przy 280 nm. Chromatografia na hydroksyapatycie (HA) Eluat z etapu TMAE wprowadzono do kolumny z HA. Po wprowadzeniu próbki żel przemyto około trzema objętościami kolumny buforu (NaH 2 PO mm, NaCl 30 mm, 4% BME), ph 6,0 ± 0,2. Nanofiltracja (Planova) Eluat z HA rozcieńczono w celu osiągnięcia następujących warunków: bufor (NaH 2 PO 4 25 mm, NaCl 10 mm, 4% BME), ph 7,5 ± 0,2. Następnie przesączono go na wstępnym filtrze 0,2 m i na filtrze Planova 15N 0,12 m 2. Filtrację prowadzono przy stałym ciśnieniu 20 kpa ± 2 kpa. Ultrafiltracja Ultrafiltrację prowadzono w układzie do ultrafiltracji z przepływem stycznym wyposażonym w membrany polieterosulfonowe (kaseta Centramate 0,1 m 2, 100kD). Eluat z filtra Planova wstępnie doprowadzono do następujących warunków: (NaH 2 PO mm, NaCl 30 mm, 4% BME), ph 6,0 ± 0,2; a następnie wprowadzono do układu, zagęszczono pięciokrotnie i diafiltrowano przy ciągłym wstrzykiwaniu ~10 objętości początkowych buforu (NaH 2 PO 4 20 mm, NaCl 500 mm), ph 6,0 ± 0,2. Chromatografia anionowymienna na DEAE Eluat ultrafiltracyjny doprowadzono do przewodnictwa buforu równoważącego, (Na 3 PO 4 20 mm, NaCl 250 mm), ph 6,0 ± 0,2 i wprowadzono do kolumny anionowymiennej (dietyloaminoetyl). Elucję przeprowadzono z użyciem buforu (NaH 2 PO 4 20 mm, NaCl 500 mm), ph 6,0 ± 0,2. Antygen wyeluowano około trzema objętościami kolumny i profil elucji monitorowano przy 280 nm. Filtracja sterylizująca Roztwór oczyszczonego antygenu L1-16 wysterylizowano przez filtrację na 0,22 m membranie. C3. Każdy typ VLP zaadsorbowano niezależnie z wytworzeniem zagęszczonego jednoważnego preparatu. Wytwarzanie zagęszczonego jednoważnego preparatu VLP16 60 g oczyszczonych VLP z HPV16 adsorbowano na 150 g Al 3+ z Al(OH) 3, przy ph 6,0 ± 0,2, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Ten zagęszczony zaadsorbowany jednoważny preparat przechowywano w +4 C. Adsorpcję sprawdzono przez odwirowanie preparatu i oznaczenie VLP w supernatancie. Wytwarzanie zagęszczonego jednoważnego preparatu VLP18 60 g oczyszczonych VLP z HPV18 adsorbowano na 150 g Al 3+ z Al(OH) 3, przy ph 6,0 ± 0,2, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Ten zagęszczony zaadsorbowany jednoważny preparat przechowywano w +4 C. Adsorpcję sprawdzono przez odwirowanie preparatu i oznaczenie VLP w supernatancie.

9 PL B1 9 D. Wytwarzanie końcowej szczepionki Zagęszczone zaadsorbowane jednoważne preparaty wytworzone powyższymi sposobami połączono, z wytworzeniem zawiesiny zawierającej 20 g każdej z VLP na dawkę. Końcową szczepionkę przechowywano w +4 C. Dodanie VLP z HPV 31 i 45 w stężeniu 20 g każdej z VLP uzupełniło szczepionkę czteroważną. Połączone zaadsorbowane preparaty lub preparaty pojedynczych zaadsorbowanych VLP można następnie zmieszać z takimi adiuwantami jak 3D-MPL. P r z y k ł a d 2 A. Wytwarzanie HPV 16/18 L1 VLP Proces wytwarzania HPV 16 i HPV 18 VLP przeprowadzono z użyciem zwykłych protokołów - jak powyżej B. Tworzenie mieszanych VLP Proces ten obejmuje rozłożenie, a następnie ponowne złożenie HPV 16 i 18 VLP, tak że złożenie HPV L1 16 i 18 prowadzi się razem umożliwiając wytworzenie mieszanej VLP. HPV 16 i 18 VLP można połączyć w dowolnym momencie powyższego sposobu wcześniejszym niż moment, w którym VLP są ponownie składane. Przykładowo zbadano dwie specyficzne strategie. 1. Zmieszanie obydwu antygenów po etapie HA. W oparciu o stężenie L1 we frakcji HA, dwa składniki miesza się do osiągnięcia równych stężeń HPV16 i 18 przed rozpoczęciem etapu UF. W tym przypadku po etapie ultrafiltracji prowadzi się etap z oktylosefarozą, tak jak w procedurze oczyszczania HPV 18, a następnie etap DEAE, tak jak w procedurze oczyszczania HPV Zmieszanie obydwu ekstraktów i wspólne oczyszczanie. W oparciu o stężenie L1 w ekstraktach dwa antygeny miesza się do osiągnięcia równych stężeń HPV 16 i 18 rozpoczynając od etapu DMAE. Ponownie, po etapie ultrafiltracji prowadzi się etap z oktylosefarozą, tak jak w procedurze oczyszczania HPV 18, a następnie etap DEAE, tak jak w procedurze oczyszczania HPV 16. HPV16-HPV18 VLP mieszane w etapie UF HPV16-HPV18 VLP mieszane w etapie DMAE Zastosowano taki sam proces oczyszczania, ale mieszanie prowadzono w etapie DMAE zamiast w etapie UF. Stężenie stosowane do elucji w etapach chromatografii anionowymiennej na żywicach z grupami DMAE i TMAE wynosiło 200 mm. Wyniki HPV16-HPV18 VLP mieszane w etapie UF

10 10 PL B1 Wytworzono dwie partie mieszanych VLP (nr partii 31b165c i 31b166c) przez połączenie białek L1 HPV 16 i HPV 18. Czystość w analizie SDS-Page Czystość mieszanych VLP była tak dobra jak obydwu klasycznych" preparatów HPV 16 i HPV 18. Czystość preparatów była wyższa niż 95%. Dane EM - Fig. 1 EM 31B165C (przesącz UF po dojrzewaniu) porównano z klasycznym preparatem HPV 16 (seria 39B122c). VLP były dobrze utworzone, miały jednorodną wielkość, brak było agregacji; w obydwu doświadczeniach obecnych było kilka wstążek kapsomerów. Rozkład wielkości Rozkład wielkości VLP oznaczono za pomocą Malvern Zetasizer 3000 HS. Próbki zmierzono w postaci nierozcieńczonej w kuwecie z tworzywa sztucznego do analizy Malvern (kuweta na 800 l). Warunki techniczne były następujące: - długość fali lasera: 532 nm, - moc lasera: 50 mw, - światło rozproszone wykrywane przy 90, - temperatura: 25 C, - czas trwania: automatycznie wyznaczony przez oprogramowanie, - liczba: trzy kolejne pomiary, - średnia średnica z: metodą analizy kumulantów, rozkład wielkości: metodą Contina. Klasyczne wyniki dla HPV18 L1-VLP: nm z dobrą polidyspersyjnością (< 0,1) Klasyczne wyniki dla HPV16 L1-VLP: nm z dobrą polidyspersyjnością (< 0,1) Dla mieszanych VLP uzyskano następujące wyniki: 31B165c: 85 nm z dobrą polidyspersyjnością (0,08). VLP były prawie całkowicie wytworzone na początku dojrzewania. 31B166c: 76 nm z dobrą polidyspersyjnością (0,08). Rozkład wielkości w partii 31B165c i 31B166c mierzony przez dynamiczne rozpraszanie światła lasera przedstawiono na fig. 2 i 3. HPV16-HPV18 VLP mieszane na etapie DMAE Preparat o nr partii 31B167B wytworzono z preparatów o numerach partii E18L1C005 (HPV18) i 39B167 (HPV16). Czystość w analizie SDS-Page Czystość mieszanych VLP była tak dobra jak obydwu klasycznych" preparatów. Czystość preparatów była wyższa niż 95%. Rozkład wielkości Rozkład wielkości VLP oznaczono za pomocą przyrządu MaIvern Zetasizer 3000 HS. Klasyczne wyniki dla HPV18 L1-VLP: nm z dobrą polidyspersyjnością (< 0,1) Klasyczne wyniki dla HPV16 L1-VLP: nm z dobrą polidyspersyjnością (< 0,1) Dla mieszanych VLP uzyskano następujące wyniki: HPV16-HPV18 31B167B: 74 nm z dobrą polidyspersyjnością (0,07). VLP były prawie całkowicie wytworzone na początku dojrzewania. P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie skojarzonej szczepionki mieszanych HPV 16, 18, 31, 45 Wprowadzenie Badanie immunogenności przeprowadzono na myszach Balb/C stosując połączenie skróconych na C-końcu L1 VLP 16, 18, 31 i 45 adiuwantowanych ałunem + 3D-MPL (tutaj adiuwant A" - 50 g soli glinu i 5 g 3D-MPL). Cztery grupy po 10 myszy immunizowano dwukrotnie domięśniowo dnia 0 i 21 odpowiednio: 1. VLP 31 (2 g)/adiuwant A 2. VLP 45 (2 g)/adiuwant A 3. VLP 16 (2 g) i VLP 18 (2 g)/adiuwant A 4. VLP 16 (2 g), VLP 18 (2 g), VLP 31 (2 g), VLP 45 (2 g)/adiuwant A. Odpowiedzi przeciwciał przeciw VLP 16, 18, 31 i 45 monitorowano w surowicy pobranej dnia 35 (14 dni po dawce II). Wyniki przedstawiono na fig. 4-7.

11 PL B1 11 Odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 16 - Silne odpowiedzi przeciwciał były wywołane w surowicy po II dawce przez VLP 16 formułowaną z VLP 18 z adiuwantem A (grupa 3) lub przez całą szczepionkę połączoną (grupa 4). - Podobny poziom przeciwciał skierowanych przeciw VLP 16 zmierzono w obydwu grupach i nie zaobserwowano zakłócających oddziaływań. Odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 18 - Silne odpowiedzi przeciwciał były wywołane w surowicy po II dawce przez VLP 18 formułowaną z VLP 16 z adiuwantem A (grupa 3) lub przez całą szczepionkę połączoną (grupa 4). - Podobny poziom przeciwciał skierowanych przeciw VLP 18 zmierzono w obydwu grupach (mniej niż 1,5-krotna różnica) i nie zaobserwowano zakłócających oddziaływań. Odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 31 - Silne odpowiedzi przeciwciał były wywołane w surowicy po II dawce przez VLP 31 formułowaną samą z adiuwantem A (grupa 1) lub przez całą szczepionkę połączoną (grupa 4). - Podobny poziom przeciwciał skierowanych przeciw VLP 31 zmierzono w obydwu grupach, zatem nie zaobserwowano zakłócających oddziaływań. Odpowiedź przeciwciał przeciw VLP 45 - Silne odpowiedzi przeciwciał były wywołane w surowicy po II dawce przez VLP 45 formułowaną samą z adiuwantem A (grupa 2) lub przez całą szczepionkę połączoną (grupa 4). - Podobny poziom przeciwciał skierowanych przeciw VLP 45 zmierzono w obydwu grupach, zatem nie zaobserwowano zakłócających oddziaływań. Wnioski Nie zaobserwowano zakłócających oddziaływań, gdy cztery VLP (VLP 16, 18, 31 i 45) podawano w połączeniu. Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja szczepionkowa, znamienna tym, że zawiera VLP zawierające białka L1 lub funkcyjne pochodne białka L1 z genotypów HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mieszaninę HPV 16 VLP, HPV 18 VLP, HPV 31 VLP i HPV 45 VLP, przy czym każda VLP zawiera białka L1 lub funkcyjne pochodne białka L1 z tylko jednego genotypu HPV. 3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera VLP będące VLP wyłącznie z L1, zawierającymi białko L1 HPV lub funkcyjne pochodne białka L1 i niezawierającymi innego białka HPV. 4. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1-3, znamienna tym, że zawiera VLP składające się zasadniczo tylko z białek HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1-4, znamienna tym, że co najmniej jedno białko L1 jest skróconym białkiem L1. 6. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1-5, znamienna tym, że jest kompozycją z VLP zawierającą białko L1 lub jego funkcyjną pochodną z dodatkowego genotypu HPV. 7. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 6, znamienna tym, że dodatkowa VLP zawiera białko L1 lub funkcyjną pochodną białka L1, wybrane z HPV 33, 52, 53, 58, 35, 56 i Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1-7, znamienna tym, że jest co najmniej w 60% skuteczna w profilaktyce raka szyjki macicy. 9. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1-8, znamienna tym, że dodatkowo zawiera adiuwant. 10. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 9, znamienna tym, że jako adiuwant zawiera sól glinu. 11. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że sól glinu stanowi wodorotlenek glinu. 12. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że dodatkowo zawiera 3D-MPL. 13. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1-12, znamienna tym, że VLP zawierają białka L1, które nie są chimeryczne. 14. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że VLP zawierające białka L1 lub funkcyjne pochodne białka L1 łączy się z HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45, z wytworzeniem szczepionki określonej w zastrz

12 12 PL B1 15. Zastosowanie mieszaniny HPV 16, HPV 18, HPV 31 i HPV 45 VLP zawierających białko L1 lub jego funkcyjną pochodną do wytwarzania szczepionki do profilaktyki lub leczenia zaburzenia związanego z zakażeniem HPV. 16. Kompozycja szczepionkowa zdefiniowana w zastrz do profilaktyki zakażenia HPV lub leczenia choroby związanej z zakażeniem HPV. 17. Stabilizowana kompozycja szczepionkowa, znamienna tym, że zawiera szczepionkę zdefiniowaną w zastrz. 1-12, w której VLP z HPV 16, 18, 31 i 45 są zaadsorbowane na wodorotlenku glinu przed zmieszaniem. 18. Kompozycja szczepionkowa, sposób albo zastosowanie według zastrz. 1-17, znamienne tym, że odpowiedź immunologiczna przeciw danemu typowi VLP w szczepionce wynosi co najmniej 50% odpowiedzi na taki sam typ VLP mierzonej indywidualnie. Rysunki

13 PL B1 13

14 14 PL B1

15 PL B1 15

16 16 PL B1

17 PL B1 17

18 18 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)