Patogeneza oraz zjawiska immunologiczne w przebiegu zakażeń cirkowirusowych

Transkrypt

1 Patogeneza oraz zjawiska immunologiczne w przebiegu zakażeń cirkowirusowych Katarzyna Podgórska, Zygmunt Pejsak Zakład Chorób Świń, Państwowy Instytut Weterynaryjny PIB, Al. Partyzantów 57, Puławy Abstrakt Cirkowirus świń typ 2 (PCV2) uczestniczy w etiologii szeregu zespołów chorobowych określanych wspólnie jako choroby związana z cirkowirusem świń (porcine circovirus disease, PCVD). Patogeneza PCVD jest zagadnieniem niezwykle złożonym, ze względu na wpływ szeregu dodatkowych czynników, które nie zostały dostatecznie scharakteryzowane. Intensywne badania obejmujące zakażenia eksperymentalne, badania in vitro oraz obserwacje terenowe, prowadzone w ostatnich latach doprowadziły do zidentyfikowania czterech głównych grup czynników związanych z patogenezą PCVD. Należą do nich czynniki związane bezpośrednio z wirusem, czynniki związane z organizmem gospodarza, wzajemne interakcje PCV2 i organizmu gospodarza oraz zakażenia innymi patogenami. Celem tej publikacji jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy na temat znaczenia wymienionych czynników w patogenezie zakażeń cirkowirusowych. Abstract Pathogenesis and virus-host interactions in porcine circovirus disease Porcine circovirus type 2 (PCV2) is involved in an etiology of a different disease syndromes, described altogether as porcine circovirus disease (PCVD). Pathogenesis of PCVD is a complicated and not fully understood problem, because of numerous co-factors that contributes to the final outcome of PCV2 infection. The issue was intensively investigated in a numerous experimental infection, in vitro and field studies during last years. The results revealed four main groups of factors involved in the pathogenesis of PCVD, namely: virusdependant factors, host-dependant factors, virus-host interactions and co-infections with other pathogens. The aim of this review is to summarize current knowledge concerning all abovementioned groups of factors and their input in the pathogenesis of PCVD.

2 Zakażenia cirkowirusowe Cirkowirus świń typ 2 (porcine circovirus type 2, PCV2) należy do grupy wirusów obejmującej najmniejsze wirusowe patogeny replikujące w komórkach ssaków. Mimo niewielkich rozmiarów i prostej budowy PCV2 stanowi jednak poważny problem w produkcji trzody chlewnej wywołując m.in. poodsadzeniowy, wielonarządowy zespół wyniszczający świń (postweaning, multisystemic wasting syndrome, PMWS). Najbardziej charakterystycznym objawem PMWS jest postępujące wyniszczenie organizmu u świń w wieku 2-4 miesięcy życia. Często występuje także bladość skóry, podwyższona wewnętrzna ciepłota ciała, powiększenie węzłów chłonnych, brak apetytu, zaburzenia oddechowe, rzadziej biegunka oraz zażółcenie powłok skórnych i spojówek. Od momentu stwierdzenia pierwszych przypadków PMWS w Kanadzie w latach 90-ych obserwowano szybkie rozprzestrzenianie choroby praktycznie na cały świat (16). W Polsce pierwszy przypadek PMWS rozpoznano w 2000 r., a wstępne badania wykazały, że stanowi ona istotny problem zdrowotny w krajowej produkcji trzody chlewnej (39). Obecnie coraz częściej w miejsce nazwy PMWS stosuje się termin choroba cirkowirusowa (porcine circovirus disease, PCVD lub porcine circovirus associated disease, PCVAD). Określenie to obejmuje także inne zespoły chorobowe związane z zakażeniem PCV2, które mogą występować jako postać płucna (zespół oddechowy świń, rozrostowe martwicze zapalenie płuc), zespół skórno-nerkowy, zapalenie jelit czy zaburzenia reprodukcyjne. Ich rozpoznawanie opiera się na występowaniu objawów klinicznych, zmian anatomopatologicznego oraz charakterystycznych zmian histopatologicznych w poszczególnych narządach lub tkankach limfatycznych (16). Znaczna większość zakażeń PCV2 ma charakter subkliniczny, jedynie w stosunkowo niewielkim odsetku ferm występuje PCVD. Sugeruje to udział dodatkowych czynników w procesie rozwoju chorób cirkowirusowych. Nie zostały one jednoznacznie scharakteryzowane, jednak prowadzone w ostatnich latach badania epidemiologiczne, zakażenia eksperymentalne a także badania in vitro doprowadziły do zidentyfikowania czterech głównych grup czynników związanych z patogenezą PCVD. Należą do nich czynniki związane bezpośrednio z wirusem, czynniki związane z organizmem gospodarza, wzajemne interakcje między PCV2 i organizmem gospodarza oraz zakażenia innymi patogenami.

3 Czynniki związane z wirusem Obserwacje epidemiologiczne przeprowadzone w Wielkiej Brytanii i Danii wykazały, że PCVD w tych krajach szerzyła się w sposób typowy dla choroby zakaźnej (206, 218). Może to sugerować wprowadzenie do wrażliwej populacji niezidentyfikowanego dotychczas wirusa lub szczepów PCV2 o wyższej zjadliwości (50, 52). Analiza filogenetyczna szczepów PCV2 wyizolowanych od świń z PCVD i zakażonych subklinicznie nie wykazała znaczących różnic. Stwierdzony w obrębie gatunku stopień podobieństwa nukleotydowego był wysoki i wynosił 95,6 100%. Wykazano jednak występowanie dwóch grup filogenetycznych wirusa PCV2a i PCV2b a także grupy PCV2c, którą tworzą duńskie szczepy archiwalne sprzed 1990 r. (45). Wzrost liczby szczególnie ostrych przypadków PMWS obserwowany w Kanadzie i USA w latach r. był skorelowany ze zmianą dominującego genotypu wirusa z PCV2a na PCV2b (6, 7). Nie jest jasne, czy fala ostrych przypadków PMWS była związana ze wzrostem poziomu zjadliwości PCV2, wprowadzeniem do populacji nowego genotypu czy też innymi czynnikami. Szereg publikacji sugeruje, że genotyp PCV2b może być bardziej zjadliwy (6, 17, 22), inne nie potwierdzają takiej prawidłowości (3). Nie można jednak wykluczyć możliwości pojawienia się nowych, bardziej zjadliwych szczepów wirusa. Firth i wsp. (14) wykazali, że tempo zmian ewolucyjnych w genomie PCV2 jest najwyższe wśród wirusów o genomie w postaci pojedynczej cząsteczki DNA. Wykazano także, że nawet drobne mutacje dotyczące jedynie dwóch aminokwasów mogą znacząco wpływać na zmianę zjadliwości PCV2 (13). Istnieją dowody na przypadki wymiany części materiału genetycznego pomiędzy dwoma wirusami (rekombinacji) prowadzącej do powstania nowych szczepów PCV2 (21). Co więcej, stwierdzono także występowanie zupełnie nowego typu cirkowirusa, wstępnie określonego jako PCV1/2a, który powstał najprawdopodobniej na drodze rekombinacji między dwoma znanymi gatunkami cirkowrusów, PCV2 i niepatogennym PCV1 (15). Doniesienia te wskazują na wysoką dynamikę zmian ewolucyjnych PCV2, które mogą prowadzić do poszerzania i udoskonalania mechanizmów pozwalających wirusowi skutecznie zakażać komórki gospodarza i unikać odpowiedzi immunologicznej. Mechanizmy te są wielokierunkowe i nadal nie do końca poznane, chociaż wiedza w tym zakresie znacznie wzrosła w ostatnich latach. Ze względu na ograniczoną wielkość genomu i brak własnej polimerazy DNA cykl życiowy wirusa w znacznym stopniu uzależniony jest od enzymów komórkowych gospodarza. Replikacja wirusa zachodzi najefektywniej w komórkach, które znajdują się w fazie syntezy materiału genetycznego przygotowującej do podziału, tzw. fazie S (49). Potwierdzają to

4 obserwacje lokalizacji antygenów wirusowych w aktywnie dzielących się subpopulacjach komórek, a także wzrost poziomu replikacji PCV2 po podaniu substancji stymulującej podziały komórkowe (53). Co ciekawe, zakażenie PCV2 może prowadzić do zwiększenia ekspresji niektórych genów odpowiedzialnych za utrzymywanie komórek w fazie podziału (m.in. receptora CD168), co stwarza korzystne warunki do namnażania się wirusa (4). Istotną rolę w procesie patogenezy odgrywa niedawno odkryte białko kodowane przez region ORF3 (28). Poprzez interakcje z białkami komórkowymi (p53 i Pirh2) białko ORF3 może powodować uruchomienie mechanizmów odpowiedzialnych za zaprogramowaną śmierć zakażonych komórek (apoptozę) (24). Wykazano również, ze białko ORF3 może wiązać się z innym białkiem regulacyjnym (RGS16), produkowanym w organizmie pod wpływem czynników takich jak stres czy zakażenia patogenami i w ten sposób wpływać na szereg procesów związanych z odpowiedzią immunologiczną, między innymi na migrację limfocytów T (48). Zmutowane szczepy PCV2 nie produkujące białka ORF3 zachowywały zdolność replikacji, jednak nie wykazywały właściwości patogennych, w odróżnieniu od macierzystego szczepu dzikiego (23). Czynniki związane z organizmem gospodarza Badania terenowe i zakażenia eksperymentalne wykazały, że pomiędzy różnymi liniami genetycznymi mogą występować różnice we wrażliwości na zakażenie PCV2. Niektóre linie genetyczne, takie jak Landrace, wydają się być bardziej wrażliwe na zakażenie PCV2 w porównaniu z Duroc czy Wielka Biała (33). Stwierdzono także większe nasilenie zmian histopatologicznych po zakażeniu PCV2 u świń rasy Landrace w porównaniu z Pietrain. Natomiast czas utrzymywania się odporności biernej był dłuższy w przypadku świń Landrace (35). Stwierdzono także występowanie pewnego zróżnicowania w obrębie jednej linii genetycznej, m.in. w poziomie replikacji PCV2 w makrofagach płucnych wyizolowanych od różnych świń tej samej linii (31). Jednym z istotnych czynników decydujących o przebiegu infekcji PCV2 jest stopień dojrzałości i stan układu immunologicznego w momencie zakażenia PCV2. Szczególnie ważny jest wiek zakażenia i czynniki które oddziałują w tym okresie na organizm. Analiza czynników ryzyka PCVD wykazała, że prawdopodobieństwo wystąpienia PCVD jest wyższe w przypadku wczesnego zakażenia PCV2 (przed 7 tygodniem życia) lub wczesnego odsadzenia (przed ukończeniem 21 dni życia) (41). Stwierdzono także, że wysoki poziom przeciwciał siarowych obniża ryzyko wystąpienia choroby, nie chroni jednak przed

5 wystąpieniem wiremii (29). Grierson i wsp. (19) zaobserwowali, że wzrost liczby pobudzonych limfocytów w okresie przed zakażeniem PCV2 predysponuje do wystąpienia PCVD. Pobudzenie limfocytów może nastąpić na skutek stymulacji układu immunologicznego, zarówno nieswoistej, spowodowanej przez stresogenne czynniki środowiskowe, jak i swoistej, związanej z występowaniem zakażeń towarzyszących. Wcześniejsze próby wywołania PCVD w warunkach eksperymentalnych potwierdziły, że jednoczesna stymulacja układu immunologicznego przy zastosowaniu niekompletnego adjuwantu Freund a zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia choroby (26). Również zastosowanie szczepień (między innymi przeciwko M. hyopneumoniae czy A. pleuropneumoniae) jednocześnie z zakażeniem PCV2 może przyczyniać się do wystąpienia PCVD (25, 27). Oddziaływania między organizmem gospodarza a wirusem Badania nad przebiegiem zakażenia PCV2 wykazały, że u świń z PCVD poziom wiremii jest zwykle wyższy w porównaniu do świń zakażonych subklinicznie (43). Jednocześnie obserwuje się niższy poziom odpowiedzi humoralnej, szczególnie przeciwciał neutralizujących (30). Związane jest to z zaburzeniami swoistej odpowiedzi immunologicznej, co powoduje że układ immunologiczny nie jest w stanie zwalczyć infekcji. Dochodzi do intensywnej replikacji wirusa i wystąpienia klinicznej postaci choroby. U świń, u których zakażenie przebiega subklinicznie replikacja wirusa zostaje ograniczona przez prawidłowo funkcjonujący układ immunologiczny, co prowadzi ostatecznie do całkowitego zwalczenia infekcji i wytworzenia odporności. Nie jest do końca jasne jaka sekwencja wydarzeń powoduje, że u części zakażonych świń dochodzi do intensywnej replikacji PCV2, zakłócenia odpowiedzi odpornościowej i wystąpienia PCVD. Dotychczas zidentyfikowano jednak szereg mechanizmów, które pozwalają wirusowi wpływać na odpowiedź immunologiczną. Mechanizmy te odgrywają kluczową rolę w patogenezie zakażeń cirkowirusowych. Charakterystyczne dla PCVD jest występowanie limfopenii, niedoboru limfocytów stanowiących jedno z głównych ogniw odpowiedzi immunologicznej. Niedobór limfocytów obserwuje się zarówno w tkankach limfatycznych, w tym w węzłach chłonnych, jak i we krwi obwodowej (32). W szczególnym stopniu dotyczy on limfocytów B, odpowiedzialnych za produkcję przeciwciał (47). Może to powodować zaburzenia produkcji przeciwciał i neutralizacji wirusa przez przeciwciała. Sugerowane mechanizmy powstawania limfopenii

6 PCV2 to apoptoza komórek, obniżenie zdolności proliferacji limfocytów, a także usuwanie limfocytów zakażonych PCV2 z organizmu. Badania in vitro wykazały, że pewną rolę w indukcji apoptozy limfocytów może odgrywać białko kodowane przez ORF3 (24), a także jednoczesne zakażenie PRRSV (5). Zaobserwowano również obniżenie produkcji cytokiny IL-4 stymulującej proliferację limfocytów B (8), co może powodować obniżenie ich liczby. Zmianom może ulegać także poziom innych cytokin, zaobserwowano m.in. wzrost ekspresji cytokin prozapalnych IL-1B i IL-8 (8), ale jednocześnie cytokiny IL-10 odpowiedzialnej za wygaszanie odpowiedzi immunologicznej (9). Upośledzenie funkcjonowania układu odpornościowego przez PCV2 związane jest także z obecnością wirusa w komórkach dendrytycznych, które stanowią populację komórek wyspecjalizowanych w prezentacji antygenu. Komórki dendrytyczne pochłaniają mikroorganizmy, które następnie zostają zdegradowane w ciągu godz. do prostych białek, przenoszą je do węzłów chłonnych i eksponują limfocytom T. Uczulone w ten sposób limfocyty T zapoczątkowują swoistą odpowiedź immunologiczną w organizmie. W odróżnieniu od innych patogenów PCV2 może przetrwać w komórkach dendrytycznych nie ulegając degradacji przez kilka tygodni. Ponadto zakażenie PCV2 powoduje hamowanie wydzielania cytokin IFN-α i TNF-α, które są sygnałem warunkującym dojrzewanie komórek dendrytycznych. W konsekwencji limfocyty T bez pomocy komórek dendrytycznych nie są w stanie rozpoznać zagrożenia, i zdolność inicjowania swoistej odpowiedzi immunologicznej organizmu zostaje zakłócona (51). Wpływ zakażeń towarzyszących PCVD rzadko występuje u świń zakażonych jedynie PCV2. Zwykle w warunkach terenowych obserwuje się występowanie zakażeń innymi patogenami. Najczęściej obserwuje się jednoczesne zakażenie wirusem zespołu rozrodczo oddechowego świń (PRRSV) (średnio 41%), M. hyopneumoniae (27%), posocznicę (16.0%), lub bakteryjne zapalenie płuc (6%), a także zakażenie wirusem grypy świń (4%). Jedynie w około 1-2% przypadków nie wykryto infekcji innymi patogenami (10, 12, 18, 38). Nie jest do końca jasne, czy wysoki odsetek występowania zakażeń towarzyszących związany jest z immunosupresyjnym wpływem infekcji PCV2, czy też to właśnie występowanie zakażeń innymi patogenami stwarza odpowiednie środowisko stymulujące występowanie PCVD. Najprawdopodobniej obydwa te mechanizmy odgrywają rolę w patogenezie syndromu.

7 O immunosupresyjnym wpływie zakażenia PCV2 świadczy obserwowany u świń z PCVD wzrost częstości występowania chorób spowodowanych przez zakażenia patogenami warunkowo chorobotwórczymi, m.in. Pneumocystis carinii, Chlamydia spp., Cryptosporidium parvum, Aspergillus spp., czy Candida albicans (44). Zaobserwowano także obniżenie skuteczności szczepień przeciwko PRRS spowodowane subklinicznym zakażeniem PCV2 (34). Na poziomie molekularnym stwierdzono zaburzenia rozpoznawania przez komórki prezentujące antygen zakażeń przez takie patogeny jak wirus choroby Aujeszkyego, wirus klasycznego pomoru świń i wirus wirusowego zapalenia żołądka i jelit (51). W warunkach eksperymentalnych wykazano, że objawy kliniczne i zmiany mikroskopowe po zakażeniu PCV2 są bardziej nasilone w przypadku nadkażenia innym patogenem, jak PRRSV (2, 20), parwowirusem świń (1, 37), M. hyopneumioniae (36) czy TTV (torque teno virus) (11). Badania epidemiologiczne wskazują na PRRSV jako czynnik zwiększający ryzyko wystąpienia PCVD (40, 42) a obserwacje terenowe wskazują, że śmiertelność związana z PCVD może być znacznie wyższa w fermach, w których krąży jednocześnie PRRSV (7). Doświadczenia in vitro rzucają nieco światła na mechanizm tego zjawiska. Wykazano, że jednoczesne zakażenie PCV2 i PRRSV może indukować apoptozę limfocytów, i przez to przyczyniać się do występowania limfopenii u świń z PCVD (5). Zakażenia eksperymentalne potwierdzają te obserwacje. U świń zakażonych jednocześnie PCV2 i PRRSV stwierdzono znaczne obniżenie liczby limfocytów, a także innych populacji leukocytów, w porównaniu do zwierząt zakażonych tylko jednym z tych wirusów (46). Podsumowanie Dotychczasowe badania pozwoliły zidentyfikować szereg czynników podwyższających ryzyko wystąpienia PCVD, a także szereg mechanizmów związanych z patogenezą zakażeń PCV2. Opóźnienie humoralnej odpowiedzi immunologicznej oraz wzrost częstości chorób obserwowany w przebiegu PCVD jest skutkiem opisanych wielokierunkowych oddziaływań PCV2 na funkcjonowanie układu odpornościowego zakażonych świń, określanych często jako immunomodulacja. Zjawisko to nasila się w przypadku obecności dodatkowych czynników wpływających na układ immunologiczny i stymulujących replikację PCV2, takich stres czy zakażenia innymi patogenami. Konieczne są dalsze badania, które dostarczą odpowiedzi na pytanie jakie czynniki warunkują przejście subklinicznego zakażenia PCV2 w PCVD.

8 Piśmiennictwo 1. Allan, G. M., S. Kennedy, F. McNeilly, J. C. Foster, J. A. Ellis, S. J. Krakowka, B. M. Meehan, and B. M. Adair Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus. J Comp Pathol 121: Allan, G. M., F. McNeilly, J. Ellis, S. Krakowka, B. Meehan, I. McNair, I. Walker, and S. Kennedy Experimental infection of colostrum deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication. Arch Virol 145: Allan, G. M., F. McNeilly, M. McMenamy, I. McNair, S. G. Krakowka, S. Timmusk, D. Walls, M. Donnelly, D. Minahin, J. Ellis, P. Wallgren, and C. Fossum Temporal distribution of porcine circovirus 2 genogroups recovered from postweaning multisystemic wasting syndrome affected and nonaffected farms in ireland and Northern Ireland. J Vet Diagn Invest 19: Bratanich, A., and A. Blanchetot A gene similar to the human hyaluronanmediated motility receptor (RHAMM) gene is upregulated during Porcine Circovirus type 2 infection. Virus Genes 32: Chang, H. W., C. R. Jeng, C. M. Lin, J. J. Liu, C. C. Chang, Y. C. Tsai, M. Y. Chia, and V. F. Pang The involvement of Fas/FasL interaction in porcine circovirus type 2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus coinoculation-associated lymphocyte apoptosis in vitro. Vet Microbiol 122: Cheung, A. K., K. M. Lager, O. I. Kohutyuk, A. L. Vincent, S. C. Henry, R. B. Baker, R. R. Rowland, and A. G. Dunham Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in United States swine herds. Arch Virol 152: D'Allaire, S., C. Moore, and G. Cote A survey on finishing pig mortality associated with porcine circovirus diseases in Quebec. Can Vet J 48: Darwich, L., S. Pie, A. Rovira, J. Segales, M. Domingo, I. P. Oswald, and E. Mateu Cytokine mrna expression profiles in lymphoid tissues of pigs naturally affected by postweaning multisystemic wasting syndrome. J Gen Virol 84: Darwich, L., J. Segales, A. Resendes, M. Balasch, J. Plana-Duran, and E. Mateu Transient correlation between viremia levels and IL-10 expression in pigs subclinically infected with porcine circovirus type 2 (PCV2). Res Vet Sci 84: Drolet, R., R. Larochelle, M. Morin, B. Delisle, and R. Magar Detection rates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine circovirus type 2, and swine influenza virus in porcine proliferative and necrotizing pneumonia. Vet Pathol 40: Ellis, J. A., G. Allan, and S. Krakowka Effect of coinfection with genogroup 1 porcine torque teno virus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pigs. Am J Vet Res 69: Ellis, J. A., A. Bratanich, E. G. Clark, G. Allan, B. Meehan, D. M. Haines, J. Harding, K. H. West, S. Krakowka, C. Konoby, L. Hassard, K. Martin, and F. McNeilly Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs

9 with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome. J Vet Diagn Invest 12: Fenaux, M., T. Opriessnig, P. G. Halbur, F. Elvinger, and X. J. Meng Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo. J Virol 78: Firth, C., M. A. Charleston, S. Duffy, B. Shapiro, and E. C. Holmes Insights into the evolutionary history of an emerging livestock pathogen: porcine circovirus 2. J Virol 83: Gagnon, C. A., N. Music, G. Fontaine, D. Tremblay, and J. Harel. Emergence of a new type of porcine circovirus in swine (PCV): A type 1 and type 2 PCV recombinant. Vet Microbiol. 16. Gillespie, J., T. Opriessnig, X. J. Meng, K. Pelzer, and V. Buechner-Maxwell Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease. J Vet Intern Med 23: Grau-Roma, L., E. Crisci, M. Sibila, S. Lopez-Soria, M. Nofrarias, M. Cortey, L. Fraile, A. Olvera, and J. Segales A proposal on porcine circovirus type 2 (PCV2) genotype definition and their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence. Vet Microbiol 128: Grau-Roma, L., and J. Segales Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine circovirus type 2, swine influenza virus and Aujeszky's disease virus in cases of porcine proliferative and necrotizing pneumonia (PNP) in Spain. Vet Microbiol 119: Grierson, S. S., D. P. King, A. W. Tucker, M. Donadeu, M. A. Mellencamp, K. Haverson, M. Banks, and M. Bailey Ontogeny of systemic cellular immunity in the neonatal pig: Correlation with the development of post-weaning multisystemic wasting syndrome. Vet Immunol Immunopathol. 20. Harms, P. A., S. D. Sorden, P. G. Halbur, S. R. Bolin, K. M. Lager, I. Morozov, and P. S. Paul Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet Pathol 38: Hesse, R., M. Kerrigan, and R. R. Rowland Evidence for recombination between PCV2a and PCV2b in the field. Virus Res 132: Horlen, K. P., P. Schneider, J. Anderson, J. C. Nietfed, S. C. Henry, L. M. Tokach, and R. R. Rowland A cluster of farms experiencing severe porcine circovirus associated disease: Clinical features and association with the PCV2b genotype. Journal of Swine Health and Production 15: Karuppannan, A. K., M. H. Jong, S. H. Lee, Y. Zhu, M. Selvaraj, J. Lau, Q. Jia, and J. Kwang Attenuation of porcine circovirus 2 in SPF piglets by abrogation of ORF3 function. Virology 383: Karuppannan, A. K., S. Liu, Q. Jia, M. Selvaraj, and J. Kwang Porcine circovirus type 2 ORF3 protein competes with p53 in binding to Pirh2 and mediates the deregulation of p53 homeostasis. Virology. 25. Krakowka, S., J. Ellis, F. McNeilly, C. Waldner, D. M. Rings, and G. Allan Mycoplasma hyopneumoniae bacterins and porcine circovirus type 2 (PCV2)

10 infection: induction of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in the gnotobiotic swine model of PCV2-associated disease. Can Vet J 48: Krakowka, S., J. A. Ellis, F. McNeilly, S. Ringler, D. M. Rings, and G. Allan Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2). Vet Pathol 38: Kyriakis, S. C., K. Saoulidis, S. Lekkas, C. Miliotis Ch, P. A. Papoutsis, and S. Kennedy The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome. J Comp Pathol 126: Liu, J., I. Chen, and J. Kwang Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis. J Virol 79: McKeown, N. E., T. Opriessnig, P. Thomas, D. K. Guenette, F. Elvinger, M. Fenaux, P. G. Halbur, and X. J. Meng Effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) maternal antibodies on experimental infection of piglets with PCV2. Clin Diagn Lab Immunol 12: Meerts, P., G. Misinzo, D. Lefebvre, J. Nielsen, A. Botner, C. S. Kristensen, and H. J. Nauwynck Correlation between the presence of neutralizing antibodies against porcine circovirus 2 (PCV2) and protection against replication of the virus and development of PCV2-associated disease. BMC Vet Res 2: Meerts, P., G. Misinzo, F. McNeilly, and H. J. Nauwynck Replication kinetics of different porcine circovirus 2 strains in PK-15 cells, fetal cardiomyocytes and macrophages. Arch Virol 150: Nielsen, J., I. E. Vincent, A. Botner, A. S. Ladekaer-Mikkelsen, G. Allan, A. Summerfield, and K. C. McCullough Association of lymphopenia with porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Vet Immunol Immunopathol 92: Opriessnig, T., M. Fenaux, P. Thomas, M. J. Hoogland, M. F. Rothschild, X. J. Meng, and P. G. Halbur Evidence of breed-dependent differences in susceptibility to porcine circovirus type-2-associated disease and lesions. Vet Pathol 43: Opriessnig, T., N. E. McKeown, K. L. Harmon, X. J. Meng, and P. G. Halbur Porcine circovirus type 2 infection decreases the efficacy of a modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine. Clin Vaccine Immunol 13: Opriessnig, T., A. R. Patterson, D. M. Madson, N. Pal, M. Rothschild, D. Kuhar, J. K. Lunney, N. M. Juhan, X. J. Meng, and P. G. Halbur Difference in severity of porcine circovirus type two-induced pathological lesions between Landrace and Pietrain pigs. J Anim Sci 87: Opriessnig, T., E. L. Thacker, S. Yu, M. Fenaux, X. J. Meng, and P. G. Halbur Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus type 2. Vet Pathol 41:

11 37. Ostanello, F., A. Caprioli, A. Di Francesco, M. Battilani, G. Sala, G. Sarli, L. Mandrioli, F. McNeilly, G. M. Allan, and S. Prosperi Experimental infection of 3-week-old conventional colostrum-fed pigs with porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus. Vet Microbiol 108: Pallares, F. J., P. G. Halbur, T. Opriessnig, S. D. Sorden, D. Villar, B. H. Janke, M. J. Yaeger, D. J. Larson, K. J. Schwartz, K. J. Yoon, and L. J. Hoffman Porcine circovirus type 2 (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). J Vet Diagn Invest 14: Podgórska, K., T. Stadejek, Szczotka A., W. Kozaczyński, M. Porowski, and Z. Pejsak Występowanie poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego w krajowej populacji świń. Medycyna Wet 65: Pogranichniy, R. M., K. J. Yoon, P. A. Harms, S. D. Sorden, and M. Daniels Case-control study on the association of porcine circovirus type 2 and other swine viral pathogens with postweaning multisystemic wasting syndrome. J Vet Diagn Invest 14: Rose, N., E. Eveno, B. Grasland, A. C. Nignol, A. Oger, A. Jestin, and F. Madec Individual risk factors for Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in pigs: A hierarchical Bayesian survival analysis. Prev Vet Med. 42. Rose, N., G. Larour, G. Le Diguerher, E. Eveno, J. P. Jolly, P. Blanchard, A. Oger, M. Le Dimna, A. Jestin, and F. Madec Risk factors for porcine postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in 149 French farrow-to-finish herds. Prev Vet Med 61: Segales, J., M. Calsamiglia, A. Olvera, M. Sibila, L. Badiella, and M. Domingo Quantification of porcine circovirus type 2 (PCV2) DNA in serum and tonsillar, nasal, tracheo-bronchial, urinary and faecal swabs of pigs with and without postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Vet Microbiol 111: Segales, J., and E. Mateu Immunosuppression as a feature of postweaning multisystemic wasting syndrome. Vet J 171: Segales, J., A. Olvera, L. Grau-Roma, C. Charreyre, H. Nauwynck, L. Larsen, K. Dupont, K. McCullough, J. Ellis, S. Krakowka, A. Mankertz, M. Fredholm, C. Fossum, S. Timmusk, N. Stockhofe-Zurwieden, V. Beattie, D. Armstrong, B. Grassland, P. Baekbo, and G. Allan PCV-2 genotype definition and nomenclature. Vet Rec 162: Shi, K., H. Li, X. Guo, X. Ge, H. Jia, S. Zheng, and H. Yang Changes in peripheral blood leukocyte subpopulations in piglets co-infected experimentally with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2. Vet Microbiol 129: Shibahara, T., K. Sato, Y. Ishikawa, and K. Kadota Porcine circovirus induces B lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome. J Vet Med Sci 62: Timmusk, S., E. Merlot, T. Lovgren, L. Jarvekulg, M. Berg, and C. Fossum Regulator of G protein signalling 16 (RGS16) is a target for a porcine circovirus type-2 protein. J Gen Virol. 49. Tischer, I., D. Peters, R. Rasch, and S. Pociuli Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence. Arch Virol 96:39-57.

12 50. Vigre, H., P. Baekbo, S. E. Jorsal, V. Bille-Hansen, A. G. Hassing, C. Enoe, and A. Botner Spatial and temporal patterns of pig herds diagnosed with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) during the first two years of its occurrence in Denmark. Vet Microbiol 110: Vincent, I. E., C. Balmelli, B. Meehan, G. Allan, A. Summerfield, and K. C. McCullough Silencing of natural interferon producing cell activation by porcine circovirus type 2 DNA. Immunology 120: Woodbine, K. A., G. F. Medley, J. Slevin, A. L. Kilbride, E. J. Novell, M. J. Turner, M. J. Keeling, and L. E. Green Spatiotemporal patterns and risks of herd breakdowns in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome. Vet Rec 160: Yu, S., P. G. Halbur, and E. Thacker Effect of porcine circovirus type 2 infection and replication on activated porcine peripheral blood mononuclear cells in vitro. Vet Immunol Immunopathol 127:350-6.