(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/039646

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12P 19/34 ( ) C12N 15/64 ( ) A61K 39/12 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Szczepionka wirusowa przeciwko infekcji wirusowej lub wielonarządowemu poodsadzeniowemu zespołowi wyniszczającemu wywoływanemu przez PCV2 oraz jej zastosowania (30) Pierwszeństwo: , US, 60/340, , US, 60/424, , US, 10/314,512 (73) Uprawniony z patentu: IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC., Ames, US VIRGINIA TECH INTELLECTUAL PROPERTIES, INC, Blacksburg, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/11 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/13 (72) Twórca(y) wynalazku: XIANG-JIN MENG, Blacksburg, US MARTIJN FENAUX, Blacksburg, US PATRICK G. HALBUR, Ames, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szczepionka wirusowa przeciwko infekcji wirusowej lub wielonarządowemu poodsadzeniowemu zespołowi wyniszczającemu wywoływanemu przez PCV2 oraz jej zastosowania medyczne. Ogólnie opisane niniejszym rozwiązania dotyczą zakaźnych klonów DNA cirkowirusa świni typu 1 (PCV1) i typu 2 (PCV2), chimerowych zakaźnych klonów DNA PCV1-2 oraz żywych chimerowych wirusów pochodzących z chimerowych klonów DNA, użytecznych jako szczepionki. Cirkowirus świni (PCV, ang. porcine circovirus) został początkowo wyodrębniony jako zanieczyszczenie hodowli komórkowej linii komórek nerki świńskiej PK-15 (I. Tischer i wsp., A very small porcine virus with circular single-stranded DNA Nature 295: (1982); I. Tischer i wsp., Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2): (1974)). PCV jest małym ikozaedralnym wirusem bezotoczkowym, który zawiera jednoniciowy kolisty genom DNA o wielkości około 1,76 kb. PCV jest zaliczany do rodziny Circoviridae, która zawiera trzy inne zwierzęce cirkowirusy (wirus anemii kurcząt (CAV, ang. chicken anemia virus), wirus papuziej choroby dzioba i piór (PBFDV, ang. psittacine beak and feather disease virus) i niedawno odkryty cirkowirus gołębia (CoCV, ang. Columbia circovirus)) oraz trzy roślinne cirkowirusy (wirus krzaczastości wierzchołkowej bananowca, wirus zgnilizny liści kokosa i wirus karłowatości goździka) (M. R. Bassami i wsp., Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses and chicken anemia virus Virology 249: (1998); J. Mankertz i wsp., Transcription analysis of porcine circovirus (PCV) Virus Genes 16: (1998); A. Mankertz i wsp., Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons Arch. Virol. 145: (2000); B. M. Meehan i wsp., Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses J. Gen. Virol. 78: (1997); B. M. Meehan i wsp., Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs J. Gen. Virol. 79: (1998); D. Todd i wsp., Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes Arch. Virol. 117: (1991)). Przedstawiciele trzech poprzednio opisanych cirkowirusów zwierzęcych (PCV, CAV i PBFDV) nie wykazują homołogii sekwencji nukleotydowej lub determinant antygenowych ze sobą nawzajem (M. R. Bassami i wsp., 1998, op. cit.; D. Todd i wsp., 1991, op. cit.). Genom nowo odkrytego CoCV wykazuje około 40% identyczności sekwencji nukleotydowej z genomem PCV (A. Mankertz i wsp., Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons Arch. Virol. 145: (2000)). Obecnie, nowy ludzki cirkowirus o kolistym genomie, opisany jako wirus przenoszony przez transfuzję lub wirus TT (TTV, ang. transfusion transmitted virus) został wyodrębniony od osób w związku z zapaleniem wątroby po transfuzji (H. Miyata i wsp., Identification of a novel GC-rich nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus J. Virol. 73: (1999); T. Nishizawa i wsp., A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology Biochem. Biophys. Res. Commun. 241: (1997)). Ponadto, ludzki mini-wirus podobny do TTV został wyodrębniony od zdrowych dawców krwi (P. Biagini i wsp., Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates J. Gen. Virol. 82: (2001); K. Takahashi I wsp., Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus Arch. Virol. 145: (2000)) i trzeci nowy ludzki cirkowirus, znany jako wirus SEN (SENV), został również wyodrębniony od ludzi z zapaleniem wątroby po transfuzji (T. Umemura i wsp., SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis, Hepathology 33: (2001)). Organizacja genomowa zarówno ludzkiego TTV, jak i ludzkiego TLMV jest podobna do tej u CAV (P. Biagini i wsp., 2001, op. cit.; H. Miyata i wsp., 1999, op. cit.; K. Takahashi i wsp., 2000, op. cit.). Chociaż przeciwciała przeciwko PCV zostały wykryte u różnych gatunków zwierząt, włączając ludzi, myszy, bydło i świnie (G. M. Allan i wsp., Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus Vet. Immunol. Immunopathol. 43: (1994); G. C. Dulac and A. Afshar, Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs Can. J. Vet. Res. 53: (1989); S. Edwards and J. J. Sands, Evidence of circovirus infection in British pigs Vet. Rec. 134: (1994); J. C. Harding and E. G. Clark, Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wast-

3 PL B1 3 ing syndrome (PMWS) Swine Health and Production 5: (1997); R. K. Hines and P. D. Lukert, Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States Swine Health and Production 3: (1995); G. P. Nayar i wsp., Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses Can. Vet. J. 40: (1999); I. Tischer i wsp., Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms Arch. Virol. 140: (1995); I. Tischer i wsp., Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle Arch. Virol. 140: (1995)), niewiele wiadomo o patogenezie PCV u tych gatunków zwierzęcych. Eksperymentalne zakażenie świń PCV pochodzącym z komórek PK-15 nie doprowadziło do choroby klinicznej, a zatem wirus ten nie jest uważany za chorobotwórczy dla świń (G. M. Allan i wsp., Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material Vet. Microbiol. 44: (1995); I. Tischer i wsp., Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus Arch. Virol. 91: (1986)). Niepatogenny PCV z zanieczyszczonych komórek linii PK-15 został określony jako cirkowirus świni typu 1 lub PCV 1. Wielonarządowy poodsadzeniowy zespół wyniszczający u świń (PMWS, ang. postweaning multisystemic wasting syndrome), po raz pierwszy opisany w 1991 r. (J. C. Harding i E. G. Clark, 1997, op. cit.), jest złożoną chorobą prosiąt po odstawieniu, która staje się coraz bardziej rozpowszechniona. W związku z groźbą możliwego poważnego wpływu gospodarczego na przemysł trzody chlewnej, pilne stało się opracowanie szczepionki przeciwko PCV2, głównemu czynnikowi etiologicznemu PMWS. PMWS dotyka przede wszystkim świnie w wieku 5-18 tygodni. Kliniczne objawy PMWS obejmują stopniową utratę wagi, płytki i częsty oddech, anemię, biegunkę i żółtaczkę. Współczynnik śmiertelności może wahać się od 1% do 2%, i nawet do 40% w pewnych skomplikowanych przypadkach w Wielkiej Brytanii (M. Muirhead, Sources of information on PMWS/PDNS Vet. Rec. 150: 456 (2002)). Uszkodzenia mikroskopowe charakterystyczne dla PMWS obejmują ziarniniakowate śródmiąższowe zapalenie płuc, limfadenopatię, zapalenie wątroby i zapalenie nerek (G. M. Allan i J. A. Ellis, Porcine circoviruses: a review J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J. C. Harding and E. G. Clark, 1997, op. cit.). PMWS został obecnie zaobserwowany u świń w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych (G. M. Allan i wsp., Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes Vet. Rec. 142: (1998); G. M. Allan i wsp., Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe J. Vet. Diagn. Invest. 10: 3-10 (1998); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. Ellis i wsp., Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Can. Vet. J. 39: (1998); A. L. Hamel i wsp., Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs J. Virol. 72: (1998); M. Kiupel i wsp., Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana Vet. Pathol. 35: (1998); R. Larochelle i wsp., Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR Vet. Rec. 145: (1999); B. M. Meehan i wsp., 1998, op. cit.; I. Morozov i wsp., Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with post weaning multisystemic wasting syndrome J. Clin. Microbiol. 36: (1998)), większości krajów europejskich (G. M. Allan i wsp., Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe J. Vet. Diagn. Invest. 10: 3-10 (1998); G. M. Allan i J. A. Ellis, 2000, op. cit.; S. Edwards i J. J. Sands, 1994, op. cit.; S. Kennedy i wsp., Porcine circovirus infection in Northern Ireland Vet. Rec. 142: (1998); A. Mankertz i wsp., Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France Virus Res. 66: (2000); C. Rosell i wsp., Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Vet. Rec. 146: (2000); P. Spillane i wsp., Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland Vet. Rec. 143: (1998); G. J. Wellenberg i wsp., Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands Vet. Quart. 22: (2000)) i w niektórych krajach w Azji (C. Choi i wsp., Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction, J. Vet. Diagn. Invest. 12: (2000); A. Onuki i wsp., Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan J. Vet. Med. Sei. 61: (1999)). PMWS ma potencjalnie poważny wpływ ekonomiczny na przemysł trzody chlewnej na całym świecie. Głównym czynnikiem etiologicznym PMWS jest patogenny szczep PCV opisany jako cirkowirus świni typu 2 lub PCV2 (G. M. Allan i wsp., Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes Vet. Rec. 142: (1998); G. M. Allan i wsp., Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe J. Vet. Diagn. Invest. 10: 3-10 (1998);

4 4 PL B1 G. M. Allan i wsp., Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland Vet. Microbiol. 66: (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. Ellis i wsp., 1998, op. cit.; A. L. Hamel i wsp., 1998, op. cit.; B. M. Meehan i wsp., 1998, op. cit.; I. Morozov i wsp., 1998, op. cit.). Została określona całkowita sekwencja genomowa PCV2 związanego z PMWS (M. Fenaux i wsp., Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2, J. Clin. Microbiol. 38: (2000); A. L. Hamel i wsp., 1998, op. cit.; J. Mankertz i wsp., 1998, op. cit.; B. M. Meehan i wsp., 1997, op. cit.; B. M. Meehan i wsp., 1998, op. cit.; I. Morozov i wsp., 1998, op. cit.). PCV1 jest powszechny u świń, ale nie jest chorobotwórczy dla świń. Dla odróżnienia, spokrewniony genetycznie PCV2 jest chorobotwórczy i powoduje PMWS u świń. Analizy sekwencji wykazują, że związany z PMWS PCV2 wykazuje tylko około 75% identyczności sekwencji nukleotydowej z niepatogennym PCV1. Gen ORF2 zarówno niepatogennego PCV1, jak i patogennego PCV2 koduje główne immunogenne białko płaszcza wirusowego (P. Nawagitgul i wsp., Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1: (2002); P. Nawagitgul i wsp., Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein J. Gen. Virol. 81: (2000)). Początkowe próby powtórzenia klinicznego PMWS u zwykłych świń przez inokulację PCV2 były nieskuteczne (M. Balasch i wsp., Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome J. Comp. Pathol. 121: (1999); M. Fenaux i wsp., Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions J. Virol. 76: (2002)). Doświadczalne powtórzenie klinicznego PMWS u sterylnych świń i u zwykłych świń z homogenatami tkankowymi od świń z naturalnie występującym PMWS i PCV2 namnażanym w hodowli komórkowej dały różne rezultaty. Kliniczny PMWS został powtórzony u sterylnych świń (SPF) i u świń pozbawionych siary, urodzonych przez cesarskie cięcie, zakażanych łącznie PCV2 i parwowirusem świni (PPV, ang. porcine parvovirus) (G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); S. Krakowka i wsp., Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus, Vet. Pathol. 37: (2000)) oraz u sterylnych świń zakażanych PCV2, kiedy ich układ odpornościowy był aktywowany hemocjaniną skałoczepu w niekompletnym adiuwancie Freunda (S. Krakowka i wsp., Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2) Vet. Pathol. 38: (2001)). Kliniczny PMWS został również powtórzony u świń urodzonych przez cesarskie cięcie/pozbawionych siary (CD/CD) zakażanych samym PCV2 (P. A. Harms i wsp., Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus Vet. Pathol. 38: (2001)) i u zwykłych świń zakażanych równocześnie PCV2 oraz parwowirusem świni (PPV), albo wirusem zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV, ang. porcine reproductive and respiratory syndrome virus) (A. Rivora i wsp., Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2 J. Virol. 76: (2002)). W przypadku łącznego zakażania PRRSV/PCV2 charakterystyczne patologiczne objawy PMWS, takie jak ubytki limfatyczne, zapalenie ziaminiakowate i nekrotyzujące zapalenie wątroby są wywoływane PCV2, a nie przez PRR- SV (P. A. Harms i wsp., 2001, op. cit.). Jednakże, kliniczny PMWS nie został powtórzony u sterylnych świń zakażanych samym PCV2 (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of Colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication Arch. Virol. 145: (2000); G. M. Allan i wsp., A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47: (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 121 rill (1999); M. Balasch i wsp., 1999, op. cit.; J. Ellis i wsp., Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic

5 PL B1 5 piglets J. Vet. Diagn. Invest. 11: 3-14 (1999); S. Kennedy i wsp., Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 122: 9-24 (2000); S. Krakowka i wsp., 2001, op. cit.; S. Krakowka i wsp., 2000, op. cit.; R. M. Pogranichny i wsp., Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection Viral. Immunol. 13: (2000)). Inokula wirusowe używane w tych doświadczeniach stanowiły albo homogenaty tkankowe ze świń z naturalnie występującym PMWS, albo wirus namnażany w hodowlach komórek PK-15 (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of Colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication Arch. Virol. 145: (2000); G. M. Allan i wsp., A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immuno-staining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47: (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); M. Balasch i wsp., 1999, op. cit.; J. Ellis i wsp., 1999, op. cit.; S. Kennedy i wsp., 2000, op. cit.; S. Krakowka i wsp., 2001, op. cit.; S. Krakowka i wsp., 2000, op. cit.; R. M. Pogranichnyy i wsp., 2000, op. cit.). Ponieważ homogenaty tkankowe mogą zawierać inne powszechne drobnoustroje świń, takie jak PPV i wirus zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV) (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of Colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication Arch. Virol. 145: (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. A. Ellis i wsp., Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Rosell i wsp., 2000, op. cit.) i ponieważ linia komórkowa ATCC PK-15 używana do namnażania PCV2 była stale zakażona PCV1 (G. C. Dulac i A. Afshar, 1989, op. cit.), choroba kliniczna i uszkodzenia patologiczne powtórzone w tych doświadczeniach mogą nie być wyłącznie związane z zakażeniem PCV2 (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of Colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication Arch. Virol. 145: (2000); G. M. Allan i wsp., A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47: (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. A. Ellis i wsp., 2000, op. cit.). Kliniczny PMWS został również powtórzony u świń CD/CD inokulowanych PCV2, kiedy zaszczepiono je Mycoplasma hyopneumoniae (G. M. Allan i wsp., Immunostimulation, PCV-2 and PMWS Vet. Rec. 147: (2000)). Dwa ostatnie badania polowe, G. M. Allana i wsp., Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postweaning multisystemic wasting syndrome: a field trial Pig J. 48: (2001), i S. C. Kyriakisa i wsp., The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome J. Comp. Pathol. 126: (2002), sprawdziły wpływ modulacji immunologicznej przez szczepionkę Mycoplasma hyopneumoniae na rozwój PMWS w stadach endemicznych i wykazały znaczące obniżenie przypadków PMWS w grupach nieszczepionych w porównaniu ze zwierzętami szczepionymi. Jednakże, inne niedawne badanie wykorzystujące zwykłe prosięta SPF w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych nie mogło powtórzyć takiego wyniku, sugerując, że szczepienia M. hyopneumoniae może potencjalnie wpływać na rozwój klinicznego PMWS, ale z pewnością ma drugorzędne znaczenie wobec zakażania PCV2. W oparciu o te i inne badania, PCV2 jest niemniej uważany za główny, lecz nie wyłączny czynnik etiologiczny PMWS. Brak zakaźnego preparatu wirusowego biologicznie czystej postaci PCV2 zahamował zrozumienie patogenezy PCV2 i znaczenia PCV2 w PMWS. Nie wykazano jednoznacznie, że szczepienia przeciwko PPV i być może PRRSV zapobiegają wystąpieniu PMWS u świń zakażanych PCV2. W konsekwencji, znalezienie bezpiecznej, lecz skutecznej szczepionki, która jest specyficznie skierowana przeciwko PMWS było utrudnione. Istnieje zdecydowana potrzeba uznawana w dziedzinie weterynarii, aby wytworzyć skuteczną, bezpieczną szczepionkę przeciwko zakażeniom PCV2 i PMWS. Opis patentowy USA nr (Poet i wsp.) i WO 99/ dotyczy kwasów nukleinowych z wirusa papuziej choroby dzioba i piór (BFDV), cirkowirusa, który zakaża gatunki ptaków oraz z cir-

6 6 PL B1 kowirusa świni (PCV). Zgłoszenie patentowe proponuje kompozycje szczepionki zawierające niezwiązane DNA lub mrna i ujawnia wektor kwasu nukleinowego do przejściowej ekspresji PCV w komórce eukariotycznej zawierający sekwencję regulatorową działającą CM na transkrypcję lub translację, pochodzącą z promotora lub wzmacniacza transkrypcji genu wczesnego ludzkiego wirusa cytomegalic przyłączoną funkcjonalnie do kwasu nukleinowego tej sekwencji. Jednakże, ponieważ DNA PCV zostało otrzymane wyłącznie z linii PK-15, prawdopodobnie zawiera niepatogenny PCV1 odkryty prawie 30 lat temu przez I. Tischera i wsp., 1974, op. cit., a zatem, najprawdopodobniej nie jest skuteczne w wywoływaniu reakcji immunologicznej przeciwko PCV2 lub zakażeniom wywoływanym przez PCV2. Szczepionki podjednostkowe z rekombinowanych białek wytwarzane z wektorów obejmujących otwarte ramki odczytu są również sugerowane w opisie patentowym, ale otwarte ramki odczytu z PCV nie zostały dobrze scharakteryzowane, czy rozróżnione jedna od drugiej. Ponieważ źródłem DNA PCV są komórki PK-15, białka wytwarzane z tych wektorów obejmujących otwarte ramki odczytu PCV1 nie wykazywałyby właściwych cech immunogennych, jeśli w ogóle, przeciwko PCV2. Opis patentowy USA nr (Allan i wsp.) oraz francuski opis patentowy nr B odnoszą się do wyodrębnienia pięciu szczepów PCV z próbek płucnych lub torbielowych pobranych od świń zakażonych PMWS w Kanadzie, Kalifornii i Francji (Bretania) i ich wykorzystania w połączeniu z przynajmniej jednym antygenem parwowirusa świni w kompozycjach immunogennych. Białka kodowane przez otwarte ramki odczytu (ORF) PCV2 obejmujące ORF1 do ORF 13 są szeroko opisywane w opisie patentowym, ale nie ma przykładu specyficznego białka wykazującego właściwości immunogenne. Opis patentowy ponadto ujawnia wektory składające się z plazmidów DNA, liniowych cząsteczek DNA i rekombinowanych wirusów, które zawierają i wytwarzają in vivo cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą antygen PCV. Szereg innych odnośników literaturowych, na przykład opisy patentowe USA nr B1; B1; francuskie opisy patentowe nr ; ; zgłoszenia międzynarodowe WO 01/ A2; WO 00/01 409; WO 99/18 214; WO 00/ A2; WO 01/ A2; WO 99/29 871; itd., również opisują podawanie polipeptydów albo kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy PCV1 lub PCV2 różnych szczepów. Jednakże, niepatogenny PCV1 nie będzie użyteczny przeciwko zakażeniom PCV2 i patogenne szczepy PCV2 opisane w dziedzinie, nawet jeśli atenuowane, najprawdopodobniej będą miały ograniczoną wartość ze względu na zwykłą tendencję żywego wirusa do powrotu do postaci zjadliwej. Zatem, nadal istnieje od dawna zapotrzebowanie w dziedzinie na żywy, zakaźny, niepatogenny antygen do szczepienia świń przeciwko poważnemu zakażeniu lub PMWS powodowanemu przez PCV2, który jest skuteczny i pozostaje bezpieczny w szczepionkach weterynaryjnych. Cele te są realizowane przez skonstruowanie nowego, żywego, chimerowego cirkowirusa świni opisanego niniejszym, który jest oparty o szkielet genomowy niepatogennego PCV1 wyodrębnionego przez I. Tischera i wsp. prawie 30 lat temu. Nowy chimerowy cirkowirus świni opisany niniejszym jest w stanie zaspokoić istniejącą od dawna potrzebę przez wyjątkowe i korzystne zachowanie niepatogennego fenotypu PCV1, lecz wywołując specyficzną odpowiedź immunologiczną przeciwko patogennemu PCV2. Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szczepionka wirusowa chroniąca świnię przed infekcją wirusową lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym (PMWS) wywoływanym przez PCV2, która zawiera nietoksyczny, dopuszczalny fizjologicznie nośnik, jeden lub więcej adiuwantów i immunogenną ilość składnika wybranego z grupy składającej się z: (a) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2) obejmującej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą niepatogenny PCV1, która zawiera gen immunogennej otwartej ramki odczytu 2 (ORF2) patogennego PCV2 w miejsce genu ORF2 cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1; (B) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sekw. nr Id: 2, jej nić komplementarną lub sekwencję nukleotydową o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2; (c) plazmidu lub wektora wirusowego zawierającego chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2), nić komplementarną lub sekwencję nukleotydową o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2; oraz (d) chimerowego cirkowirusa świni oraz, ewentualnie, immunogenną ilość co najmniej jednego dodatkowego antygenu świni.

7 PL B1 7 W korzystnej postaci wykonania szczepionka według wynalazku jest szczepionką DNA, żywą szczepionką, modyfikowaną żywą szczepionką, inaktywowaną szczepionką, podjednostkową szczepionką, atenuowaną szczepionką lub szczepionką modyfikowaną środkami inżynierii genetycznej. Ponadto, korzystnie, ewentualny dodatkowy antygen świni w szczepionce według wynalazku stanowi antygen wirusa zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV), antygen parwowirusa świni (PPV) lub oba. Adiuwant w szczepionce według wynalazku stanowi wodorotlenek glinu, kompleks immunostymulujący (ISCOMS), niejonowy polimer blokowy lub kopolimer, saponina, monofosforylolipid A (MLA), dipeptyd muramylowy (MDP), siarczan glinowo-potasowy, ciepło-wrażliwa lub ciepło-trwała enterotoksyna izolowana z Escherichia coli, toksyna cholery lub jej podjednostka B, toksyna błonicza, toksyna tężcowa, toksyna krztuśca, niekompletny lub kompletny adiuwant Freunda lub ich kombinacja. Wynalazek dotyczy także zastosowań medycznych szczepionki według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie szczepionki według wynalazku do wytwarzania leku do ochrony świni przed infekcją wirusową lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym u świń (PMWS) wywoływanym przez PCV2, przy czym lek jest przeznaczony do podawania świni potrzebującej takiej ochrony w immunologicznie skutecznej ilości. Korzystnie, lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do stosowania w pojedynczej dawce. Również korzystnie, lek ten jest przeznaczony do podawania parenteralnego, donosowego, śródskórnego lub przezskórnego. W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania szczepionki zawierającej immunogenną ilość genu kapsydu ORF2 lub białka PCV2 do wytwarzania leku do ochrony prosięcia mającego matczyne przeciwciała wobec PCV2 lub wielonarządowy poodsadzeniowy zespół wyniszczający u świń (PMWS) wywoływany przez PCV2, przy czym lek jest przeznaczony do podawania prosięciu w immunologicznie skutecznej ilości. Zgodnie z tym aspektem wynalazku szczepionka korzystnie obejmuje składnik wybrany z grupy składającej się z: (a) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2) obejmującej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą niepatogenny PCV1, która zawiera gen immunogennej otwartej ramki odczytu 2 (ORF2) patogennego PCV2 w miejsce genu ORF cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1; (b) plazmidu lub wektora wirusowego zawierającego chimerową cząsteczkę z (a); (c) niezjadliwego, chimerowego cirkowirusa świni typu 1 kodującego immunogenne białko ORF2 PCV2; oraz (d) immunogennego białka ORF2 PCV2 kodowanego przez chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego z (a). Korzystniej, szczepionka do zastosowania według wynalazku obejmuje niezjadliwego, chimerowego cirkowirusa świni typu 1 kodującego immunogenne białko ORF2 PCV2. Najkorzystniej, lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera adiuwant w kombinacji ze szczepionką. Ponadto, korzystnie, wyżej wskazany lek jest przeznaczony do stosowania w pojedynczej dawce. Korzystniej, lek ten jest przeznaczony do podawania parenteralnego, donosowego, śródskórnego lub przezskórnego. W korzystnej postaci wykonania wektorem wirusowym z punktu (b) powyżej jest bakulowirus wyrażający białko ORF2 PCV2. Lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera ponadto co najmniej jeden dodatkowy antygen świni, a korzystnie czynnik zakaźny świni, w szczególności antygen wirusa zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV), antygen parwowirusa świni (PPV) lub oba. Najkorzystniej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku szczepionka jest szczepionką DNA, żywą szczepionką, modyfikowaną żywą szczepionką, inaktywowaną szczepionką, podjednostkową szczepionką, atenuowaną szczepionką lub szczepionką modyfikowaną środkami inżynierii genetycznej. Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy zakaźnych chimerowych klonów DNA cirkowirusa świni (PCV) i żywych chimerowych wirusów otrzymanych z klonów DNA, które są użyteczne jako szczepionki. Te nowe, żywe, chimerowe, genetycznie niezjadliwe wirusy zostały wykonane ze struktury genomowej niepatogennego PCV1, w której immunogenny gen szczepu patogennego PCV2 zastępuje gen PCV1, zazwyczaj w tej samej odpowiadającej pozycji. Niniejszym opisano biologicznie funkcjonalne plazmidy, wektory wirusowe i im podobne, które zawierają nowe rekombinowane cząsteczki

8 8 PL B1 kwasów nukleinowych opisane niniejszym, odpowiednie komórki gospodarza transfekowane wektorami zawierającymi DNA oraz immunogenne polipeptydowe produkty ekspresji. Poniżej opisano także sposób ochrony świń przed zakażeniem wirusowym lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym (PMWS), powodowanym przez PCV2, obejmujący podawanie świni wymagającej takiej ochrony immunologicznie skutecznej ilości szczepionki zawierającej, na przykład, sklonowane chimerowe DNA w plazmidzie, chimerowego wirusa pochodzącego z chimerowego klonu DNA, polipeptydowe produkty wytwarzane z DNA opisanego niniejszym, itp. Niniejszym opisany został także zakaźny molekularny DNA PCV2 i odpowiadające chimerowe klony DNA PCV, które znajdą zastosowanie jako modele eksperymentalne w otrzymywaniu lub charakteryzowaniu nowych awirulentnych szczepionek wirusowych. Krótki opis rysunków Figura 1 przedstawia konstrukcję zakaźnego molekularnego klonu DNA PCV2. Względne pozycje par starterów używanych do amplifikacji całkowitego genomu PCV2 są wskazane strzałkami (starter dolny PCVSAC2, starter górny PCVSAC2). Genomowe DNA PCV2 amplifikowane w PCR jest trawione enzymem restrykcyjnym SacU i oczyszczane. Oczyszczone i strawione SacU genomowe DNA jest łączone w celu utworzenia konkatamerów. Połączone konkatamery są rozdzielane przez elektroforezę żelową, tandemowy dimer genomu PCV2 jest oczyszczany i klonowany w wektorze psk, który wcześniej jest strawiony enzymem SacU aby otrzymać molekularny klon DNA PCV2. Figury 2A i 2B pokazują, że sklonowane plazmidowe DNA PCV2 jest zakaźne, gdy transfekowane in vitro do komórek PK-15. Fig. 2A przedstawia wykrywanie antygenu PCV2 przez oznaczenie immunofluorescencyjne (IF A) w komórkach PK-15 transfekowanych plazmidowym DNA ze sklonowanym PCV2. Intensywne znakowanie immunologiczne antygenu PCV2 jest uwidocznione w jądrze i w mniejszym stopniu, cytoplazmie transfekowanych komórek. Fig. 2B przedstawia kontrolnie transfekowane ujemnie komórki PK-15. Figura 3A przedstawia płuca świni zakażonej drogą wewnątrz-limfatyczną DNA PCV2 w 21 DPI. Płuca są gumowate, nie zapadają się i są cętkowane, jasnobrązowo-czerwone. Węzły limfatyczne oskrzelowe są znacznie powiększone i jasnobrązowe (strzałki). Figura 3B przedstawia przekrój mikroskopowy normalnego płuca ze świni kontrolnej (25X). Figura 3C przedstawia przekrój mikroskopowy płuca ze świni z fig. 3A. Należy zauważyć wokółoskrzelowe limfocystolityczne zapalenie tkanki i łagodne nekrotyczne zapalenie oskrzelików (25X). Figura 3D przedstawia barwienie immunohistochemiczne płuca z fig. 3A. Należy zauważyć antygen PCV2 w makrofagach (strzałki) i komórki podobne do fibroblastów (końcówki strzałek) wokół dróg oddechowych (64X). Figura 4A przedstawia normalny węzeł limfatyczny ze świni kontrolnej. Należy zauważyć dobrze wyodrębnione pęcherzyki limfatyczne (strzałki) (25X). Figura 4B przedstawia przekrój mikroskopowy węzła limfatycznego tchawiczno-oskrzelowego ze świni z fig. 3A zakażonej 21 dni wcześniej drogą wewnątrzlimfatyczną sklonowanym genomowym DNA PCV2. Pęcherzyki limfatyczne są słabo wyodrębnione, jest tu słaby do średniego zanik tkanki limfatycznej, i słabe wieloogniskowe zapalenie ziarniniakowate (25X). Figura 4C przedstawia przekrój mikroskopowy węzła limfatycznego z fig. 4B w silniejszym powiększeniu skupionym na jednym pęcherzyku. Należy zauważyć słabo wyodrębniony pęcherzyk z makrofagami i komórkami olbrzymimi (strzałka) zastępującymi limfocyty pęcherzykowe (64X). Figura 4D pokazuje wykrywanie immunohistochemiczne antygenu PCV2 w tym samym węźle limfatycznym, co na fig. 4B w makrofagach (strzałki) i komórkach olbrzymich (małe końcówki strzałek), i komórkach podobnych do dendrytycznych (duże końcówki strzałek) w pęcherzykach (64X). Figura 5 przedstawia konstrukcję chimerowego klonu DNA PCV1-2 (PCV1/PCV2) z niepatogennym genomem PCV1 zawierającym ORF2 immunogennego genu białka płaszcza patogennego PCV2. Dimeryzowany klon DNA jest stosowany do transfekcji in vitro komórek PK-15 w celu wytworzenia żywych wirusów chimerowych produkujących białko ORF 2 PCV2 i eksperymentów in vivo na zwierzętach do potwierdzenia aktywności. Figura 6 przedstawia konstrukcję i organizację zakaźnych molekularnych klonów DNA PCV1, PCV2, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1. Klon DNA PCV2 jest skonstruowany przez połączenie dwóch pełnej długości liniowych genomów PCV2 tandemowo w wektorze Bluescript SK (psk) z użyciem ogólnych metod opisanych uprzednio (M. Fenaux i wsp., 2002, op. cit.). Klon DNA PCV1 jest skonstruowany przez połączenie dwóch pełnej długości liniowych genomów PCV1 tandemowo w wektorze psk. Chimerowy klon PCV 1-2 DNA jest skonstruowany przez zastą-

9 PL B1 9 pienie ORF 2 genu białka płaszcza PCV1 przez ten z PCV2 w szkielecie genomowym niepatogennego PCV1 w wektorze psk. Odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1 DNA jest skonstruowany przez zastąpienie ORF 2 genu białka płaszcza patogennego PCV2 przez jego odpowiednik z niepatogennego PCV1 w szkielecie genomowym patogennnego PCV2 w wektorze psk. Oba klony chimerowe są dimerami w wektorze psk. Strzałki przedstawiają odpowiednie położenia starterów PCR do wykrywania wiremii PCV1, PCV2, PCV1-2 i PCV2-1 w inokulowanych zwierzętach. Figury 7A-7J pokazują, że klony DNA PCV1, PCV2, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1 są zakaźne i wytwarzają odpowiednie antygeny wirusowe, gdy zostaną transfekowane in vitro do komórek PK-15. Lewa część (7A, 7C, 7E, 7G i 7I) jest barwiona przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ORF2 PCV1. Prawa część (7B, 7D, 7F, 7H i 7J) jest barwiona przeciwciałem przeciwko PCV2. Części 7A i 7B to transfekowane kontrolnie ujemnie komórki PK-15. Części 7C i 7D to komórki PK-15 transfekowane klonem DNA PCV1. Części 7E i 7F to komórki PK-15 transfekowane klonem DNA PCV2. Części 7G i 7H to komórki PK-15 transfekowane chimerowym klonem DNA PCV1-2. Części 71 i 7J to komórki PK-15 transfekowane odpowiadającym chimerowym klonem DNA PCV2-1. Figura 8 przedstawia pełnej długości sekwencję DNA sklonowanego molekularnego DNA PCV2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 1). Figura 9 przedstawia pełnej długości sekwencję DNA sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 2). Figura 10 przedstawia sekwencję DNA ORF 2 genu immunogennego białka płaszcza sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 3). Figura 11 przedstawia przypuszczalną translację do aminokwasów genu immunogennego białka płaszcza chimerowego DNA PCV1-2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 4). Szczegółowy opis wynalazku Zostaną niniejszym ujawnione zakaźne molekularne i chimerowe cząsteczki kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV), żywe chimerowe wirusy wytwarzane z chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego oraz szczepionki weterynaryjne do ochrony świń przed zakażeniem wirusowym lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym u świń (PMWS), powodowanym przez PCV2. Opisano tu immunogenne polipeptydowe produkty ekspresji, które mogą być wykorzystywane jako szczepionki. Niezjadliwa, zakaźna chimerowa cząsteczka DNA PCV (PCV1-2) obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zakaźny, niepatogenny PCV1, który zawiera gen immunogennej otwartej ramki odczytu (ORF) patogennego PCV2 w miejscu genu ORF w genomie PCV1. Zakaźny, chimerowy klon DNA PCV1-2 DNA zawiera gen immunogennego białka płaszcza (ORF2) DNA PCV2 sklonowany w szkielecie genomowym zakaźnego, niepatogennego klonu DNA PCV1.' Ogólnie, gen białka płaszcza DNA PCV2 zastępuje gen ORF2 w DNA PCV1 w strukturze genomowej niepatogennego PCV1, lecz jest rozważane, że różnorodne warianty pozycyjne mogą być konstruowane przez inżynierię genetyczną w celu otrzymania innych niezjadliwych lub atenuowanych chimerowych klonów DNA. Odwrotny chimerowy zakaźny klon DNA PCV2-1 pomiędzy PCV1 i PCV2 jest ujawniony jako kontrola do analizowania chimerowego klonu PCV1-2 i jest skonstruowany przez zastąpienie genu białka płaszcza PCV2 przez ten z PCV1 w szkielecie zakaźnego klonu DNA patogennego PCV2. Oprócz tego, że jest modelem doświadczalnym, odwrotny chimerowy klon DNA PCV2-1 DNA może znaleźć zastosowanie w przygotowywaniu specjalnie zaprojektowanych szczepionek. Wykazano, że sklonowane genomowe DNA PCV2 opisane niniejszym jest zakaźne in vitro i in vivo, kiedy jest transfekowane do komórek PK-15 i podawane świniom. Zakaźny klon DNA PCV2 powoduje patologiczne uszkodzenia charakterystyczne dla PMWS u świń umożliwiając ulepszoną charakteryzację choroby klinicznej i zrozumienie rozmieszczenia wirusa w komórkach tkanek. Ten nowy, łatwy do namnażania czynnik patogenny przyczynia się do rozwoju odpowiedniego programu szczepień do zapobiegania PMWS u świń. Chimerowy klon DNA PCV1-2 jest zakaźny zarówno przez transfekcję in vitro komórek PK-15, jak i podanie in vivo świniom. W transfekowanych komórkach PK-15 chimerowy klon DNA PCV1-2 produkuje antygen białka płaszcza PCV2 (immunogenne białko płaszcza PCV2), podczas gdy odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1 produkuje antygen białka płaszcza PCV1, jak wykazano w oznaczeniu immunofluorescencyjnym (IFA) z użyciem przeciwciał specyficznych wobec antygenu białka płaszcza PCV1 lub PCV2. Konwersja serologiczna do przeciwciała specyficznego wobec PCV2 jest wykrywana u świń inokulowanych zakaźnym klonem PCV2, jak również chimerowym klonem

10 10 PL B1 PCV1-2. Wykrywanie konwersji serologicznej do przeciwciała specyficznego wobec PCV2 oznacza, że chimerowy klon DNA PCV1-2 wywołuje powstawanie przeciwciała specyficznego wobec PCV2 w infekowanych świniach i, w następstwie, przyczynia się do ochrony inokulowanych świń przez zakażeniem PCV2. Poniższe przykłady opisują ocenę immunogenności i patogenności chimerowych klonów DNA w inokulowanych świniach bardziej szczegółowo. Zasadniczo, konwersje serologiczne do przeciwciał przeciwko antygenowi ORF 2 PCV2 są wykrywane u świń inokulowanych klonem DNA PCV2 (grupa 3) i chimerowym Klonem DNA PCV1-2 (grupa 4). Wszystkie świnie inokulowane klonem PCV1 i odpowiadającym klonem DNA PCV2-1 (grupy 2 i 5, odpowiednio) ulegają konwersji serologicznej do przeciwciała przeciwko PCV1. Wirusy otrzymane z wybranych świń w każdej grupie są częściowo sekwencjonowane i potwierdzono, że są to autentyczne odpowiednie zakaźne klony DNA używane w inokulacji. Ogólne i mikroskopowe uszkodzenia w różnych tkankach zwierząt inokulowanych klonem DNA PCV2 są znacząco cięższe niż te znajdywane u świń inokulowanych klonami DNA PCV1, chimerowego PCV 1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1. Nieoczekiwanie i korzystnie, chimerowy zakaźny klon DNA PCV1-2 posiadający immunogenny gen białka płaszcza (ORF2) z patogennego PCV2 sklonowany w szkielecie genomowym niepatogennego PCV1 wywołuje specyficzną odpowiedź humoralną wobec antygenu białka płaszcza patogennego PCV2, podczas gdy wyjątkowo zachowuje on niepatogenną naturę PCV1 u świń. Zwierzęta szczepione chimerowym zakaźnym klonem DNA PCV1-2 przechodzą łagodne zakażenie przypominające to u zwierząt inokulowanych PCV1, podczas gdy ulegają konwersji serologicznej do przeciwciała przeciwko białku płaszcza ORF2 patogennego PCV2. Przeciętna długość wiremii obserwowana u zwierząt inokulowanych PCV1 i chimerowym PCV1-2 jest krótsza, odpowiednio 0,625 tygodnia i 1 tydzień, niż ta u zwierząt inokulowanych patogennym PCV2, która wynosi około 2,12 tygodnia. Brak wykrywalnej wiremii chimerowego PCV1-2 u niektórych inokulowanych zwierząt nie wpływa na konwersję serologiczną do przeciwciała przeciwko białku płaszcza ORF 2 PCV2 u świń inokulowanych PCV1-2 (grupa 4). Te wyniki wskazują, że nawet jeśli wiremia chimerowego PCV1-2 jest krótka lub niewykrywalna u niektórych inokulowanych zwierząt, chimerowy wirus PCV1-2 jest zdolny do wywołania odpowiedzi humoralnej przeciwko białku płaszcza ORF 2 PCV2. Szczególna zdolność chimerowego zakaźnego klonu DNA PCV1-2 do wywołania odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec immunogennego białka płaszcza ORF 2 patogennego PCV2 przy pozostaniu niepatogennym dla świń czyni chimerowy klon PCV1-2 szczególnie użytecznym jako genetycznie zmodyfikowaną żywą, atenuowaną szczepionkę i inne typy szczepionek. Oczyszczone i izolowane cząsteczki kwasów nukleinowych opisane niniejszym obejmują pełnej długości sekwencję DNA sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 ujawnioną w Sekw. nr Id: 2, pokazaną na fig. 9 i zdeponowaną w American Type Culture Collection (ATCC) pod depozytowym numerem dostępu PTA-3912; jej nić komplementarna (tzn. odwrócone i przeciwstawne pary zasad) lub sekwencje nukleotydowe posiadające przynajmniej 95% homologii do chimerowej sekwencji nukleotydowej (tzn. znaczącą aktywną część całego genu). Typowe metody, które są dobrze znane w dziedzinie mogą być używane do przygotowania nici komplementarnych lub sekwencji nukleotydowych o wysokiej homologii, na przykład przez uznawane w dziedzinie standardowe lub wysoko specyficzne techniki hybrydyzacyjne. Oczyszczona i izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję DNA genu immunogennego białka płaszcza sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 jest również ujawniona w Sekw. nr Id: 3 i na fig. 10. Odpowiednie komórki zawierające cząsteczkę chimerowego kwasu nukleinowego specyficznie wytwarzają żywe, zakaźne chimerowe cirkowirusy świni. Żywy, zakaźny chimerowy wirus jest otrzymywany z chimerowego klonu DNA przez transfekcję komórek PK-15 przez transfekcję in vitro i in vivo jak pokazano niniejszym. Korzystnym przykładem sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 jest sekwencja nukleotydowa ujawniona w Sekw. nr Id: 2 i na fig. 9. Chimerowy wirus jest otrzymywany z nici komplementarnej lub sekwencji nukleotydowych posiadających wysoką homologię, przynajmniej 95% homologii, do chimerowej sekwencji nukleotydowej. Niniejszym opisane zostały także biologicznie funkcjonalne plazmidy, wektory wirusowe i im podobne, które zawierają ujawnione poniżej rekombinowane cząsteczki kwasów nukleinowych, odpowiednie komórki gospodarza transfekowane wektorami zawierającymi chimerowe i molekularne klony DNA oraz immunogenne polipeptydowe produkty ekspresji. Immunogenne białko ujawnione niniejszym posiada sekwencję aminokwasową ujawnioną w Sekw. nr Id: 4 i na fig. 11. Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie będzie wiedzieć bez nadmiernego wysiłku, jak zmodyfikować, za-

11 PL B1 11 mieniać, usuwać itp., aminokwas(y) z sekwencji polipeptydu i wytwarzać biologicznie aktywne warianty, które zachowują taką samą, albo zasadniczo taką samą aktywność, jak sekwencja wyjściowa. Proces wytwarzania immunogennych produktów polipeptydowych może obejmować następujące etapy: wzrost, w odpowiednich warunkach odżywczych, prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza transfekowanych cząsteczkami nowych rekombinowanych kwasów nukleinowych opisanych niniejszym, w sposób umożliwiający produkcję produktów polipeptydowych oraz izolację pożądanych produktów polipeptydowych ekspresji cząsteczek kwasów nukleinowych standardowymi metodami znanymi w dziedzinie. Jest rozważane, że immunogenne białka mogą być przygotowywane innymi metodami, takimi jak, na przykład, synteza biochemiczna i podobne. Szczepionki z chimerowych wirusowych i molekularnych klonów DNA oraz sposoby ich zastosowania są zawarte w obrębie niniejszego wynalazku. Inokulowane świnie są chronione przed poważnym zakażeniem wirusowym i PMWS powodowanym przez PCV2. Ten nowy sposób chroni świnie wymagające ochrony przed zakażeniem wirusowym lub PMWS przez podanie świni immunologicznie skutecznej ilości szczepionki, takiej jak, na przykład, szczepionka zawierająca immunogenną ilość chimerowego DNA PCV1-2, sklonowany chimerowy wirus, wektor plazmidowy lub wirusowy zawierający chimerowe DNA PCV1-2, polipeptydowe produkty ekspresji, rekombinowane DNA PCV2, itp. Inne antygeny takie jak PRRSV, PPV, inne czynniki zakaźne świń i środki immunologicznie stymulujące mogą być podawane świni równocześnie, aby dostarczyć szerokiego zakresu ochrony przed zakażeniami wirusowymi. Szczepionki zawierają, na przykład, zakaźny chimerowy DNA PCV1-2, sklonowany DNA chimerowego genomu PCV w odpowiednich plazmidach lub wektorach, takich jak, na przykład, wektor psk, niezjadliwy żywy chimerowy wirus, inaktywowany chimerowy wirus, itp. w połączeniu z nietoksycznym, dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem oraz, ewentualnie, jednym lub więcej adiuwantem. Szczepionka może również zawierać zakaźny molekularny klon DNA PCV2 opisany niniejszym. Zakaźny chimerowy DNA PCV1-2, DNA plazmidowy zawierający zakaźny chimerowy genom wirusowy i żywy chimerowy wirus są korzystniejsze, a żywy chimerowy wirus jest najbardziej korzystny. Niezjadliwa, żywa szczepionka wirusowa według wynalazku posiada przewagę nad tradycyjnymi szczepionkami wirusowymi, które wykorzystują albo atenuowane, żywe wirusy, które przestawiają ryzyko powrotu do stanu zjadliwego lub zabitego całego wirusa namnażanego w hodowli komórkowej, który może nie wywołać wystarczającej humoralnej odpowiedzi immunologicznej, aby zapewnić ochronę przed chorobą wirusową. Adiuwant, który może być podawany w połączeniu ze szczepionką według niniejszego wynalazku, jest substancją, która zwiększa odpowiedź immunologiczną świni na szczepionkę. Adiuwant może być podawany w tym samym czasie i w tym samym miejscu co szczepionka, lub w innym czasie, na przykład, jako dawka wzmagająca odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty również mogą korzystnie być podawane świni w sposób lub w miejscu innym niż sposób lub miejsce, w którym jest podawana szczepionka. Odpowiednie adiuwanty obejmują, ale nie są ograniczone do, wodorotlenku glinu (alum), kompleksów immunostymulujących (ISCOMS), niejonowych polimerów blokowych lub kopolimerów, cytokin (takich, jak IL-1, IL-2, IL-7, IFN-G, IFN-O, IFN-D, itp.), saponin, monofosforanu lipidu A (MLA), dipeptydów muramylowych (MDP) i podobnych. Inne odpowiednie adiuwanty obejmują, na przykład, siarczan glinowo-potasowy, ciepło-wrażliwą lub ciepło-trwałą enterotoksynę izolowaną z Escherichia coli, toksynę cholery lub jej podjednostkę B, toksynę błoniczą, toksynę tężcową, toksynę krztuśca, niekompletny lub kompletny adiuwant Freunda itp. Adiuwanty oparte na toksynach, takich jak toksyna błoniczą, toksyna tężcowa, toksyna krztuśca, mogą być inaktywowane przed użyciem, na przykład, przez działanie formaldehydem. Szczepionki mogą ponadto zawierać dodatkowe antygeny w celu podnoszenia aktywności immunologicznej zakaźnych chimerowych klonów DNA PCV, takie jak, na przykład, wirus zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV), parwowirus świni (PPV), inne czynniki zakaźne świni i środki stymulujące immunologicznie. Szczepionki według wynalazku nie są ograniczone do żadnego szczególnego typu lub sposobu przygotowania. Sklonowane szczepionki wirusowe obejmują, lecz nie są ograniczone do zakaźnych szczepionek DNA (tzn. wykorzystania plazmidów, wektorów lub innych typowych nośników do bezpośredniego wstrzyknięcia DNA do świń), żywych szczepionek, modyfikowanych żywych szczepionek, inaktywowanych szczepionek, podjednostkowych szczepionek, atenuowanych szczepionek, szczepionek modyfikowanych przez inżynierię genetyczną, itp. Te szczepionki są przygotowywane standardowymi sposobami znanymi w dziedzinie.

12 12 PL B1 Żywa wirusowa szczepionka jest na ogół najbardziej pożądaną szczepionką, ponieważ są pobudzane wszystkie możliwe odpowiedzi immunologiczne u przyjmującego szczepionkę, włączając odpowiedzi immunologiczne ogólnoustrojową, miejscową, humoralną i za pośrednictwem komórek. Zabita szczepionka, z drugiej strony, może wywołać wyłącznie immunologiczną odpowiedź humoralną. Aczkolwiek najbardziej pożądane, żywe wirusowe szczepionki mają jednakże szereg wad, takich jak potencjalne ryzyko zanieczyszczenia żywym przypadkowym wirusem lub ryzyko, że wirus może powrócić do zjadliwości podczas stosowania. Znaczące jest, że wyjątkowy chimerowy DNA PCV1-2 przezwycięża te trudności. Wykorzystując wyłącznie geny immunogenne z patogennego PCV2, chimerowe konstrukcje DNA, żywy, replikujący się wirus, który jest niepatogenny, wywołuje jednak całkowite, korzystne odpowiedzi immunologiczne dla żywych szczepionek wirusowych przeciwko patogennemu wirusowi PCV2. Żywa szczepionka wirusowa oparta o żywego wirusa będzie miała małe szanse, jeśli jakiekolwiek, powrotu do fenotypu patogennego. Zatem, chimerowy wirus oparty o strukturę niepatogennego PCV1 ma dużą przewagę nad jakimkolwiek rekombinowanym DNA wirusa PCV2, jakąkolwiek żywą, atenuowaną szczepionką PCV2 lub jakimkolwiek innym rodzajem szczepionki bazującym wyłącznie na PCV2 w celu wywoływania odporności na zakażenia PCV2. Chociaż żywa szczepionka wirusowa jest najbardziej korzystna, inne rodzaje szczepionek mogą być wykorzystywane do inokulacji świń nowym chimerowym wirusem oraz innymi antygenami przedstawionymi niniejszym. Aby przygotować szczepionki z inaktywowanych wirusów, na przykład prowadzone jest namnażanie wirusa z zakaźnego klonu DNA metodami znanymi w dziedzinie lub ujawnionymi niniejszym. Seryjna inaktywacja wirusa jest następnie optymalizowana sposobami ogólnie znanymi osobom o zwykłych umiejętnościach dziedzinie. Inaktywowane szczepionki wirusowe mogą być przygotowywane przez działanie na chimerowego wirusa otrzymanego ze sklonowanego DNA PCV czynnikami inaktywującymi, takimi jak formalina lub rozpuszczalniki hydrofobowe, kwasy, itp., przez naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym lub promieniami X, przez ogrzewanie, itp. Inaktywacja jest prowadzona sposobem zrozumiałym w dziedzinie. Na przykład, podczas inaktywacji chemicznej, odpowiednia próbka wirusa lub próbka surowicy zawierająca wirusa jest poddawana działaniu przez wystarczająco długi czas odpowiedniej ilości lub stężeniu czynnika inaktywującego w odpowiednio wysokiej (lub niskiej, w zależności od czynnika inaktywującego) temperaturze lub ph, aby inaktywować wirusa. Inaktywacja przez ogrzewanie jest prowadzona w temperaturze i przez okres czasu wystarczający, aby inaktywować wirusa. Inaktywacja przez promieniowanie jest prowadzona używając długości fali światła lub innego źródła energii przez okres czasu wystarczający, aby inaktywować wirusa. Wirusa uważa się za inaktywowanego, jeżeli jest on niezdolny do zakażenia komórki podatnej na zakażenie. Przygotowanie szczepionek podjednostkowych zazwyczaj różni się od przegotowywania modyfikowanej żywej szczepionki lub inaktywowanej szczepionki. Przed przygotowaniem szczepionki podjednostkowej, muszą zostać określone ochronne lub antygenowe składniki szczepionki. Takie ochronne lub antygenowe składniki obejmują pewne segmenty aminokwasowe lub fragmenty wirusowych białek płaszcza, które wywołują szczególnie silną ochronną lub immunologiczną odpowiedź u świń; same pojedyncze lub liczne wirusowe białka płaszcza, ich oligomery oraz połączenia wyższego rzędu wirusowych białek płaszcza, które tworzą substruktury wirusowe lub możliwe do identyfikacji części lub jednostki takich struktur; oligoglikozydy, glikolipidy lub glikoproteiny obecne na lub blisko powierzchni wirusa lub w wirusowych strukturach, takich jak lipoproteiny lub grupy lipidowe związane z wirusem, itp. Korzystnie, białko płaszcza, takie jak białko kodowane przez gen ORF 2, jest wykorzystywane jako składnik antygenowy szczepionki podjednostkowej. Inne białka kodowane przez zakaźny klon DNA mogą również być wykorzystywane. Te immunogenne składniki są łatwo identyfikowane sposobami znanymi w dziedzinie. Po zidentyfikowaniu, ochronne lub antygenowe części wirusa (tzn. podjednostka ) są następnie oczyszczane i/lub klonowane sposobami znanymi w dziedzinie. Szczepionka podjednostkowa posiada przewagę nad innymi szczepionkami opartymi na żywym wirusie, ponieważ podjednostka, taka jak wysoko oczyszczone podjednostki wirusa, jest mniej toksyczna niż cały wirus. Jeśli szczepionka podjednostkowa jest wytwarzana technikami rekombinacji genetycznej, ekspresja sklonowanej podjednostki takiej jak gen ORF 2 (białko płaszcza), na przykład, może być optymalizowana sposobami znanymi tym w dziedzinie (zob., na przykład, Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MA., 1989). Jeżeli podjednostka, która jest wykorzystywana, stanowi nienaruszoną cechę strukturalną wirusa, taką jak kompletne białko płaszcza, wówczas procedura jego izolacji z wirusa musi być optymalizowana.

13 PL B1 13 W każdym przypadku, po optymalizacji sposobu inaktywacji, sposób oczyszczania podjednostki może być optymalizowany przed jej produkcją. Aby przygotować atenuowane szczepionki z klonów patogennych, adaptowany do hodowli tkankowej, żywy, patogenny PCV2 jest najpierw atenuowany (uczyniony niepatogennym lub nieszkodliwym) sposobami znanymi w dziedzinie, zazwyczaj przez kolejne pasażowanie przez hodowle komórkowe. Atenuacja klonów patogennych może być również prowadzona przez usunięcie genów lub mutacje genów odpowiedzialnych za wytwarzanie wirusa. Następnie, atenuowane wirusy PCV2 mogą być wykorzystywane do konstrukcji dodatkowych chimerowych wirusów PCV1-2, które zachowują niepatogenny fenotyp PCV1, ale mogą różnić się siłą właściwości immunogennych wyselekcjonowanych z genomu PCV2 przez technikę rekombinacyjną. Szczepionka może zawierać klon DNA żywego chimerowego wirusa, w szczególności, klon zawierający geny PCV2 immunogenne sklonowane w szkielecie niepatogennego PCV1. Korzystnie, żywy chimerowy wirus, który jest naturalnie nie zjadliwy, kiedy zostanie skonstruowany przez inżynierię genetyczną nie wymaga czasochłonnych procedur atenuacji. Wirus wyłącznie służy jako żywy, ale niepatogenny replikujący się wirus, który wytwarza immunogenne białka przeciwko PCV2 podczas replikacji wirusa, które mogą następnie wywołać pełen zakres odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogennemu PCV2. Jako dalsza zaleta, korzystny żywy chimerowy wirus stanowi stabilną genetycznie szczepionkę, która jest łatwiejsza do przygotowania, przechowywania i podawania niż inne rodzaje atenuowanych szczepionek. Niezjadliwe lub atenuowane szczepionki oparte na chimerowych wirusach są na ogół uważane za tak bezpieczne jak, jeśli nie bezpieczniejsze niż tradycyjnie modyfikowane żywe szczepionki (J. Arroyo i wsp., Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever virus/japanese encephalitis vims chimera vaccine (ChimeriVax-JE) J. Virol. 75 (2): (2001); F. Guirakhoo i wsp., Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 vims is immunogenic and protective in nonhuman primates J. Virol. 74 (12): (2000); S. Tang i wsp., Toward a poliovims-based simian immunodeficiency wirus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity J. Virol. 71 (10): (1997)). Na przykład wykazano, że szczepionka ChimeriVax-JE przeciwko wirusowi japońskiego zapalenia mózgu (JEV, ang. Japanese encephalitis virus), która jest genetycznie zmodyfikowaną pochodną szczepionki YFV17D przeciwko wirusowi żółtej febry, w której geny kodujące białka strukturalne prm i E YFV17D są zastąpione odpowiadającymi genami atenuowanego szczepu JEV SA , jest genetycznie stabilna po długotrwałych pasażach zarówno in vitro, jak i in vivo (J. Arroyo i wsp., 2001, op. cit.). Stwierdzono również, że inna chimerowa szczepionka wirusowa ChimeriVax-D2 przeciwko wirusowi Dengue typu 2, którą stanowi atenuowany chimerowy wirus żółtej febry (YF)-dengue typu 2 (dengue-2), jest genetycznie stabilna; jej sekwencje zostały opisane jako niezmienione po 18 pasażach w komórkach Vero (F. Guirakhoo i wsp., 2000, op. cit.). Szczepionka może też wykorzystywać odpowiednie plazmidy w celu dostarczenia niepatogennego chimerowego klonu DNA do świń. W przeciwieństwie do tradycyjnej szczepionki, która wykorzystuje żywego lub zabitego całego wirusa namnażanego w hodowli komórkowej, niniejszy wynalazek umożliwia bezpośrednią inokulację świń plazmidem DNA zawierającym zakaźny chimerowy genom wirusowy. Dodatkowe modyfikowane genetycznie szczepionki, które są pożądane w niniejszym wynalazku, są wytwarzane sposobami znanymi w dziedzinie. Takie techniki obejmują, ale nie są ograniczone do, dalszej manipulacji rekombinowanego DNA, modyfikacji lub podstawień sekwencji aminokwasowych rekombinowanych białek i tym podobne. Genetycznie modyfikowane szczepionki oparte o technologie rekombinacji DNA są przygotowywane, na przykład, przez identyfikację alternatywnych części genów wirusowych kodujących białka odpowiedzialnych za wywoływanie silniejszej odpowiedzi immunologicznej lub ochronnej u świń (np., białka pochodzące z ORF 3, ORF 4, itp.). Takie zidentyfikowane geny lub fragmenty immunodominujące mogą być klonowane w standardowych wektorach do ekspresji białek, takich jak wektor bakulowirusowy i wykorzystywane do infekcji odpowiednich komórek gospodarza (zob. na przykład O'Reilly i wsp., Baculovirus Expression Wektors: A Lab Manual Freeman & Co., 1992). Komórki gospodarza są hodowane, w ten sposób wytwarzając pożądane białka szczepionkowe, które mogą być oczyszczone w pożądanym stopniu i włączone do odpowiedniego produktu szczepionkowego. Jeżeli klony zachowują jakiekolwiek niepożądane naturalne zdolności powodowania choroby, jest również możliwe określenie sekwencji nukleotydowych w genomie wirusowym odpowiedzialnych

14 14 PL B1 za zjadliwość i zmodyfikowanie genetyczne wirusa do niezjadliwości poprzez, na przykład, ukierunkowaną mutagenezę. Ukierunkowana mutageneza jest w stanie dodawać, usuwać lub zmieniać jeden lub więcej nukleotydów (zob., na przykład, Zoller i wsp., DNA 3: , 1984). Syntetyzowany jest oligonukleotyd zawierający pożądaną mutację i przyłączany do części jednoniciowego wirusowego DNA. Cząsteczka hybrydowa, która powstaje w wyniku tej procedury, jest wykorzystywana do transformacji bakterii. Następnie, dwuniciowe DNA, które zostaje wyizolowane, zawierające odpowiednią mutację, jest wykorzystywane do wytworzenia pełnej długości DNA przez połączenie z fragmentem restrykcyjnym tego ostatniego, który jest następnie transfekowany do odpowiedniej hodowli komórkowej. Połączenie genomu z odpowiednim wektorem do transferu może zostać przeprowadzone przez każdą standardową techniką znaną osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Transfekcja wektora do komórek gospodarza w celu wytworzenia wirusów potomnych może zostać przeprowadzona z użyciem typowych metod, takich jak transfekcja za pośrednictwem fosforanu wapnia lub DEAE-dekstranu, elektroporacja, łączenie protoplastów i inne dobrze znane techniki (np., Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Sklonowany wirus następnie wykazuje pożądaną mutację. Alternatywnie, mogą zostać zsyntetyzowane dwa oligonukleotydy, które zawierają odpowiednią mutację. Mogą one zostać połączone do utworzenia dwuniciowego DNA, które może zostać włączone do DNA wirusowego dla utworzenia DNA o pełnej długości. Genetycznie zmodyfikowane białka, przydatne w szczepionkach, na przykład, mogą być wytwarzane w komórkach owadzich, komórkach drożdżowych lub komórkach ssaczych. Genetycznie zmodyfikowane białka, które mogą zostać oczyszczone lub wyizolowane typowymi metodami, mogą być bezpośrednio inokulowane do świń, aby wywołać ochronę przed zakażeniem wirusowym lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym u świń (PMWS) powodowanym przez PCV2. Linia komórek owadzich (jak HI-FIVE) może być transformowana wektorem transferowym zawierającym cząsteczki kwasu nukleinowego otrzymane z wirusa lub skopiowane z genomu wirusowego, które kodują jedno lub więcej immunodominujące białko wirusa. Wektor transferowy obejmuje, na przykład, liniowe DNA bakulowirusa i plazmid zawierający pożądane polinukleotydy. Linia komórek gospodarza może być równocześnie transfekowana liniowym DNA bakulowirusa i plazmidem w celu wytworzenia rekombinowanego bakulowirusa. Alternatywnie, DNA od świni cierpiącej na PMWS, który koduje jedno lub więcej białek płaszcza, zakaźny molekularny klon DNA lub sklonowany chimerowy genom DNA PCV może zostać włączony do żywych wektorów, takich jak wirus ospy lub adenowirus i używany jako szczepionka. Immunologicznie skuteczna ilość szczepionek według wynalazku jest podawana świni wymagającej ochrony przed zakażeniem wirusowym lub PMWS. Immunologicznie skuteczna ilość lub immunogenna ilość do inokulacji świni może zostać łatwo określona lub szybko zmierzona przez rutynowe testowanie. Skuteczna ilość to taka, w której osiągnięta zostaje wystarczająca odpowiedź immunologiczna na szczepionkę dla ochrony świni eksponowanej na wirusa, który powoduje PMWS. Korzystnie, świnia jest chroniona w stopniu, w którym jeden do wszystkich niekorzystnych objawów lub skutków choroby wirusowej są znacząco zmniejszone, poprawione lub całkowicie się im zapobiega. Szczepionka może zostać podana w pojedynczej dawce lub w powtarzanych dawkach. Dawkowanie może wahać się, na przykład, od 1 do 1000 mikrogramów plazmidowego DNA zawierającego zakaźny chimerowy genom DNA (w zależności od stężenia aktywnego immunologicznie składnika szczepionki), ale nie powinno zawierać antygenu opartego na wirusie w ilości wystarczającej do wywołania niepożądanego skutku lub objawów fizjologicznych zakażenia wirusowego. W dziedzinie znane są sposoby określenia lub zmierzenia odpowiednich dawek aktywnego czynnika antygenowego w oparciu o wagę świni, stężenie antygenu i inne typowe czynniki. Korzystnie, zakaźny chimerowy klon DNA jest używany jako szczepionka, albo żywy zakaźny chimerowy wirus może zostać wytworzony in vitro i następnie żywy chimerowy wirus jest wykorzystywany jako szczepionka. W tym przypadku, 100 do 200 mikrogramów sklonowanego chimerowego DNA PCV lub około % dawki zakażającej w hodowli tkankowej (TCID50) żywego chimerowego wirusa może zostać podane świni. Pożądane jest, aby szczepionka była podawana świni jeszcze nie kontaktującej się z wirusem PCV. Szczepionka zawierająca chimerowy zakaźny klon DNA PCV1-2 lub inne jego postacie antygenowe może być wygodnie podawana donosowo, przezskórnie (tzn. nałożona na lub na powierzchnię skóry w celu wchłonięcia ogólnoustrojowego), parenteralnie, itp. Parenteralna droga podania obejmuje, ale nie jest ograniczona do dróg domięśniowej, dożylnej, dootrzewnowej, śródskórnej (tzn. wstrzyknięta lub inaczej umieszczona pod skórą) i podobnych. Ponieważ drogi inokulacji domięśniowa

15 PL B1 15 i śródskórna były skuteczne w innych badaniach z użyciem zakaźnych klonów wirusowych (E. E. Sparger i wsp., Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency wirus molecular clone Virology 238: (1997); L. Willems i wsp., In vivo transfection of bovine leukemia provims into sheep Virology 189: (1992)), te drogi są najbardziej korzystne, w dodatku do praktycznej donosowej drogi podania. Chociaż mniej wygodnie, rozważa się również, że szczepionka może zostać podana świni poprzez drogę inokulacji do węzłów limfatycznych. Wyjątkowy, wysoce korzystny sposób podania obejmuje bezpośrednie wstrzyknięcie plazmidowego DNA zawierającego chimerę PCV1-2 do świni domięśniowo, śródskórnie, do węzłów limfatycznych itp. Kiedy podawana jako ciecz, niniejsza szczepionka może zostać przygotowana w postaci roztworu wodnego, syropu, eliksiru, tynktury i podobnych. Takie preparaty są znane w dziedzinie i są zazwyczaj przygotowywane przez rozpuszczenie antygenu i innych typowych dodatków w odpowiednich systemach nośników lub rozpuszczalników. Odpowiednie nośniki lub rozpuszczalniki obejmują, ale nie są ograniczone do wody, soli fizjologicznej, etanolu, glikolu etylenowego, glicerolu itp. Typowe dodatki to, na przykład, posiadające certyfikat barwniki, substancje zapachowe, słodziki i konserwanty przeciwko drobnoustrojom takie jak timerosal (sól sodowa etylortęciosalicynianu). Takie roztwory mogą być stabilizowane, na przykład przez dodanie częściowo zhydrołizowanej żelatyny, sorbitolu lub podłoża do hodowli komórkowych i mogą być buforowane typowymi metodami z użyciem odczynników znanych w dziedzinie, takich jak zasadowy fosforan sodowy, kwaśny fosforan sodowy, zasadowy fosforan potasowy, kwaśny fosforan potasowy, ich mieszanina i podobne. Ciekłe postacie mogą również obejmować zawiesiny i emulsje, które zawierają czynniki zawieszające lub emulgujące w połączeniu z innymi standardowymi formułami łącznymi. Te rodzaje ciekłych postaci mogą zostać przygotowane typowymi metodami. Zawiesiny, na przykład, mogą zostać przygotowane z użyciem młyna koloidowego. Emulsje, na przykład, mogą zostać przygotowane z użyciem homogenizatora. Parenteralne postacie, opracowywane w celu wstrzyknięcia do układów płynów ustrojowych, wymagają odpowiedniej izotoniczności i zbuforowania ph do odpowiadających poziomów płynów ustrojowych świni. Izotoniczność może być odpowiednio ustalona chlorkiem sodu i innymi solami według potrzeby. Odpowiednie rozpuszczalniki, takie jak etanol lub glikol propylenowy mogą być używane dla zwiększenia rozpuszczalności składników preparatu i trwałości płynnego preparatu. Dalsze dodatki, które mogą zostać wykorzystane, obejmują, ale nie są ograniczone do dekstrozy, typowych antyutleniaczy i typowych czynników chelatujących, takich jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Postacie do dawkowania parenteralnego muszą również zostać wyjałowione przed użyciem. Sposób przygotowywania zakaźnej, niepatogennej chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1-2 obejmuje usunięcie genu otwartej ramki odczytu (ORF) z cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zakaźny niepatogenny PCV1, zastąpienie tej samej pozycji immunogennym genem ORF z cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zakaźny patogenny PCV2 i odzyskanie chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego. Cząsteczką kwasu nukleinowego jest zazwyczaj DNA. Korzystny sposób zastępuje gen ORF2 w DNA niepatogennego PCV1 immunogennym genem białka płaszcza ORF2 z zakaźnego patogennego cząsteczkowego DNA PCV2 opisanego niniejszym. Jest rozważane, że inne pozycje ORF lub ich fragmenty immunogenne mogą być wymieniane pomiędzy DNA PCV1 i PCV2 w celu skonstruowania atenuowanych zakaźnych chimerowych klonów DNA zgodnie z opisanymi tu sposobami. Zrekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest następnie używana do konstruowania żywego, zakaźnego, replikującego się chimerowego wirusa, który korzystnie zachowuje niepatogenny charakter PCV1, ale wytwarza immunogenne białko ORF2 patogennego PCV2 i wywołuje pełną odpowiedź immunologiczną przeciwko patogennemu PCV2. Korzystnie, klon DNA PCV1-2 służy jako genetycznie zmodyfikowana niezjadliwa, żywa szczepionka przeciwko zakażeniu PCV2 i PMWS u świń. Zakaźny klon DNA PCV2 jest skonstruowany, jak opisano niniejszym, tak, że biologicznie czysty i jednorodny preparat zakaźnego wirusa może zostać wytworzony do badań nad patogenezą i tworzenia niepatogennych chimerowych szczepionek. Kliniczny przebieg choroby, rozmieszczenie wirusa i uszkodzenia patologiczne związane z infekcją PCV2 są bardziej jednoznacznie scharakteryzowane z użyciem tego molekularnego klonu DNA i biologicznie czystego i jednorodnego zakaźnego preparatu wirusa PCV2 pochodzącego z molekularnego klonu DNA niż było to obserwowane w przeszłości, co samo umożliwia wytworzenie pożądanych produktów szczepionkowych według wynalazku.

16 16 PL B1 Molekularny klon PCV2 jest wytwarzany przez tandemowe połączenie dwóch kopii całego PCV2 genomu w wektorze psk. W zdecydowanym przeciwieństwie do pojedynczej kopii genomu ujawnionej w dziedzinie, zakaźny klon DNA PCV2 przygotowany sposobami opisanymi niniejszym zawiera dwie pełne kopie genomu PCV2 połączone razem w powtórzenie tandemowe. Tandemowe połączenie dwóch kopii genomu dostarcza podobnego kolistego genomu, który naśladuje typowy kolisty genom PCV2. Korzyścią posiadania dwóch kopii genomu w tandemie w zakaźnym klonie DNA PCV2 jest umożliwienie zwiększenia replikacji, gdy zakaźny klon DNA zostanie transfekowany in vitro i in vivo. Zatem, klon działa bardziej wydajnie i skutecznie niż wcześniejsza pojedyncza kopia genomu. Infekcja zwierząt molekularnym klonem wirusowym jest ogromnie użyteczna do badania genetycznych determinant replikacji wirusowej i zjadliwości w gospodarzu. Cirkowirus świni typu 2 (PCV2) był podejrzewany jako czynnik etiologiczny wielonarządowego poodsadzeniowego zespołu wyniszczającego u świń (PMWS). PMWS jest złożonym zespołem chorobowym u świń i liczne czynniki mogą być zaangażowane w kliniczny obraz PMWS. Jednakże, trudność w wytworzeniu biologicznie czystej postaci PCV2 z powodu obecności innych pospolitych czynników patogennych świni w homogenatach tkankowych od porażonych świń hamowało jednoznaczne scharakteryzowanie choroby klinicznej i uszkodzeń patologicznych wyłącznie związanych z infekcją PCV2. Jest to przypadek, gdy zakaźny molekularny klon DNA PCV2 został skonstruowany i użyty w celu scharakteryzowania choroby i uszkodzeń patologicznych związanych z infekcją PCV2 przez bezpośrednią transfekcję in vivo świń molekularnym klonem. Wykazano, że jednorodny preparat żywego wirusa PCV2 otrzymany z molekularnego klonu jest zakaźny in vitro, gdy zostanie transfekowany do komórek PK-15. Sklonowany genomowy DNA PCV2 jest również zakaźny, gdy zostanie bezpośrednio wstrzyknięty do wątroby i płytko położonych węzłów limfatycznych dwunastnicy specyficznie wolnych od patogenu (SPF) świń. U zwierząt, którym wstrzyknięto sklonowane DNA plazmidowe PCV2 dochodzi do rozwoju infekcji i choroby przypominającej tę wywoływaną przez donosową inokulację jednorodnym, zakaźnym preparatem żywego wirusa PCV2. Konwersja serologiczna do przeciwciała specyficznego wobec PCV2 jest wykrywana u większości świń z inokulowanych grup 35 dni po inokulacji (DPI, ang. days postinoculation). Wystąpienie i czas trwania wiremii u świń inokulowanych chimerowym klonem DNA PCV1-2 są podobne do tych u świń inokulowanych niepatogennym klonem DNA PCV1, podczas gdy wiremia u świń inokulowanych klonem PCV2 pojawiła się wcześniej i trwała dłużej. Rozpoczynająca się w 14 DPI i trwająca około 2-4 tygodni wiremia jest wykrywana u większości zwierząt inokulowanych PCV2. Podobnie, większość inokulowanych świń poddanych sekcji w 35 DPI uległa konwersji serologicznej do przeciwciał wobec PCV2. Antygen PCV2 jest wykrywany w różnych tkankach i organach u inokulowanych świń. Ogólne uszkodzenia są ograniczone do płuc i węzłów i charakteryzują się systematycznie powiększającymi się jasnobrązowo wybarwionymi węzłami limfatycznymi, płucami, które się nie zapadają i łagodnymi wieloogniskowymi jasnobrązowo wybarwionymi ogniskami konsolidacji. Ogólne uszkodzenia dotykające węzły limfatyczne zarówno u świń inokulowanych niepatogennym PCV1, jak i chimerowym PCV1-2 są łagodne i ograniczone do wyłącznie kilku zwierząt, podczas gdy wszystkie świnie inokulowane patogennym PCV2 mają średnią do silnej opuchliznę i odbarwienie tkanek limfatycznych (tabela 9, poniżej). Analiza statystyczna wykazuje, że ilości rozległych uszkodzeń w węzłach limfatycznych zwierząt inokulowanych chimerowym PCV1-2 są podobne do tych u świń inokulowanych niepatogennym PCV1. W 21 DPI, świnie inokulowane PCV2 miały ogólne uszkodzenia, które są statystycznie bardziej poważne niż te u świń inokulowanych PCV1 i chimerowym PCV1-2. Uszkodzenia histopatologiczne i antygen specyficzny wobec PCV2 są wykrywane w licznych tkankach i organach, włączając mózg, płuco, serce, nerkę, migdałek, węzły limfatyczne, śledzionę, jelito kręte i wątrobę inokulowanych (infekowanych) świń. Uszkodzenia histopatologiczne w licznych tkankach i organach podobne do tych w PMWS, są powtarzane molekularnym klonem DNA PCV2, jak również zakaźnym wirusem przygotowanym in vitro z molekularnego klonu DNA. Mikroskopowo, zarówno w 21 jak i 49 DPI, zwierzęta inokulowane chimerowym PCV1-2 mają statystycznie mniej mikroskopowych uszkodzeń niż zwierzęta inokulowane PCV2. Ilości uszkodzeń mikroskopowych w węzłach limfatycznych świń inokulowanych chimerowym PCV 1-2 są podobne do tych u świń inokulowanych niepatogennym PCV1, odpowiadającym PCV2-1 i nie inokulowanych zwierząt kontrolnych. Średnie do silnych uszkodzenia mikroskopowe są znajdowane w licznych tkankach zwierząt inokulowanych patogennym PCV2 włączając tkankę płuca, wątroby, układu limfatycznego, śledziony, mózgu, serca, nerki i migdałka. Jednakże, u zwierząt inokulowa-

17 PL B1 17 nych chimerowym PCV1-2, łagodne do średnich uszkodzenia mikroskopowe są ograniczone tylko do tkanek wątroby, węzłów limfatycznych i nerki (patrz tabela 10, poniżej). Nie ma żadnych znaczących objawów klinicznych PMWS u kontrolnych lub jakiejkolwiek z inokulowanych świń. Chociaż charakterystyczne objawy kliniczne PMWS nie są obserwowane dla plazmidowego DNA ze sklonowanym PCV2 (zakaźnego klonu DNA PCV2) lub dla biologicznie czystego preparatu zakaźnego wirusa PCV2, PCV2 jest wyraźnie odpowiedzialny za uszkodzenia histopatologiczne podobne do PMWS powtórzone w poniższych objaśniających przykładach. Uważa się ogólnie, że PCV2 jest głównym, ale nie jedynym czynnikiem patogennym odpowiedzialnym za wystąpienie klinicznego PMWS. Niniejszym bardziej dokładnie scharakteryzowano przebieg kliniczny i uszkodzenia patologiczne związane wyłącznie z infekcją PCV2. Niniejsze dane w poniższych objaśniających przykładach wskazują, że łatwo namnażane, sklonowane genomowe DNA PCV2 jest dostępne, aby zastąpić zakaźnego wirusa w badaniach patogenezy i immunizacji PCV2. Podczas gdy wykazano, że PCV2 jest niezbędny do rozwoju PMWS, inne warunki lub czynniki, takie jak PRRSV, PPV, itp. mogą być konieczne dla wywołania pełnego zakresu objawów klinicznych i uszkodzeń związanych z zaawansowanymi przypadkami PMWS. Jednakże, wiedząc, że PCV2 stanowi czynnik kluczowy, zakaźny, replikujący się klon wirusowy może być dalej modyfikowany lub zmieniany przez inżynierię genetyczną w celu uzyskania pożądanego efektu immunogennego poprzez metody znane osobom o przeciętnej biegłości w dziedzinie immunologii i genetyki molekularnej. Dostępność zakaźnego klonu DNA PCV2 opisanego niniejszym czyni możliwym wytworzenie genetycznie zmodyfikowanej atenuowanej szczepionki do zapobiegania infekcjom PCV2 i PMWS u świń. Wiadomo, że PCV2 replikuje się w węzłach limfatycznych, płucach i wątrobie podczas naturalnej infekcji, i jednym z głównych patogennych skutków jest zaburzenie funkcjonowania układu immunologicznego przez rozpad struktur limfoidalnych (S. Krakowka i wsp., 2001, op. cit.; G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; S. Kennedy i wsp., 2000, op. cit.; G. J. Wellenberg i wsp., 2000, op. cit.; G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovims and porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); J. Ellis i wsp., Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets J. Vet. Diagn. Invest. 11: 3-14 (1999); J. C. Harding and E. G. Clark, 1997, op. cit.). Przez użycie niniejszego nowego zakaźnego molekularnego klonu DNA PCV2, choroba kliniczna, uszkodzenia patologiczne i rozmieszczenie wirusa wyłącznie związane z infekcją PCV2 zostają bardziej dokładnie scharakteryzowane. Strukturalne i funkcjonalne związki genów PCV są lepiej zrozumiałe dzięki dostępności zakaźnych klonów DNA PCV2, PCV1, chimerowego PCV1-2 i odwróconego chimerowego PCV2-1 opisanych niniejszym. Will i wsp., Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees Nature 299: (1982), jako pierwsi wykazali możliwość użycia sklonowanego DNA wirusa zapalenia wątroby typu B do zakażania szympansów przez bezpośrednie wstrzyknięcie in vivo. To podejście od tej pory było używane do badania replikacji wirusowej i patogenezy szeregu innych wirusów (T. W. Dubensky i wsp., Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of mice Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: (1984); R. Girones i wsp., Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis vims that is infectious in the natural host Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: (1989); N. L. Letvin i wsp., Risks of handling HIV Nature 349: 573 (1991); C. Seeger i wsp., The cloned genome of ground squirrel hepatitis vims is infectious in the animal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: (1984); E. E. Sparger i wsp., Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone Virology 238: (1997); R. Sprengel i wsp., Homologous recombination between hepadnaviral genomes following in vivo DNA transfection: implications for studies of viral infectivity Virology 159: (1987); H. Will i wsp., 1982, op. cit.; L. Willems i wsp., In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep Virology 189: (1992)). Skonstruowanie zakaźnego molekularnego klonu DNA PCV2 i wykazanie infekcji przez bezpośrednie wstrzyknięcie sklonowanego plazmidowego DNA PCV2 do wątroby i węzłów limfatycznych świń są korzystne dla badań nad PCV2. Ten system transfekcji in vivo rozwinie badania nad strukturalnym i funkcjonalnym związkiem genów PCV2 z użyciem rekombinowanych plazmidów skonstruowanych in vitro w celu badania ról różnych regionów lub genów PCV2 w replikacji wirusa i patogenezy w gospodarzu. Replikacja i patogeneza PCV2 może być badana in vivo bez konieczności wytwarzania zakaźnego preparatu wirusa przez namnażanie PCV2 w hodowlach komórkowych. Jest to korzystne, ponieważ kolejne pasaże w hodowlach komórkowych mogą doprowadzić do selekcji warian-

18 18 PL B1 tów wirusowych. Inną korzyścią z używania sklonowanego genomowego DNA PCV2, zamiast żywego wirusa, w badaniach na zwierzętach jest jego względna łatwość zmierzenia dawki do inokulacji. Ilość sklonowanego DNA PCV2 używanego do inokulacji zwierząt może być łatwo określona w spektrofotometrze, podczas gdy dawka żywego wirusa PCV2 wymaga pomiaru zakaźności w hodowlach komórkowych i potwierdzenia zakaźności przez IFA. Bezpośrednie wstrzykniecie zwierzętom sklonowanego plazmidowego DNA PCV2 eliminuje problemy związane z obecnością innych właściwych świni czynników w preparatach homogenatów tkankowych do inokulacji do badań na zwierzętach. Zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku gen ORF2 immunogennego białka płaszcza jest wymieniony pomiędzy patogennym PCV2 a niepatogennym PCV1, co stwarza wyjątkową strukturę chimerowego zakaźnego klonu DNA PCV1-2. Nieoczekiwanie i korzystnie, chimerowy replikowany zakaźny klon PCV1-2, wyrażał immunogenny antygen białka płaszcza ORF 2 in vitro i in vivo oraz wywoływał specyficzną odpowiedź humoralną przeciwko ORF2 PCV2, lecz zachowywał niepatogenny charakter PCV1. Chimerowy zakaźny klon DNA PCV1-2 ma zdolność wywoływania silnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko PCV2, podczas gdy wywołuje tylko ograniczoną infekcję z łagodnymi patologicznymi uszkodzeniami podobnymi do tych niepatogennego PCV1. W celu wytwarzania szczepionki, względnie łatwe przechowywanie i stabilność sklonowanego DNA oraz opłacalność produkcji na dużą skalę rekombinowanego plazmidowego DNA PCV2 i chimerowego klonu DNA PCV1-2 dostarcza atrakcyjnych środków dostarczania żywej, zakaźnej szczepionki DNA wirusowego lub genetycznie zmodyfikowanych, atenuowanych szczepionek wirusowych dla świń. Zatem, chimerowy zakaźny klon DNA PCV1-2 jest użytecznym kandydatem na szczepionkę przeciwko infekcji PCV2 i PMWS. Powinno być docenione, że wszystkie naukowe i technologiczne określenia używane niniejszym mają takie same znacznie jak powszechnie rozumiane przez osoby o przeciętnej biegłości w dziedzinie. Dla celów niniejszego wynalazku, określenie zakaźny oznacza, że wirus replikuje się w świniach, niezależnie od tego, czy wirus powoduje lub nie jakieś choroby. SPF odnosi się do świń wolnych od swoistego patogenu (ang. specific-pathogen-free). Świnie gnotobiotyczne w zamierzeniu oznaczają świnie wolne od drobnoustrojów. Określenia plazmidowe DNA PCV2, genomowe DNA PCV2 i molekularne DNA PCV2 są używane wymiennie w odniesieniu do tej samej sklonowanej sekwencji nukleotydowej. Zakaźny chimerowy klon DNA PCV1/PCV2 (opis szczepu chimera PCV1-2 ), zakaźny molekularny klon DNA PCV2 (opis szczepu klon PCV2 ) oraz biologicznie czysty i jednorodny preparat PCV2 otrzymany z próbki PCV2 ze stanu Iowa, która została pobrana od świni z ciężkim PMWS i opisany jako izolat numer (opis szczepu PCV2 #40895 ) są zdeponowane pod warunkami określonymi przez C.F.R i przechowyane zgodnie z Umową Budapeszteńską w American Type Culture Collection (ATCC), University Boulevard, Manassas, Virginia , Stany Zjednoczone. Sekwencje DNA opisane niniejszym są zawarte w obrębie 6,490 bp plazmidów sklonowanie w wektorze pbluescript SK(+)(pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) i wprowadzone do komórek kompetentnych Escherichia coli DH5a. Plazmidy zawierające zakaźny chimerowy klon DNA PCV1-2 (określane jako zakaźny chimerowy klon DNA cirkowirusa świni typu 1 (PCV1) i typu 2 (PCV2) ) i zakaźny molekularny klon DNA PCV2 (określany jako zakaźny klon DNA cirkowirusa świni typu 2 (PCV2) ) zostały zdeponowane w ATCC 7 grudnia 2001 r. i oznakowane numerem depozytu dokonanego w celach patentowych ATCC PTA-3912 i PTA-3913, odpowiednio. Powinno być uwzględniane, że inne plazmidy, które mogą łatwo zostać skonstruowane z użyciem ukierunkowanej mutagenezy i technik opisanych niniejszym, są również zawarte w obrębie niniejszego wynalazku. Biologicznie czysty i jednorodny preparat PCV2 izolatu numer (określony jako Cirkowirus świni Typu 2 (PCV2) ) został również zdeponowany w ATCC 7 gmdnia 2001 r. i oznakowany numerem depozytu dokonanego w celach patentowych ATCC PTA Genomowa (nukleotydowa) sekwencja izolatu PCV2 o numerze została zgłoszona do bazy danych Genbank i stała się dostępna publicznie od 23 lipca 2000 r. pod numerem dostępu AF Następujące przykłady pokazują pewne aspekty niniejszego wynalazku. Jednakże, powinno być zrozumiałe, że przykłady te służą tylko w celu zobrazowania i nie mają na celu bycia zupełnie wyczerpującymi co do warunków i zakresu niniejszego wynalazku. Powinno być uwzględnione, że kiedy typowe warunki reakcji (np., temperatura, czasy reakcji, itp.) zostały podane, warunki zarówno powyżej, jak i poniżej poszczególnych zakresów mogą być również stosowane, chociaż na ogół mniej dogodnie. Przykłady są przeprowadzane w temperaturze pokojowej (około 23 C do około 28 C) i pod ci-

19 PL B1 19 śnieniem atmosferycznym. Wszystkie udziały i procenty, do których istnieje odniesienie, są określone wagowo i wszystkie temperatury są wyrażone w stopniach Celsjusza, chyba że określono inaczej. P r z y k ł a d 1 Wytwarzanie linii komórkowej PK-15 wolnej od zanieczyszczenia PCV1 Źródłem izolatu PCV2 była próbka z tkanki śledziony świni z naturalnie występującym PMWS (PCV2 o seryjnym numerze identyfikacynym 40895, określany jako izolat ) (M. Fenaux i wsp., 2000, op. cit.). Barwienie immunohistochemiczne (IHC) z przeciwciałem specyficznym wobec PCV2 potwierdziło obecność antygenu PCV2 w tkance. Tkanki śledziony były przechowywane w -80 C do chwili użycia. Linia komórek PK-15 nabyta z American Type Culture Collecion (numer dostępu ATCC CCL-33) była trwale zakażona PCV1 (G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, op. cit.). Ponieważ tylko część populacji komórek PK-15 była trwale zakażona (Jw.), linia komórek PK-15, która jest wolna od zanieczyszczenia PCV1 została wytworzona przez rozcieńczanie końcowe. Doświadczenie przebiegało jak następuje: komórki PK-15 były hodowane w MEM z solami Earle's i L-glutaminą (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) uzupełnionym 10% surowicą płodu bydlęcego (FBS) i IX antybiotykiem (Life Technologies, Inc.). Nagromadzone pojedyncze warstwy komórek były trawione trypsyną i następnie komórki były liczone i seryjnie rozcieńczane do punktu końcowego z jedną komórką na 0,2 ml. Rozcieńczenie punktu końcowego było umieszczane w płytkach 96-studzienkowych i pozostawiane do wzrostu do pojedynczej warstwy rozpoczynającej się od pojedynczej komórki. Komórki z każdej studzienki były badane na DNA PCV1 z użyciem oznaczenia PCR-RFLP zdolnego do wykrycia i rozróżnienia PCV1 i PCV2 (M. Fenaux i wsp., 2000, op. cit.). Komórki PK-15 ze studzienek, dla których oznaczenie PCR-RFLP było ujemne względem PCV1, były następnie hodowane w większej ilości. Linia komórkowa PK-15 wolna od PCV1 była hodowana przez pięć dodatkowych pasaży i stwierdzono, że jest ujemna względem DNA PCV1 w PCR przy każdym pasażu. Cztery linie komórkowe, które były ujemne względem zanieczyszczenia PCV1, zostały wytworzone przez rozcieńczenia końcowe trwale zakażonych komórek PK-15 z ATCC. Linie komórkowe pozostawały ujemne względem PCV1 w PCR po pięciu dodatkowych pasażach. Jedna z linii komórkowych była następnie hodowana w większej ilości i wykazano, że jest zdolna do umożliwienia replikacji PCV2, kiedy komórki zostały transfekowane klonem molekularnego DNA PCV2 (fig. 2) i infekowane wirusem PCV2. Sklonowane komórki były dalej wykorzystywane do transfekcji in vitro molekularnego klonu DNA PCV2 do wytworzenia biologicznie czystego preparatu zakaźnego wirusa PCV2 do doświadczenia z inokulacją zwierząt. P r z y k ł a d 2 Konstrukcja zakaźnego klonu DNA PCV2 Aby skonstruować molekularny klon DNA PCV2, para starterów PCR została zaprojektowana zgodnie z opublikowaną sekwencją izolatu PCV2 (M. Fenaux i wsp., 2000, op. cit.): górny starter F-PCVSAC2 (5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3'), ujawniony w Sekw. nr Id: 5 i dolny starter R-PCVSAC2 (5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'), ujawniony w Sekw. nr Id: 6. Ta para starterów amplifikuje całkowity genom PCV2 z nakładającym się regionem zawierającym unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego SacU (fig. 1). DNA był oczyszczany z użyciem zestawu QlAamp DNA Minikit (Qiagen, Inc., Valencia, CA) z próbki tkanki śledziony świni z naturalnie występującym PMWS (izolat 40895) (M. Fenaux i wsp., 2000, op. cit.). Oczyszczony DNA był poddawany amplifikacji w PCR z polimerazą AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). Reakcja PCR składała się w początkowej aktywacji enzymu w 95 C przez 9 min, następnie z 35 cykli denaturacji w 94 C przez 1 min, przyłączania w 48 C przez 1 min, wydłużania w 72 C przez 3 min i końcowego wydłużania w 72 C przez 7 min. Produkt PCR oczekiwanej wielkości był rozdzielany przez elektroforezę żelową i oczyszczany przez procedurę z odczynnikiem glassmilk zestawem Geneclean Kit (Bio 101, Inc., La Jolla, CA). Dla konstrukcji molekularnego klonu DNA zawierającego tandemowy dimer genomu PCV2, produkt PCR zawierający całkowity genom PCV2 był najpierw łączony z wektorem plazmidowym advantage (Clontech, Palo Alto, CA). Komórki kompetentne E. coli DH5a zostały stransformowane. Rekombinowane plazmidy zostały sprawdzone przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Pełnej długości genomowy DNA PCV2 był wycinany z wektora advantage przez trawienie enzymem restrykcyjnym SacU. Strawione genomowe DNA PCV2 było łączone ligazą T4 DNA w 37 C przez tylko 10 min, co sprzyja tworzeniu tandemowych dimerów. Tandemowe dimery były następnie klonowane do wektora pbluescript SK(+)(pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) (fig. 1). Rekombinowane plazmidy zawiera-

20 20 PL B1 jące tandemowe dimery genomu PCV2 (niniejszym określane jako molekularne klony DNA PCV2) były potwierdzane przez PCR, trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowanie DNA. Stężenie DNA rekombinowanych plazmidów było określane spektrofotometrycznie. Specyficznie, całkowity genom PCV2 (izolat 40895) był amplifikowany w PCR dla skonstmowania zakaźnego molekularnego klonu DNA PCV2. Dwie kopie całkowitego genomu PCV2 zostały połączone tandemowo w wektorze psk dla wytworzenia molekularnego klonu DNA PCV2 (fig. 1). Zakaźność molekularnego klonu DNA PCV2 został określona przez transfekcję in vitro komórek PK-15. IFA z przeciwciałem specyficznym wobec PCV2 potwierdziło, że molekularny klon DNA jest zakaźny in vitro i że około 10-15% komórek PK-15 zostało transfekowanych. Antygen specyficzny dla PCV2 został pokazany przez IFA w jądrze i, w mniejszym stopniu, cytoplazmie transfekowanych komórek (fig. 2). Komórki kontrolnie transfekowane pustym wektorem psk pozostały ujemne względem antygenu PCV2. P r z y k ł a d 3 Transfekcja in vitro molekularnym klonem DNA PCV2 i wytworzenie biologicznie czystego i jednorodnego preparatu zakaźnego wirusa PCV2 W celu zbadania zakaźności molekularnego klonu DNA in vitro, komórki PK-15 wolne od zanieczyszczenia PCV1 były hodowane w 8-studzienkowych płytkach komorowych LabTek. Kiedy komórki PK-15 osiągnęły około 85% nasycenia, komórki były transfekowane molekularnym klonem DNA z użyciem odczynników Lipofectamine Plus zgodnie z instmkcją dostarczoną przez producenta (Life Technologies, Inc). Tranfekowane kontrolnie pustym wektorem psk komórki zostały dołączone jako kontrole ujemne. Trzy dni po transfekcji komórki zostały utrwalone roztworem zawierającym 80% acetonu i 20% metanolu w 4 C przez 20 min. i oznaczenie immunofluorescencyjne z użyciem specyficznych wobec PCV2 przeciwciał poliklonalnych królika zostało przeprowadzone dla określenia zakaźności in vitro molekularnego klonu DNA (zob. poniżej). Aby wytworzyć biologicznie czysty i jednorodny preparat zakaźnego wirusa PCV2 do doświadczenia nad inokulacją zwierząt, komórki PK-15 wolne od zanieczyszczenia PCV1 były hodowane w butelkach hodowlanych T-25 i transfekowane molekularnym klonem DNA PCV2. Komórki PK-15 były hodowane do nasycenia 85% w butelkach T-25. Komórki były płukane jednokrotnie jałowym buforem PBS przed transfekcją. Do każdej reakcji transfekcji w butelce T-25, 12 pg plazmidowego DNA PCV2 było mieszane z 16 µl odczynnika Plus w 0,35 ml podłoża MEM. Butelka z komórkami transfekowanymi kontrolnie pustym wektorem psk została dołączona jako kontrola ujemna. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 min., 50 pi odczynnika Lipofectamine rozcieńczonego w 0,35 ml podłoża MEM zostało dodane do mieszaniny i inkubowane w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 15 min. Mieszanina transfekeyjna była następnie dodawana do butelki T-25 komórek PK-15 zawierającej 2,5 ml świeżego MEM. Po inkubacji w 37 C przez 3 godz., podłoże było zastępowane świeżym podłożem MEM zawierającym 2% FBS i 1 x antybiotyki. Transfekowane komórki były zbierane po 3 dniach od transfekcji i przechowywane w -80 C do wykorzystania. Zakaźne miano preparatu wirusowego było określane przez IFA (zob. poniżej). Zasadniczo, biologicznie czysty i jednorodny preparat zakaźnego wirusa PCV2 został wytworzony przez transfekcję komórek PK-15 molekularnym klonem PCV2. Wiriony PCV2 wytworzone przez transfekcję in vitro były zakaźne, ponieważ lizaty transfekowanych komórek były skutecznie używane do infekcji komórek PK-15. Zatem, molekularny klon DNA PCV2 jest zdolny do wytwarzania zakaźnych wirionów PCV2, gdy jest transfekowany in vitro. Zakaźne miano jednorodnego preparatu wirusa PCV2 przygotowanego z transfekowanych komórek zostało określone jako wynoszące 1 x 10 4,5 TCID50/ml. Ten preparat wirusowy był używany do inokulowania świń w grupie 2. Lizaty komórek transfekowanych kontrolnie pustym wektorem psk były niezdolne do zainfekowania komórek PK-15. P r z y k ł a d 4 Określenie miana wirusa w oznaczeniu immunofluorescencyinym (IFA) W celu określenia zakaźnego miana jednorodnego preparatu wirusa PCV2, komórki PK-15 były hodowane w 8-studzienkowychh płytkach komorowych LabTek. Preparat wirusowy był seryjnie rozcieńczany 10-krotnie w MEM i każde rozcieńczenie było inokulowane do 10 studzienek pojedynczych warstw komórek PK-15 rosnących w płytkach komorowych LabTek. Studzienki z nie inokulowanymi komórkami zostały dołączone jako kontrole. Infekowane komórki zostały utrwalone w 3 dni po inokulacji roztworem zawierającym 80% acetonu i 20% metanolu w 4 C przez 20 min. Po przepłukaniu komórek buforem PBS, infekowane komórki były inkubowane z rozcieńczonym 1:1000 przeciwciałem poliklonalnym królika specyficznym wobec PCV2 (S. D. Sorden i wsp., Deve-

21 PL B1 21 lopment of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue J. Vet. Diagn. Invest. 11: (1999)) w 37 C przez 1 godz. Komórki były następnie płukane trzykrotnie buforem PBS i inkubowane z drugorzędowym IgG kozim wyznakowanym FITC przeciwko królikowi (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) w 37 C przez 45 min. Po przepłukaniu płytek trzykrotnie buforem PBS płytki zostały pokryte odczynnikiem fluoromount-g, przykryte i obejrzane w mikroskopie fluorescencyjnym. Została wyliczona 50% dawka zakażająca dla hodowli tkankowej na ml (TCID50/ml). Początkowo, komórki były transfekowane konstrukcją plazmidową zawierającą pojedynczą kopię genomu PCV2, ale miano zakaźne PCV2 dla konstrukcji z pojedynczym genomem jest znacznie niższe niż takiej zawierającej tandem genomu. Zatem, konstrukcja plazmidowa zawierająca postać dimerową genomu PCV2 była wykorzystywana do doświadczeń nad transfekcja in vitro i in vivo. P r z y k ł a d 5 Transfekcja in vivo świń molekularnym klonem DNA PCV2 i inokulacja doświadczalna świń homogennym preparatem zakaźnego wirusa PCV2 Czterdzieści specyficznie wolnych od patogenu świń (SPF) w wieku 4 tygodni zostało losowo skierowanych do 4 pomieszczeń po 10 zwierząt w każdym. Przed inokulacją, świnie SPF zostały zbadane na przeciwciała dla PCV, PRRSV, PPV i świńskiego wirusa zapalenia wątroby typu E. Świnie w grupie 1 nie zostały inokulowane i służyły jako kontrole ujemne. Wszystkie świnie w grupie 2 zostały inokulowane donosowo około 1,9 x 10 TCID50 preparatu zakaźnego wirusa PCV2 otrzymanego z molekularnego klonu DNA PCV2. Świnie w grupie 3 otrzymały bezpośrednie wstrzyknięcie wewnątrz-wątrobowe rekombinowanego plazmidowego DNA molekularnego klonu PCV2. Każdej świni wstrzyknięto łącznie po 200 pg rekombinowanego plazmidowego DNA (sklonowanego plazmidowego DNA PCV2), poprzez technikę wspomaganą ultrasonografią, do 6 różnych miejsc w wątrobie. Wszystkim świniom w grupie 4 wstrzyknięto całkowicie po 200 pg rekombinowanego plazmidowego DNA bezpośrednio do płytko położonych biodrowych węzłów limfatycznych i każdy węzeł limfatyczny otrzymał dwa oddzielne wstrzyknięcia. Zwierzęta kontrolowano codziennie na kliniczne objawy choroby. Próbki surowicy były pobierane od każdego zwierzęcia w 0, 7, 14, 21, 28, 35 dni po inokulacji (DPI). W 21 DPI, pięć świń zostało losowo wybranych z każdej grupy i poddanych sekcji. Pozostających pięć zwierząt w każdej grupie zostało poddanych sekcji w 35 DPI. Różne tkanki i organy zostały pobrane podczas sekcji i przygotowane do badania histologicznego i barwienia immunohistochemicznego (zob. poniżej). Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 1. Wszystkie inokulowane świnie z grup 2, 3 i 4 były ujemne wobec przeciwciał dla PCV2 w 0 DPI. Dwie świnie w nieinokulowanej grupie kontrolnej 1 posiadały wykrywalne przeciwciało matczyne dla PCV2 w 0 DPI. Przeciwciało matczyne u tych dwóch prosiąt zanikło do 7 DPI. Nie wykryto konwersji serologicznej do przeciwciała dla PCV2 u żadnej z 10 nie inokulowanych świń kontrolnych. W grupie 2 świń inokulowanych donosowo zakaźnym wirusem PCV2, 1 prosię uległo konwersji serologicznej do przeciwciała dla PCV2 w 21 DPI. Do 35 DPI, 4 z pozostałych 5 świń grupy 2 uległy konwersji serologicznej. Konwersja serologiczna u transfekowanych zwierząt z grup 3 i 4 po raz pierwszy wystąpiła w 28 DPI. Do 35 DPI, 5 z 5 pozostałych świń z grupy 3 oraz 3 z 5 pozostałych świń z grupy 4 uległo konwersji serologicznej do przeciwciała dla PCV2. Przeciwciała dla PPV były oznaczane w 3 i 21 DPI u wszystkich świń i w 35 DPI u pozostałych świń. Przeciwciała matczyne dla powszechnego u świń zarazka PPV były wykrywane u prosiąt SPF. Miana przeciwciał PPV HI u wszystkich prosiąt z wyjątkiem jednego zmniejszały się znacząco od 3 DPI (przeciętne miano 1:2665) do 21 DPI (przeciętne miano 1:246), wskazując, że przeciwciało wykrywane u tych prosiąt zostało otrzymane biernie. Jedno prosię miało nieco podwyższone miano HI PPV od 1:32 w 3 DPI do 1:64 w 21 DPI, co prawdopodobnie było spowodowane odchyleniem oznaczenia. Próbki surowicy pobrane od wszystkich świń w 0, 21 i 35 DPI były dalej badane na DNA PPV opublikowanym oznaczeniem PCR (J. M. Soucie i wsp., Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate Transfusion 40: (2000)). Nie wykryto wiremii PPV u żadnej ze świń któregokolwiek DPI, co dalej wskazuje, że świnie nie były zainfekowane PPV.

22 22 PL B1 T a b e l a 1 Konwersja serologiczna do przeciwciał specyficznych dla PCV2 i świń inokulowanych żywym wirusem PCV2 lub bezpośrednio wstrzykniętym sklonowanymplazmidowym DNA PCV2 Grupa Inokula Droga inokulacji Dni po inokulacji Żadne Żywy wirus PCV2 b DNA PCV2 c DNA PCV2 c Donosowa Dowątrobowa Dolimfatyczna /10 0/10 0/10 0/10 a Przeciwciało dla PCV2 zostało zmierzone ELISA, ilość dodatnich/ilość zbadanych b Biologicznie czysty i jednorodny preparat wirusa PCV2 został wytworzony przez transfekcję komórek PK-15 molekularnym klonem DNA PCV2 c Sklonowane genomowe DNA PCV2 w plazmidzie psk 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/5 1/5 1/5 1/5 0/5 4/5 5/5 3/5 P r z y k ł a d 6 Analizy typu PCR-RFLP Dla pomiaru wiremii PCV2 u świń transfekowanych molekularnym klonem DNA PCV2 i u świń infekowanych preparatem zakaźnego wirusa PCV2, próbki surowicy pobrane w różnych DPI były badane na obecność DNA PCV2 ogólnymi metodami oznaczenia PCR-RFLP opisanego poprzednio (M. Fenaux i wsp., 2000, op. cit.). DNA wirusowy był oczyszczany z 50 µl każdej próbki surowicy z użyciem odczynnika DNAzol według instrukcji dostarczonej przez producenta (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Oczyszczony DNA był rozpuszczany w wodzie wolnej od DNaz, RNaz i proteinaz oraz badany na DNA PCV2 przez PCR-RFLP (jw). Produkty PCR od wybranych zwierząt zostały zsekwencjonowane dla sprawdzenia pochodzenia wirusa infekującego świnie. Próbki surowicy zostały pobrane od wszystkich kontrolnych i inokulowanych zwierząt w 0, 7, 14, 21, 28 i 35 DPI i zbadane na wiremię PCV2 przez wykrywanie DNA PCV2 (jw). Wyniki są przedstawione poniżej w tabeli 2. DNA PCV2 nie został wykryty w grupie 1 nie inokulowanych zwierząt kontrolnych żadnego DPI. Wiremia została wykryta u 7/10 świń z grupy 2 w 14 DPI i u 8/10 do 35 DPI. Wiremia trwała tylko kilka tygodni, ponieważ DNA PCV2 było niewykrywalne w 28 DPI i 35 DPI u wszystkich 5 pozostałych świń z grupy 2. W grupie 3 świń, którym wewnątrzwątrobowo wstrzyknięto molekularny klon DNA PCV2 DNA, 8/10 świń miało wiremię w 14 DPI i 9/10 świń miało wykrywalną wiremię do 35 DPI. Świniom grupy 4 wstrzyknięto molekularny klon DNA PCV2 do węzłów limfatycznych. Dwie z 10 świń w 14 DPI i 8 z 10 świń w 21 DPI z grupy 4 miało wiremię. Wyniki pokazują, że molekularny klon DNA PCV2 jest zakaźny, gdy zostanie wstrzyknięty bezpośrednio do wątroby i płytko położonych biodrowych węzłów limfatycznych świń SPF. Produkty PCR amplifikowane u wybranych zwierząt zostały zsekwencjonowane. Sekwencja produktów PCR amplifikowanych z wybranych zwierząt była identyczna z odpowiadającym obszarem molekularnego klonu DNA PCV2. T a b e l a 2 Wykrywanie wiremii (DNA PCV2) przez PCR w surowicach inokulowanych i kontrolnych świń Inokula Droga inokulacji Dni po inokulacji suma Żadne 2/10 0/10 0/10 0/10 0/5 0/5 0/10 Żywy wirus PCV2 b Donosowa 0/10 0/10 7/10 5/10 0/5 0/5 8/10 DNA PCV2 c Dowątrobowa 0/10 0/10 8/10 6/10 3/5 3/5 9/10 DNA PCV2 c Dolimfatyczna 0/10 0/10 2/10 8/10 2/5 0/5 8/10 a 10 świń w każdej grupie, ilość dodatnich/ilość zbadanych b BioIogicznie czysty i jednorodny preparat wirusa PCV2 wytworzony przez transfekcję komórek PK-15 molekularnym klonem DNA PCV2 c Sklonowane genomowe DNA PCV2 w plazmidzie psk

23 PL B1 23 P r z y k ł a d 7 Ocena kliniczna Świnie zostały zważone w 0 DPI i w dniu sekcji. Temperatury w odbycie i kliniczne oceny choroby układu oddechowego, sięgające od 0 do 6 (0 = normalna, 6 = ciężka) (P. G. Halbur i wsp., Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome vims isolates with that of the Lelystad vims Vet. Pathol. 32: (1995)), były odnotowywane co drugiego dnia od 0 do 35 DPI. Obserwacje kliniczne obejmujące przejaw choroby centralnego układu nerwowego, choroby wątroby (żółtaczka), choroby mięśni i szkieletu oraz zmian w stanie ciała były również odnotowywane codziennie. Do oceny ogólnej patologii i histopatologii, pięć świń z każdej grupy zostało losowo wybranych do sekcji w 21 i 35 DPI. Grupa prowadząca sekcję nie była informowana o statusie zainfekowania świń podczas sekcji. Całkowite sekcje zostały przeprowadzone dla wszystkich świń. Przybliżony odsetek płuca z silnie widocznym zapaleniem został odnotowany dla każdej świni w oparciu o poprzednio opisany system oceny (jw.). System oceny jest oparty na przybliżonej objętości, jaką każdy płat płuca stanowi w całym płucu: prawy górny płat, prawy środkowy płat, górna część lewego górnego płatu i dolna część lewego górnego płatu każda stanowi 10% całkowitej objętości płuc, środkowy płat stanowi 5% i dolne płaty prawy i lewy każdy stanowi 27,5%. Inne uszkodzenia, takie jak powiększenie węzłów limfatycznych zostały odnotowane oddzielnie. Wycinki do badania histopatologicznego zostały pobrane z małżowiny nosowej, płuc (siedem wycinków) (jw), serca, mózgu, węzłów limfatycznych (oskrzelowych, biodrowych, krezkowych, podjęzykowych), migdałka, grasicy, wątroby, woreczka żółciowego, śledziony, stawów, jelita krętego, okrężnicy, trzustki i nerki. Tkanki zostały zbadane bez informowania o statusie zwierząt i ocenione subiektywnie pod względem ciężkości uszkodzeń płuc, węzłów limfatycznych i wątroby. Oceny płuc wahały się od 0 (normalne) do 3 (ciężkie limfohistiocytarne śródmiąższowe zapalenie płuc). Oceny wątroby wahały się od 0 (normalne) do 3 (ciężkie limfohistiocytarne zapalenie wątroby). Oceny węzłów limfatycznych opierały się na ocenie ilości ubytku pęcherzyków obejmując od 0 (normalne lub brak ubytku pęcherzyków) do 3 (silne ubytki limfatyczne i histiocytarne zastąpienie pęcherzyków). Badanie serologiczne obejmowało pobieranie krwi po przybyciu w wieku 11 do 12 dni oraz od wszystkich świń w 0, 7, 14, 21, 28 i 35 DPI. Przeciwciała surowicy przeciwko PRRSV były oznaczane z użyciem ELISA Herd Check PRRSV (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Przeciwciała surowicy przeciwko PPV były wykrywane w oznaczeniu zahamowania hemaglutynacji (HI) (H. S. Joo i wsp., A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody Aust. Vet. J. 52: (1976)). Przeciwciała surowicy przeciwko PCV2 były wykrywane przez zmodyfikowane pośrednie ELISA oparte o rekombinowane białko ORF2 PCV2 (P. Nawagitgul i wsp., Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1: (2002)). Częściowo oczyszczony antygen PCV2 antygen został przygotowany z komórek Hi Five (Invitrogen, Carlsbad, CA) infekowanych rekombinowanym bakulowirusem zawierającym ORF2 głównego białka płaszcza PCV2 (P. Nawagitgul i wsp., Open reading frame 2 of porcine circovims type 2 encodes a major capsid protein J. Gen. Virol. 81: (2000)). Lizaty komórkowe komórek Hi Five infekowanych bakulowirusem typu dzikiego zostały przygotowane podobnie i służyły jako antygen kontroli ujemnej. Polistyrenowe płytki mikrotitracyjne Immulon 2 HB (Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA) zostały opłaszczone optymalnymi stężeniami antygenów dodatnich i ujemnych w 4 C przez 36 godz. Sto pi każdej próbki surowicy rozcieńczonej 1:100 w 5% rozcieńczalniku z mlekiem (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) zostało dodane do każdej studzienki. Próbki surowicy były badane w czterech powtórzeniach: 2 studzienki dla antygenu kontroli ujemnej i 2 równoległe studzienki dla antygenu PCV2. Surowice kontroli dodatniej i ujemnej były uwzględnione na każdej płytce. Surowice inkubowano w 37 C przez 30 min., a następnie płukano 5 razy buforem 0,1 M PBS zawierającym 0,1% Tween-20. Drugorzędowe IgG przeciwko świni wyznakowane peroksydazą (Sig-

24 24 PL B1 ma Co, St. Louis, MO) było inkubowane w 37 C przez 30 min. Płytki były ponownie płukane i inkubowane z 6-siarczanem 2,2'-azyno-di-(3-etylobenzytiazolinu) (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc) w 37 C przez 15 min. dla wywołania koloru. Gęstość optyczna (OD) była odczytywana przy 405 nm. Skorygowana OD każdej badanej i kontrolnej surowicy była wyliczana przez odjęcie średniej wartości OD studzienek zawierających antygen ujemny od tych zawierających antygen PCV2. Dane zostały znormalizowane przez podzielenie skorygowanej wartości OD badanej próbki surowicy (S) przez tę surowicy kontroli dodatniej (P) i przedstawione jako proporcje S/P. Próbki z proporcjami S/P < 0,12, 0,12 do 0,2 i > 0,2 były odpowiednio uważane za ujemne, równoważne i dodatnie. Na podstawie ocen klinicznych, żadna z kontrolnych ani inokulowanych świń nie wykazywała wyraźnych objawów choroby przypominającej objawy klinicznego PMWS. Brak było różnic w przybieraniu na wadze lub średnich temperaturach w odbycie pomiędzy którąkolwiek z czterech grup. Świnie kontrolne z grupy 1 pozostawały normalne przez cały eksperyment. Wystąpiła łagodna przejściowa choroba układu oddechowego zaobserwowana u większości świń w grupach transfekowanej DNA PCV2 oraz infekowanej wirusem PCV2 od 8 do 14 DPI. Oznaczała się ona słabym spłyceniem oddechu (kliniczne oceny układu oddechowego od 1 do 2), co trwało jeden do dwóch dni u pojedynczych świń i 5-6 dni dla grupy. Nie zaobserwowano ogólnych uszkodzeń u kontrolnych świń podczas sekcji. Świnie w trzech inokulowanych grupach miały ogólne uszkodzenia ograniczone do płuc i węzłów limfatycznych (zob. tabela 3, poniżej). Uszkodzenia były podobne wśród świń w grupach transfekowanej plazmidowym DNA PCV2 oraz infekowanej wirusem PCV2. Płuca nie zapadały się i posiadały losowo rozmieszczone, wieloogniskowe, dość dobrze wydzielone obszary jasnobrązowo-fioletowej konsolidacji obejmującej 0-2% płuca (fig. 3) w 21 DPI i 0-13% płuca 35 DPI. Węzły limfatyczne były regularnie powiększone 2 do 5 razy normalnej wielkości, twarde i jasnobrązowe (fig. 3) w zarówno 21, jak i 35 DPI u większości świń ze wszystkich trzech grup inokulowanych PCV2. Badanie mikroskopowe nie ujawniło żadnych uszkodzeń w żadnych tkankach kontrolnych świń z wyjątkiem wątrób. Osiem z dziesięciu kontrolnych świń miało bardzo łagodne wieloogniskowe limfoplazmatyczne zapalenie, głównie w regionach okołowrotnych w wątrobie, jak powszechnie obserwuje się u normalnych świń i uważa za zwyczajne tło (P. G. Halbur i wsp., 2001, op. cit.). Świnie z dwóch grup transfekowanych plazmidowym DNA PCV2 (wewnątrzwątrobowo i do węzłów limfatycznych) i z grupy infekowanej wirusem PCV2 (donosowo) miały podobne uszkodzenia w mózgu, płucu, sercu, nerce, tkankach limfatycznych (migdałki, węzły limfatyczne, śledziona), jelicie krętym i wątrobie (zob. tabela 4, poniżej). Uszkodzenia mózgu obserwowano u 23/30 świń z trzech inokulowanych grup i przejawiały się one łagodnym do umiarkowanego wieloogniskowym limfoplazmatycznym zapaleniem mózgowooponowym ze zwężeniem naczyń obwodowych i glejozą. Uszkodzenia płuc obserwowano u 28/30 świń inokulowanych PCV2 przejawiały się one łagodnym do umiarkowanego wokół-oskrzelowym limfoplazmatycznym i histiocytarnym ostrzelowo-śródmiąższowym zapaleniem płuc (fig. 3C). Jedna ze świń z grup 2 infekowanej wirusem PCV2 poddana sekcji w 21 DPI i po jednej ze świń z obu grup transfekowanych plazmidowym DNA PCV2 poddanych sekcji w 35 DPI miały wrzodziejące i rozrostowe zapalenie oskrzelików ze zwłóknieniowym i ziarniniakowatym zapaleniem w blaszce właściwej i regionach otaczających oskrzela. Łagodne wieloogniskowe zapalenie mięśnia sercowego było również obserwowane u 18/30 świń inokulowanych PCV2. U 14/30 świń inokulowanych PCV2 było obserwowane łagodne do umiarkowanego wieloogniskowe limfoplazmatyczne śródmiąższowe zapalenie nerek. Nie obserwowano uszkodzeń w grasicach. Łagodne do umiarkowanych ubytki limfatyczne (fig. 4B) i histiocytarne zastępowanie pęcherzyków było obserwowane w migdałkach u 8/30, w śledzionie u 7/30 i węzłach limfatycznych u 26/30 świń inokulowanych PCV2. Umiarkowane ziarniniakowate zapalenie węzłów chłonnych z komórkami olbrzymimi (fig. 4C) było obserwowane w 21 DPI u trzech świń inokulowanych donosowo wirusem PCV2 oraz u jednej świni w 35 DPI w każdej z grup transfekowanych plazmidowym DNA PCV2.

25 PL B1 25 Łagodne limfoplazmatyczne i histiocytarne zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy było obserwowane u 3/5 świń w grupie infekowanej wirusem PCV2, u 3/5 świń w grupie transfekowanej wewnątrzwątrobowo-plazmidowym DNA PCV2 i u 1/5 świń w grupie transfekowanej do węzłów limfatycznych plazmidowym DNA PCV2 w 35 DPI. Po jednej ze świń w każdej z grup transfekowanych plazmidowym DNA PCV2 miała łagodne ubytki limfatyczne z zastępowaniem histiocytarnym i małą ilość komórek olbrzymich w kępkach Peyera. Łagodne do umiarkowanego limfoplazmatyczne zapalenie wątroby było obserwowane u 29/30 z trzech grup świń inokulowanych PCV2. Małe ilości szeroko rozproszonych pojedynczych nekrotycznych hepatocytów otoczonych przez zapalenie limfohistiocytarne były obserwowane u pojedynczych świń z każdej z grup transfekowanych plazmidowym DNA PCV2 w 21 DPI. Uszkodzenia w pozostałych tkankach były nieznaczące. Mikroskopowe uszkodzenia w płucu, wątrobie i węzłach limfatycznych były oceniane według opublikowanych systemów oceny (tabela 4, poniżej) (P. G. Halbur i wsp., 2001, op. cit.; P. G. Halbur i wsp., 1995, op. cit.). Brak jest przyjętych systemów oceny dla innych tkanek i organów. Przeciętne oceny uszkodzeń w płucu i węzłach limfatycznych u świń z trzech grup inokulowanych PCV2 były statystycznie różne od tych u kontrolnych świń z grupy 1. Przeciętne oceny uszkodzeń w wątrobie u świń z trzech grup inokulowanych PCV2 nie są statystycznie różne od tych u kontrolnych świń. T a b e l a 3 Ogólne uszkodzenia płuca i węzłów limfatycznych w świniach kontrolnych i inokulowanych PCV2 Grupa Inokula Droga inokulacji 21 DPI 35 DPI Węzły limfatyczne Płuco Węzły limfatyczne Płuco 1 Żadne 0/5 a 0/5 0/5 0/5 2 Żywy wirus PCV2 b Donosowa 5/5 1/5 (0-1) c 5/5 4/5 (0-5) 3 DNA PCV2 d Dowątrobowa 2/5 2/5 (0-2) 5/5 2/5 (0-13) 4 DNA PCV2 d Dolimfatyczna 4/5 5/5 (0-1) 3/5 1/5 (0-9) a Pięć świń z każdej grupy zostało poddanych sekcji w 21 DPI i pozostałych 5 świń zostało poddanych sekcji w 35 DPI. Ilość dodatnich/ilość zbadanych b Biologicznie czysty i jednorodny preparat wirusa PCV2 wytworzony przez transfekcję komórek PK-15 molekularnym klonem DNA PCV2 c Ilość z uszkodzeniami/ilość zbadanych (zakres przybliżonego odsetka płuca dotkniętego ogólnie widocznymi uszkodzeniami zapalenia płuc, 0-100%) d Sklonowane genomowe DNA PCV2 w plazmidzie psk

26 26 PL B1

27 PL B1 27 P r z y k ł a d 8 Immunohistochemia Immunohistochemiczne (IHC) wykrywanie antygenu specyficznego dla PCV2 przeprowadzano we wszystkich tkankach pobranych podczas sekcji w 21 i 35 DPI. Poliklonalna surowica królika specyficzna dla PCV2 była wykorzystywana w IHC i ogólne procedury zostały uprzednio opisane (S. D. Sorden i wsp., 1999, op. cit.). Dla wykrywania i dystrybucji tkankowej antygenu PCV2, barwienie IHC antygenu PCV2 zostało przeprowadzone w mózgu, płucach, małżowinie nosowej, sercu, nerkach, migdałku, węzłach limfatycznych, śledzionie, grasicy, jelicie krętym, wątrobie, woreczku żółciowym i trzustce wszystkich świń poddanych sekcji w 21 i 35 DPI. Wszystkie tkanki ze świń kontrolnych były ujemne wobec antygenu PCV2. Dystrybucja tkankowa antygenu PCV2 w trzech grupach inokulowanych PCV2 była podobna (zob. tabela 5, poniżej). W mózgu antygen PCV2 antygen był znajdywany przede wszystkim w komórkach jednojądrzastych, komórkach zbliżonych do fibroblastów i komórkach śródbłonka w oponach mózgowych i splocie naczyniowym oraz rzadziej w komórkach śródbłonka i obwodowych komórkach jednojądrzastych w mózgu i w móżdżku. W płucach antygen PCV2 był wykrywany wewnątrz makrofagów pęcherzykowych i przegród międzypęcherzykowych oraz komórkach zbliżonych do fibroblastów w blaszce właściwej dróg oddechowych (fig. 3D). W sercu antygen PCV2 był wykrywany w szeroko rozproszonych makrofagach i komórkach śródbłonka. W nerkach antygen PCV2 był wykrywany wewnątrz walcowatych komórek nabłonkowych i komórek jednojądrzastych w miąższu. W tkankach limfatycznych (węzły limfatyczne, śledziona, migdałek i kępki Peyera) antygen PCV2 był wykrywany głównie wewnątrz makrofagów i komórek podobnych do dendrytycznych oraz komórkach olbrzymich w pęcherzykach (fig. 4D). Antygen PCV2 był wykrywany również wewnątrz makrofagów w blaszce właściwej jelita cienkiego. W wątrobie antygen PCV2 był wykrywany wewnątrz komórek jednojądrzastych i komórek Kupffera. Antygen PCV2 nie był wykrywany w małżowinie nosowej, grasicy lub woreczku żółciowym.

28 28 PL B1

29 PL B1 29 P r z y k ł a d 9 Konstrukcja niepatogennego zakaźnego klonu DNA PCV1 Sposób wykorzystany dla skonstmowania infekcycjnego klonu DNA PCV1 jest zasadniczo taki sam, jak ten opisany niniejszym dla PCV2. Para starterów PCR, KPNPCV1.U ujawniony w Sekw. nr Id: 7 i KPNPCV1.L ujawniony w Sekw. nr Id: 8 (zob. tabela 6, poniżej), została zaprojektowana w oparciu o opublikowaną sekwencję PCV1. Ta para starterów amplifikuje całkowity genom PCV1 razem z nakładającym się obszarem zawierającym unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego Kpnl. DNA wirusa PCV1 został oczyszczony z zakażonej linii komórkowej ATCC PK-15, która została uzyskana od Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (numer dostępowy ATCC CCL-33). DNA PCV1 został oczyszczony z komórek ATCC PK-15 trwale zakażonych PCV1 z wykorzystaniem zestawu QIAmp DNA minikit (Qiagen, Inc.,Valencia, CA.). Oczyszczony DNA był namażany w PCR przez AmpliTaq Gold Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). Cykle PCR składały się z początkowego etapu w 95 C przez 10 min., następnie z 35 cykli denaturacji w 94 C przez 1 min., przyłączania w 48 C przez 1 min., wydłużania w 72 C przez 2 min. oraz końcowego wydłużania w 72 C przez 7 min. Produkt PCR o oczekiwanej wielkości był rozdzielany przez elektroforezę żelową i oczyszczany w procedurze z odczynnikiem glassmilk z wykorzystaniem zestawu Geneclean Kit (Bio 101, Inc., La Jolla, CA). Oczyszczony produkt PCR zawierający całkowity genom PCV1 był najpierw łączony z wektorem plazmidowym advantage (Clontech, Palo Alto, CA). Komórki kompetentne Escherichia coli DH5a były wykorzystywane da transformacji. Rekombinowane plazmidy były sprawdzane przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Pełnej długości genomowe DNA PCV1 było wycinane z wektora advantage przez trawienie enzymem restrykcyjnym Kpnl. Pełnej długości genomowe DNA PCV1 było łączone z wektorem pbluescript SK(+)(pSK) (Stratagene, La Jolla, CA) przez ligazę DNA T4 w 37 C przez noc. Rekombinowane plazmidy zawierające pełnej długości genom PCV1 były izolowane zestawem Qiagen plazmid mini kit (Qiagen, Valencia, CA) i były sprawdzane przez trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowanie DNA. Pełnej długości genomowe DNA PCV1 było wycinane z wektora psk przez trawienie Kpnl i poddawane dimeryzacji dla wytworzenia zakaźnego klonu DNA PCV1 jak opisano powyżej w przykładzie 2 dla zakaźnego klonu PCV2. Te tandemowe dimery zostały wytworzone, ponieważ, jak stwierdzono, dimerowe tandemowe klony DNA są korzystnie bardziej wydajne do transfekowania komórek i wytwarzania zakaźnych wirionów. Dla wytworzenia tandemowego dimem DNA PCV1, strawione genomowe DNA PCV1 było łączone ligazą DNA T4 w 37 C przez tylko 10 min., co ułatwia tworzenie tandemowych dimerów. Tandemowe dimery były następnie klonowane w wektorze pbluescript SK(+)(pSK) (Stratagene, La Jolla, CA). Rekombinowane plazmidy zawierające tandemowe dimery genomu PCV1 (niniejszym określane jako klon DNA PCV1 ) zostały potwierdzone w PCR, trawieniu enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowaniu DNA. Stężenie rekombinowanych plazmidów zostało określone spektrofotometrycznie.

30 30 PL B1

31 PL B1 31 P r z y k ł a d 10 Ocena zakaźności klonu DNA PCV1 po transfekcji do komórek PK-15 wolnych od zanieczyszczenia wirusem Zakaźność molekularnego klonu DNA PCV1 została określona przez transfekcję in vitro komórek PK-15. IFA z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla PCV1 (dar od Dr. Gordona Allana, Belfast, U.K.) potwierdziło, że molekularny klon DNA PCV1 jest zakaźny w komórkach PK-15. Antygen specyficzny dla PCV1 został uwidoczniony przez IFA w jądrze oraz, w mniejszym stopniu, w cytoplazmie transfekowanych komórek. Komórki transfekowane kontrolnie pustym wektorem psk pozostały ujemne wobec antygenu PCV 1. P r z y k ł a d 11 Konstrukcja chimerowego klonu wirusowego DNA PCV 1-2 Chimerowy wirus został skonstruowany pomiędzy niepatogennym PCV1 i PCV2 związanym z PMWS przez wykorzystanie zakaźnych klonów DNA PCV1 i PCV2. Dla skonstruowania chimerowego klonu PCV 1-2 DNA, gen ORF2 białka płaszcza niepatogennego PCV1 został usunięty z zakaźnego klonu DNA PCV1 i zastąpiony genem ORF2 immunogennego białka płaszcza patogennego PCV2 w tle genomowym PCV1 (zob. fig. 5 i 6). Zostały zaprojektowane dwie pary starterów PCR. Pierwsza para starterów dla ORF2 PCV2, Psi 1-5 ujawniony w Sekw. nr Id: 11 i Acl 1-6 ujawniony w Sekw. nr Id: 12, została zaprojektowana z mutacjami punktowymi na końcach 5' starterów dla stworzenia miejsc dla enzymów restrykyjnych Acll i Psil dla namnożenia genu ORF2 PCV2 i wprowadzenia otaczających miejsc enzymów restrykcyjnych Psil i Acll przez mutację punktową. Reakcja PCR dla namnożenia ORF2 PCV2 składała się z początkowego etapu w 95 C przez 9 min., następnie 38 cykli denaturacji w 95 C przez 1 min., przyłączania w 48 C przez 1 min., wydłużania w 72 C przez 1 min. i końcowego wydłużania w 72 C przez 7 min. Druga para starterów PCR, Hpa 1-2 ujawniony w Sekw. nr Id: 9 i Nar 1-3 ujawniony w Sekw. nr Id: 10, została zaprojektowana w celu namnożenia wektora psk+ i jego wstawki - genomu PCV1. Mutacje punktowe zostały wprowadzone na końcach 5' starterów PCR, aby utworzyć otaczające miejsca enzymów restrykcyjnych Narl i Hpal. Ta para starterów namnażała wektor psk+ i jego wstawkę - genomowy DNA PCV1 nie posiadający genu ORF2 białka płaszcza, czyli genom PCV1 po odjęciu ORF2 PCV1 (psk-pcvl AORF2) przez wykorzystanie zakaźnego klonu DNA jako matrycy w PCR. Reakcja PCR składała się z początkowego etapu w 95 C przez 9 min., następnie 38 cykli denaturacji w 95 C przez 1 min., przyłączania w 50 C przez 1 min., wydłużania w 72 C przez 3,5 min. i końcowego wydłużania w 72 C przez 7 min. Produkt PCR ORF2 PCV2 był trawiony Acll i Psil, aby usunąć wprowadzone mutacje punktowe. Produkt psk-pcv1 AORF2 (produkt PCR dla wektora psk - genomu PCV1 nie posiadający genu ORF2 PCV1) był trawiony Narl i Hpal, aby usunąć wprowadzone przez PCR mutacje punktowe. To ostatnie trawienie wytworzyło lepki koniec oraz tępy koniec komplementarne do produktów PCR ORF2 PCV2 trawionych enzymami restrykcyjnymi Acll Psil. Strawiony produkt ORF2 PCV2 i produkt psk-pcvl z delecją ORF2 były łączone ligazą DNA T4 dla utworzenia chimerowego klonu genomowego DNA PCV1-2, w którym gen ORF2 PCV1 jest zastąpiony genem ORF2 z PCV2. Kiedy dwa produkty PCR zostały strawione i ponownie połączone, wszystkie wprowadzone przez PCR mutacje punktowe używane dla ułatwienia klonowania, zostały usunięte w otrzymanym chimerowym klonie. Komórki kompetentne Escherichia coli DH5a zostały stransformowane. Rekombinowane plazmidy zawierające chimerowy klon DNA zostały wyizolowane i potwierdzone przez PCR, trawienie enzymem restrykcyjnym i częściowe sekwencjonowanie DNA. Pełnej długości chimerowy genom PCV1-2 został wycięty z wektora psk+ (plazmid rekombinowany) przez trawienie Kpnl. Chimerowy genom DNA został następnie poddany dimeryzacji przez krótką 10-minutową reakcję łączenia ligazą DNA T4, co ułatwia powstawanie liniowych dimerów dla wytworzenia chimerowego zakaźnego klonu DNA PCV 1-2 (fig. 6). Rekombinowane plazmidy zawierające dwie kopie chimerowego genomu wirusowego zostały potwierdzone przez PCR, trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowaniem DNA.

32 32 PL B1 P r z y k ł a d 12 Ocena zakaźności in vitro klonu DNA chimerowego PCV 1-2 Żywotność chimerowego klonu DNA PCV (niepatogenny PCV1 z genem immunogennego białka płaszcza PCV2) został sprawdzony w komórkach PK-15. Kiedy komórki PK-15 zostały transfekowane chimerowym wirusowym klonem DNA, antygen wirusowy specyficzny dla białka płaszcza ORF2 PCV2 został wykryty przez IFA w około 2 dni po transfekcji. Antygen białka płaszcza PCV1 nie został wykryty w transfekowanych komórkach. To doświadczenie wykazało, że chimerowy klon DNA jest zakaźny in vitro, replikuje się w komórkach PK-15 i wytwarza immunogenne białko płaszcza PCV2. P r z y k ł a d 13 Konstrukcja odpowiadającego klonu DNA chimerowego PCV2-1 Aby wytworzyć odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1, gen ORF2 białka płaszcza PCV2 jest zastąpiony przez swój odpowiednik z niepatogennego PCV1 w szkielecie genomowym patogennego PCV2 (fig. 6). Zostały zaprojektowane dwie pary starterów PCR: para Bgl-II-ORF2 ujawniony w Sekw. nr Id: 13 i SpH-I-ORF2 ujawniony w Sekw. nr Id: 14, namnaża gen ORF2 PCV1 i wprowadza otaczające miejsca enzymów restrykcyjnych Bglll i SpHl przez mutację punktową. Druga para starterów PCR, Bgl- -II-PCV2 ujawniony w Sekw. nr Id: 15 i SpH-I-PCV2 ujawniony w Sekw. nr Id: 16, namnażała wektor psk i genom PCV2 po odjęciu genu ORF2 (psk-pcv2 AORF2) przez użycie zakaźnego klonu DNA PCV2 jako matrycy w PCR, oraz wprowadzała otaczające miejsca enzymów restrykcyjnych Bglll i SpHl przez mutację punktową. Produkt psk-pcv2 AORF2 i produkt PCR PCV1 ORF2 zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Bglll i SpHl dla wytworzenia komplementarnych lepkich i tępych końców połączonych razem. Po transformacji do komórek E. coli, właściwe rekombinowane plazmidy były izolowane i potwierdzone przez trawienie enzymatyczne i częściowe sekwencjonowanie DNA. Pełnej długości odpowiadający chimerowy genom PCV2-1 został wycięty z rekombinowanego plazmidu przez trawienie Stfdl i poddany dimeryzacji, jak to opisano niniejszym dla wytworzenia odpowiadającego chimerowego zakaźnego klonu PCV2-1. P r z y k ł a d 14 Transfekcja in vitro komórek PK-15 klonami DNA PCV1, PCV2, PCV1-2 i PCV2-1 Zakaźność in vitro i in vivo klonu PCV2 została wykazana w powyższych przykładach 3-5. Dla sprawdzenia zakaźności PCV1 i dwóch chimerowych klonów in vitro, komórki PK-15 wolne od zanieczyszczenia PCV1 przygotowane według sposobu z przykładu 1 były hodowane w 8-studzienkowych płytkach komorowych LabTek (Nalge Nunc Int., Denmark). Kiedy komórki PK-15 osiągnęły 80% nasycenia, komórki zostały transfekowane odpowiednio klonami DNA PCV1, PCV2, PCV1-2 i PCV2-1, z użyciem odczynnika Lipofectamine Plus według wskazówek dostarczonych przez producenta (Life Technologies, Inc.). Komórki transfekowane ujemnie pustym wektorem psk zostały włączone jako kontrole. Trzy dni po transfekcji komórki zostały utrwalone roztworem zawierającym 80% acetonu i 20% metanolu w 4 C przez 20 min. Oznaki zakaźności i replikacji wirusa w komórkach transfekowanych klonami DNA PCV1 i PCV2-1 zostały potwierdzone przez pośrednie oznaczenie immunofluorescencyjne (IFA) z użyciem przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku płaszcza genu ORF2 PCV1, uprzejmie dostarczonego przez Dr. G. M. Allana (G. M. Allan i wsp., Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus Vet. Immunol. Immunopathol. 43: (1994)). Utrwalone komórki zostały przepłukane solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i inkubowane z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko PCV1 rozcieńczonym 1:20 w 37 C przez 1 godz. Komórki zostały następnie przepłukane trzy razy buforem PBS i inkubowane z kozią immunoglobuliną G przeciwko myszy wyznakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.) w 37 C przez 45 min. Po płukaniu trzy razy buforem PBS, płytki zostały pokryte odczynnikiem fluoromount-g, przykryte i zbadane w mikroskopie fluorescencyjnym. Zakaźność komórek transfekowanych klonami DNA PCV2 i chimerowym PCV1-2 została potwierdzona przez IFA z użyciem przeciwciała specyficznego wobec PCV2, jak uprzednio opisano w przykładzie 4.

33 PL B1 33 Zakaźność klonów DNA PCV1, chimerowego DNA PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1 została udowodniona przez transfekcję in vitro komórek PK-15. Dwie identyczne kopie całkowitego genomu PCV1 genome zostały połączone w tandemie w wektorze psk dla wytworzenia klonu DNA PCV1 (fig. 6). W chimerowym klonie DNA PCV1-2 gen ORF2 białka płaszcza PCV1 został zastąpiony przez swój odpowiednik z patogennego PCV2 w tle genomu niepatogennego PCV1. Odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1 miał gen ORF2 białka płaszcza PCV2 zastąpiony przez swój odpowiednik z niepatogennego PCV1 w tle genomu patogennego PCV2. Jeśli zakaźny in vitro, chimerowy klon DNA PCV1-2 będzie produkował antygen białka płaszcza ORF2 z PCV2 i odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1 będzie produkował antygen białka płaszcza ORF2 PCV1 w transfekowanych komórkach PK-15. Wyniki pokazały, że klony DNA PCV1, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1 wszystkie niespodziewanie okazały się zakaźne po trasnfekcji do komórek PK-15 i produkowały odpowiadające antygenowe białka wirusowego białka płaszcza, jak wykazano w IFA z użyciem przeciwciał specyficznych wobec PCV1 lub PCV2. IFA z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko ORF2 PCV1 i przeciwciał przeciwko PCV2 potwierdziło, że klony DNA PCV1 i DNA PCV1-2 były zakaźne. IFA z użyciem przeciwciała monoklonalnego specyficznego wobec ORF2 PCV1 wykazało, że chimerowy klon DNA PCV1-2 był również zakaźny. Około 10-20% transfekowanych komórek PK-15 było dodatnich dla antygenu białka płaszcza PCV1 i antygenu PCV2 i posiadało antygen ORF2 PCV1, w obrębie jądra transfekowanych komórek (fig. 7). P r z y k ł a d 15 Doświadczalna inokulacia świń klonami DNA PCV1, PCV2, chimerowym PCV 1-2 i odpowiadającym chimerowym PCV2-1 Aby ocenić immunogenność i patogenność chimerowych klonów DNA, czterdzieści specyficznie wolnych od patogenów (SPF) świń w wieku 4-6 tygodni zostało losowo przypisanych do pięciu pomieszczeń po 8 zwierząt w każdym. Przed inokulacją zwierzęta zostały sprawdzone na przeciwciała przeciwko PCV, PRRSV, PPV i wirusowi zapalenia wątroby typu E świń. Ponadto, próbki surowicy sprzed inokulacji zostały zbadane przez PCR na kwas nukleinowy PCV1 i PCV2 dla potwierdzenia, że świnie nie są naturalnie zainfekowane przez żaden z tych wirusów. Wszystkie klony DNA PCV1, PCV2, PCV1-2 i PCV2-1 były inokulowane przez bezpośrednie wstrzyknięcie sklonowanego plazmidowego DNA do podskórnych biodrowych węzłów limfatycznych świń. Świnie z grupy 1 otrzymały sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (bufor PBS) i służyły jako kontrola ujemna. Wszystkim świniom z grupy 2 wstrzyknięto do podskórnych biodrowych węzłów limfatycznych 200 μg zakaźnego klonu DNA PCV1. Wszystkim świniom z grupy 3 wstrzyknięto 200 μg zakaźnego klonu DNA PCV2. Wszystkie świnie z grupy 4 otrzymały wstrzyknięcia 200 μg zakaźnego chimerowego klonu DNA PCV1-2. Wszystkie świnie z grupy 5 otrzymały 200 μg zakaźnego chimerowego odpowiadającego klonu DNA PCV2-1. Wszystkie zwierzęta były codziennie obserwowane na kliniczne objawy choroby. Próbki surowicy były pobierane od każdego zwierzęcia w -2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 dni po inokulacji (DPI). W 21 DPI, cztery losowo wybrane zwierzęta z każdej grupy zostały poddane sekcji. Pozostałe cztery zwierzęta w każdej grupie zostały poddane sekcji w 49 DPI. Różne tkanki i organy zostały pobrane podczas sekcji, jak opisano poprzednio w przykładzie 7 i przygotowane do badania histologicznego. Immunogenność zakaźnych klonów DNA PCV1, PCV2 i chimerowych zakaźnych klonów została zbadana w świniach. Próbki surowicy pobrane od wszystkich kontrolnych i inokulowanych zwierząt w -2 (0), 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 DPI były zbadane na wiremię PCV1, PCV2, PCV1-2 i PCV2-1 przez wykrywanie w PCR sekwencji DNA specyficznych dla klonu, na przeciwciało przeciwko PCV1 przez IFA i na przeciwciało przeciwko ORF2 PCV2 przez ELISA. Stwierdzono, że przed inokulacją w -2 DPI, zwierzęta ze wszystkich pięciu grup były ujemne w PCR dla zarówno PCV1, jak i PCV2 DNA.

34 34 PL B1 Zwierzęta kontroli ujemnej były ujemne dla wiremii zarówno PCV1, jak i PCV2 podczas doświadczenia (zob. tabela 7, poniżej). Pięć świń w kontrolnej nieinokulowanej grupie miało wykrywalne przeciwciało matczyne dla PCV2 w -2 DPI i 2 świnie miały wykrywalne przeciwciało matczyne dla PCV1 w 7 DPI (zob. tabela 8, poniżej). Przeciwciała matczyne dla zarówno PCV1, jak i PCV2 u tych prosiąt zanikły w 21 DPI. Nie wykryto konwersji serologicznej do zarówno PCV1, jak i PCV2 u żadnego z 8 nie inokulowanych kontrolnych świń podczas doświadczenia. W grupie inokulowanej PCV1, wiremia została wykryta po raz pierwszy u inokulowanej świni w 7 DPI (tabela 7, poniżej) i została wykryta po raz ostatni w 35 DPI. Pięć z 8 zwierząt inokulowanych zakaźnym klonem DNA PCV1 było dodatnich dla wiremii PCV1. Przeciętna długość ciągłej wiremii PCV1 wynosiła 0,625 tygodnia. Do 21 DPI, wszystkie zwierzęta w grupie inokulowanej PCV1 uległy konwersji serologicznej dla PCV1 i pozostały dodatnie dla przeciwciał PCV1 do końca doświadczenia w 49 DPI. Niniejszym wykazano, że klon DNA PCV2 jest zakaźny u świń. W grupie inokulowanej klonem DNA PCV2, wiremia PCV2 została wykryta po raz pierwszy w 7 DPI (tabela 7, poniżej). Do 21 DPI, wszystkie zwierzęta w grupie inokulowanej PCV2 były dodatnie dla wiremii PCV2. Przeciętna długość wiremii PCV2 wynosiła 2,12 tygodnia. Dwie świnie w grupie inokulowanej PCV2 miało wykrywalne poziomy przeciwciał matczynych dla PCV2 w 7 DPI (tabela 8, poniżej), przeciwciała matczyne u tych prosiąt zanikły do 14 DPI. Konwersja serologiczna dla PCV2, zmierzona przez ELISA specyficzne dla PCV2, została po raz pierwszy wykryta w 35 DPI. Do 42 DPI, wszystkie świnie inokulowane zakaźnym klonem DNA PCV2 uległy konwersji serologicznej dla PCV2. W grupie 4 świń inokulowanych chimerowym zakaźnym klonem DNA PCV1-2, wiremia specyficznadla chimerowego wirusa została po raz pierwszy wykryta w 14 DPI (tabela 7, poniżej). Cztery z 7 inokulowanych zwierząt miały wiremię dla PCV1-2 pomiędzy 14 DPI i 42 DPI. Przeciętna długość wiremii dla chimerowego PCV1-2 wynosiła 1 tydzień. Jedna świnia miała wykrywalne poziomy przeciwciał matczynych dla PCV2 w 7 i 14 DPI, ale przeciwciało matczyne zanikło do 21 DPI (tabela 8, poniżej). Konwersja serologiczna do przeciwciała specyficznego dla ORF2 PCV2 po raz pierwszy wystąpiła w 28 DPI. Do 49 DPI, wszystkie świnie inokulowane chimerowym klonem DNA PCV1-2 uległy konwersji serologicznej do przeciwciała specyficznego dla ORF2 PCV2. U świń inokulowanych odpowiadającym chimerowym klonem PCV2-1, nie wykryto w próbkach surowicy wirusowego DNA właściwego dla chimerowego wirusa PCV2-1 (tabela 7, poniżej). Jednakże, po 21 DPI wszystkie zwierzęta w grupie 5 uległy konwersji serologicznej dla przeciwciała dla PCV1. Produkty PCR namnazane u wybranych świń w każdej grupie zostały zsekwencjonowane i potwierdzono, że są to prawdziwe odpowiadające klony zakaźne używane dla inokulacji każdej z grup. T a b e l a 7 Wykrywanie wiremii przez PCR typu nested w surowicach inokulowanych i kontrolnych świń Inokulum DPI Suma PBS a 0/8 0/8 0/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/8 PCV1 DNA c 0/8 1/8 1/8 2/8 0/4 2/4 0/4 0/4 5/8 PCV2 DNA c 0/8 3/8 6/8 7/8 1/4 2/4 2/4 0/4 8/8 PCV 1-2 DNA 0 0/7 0/7 1/7 2/7 2/4 2/4 2/4 0/4 4/7 PCV2-1 DNA e 0/8 0/8 0/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/8 a Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) używana jako kontrola ujemna b Osiem świń w każdej grupie; ilość dodatnich/ilość badanych c Sklonowany genomowy DNA PCV lub chimerowego PCV w plazmidzie psk

35 PL B1 35

36 36 PL B1 P r z y k ł a d 16 Ocena kliniczna Świnie zostały zważone w 0 DPI i w dniu sekcji. Temperatury w odbycie i kliniczne oceny oddechowe, sięgające od 0 do 6 (0 = normalny; 6 = ciężki) (P. G. Halbur i wsp., Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome vims isolates with that of the Lelystad vims Vet. Pathol. 32: (1995)), były rejestrowane co drugi dzień od 0 do 49 DPI. Obserwacje kliniczne obejmujące objaw choroby centralnego układu nerwowego, choroby wątroby (żółtaczka), choroby mięśni szkieletowych i zmiany w stanie ciała, były również rejestrowane codziennie. Zespół dwóch ludzi przeprowadzał wszystkie oceny kliniczne. Żadna z kontrolnych lub inokulowanych świń nie wykazywała wyraźnych oznak pełnoobjawowego klinicznego PMWS. Nie było różnic w przybieraniu na wadze lub średniej temperaturze w odbycie pomiędzy jakakolwiek z grup. Jedna ze świń z grupy 3 inokulowanej PCV1-2 zdechła jeden dzień po inokulacji. Po sekcji i analizie klinicznej, nie wykryto żadnego czynnika patogennego oraz zgon nie był związany z procedurą inokulacji lub chimerowym wirusem PCV 1-2. P r z y k ł a d 17 Ogólna patologia i histopatologia Cztery świnie z każdej grupy zostały poddane sekcji w 21 i 49 DPI, odpowiednio. Grupa sekcyjna nie była informowana o statusie zakaźnym świń przy sekcji. Całkowite sekcje zostały przeprowadzone dla wszystkich świń. Przybliżony odsetek płuca z całkowicie widocznym zapaleniem płuc został zarejestrowany dla każdej świni w oparciu o poprzednio opisany system oceny (P. G. Halbur i wsp., 1995, op. cit.). Inne uszkodzenia, takie jak powiększenie węzłów limfatycznych zostały zarejestrowane oddzielnie. Wycinki do badania histopatologicznego zostały pobrane z małżowiny nosowej, płuc (siedem wycinków) (jw), serca, mózgu, węzłów limfatycznych (oskrzelowych, biodrowych, krezkowych, podjęzykowych), migdałka, grasicy, wątroby, woreczka żółciowego, śledziony, stawów, jelita cienkiego, okrężnicy, trzustki i nerki. Tkanki były badane bez informowania o statusie zwierząt i poddane subiektywnej ocenie dla ciężkości uszkodzeń płuc, węzłów limfatycznych i wątroby, jak opisano w przykładzie 7. Oceny płuc sięgały od 0 (normalne) do 3 (ciężkie limfohistiocytarne śródmiąższowe zapalenie płuc). Oceny wątroby sięgały od 0 (normalna) do 3 (ciężkie limfohistiocytarne zapalenie wątroby). Oceny węzłów limfatycznych były dla przybliżonej ilości ubytku pęcherzyków w zakresie 0 (normalne lub brak ubytków limfatycznych) do 3 (ciężkie ubytki limfatyczne i histiocytarne zastąpienie pęcherzyków). Dla określenia patogenności zakaźnych klonów DNA PCV1, PCV2, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1 u świń, ogólne uszkodzenia były zbadane jako pierwsze. Wyniki są pokazane w tabeli 9 poniżej. Węzły limfatyczne u zwierząt z nieinokulowanej grupy kontrolnej 1 były normalne zarówno 21 i 49 DPI. Świnie w czterech inokulowanych grupach miały różne poziomy ogólnych uszkodzeń ograniczonych do węzłów limfatycznych. W grupie 2 świń inokulowanych PCV1, węzły limfatyczne były ogólnie normalne w 21 DPI, jednakże, łagodne do umiarkowanego powiększenie i odbarwienie węzłów limfatycznych było wykryte w 49 DPI. Wszystkie świnie grupy 3 inokulowane PCV2 miały powiększone węzły limfatyczne dwa do pięciu razy normalnej wielkości, które były twarde i jasnobrązowe w zarówno 21 i 49 DPI. Węzły limfatyczne u zwierząt inokulowanych chimerowym PCV 1-2 były łagodnie do umiarkowanie powiększone i odbarwione w zarówno 21 i 49 DPI u 5 z 7 świń. W grupie 5 świń, inokulowanych klonem PCV2-1 clone, 1 z 8 zwierząt miało łagodne powiększenie i odbarwienie węzłów limfatycznych w 21 DPI. Przeciętne oceny ogólnych uszkodzeń węzłów limfatycznych u świń inokulowanych chimerowym klonem PCV 1-2 nie były statystycznie różne od tych w grupach 1, 2 i 5, ale były statystycznie różne od tych u świń grupy 3 inokulowanych patogennym PCV2 w zarówno 21 i 49 DPI. Przeciętne oceny ogólnych uszkodzeń limfatycznych w 49 DPI u zwierząt inokulowanych PCV1, PCV2 i PCV1-2 nie były statystycznie różne od siebie nawzajem, ale były statystycznie różne od przeciętnych ocen ogólnych uszkodzeń grup 1 i 5.

37 PL B1 37 Następnie, były badane uszkodzenia mikroskopowe. Wyniki są pokazane w tabeli 10 poniżej. Nie wykryto uszkodzeń mikroskopowych, ani u nieinokulowanych świń kontrolnych grupy 1, ani u świń grupy 2 inokulowanych PCV1 żadnego DPI. Mikroskopowe uszkodzenia płuc przejawiające się jako łagodne wokółoskrzelowe limfohistiocytarne i histiocytarne ostrzelowo-śródmiąższowe zapalenie płuc, były obserwowane u 1 z 8 świń inokulowanych PCV2. U zwierząt inokulowanych PCV1-2 i PCV2-1, nie zaobserwowano uszkodzeń mikroskopowych w płucach. Nie zaobserwowano uszkodzeń w grasicach żadnej z inokulowanych świń. Łagodne wieloogniskowe limfoplazmatyczne zapalenie mięśnia sercowego było obserwowane u 2 z 8 świń w grupie inokulowanej PCV2. Tkanki serca od zwierząt inokulowanych PCV1-2 i PCV2-1 były wolne od uszkodzeń mikroskopowych. Łagodne wieloogniskowe limfoplazmatyczne śródmiąższowe zapalenie nerek było obserwowane u 4 z 8 świń w grupie inokulowanej PCV2, u 2 z 7 świń inokulowanych PCV1-2 i u 1 z 8 świń inokulowanych PCV2-1. Łagodne do umiarkowanych ubytki limfatyczne i histiocytarne zastąpienie pęcherzyków było obserwowane w migdałku u 5 z 8 świń, w śledzionie u 3 z 8 świń i w węzłach limfatycznych u 8 z 8 świń w grupie inokulowanej PCV2. U zwierząt inokulowanych chimerowym PCV1-2, łagodne ubytki limfatyczne i histiocytarne zastąpienie pęcherzyków było obserwowane w węzłach limfatycznych u 2 z 7 świń, ale nie zostało wykryte ani w śledzionie, ani w migdałkach. Nie zaobserwowano ubytków limfatycznych i histiocytarnych zastąpienia pęcherzyków w węzłach limfatycznych, śledzionie lub migdałkach zwierząt inokulowanych odpowiadającym chimerowym PCV2-1. Łagodne do umiarkowanego limfoplazmatyczne zapalenie wątroby było obserwowane u 7 z 8 świń inokulowanych PCV2. Łagodne limfoplazmatyczne zapalenie wątroby było obserwowane u 2 z 7 świń inokulowanych chimerowym PCV1-2. Nie zaobserwowano limfoplazmatyczne zapalenia wątroby u świń inokulowanych odpowiadającym chimerowym PCV2-1. Uszkodzenia w innych tkankach były niezauważalne. Uszkodzenia mikroskopowe w płucu, wątrobie i węzłach limfatycznych były oceniane według opublikowanego systemu oceny (P. G. Halbur i wsp., 1995, op. cit.). Wyniki pokazano w tabeli 10 poniżej. Przeciętne oceny uszkodzeń w węzłach limfatycznych u świń z grupy 4 inokulowanych chimerowym PCV1-2 były podobne do tych z grup 1, 2 i 5, ale były statystycznie różne od tych u świń grupy 3 inokulowanych patogennym PCV2, w zarówno 21 i 49 DPI. Przeciętne oceny uszkodzeń mikroskopowych wątroby z grupy inokulowanej chimerowym PCV 1-2 w 21 DPI były statystycznie różne od tych u zwierząt grupy 3 inokulowanych PCV2, ale były podobne do tych w grupach 1, 2 i 5 świń w 21 DPI. W 49 DPI, przeciętne mikroskopowe oceny wątroby u świń z grupy 4 inokulowanych chimerowym PCV1-2 nie były statystycznie różne od tych u świń grup 1, 2, 3 i 5. Nie było ustalonych systemów oceny dla innych tkanek lub organów. T a b e l a 9 Ogólne uszkodzenia węzłów limfatycznych u kontrolnych i inokulowanych świń Grupa Inokulum a DPI b PBS 0/4 (0,0) 0/4 (0,0) 2 PCV1 DNA 0/4 (0,0) 4/4 (1,5) 3 PCV2 DNA 4/4 (2,5) 4/4 (2,25) 4 PCV 1-2 DNA 2/3 (0,66) 3/4 (1,25) 5 PCV2-1 DNA 1/4 (0,25) 0/4 (0,0) a Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) używana jako kontrola ujemna. Inokula stanowiły sklonowane DNA genomowe PCV i chimerowego PCV w plazmidzie psk b Cztery świnie z każdej grupy zostały poddane sekcji w 21 DPI i pozostałe świnie zostały poddane sekcji w 49 DPI; ilość dodatnich/ilość zbadanych. Ilość z uszkodzeniami/ilość zbadanych (zakres przybliżonej ciężkości powiększenia węzła limfatycznego)

38 38 PL B1

39 PL B1 39 P r z y k ł a d 18 Serologia Krew została pobrana od wszystkich świń w -2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 DPI. Przeciwciała surowicy przeciwko PRRSV zostały oznaczone z użyciem ELISA Herd Check PRRSV (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Przeciwciała surowicy przeciwko PPV były wykrywane przez oznaczenie zahamowania hemaglutynacji (HI) (H. S. Joo i wsp., J standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody Aust. Vet. J. 52: (1976)). Przeciwciała surowicy przeciwko PCV2 były wykrywane przez zmodyfikowane pośrednie ELISA oparte o rekombinowane białko płaszcza ORF2 PCV2 jak opisano niniejszym powyżej (zob. również P. Nawagitgul i wsp., Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1: (2002)). Przeciwciała surowicy przeciwko PCVl były wykrywane przez pośrednie oznaczenie immunofluorescencyjne (IFA). Komórki PK-15 infekowane PCV1 były hodowane w ośmiostudzienkowych płytkach komorowych Lab- Tek. Kiedy infekowane komórki PK-15 osiągały około % nasycenia, infekowane komórki były utrwalane roztworem zawierającym 80% acetonu i 20% metanolu w 4 C przez 20 min. Utrwalone komórki były płukane jeden raz buforem PBS. Sto mikrolitrów próbki surowicy świni rozcieńczonego 1:10 w PBS było dodawane do komór i inkubowane przez 1 godzinę w 37 C. Komórki były następnie płukane trzy razy PBS i inkubowane przez 45 min. w 37 C z przeciwciałem drugorzędowym kozy przeciwko świni wyznakowanym FITC. Płytki były następnie płukane trzy razy PBS, pokryte odczynnikiem fluoromount-g, przykryte i zbadane w mikroskopie fluorescencyjnym. Jako kontrola dodatnia, komórki infekowane PCV1 były inkubowane z rozcieńczonym przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla PCV1 (dar od Dr. G. M. Allana), następnie inkubowane z IgG kozim przeciwko myszy wyznakowanym FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). Jako kontrola ujemna, komórki infekowane PCV1 były inkubowane ze świńską surowicą rozcieńczoną 1:10 wolną od przeciwciała dla PCV1 i PCV2, następnie inkubowane z IgG kozim przeciwko świni wyznakowanym FITC (Kirkegaard & Peny Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). P r z y k ł a d 19 Wykrywanie PCR Dla wykrycia wiremii PCV1, PCV2, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1 w surowicach inokulowanych świń, próbki surowicy zebrane w różnych DPI były badane przez PCR. Wirusowy DNA był izolowany z 100 μl każdej próbki surowicy z użyciem odczynnika DNAzol według instmkcji producenta (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Wyizolowany DNA był zawieszany w wodzie wolnej od DNaz, RNaz i proteinaz. Do namnożenia specyficznych dla klonu sekwencji genomowych PCVl, PCV2, chimerowego PCV1-2 i chimerowego odpowiadającego PCV2-1 zostały zaprojektowane dwa zestawy par starterów PCR typu nested (tabela 6, powyżej). Pierwszy zestaw starterów nested został zaprojektowany w oparciu o opublikowane sekwencje PCV1. Startery Gen.PCV1 ujawniony w Sekw. nr Id: 20 i Orf.PCV1 ujawniony w Sekw. nr Id: 19 namnażały fragment 400 bp w obecności genomu PCV1. Startery nested, nested.gen.pcv1 ujawniony w Sekw. nr Id: 22 i nested.orf.pcv1 ujawniony w Sekw. nr Id: 21, namnażały fragment 220 bp. Dla wykrycia wiremii, para starterów PCV2 Gen.PCV2 ujawniony w Sekw. nr Id: 24 i Orf.PCV2 ujawniony w Sekw. nr Id: 23 namnażała fragment 900 bp w obecności PCV2 w pierwszym etapie PCR. Startery nested.gen.pcv2 ujawniony w Sekw. nr Id: 26 i nested.orf.pcv2 ujawniony w Sekw. nr Id: 25 namnażały fragment 600 bp w PCR typu nested. Dla wykrycia wiremii chimerowego PCV 1-2, pierwszy etap reakcji PCR wykorzystywał starter specyficzny dla PCVl, Gen.PCVl ujawniony w Sekw. nr Id: 20 i starter specyficzny dla ORF2PCV2, Orf.PCV2 ujawniony w Sekw. nr Id: 23 do namnażania chimerowego fragmentu 580 bp. Do PCR typu nested, starter specyficzny dla PCV1, nested.gen.pcvl ujawniony w Sekw. nr Id: 22 i starter specyficzny dla ORF2PCV2, nested.orf.pcv2 ujawniony w Sekw. nr Id: 25 były używane do namnażania chimerowego fragmentu 370 bp. Aby wykryć wiremię odwrotnego chimerowego PCV2-1, pierwszy etap PCR wykorzystywał starter specyficzny dla PCV2, Gen.PCV2 ujawniony w Sekw. nr Id: 24 i starter specyficzny dla ORF2PCV1, Orf.PCV1 ujawniony w Sekw. nr Id: 19 do namnażania chimerowego fragmentu 700 bp. Do PCR typu nested, starter specyficzny dla PCV2, nested.gen.pcv2 ujawniony w Sekw. nr Id: 26 i starter specyficzny dla ORF2 PCV1, nested.orf.pcvl ujawniony w Sekw. nr Id: 21 były używane do namnażania chimerowego fragmentu 460 bp. Wszystkie parametry PCR były zasadniczo takie same, obejmując 38 cykli denaturacji w 94 C przez 1 min., przyłączania w 45 C przez 1 min. i wydłużania

40 40 PL B1 w 72 C przez 1,5 min. Próbki surowicy od świń kontroli ujemnej były badane testem diagnostycznym typu PCR-RFLP, który może wykryć i rozróżnić zarówno PCV1 i PCV2, jak opisano uprzednio (M. Fenaux i wsp., Genetic characterization of type 2 porcine circovims (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2 J. Clin. Microbiol. 38: (2000)). Produkty PCR od wybranych zwierząt w każdej grupie były sekwencjonowane dla sprawdzenia pochodzenia wirusa infekującego świnie. P r z y k ł a d 20 Immunohistochemia (IHC) Wykrywanie IHC antygenu specyficznego dla PCV2 było prowadzone na tkankach węzłów limfatycznych pobranych od wszystkich świń poddanych sekcji w 21 i 49 DPI. Poliklonalna surowica królika przeciwko PCV2 była wykorzystywana do IHC, według powszechnych procedur opisanych poprzednio (S. D. Sorden i wsp., Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovims in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue J. Vet. Diagn. Invest. 11: (1999)). W oparciu o barwienie IHC antygenu specyficznego wobec PCV2, tkanki limfatyczne od nieinokulowanej kontroli, świń inokulowanych PCV1 i PCV2-1 były ujemne dla antygenu PCV2. Antygen PCV2 został wykryty w tkankach limfatycznych 7 z 8 zwierząt w grupie inokulowanej PCV2. Antygen PCV2 został również wykryty w tkance limfatycznej 1 z 7 świń z grupy inokulowanej chimerowym PCV 1-2. Zastrzeżenia patentowe 1. Szczepionka wirusowa chroniąca świnię przed infekcją wirusową lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym (PMWS) wywoływanym przez PCV2, znamienna tym, że zawiera nietoksyczny, dopuszczalny fizjologicznie nośnik, jeden lub więcej adiuwantów i immunogenną ilość składnika wybranego z grupy składającej się z: (a) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2) obejmującej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą niepatogenny PCV1, która zawiera gen immunogennej otwartej ramki odczytu 2 (ORF2) patogennego PCV2 w miejsce genu ORF2 cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1; (b) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sekw. nr Id: 2, jej nić komplementarną lub sekwencję nukleotydową o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2; (c) plazmidu lub wektora wirusowego zawierającego chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2), nić komplementarną lub sekwencję nukleotydową o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2; oraz (d) chimerowego cirkowirusa świni; oraz ewentualnie, immunogenną ilość co najmniej jednego dodatkowego antygenu świni. 2. Szczepionka wirusowa według zastrz. 1, znamienna tym, że jest szczepionką DNA, żywą szczepionką, modyfikowaną żywą szczepionką, inaktywowaną szczepionką, podjednostkową szczepionką, atenuowaną szczepionką lub szczepionką modyfikowaną środkami inżynierii genetycznej. 3. Szczepionka wirusowa według zastrz. 1, znamienna tym, że ewentualny dodatkowy antygen świni stanowi antygen wirusa zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV), antygen parwowirusa świni (PPV) lub oba. 4. Szczepionka wirusowa według zastrz. 1, znamienna tym, że adiuwant stanowi wodorotlenek glinu, kompleks immunostymulujący (ISCOMS), niejonowy polimer blokowy lub kopolimer, saponina, monofosforylolipid A (MLA), dipeptyd muramylowy (MDP), siarczan glinowo-potasowy, ciepło-wrażliwa lub ciepło-trwała enterotoksyna izolowana z Escherichia coli, toksyna cholery lub jej podjednostka B, toksyną błoniczą, toksyna tężcowa, toksyna krztuśca, niekompletny lub kompletny adiuwant Freunda lub ich kombinacja. 5. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 1 do 4 do wytwarzania leku do ochrony świni przed infekcją wirusową lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym u świń (PMWS) wywoływanym przez PCV2, przy czym lek jest przeznaczony do podawania świni potrzebującej takiej ochrony w immunologicznie skutecznej ilości.

41 PL B Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do stosowania w pojedynczej dawce. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania parenteralnego, donosowego, śródskórnego lub przezskórnego. 8. Zastosowanie szczepionki zawierającej immunogenną ilość genu kapsydu ORF2 lub białka PCV2 do wytwarzania leku do ochrony prosięcia mającego matczyne przeciwciała wobec PCV2 lub wielonarządowy poodsadzeniowy zespół wyniszczający u świń (PMWS) wywoływany przez PCV2, przy czym lek jest przeznaczony do podawania prosięciu w immunologicznie skutecznej ilości. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że szczepionka obejmuje składnik wybrany z grupy składającej się z: (a) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2) obejmującej cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą niepatogenny PCV1, która zawiera gen immunogennej otwartej ramki odczytu 2 (ORF2) patogennego PCV2 w miejsce genu ORF cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1; (b) plazmidu lub wektora wirusowego zawierającego chimerową cząsteczkę z (a); (c) niezjadliwego, chimerowego cirkowirusa świni typu 1 kodującego immunogenne białko ORF2 PCV2; oraz (d) immunogennego białka ORF2 PCV2 kodowanego przez chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego z (a). 10. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że szczepionka obejmuje niezjadliwego, chimerowego cirkowirusa świni typu 1 kodującego immunogenne białkoorf2 PCV Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek zawiera adiuwant w kombinacji ze szczepionką. 12. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do stosowania w pojedynczej dawce. 13. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania parenteralnego, donosowego, śródskórnego lub przezskórnego. 14. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, ze wektorem wirusowym z (b) jest bakulowirus wyrażający białko ORF2 PCV Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek zawiera ponadto co najmniej jeden dodatkowy antygen świni. 16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że co najmniej jeden dodatkowy antygen świni stanowi czynnik zakaźny świni. 17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że dodatkowy antygen świni stanowi antygen wirusa zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV), antygen parwowirusa świni (PPV) lub oba. 18. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką DNA, żywą szczepionką, modyfikowaną żywą szczepionką, inaktywowaną szczepionką, podjednostkową szczepionką, atenuowaną szczepionką lub szczepionką modyfikowaną środkami inżynierii genetycznej.

42 42 PL B1 Rysunki

43 PL B1 43

44 44 PL B1

45 PL B1 45

46 46 PL B1

47 PL B1 47

48 48 PL B1

49 PL B1 49

50 50 PL B1

51 PL B1 51

52 52 PL B1

53 PL B1 53

54 54 PL B1

55 PL B1 55