Zastosowanie mikroorganizmów jako wektorów w antynowotworowych terapiach genowych

Transkrypt

1 Zastosowanie mikroorganizmów jako wektorów w antynowotworowych terapiach genowych Katarzyna Łepeta Anna Maria Łasica Elżbieta Katarzyna Jagusztyn- -Krynicka * Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa * Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, Warszawa; kjkryn@biol.uw.edu.pl Artykuł otrzymano 28 marca 2012 r. Artykuł zaakceptowano 20 czerwca 2012 r. Słowa kluczowe: nowotwór, szczepionka DNA, terapia genowa, wektor, LBV Wykaz skrótów: APC (ang. antigen presenting cell) komórka prezentująca antygen; IL-2 (ang. interleukin 2) interleukina 2; LBV (ang. attenuated live bacterial vaccine) atenuowane żywe bakteryjne szczepionki; MHC (ang. major histocompatibility complex) główny układ zgodności tkankowej; SPI1/2 (ang. Salmonella pathogenicity island 1 or 2) wyspa patogenności 1 lub 2 w komórkach Salmonella STRESZCZENIE Terapia genowa stanowi potencjalną nową strategię leczenia chorób nowotworowych. Aby dostarczyć transgen specyficznie do komórek nowotworowych, wymagane jest zastosowanie odpowiedniego wektora. Do tej pory większość genowych terapii nowotworowych opierało się na wykorzystaniu różnych wektorów wirusowych. Bakterie takie jak Salmonella, Clostridium lub niepatogenne Bifidobacterium selektywnie gromadzą się w guzach in vivo, co czyni je użytecznymi wektorami w terapii genowej nowotworów. Chociaż mechanizm transferu DNA z bakterii do komórek ssaków nie jest całkowicie poznany ich potencjał do dostarczania genów terapeutycznych do komórek nowotworowych wykazano in vitro i in vivo. Praca przeglądowa prezentuje najnowsze osiągnięcia terapii genowej nowotworów z wykorzystaniem bakterii. WPROWADZENIE Jednym z głównych problemów konwencjonalnych terapii antynowotworowych jest brak specyficzności leków wobec komórek nowotworowych, czego skutkiem jest ich toksyczność wobec wszystkich komórek, zarówno rakowych, jak i tych zdrowych. Dlatego badania dotyczące terapii antynowotworowych koncentrują się na poszukiwaniu metody, która umożliwiłaby selektywne działanie leków na komórki guza. Od około 20 lat prowadzone są intensywne badania dotyczące zastosowania antynowotworowych terapii genowych. Terapie te można zaklasyfikować do sześciu kategorii: terapie samobójcze (ang. suicide- -gene therapy), terapie mające na celu przywrócenie właściwego cyklu komórkowego poprzez dostarczenie prawidłowych kopii uszkodzonych genów (ang. corrective gene addition), terapie immunomodulujące, terapie blokujące procesy angiogenezy, terapie powodujące wyciszanie genów oraz terapie onkolityczne. Jako wektory dostarczające do komórek nowotworowych odpowiednie geny stosowane były w początkowych badaniach głównie wektory wirusowe takie jak adenowirusy, retrowirusy, HSV (ang. herpex simplex virus) oraz plazmidowy DNA [1-3]. Także bakterie od wielu lat próbowano wykorzystywać w walce z chorobami nowotworowymi. Od ponad 200 lat opisywane były przypadki regresji chorób nowotworowych u pacjentów przechodzących infekcje bakteryjne, np. już w 1813 roku odnotowano regresję nowotworu u pacjenta z objawami zgorzeli gazowej spowodowanej infekcją Clostridium perfringens. Stosowano celowe infekcje, które w wielu przypadkach prowadziły do regresji lub całkowitego zaniku guza. Przykładem mogą być tzw. toksyny Coley a (mieszanina zabitych temperaturą komórek Streptococcus pyogenes i Serratia marcescens) stosowane jako stymulatory układu odpornościowego w terapiach mięsaków [4,5]. W roku 1976 po raz pierwszy udokumentowano terapeutyczne działanie prątków BCG (ang. Bacillus Calmette-Guerin) w leczeniu powierzchniowego raka pęcherza moczowego (ang. superficial bladder cancer). Terapia ta stosowana jest do dzisiaj, choć dopiero niedawno częściowo wyjaśniono mechanizm tego zjawiska [6]. Ponadto, prątki BCG są stosowane jako stymulujący adiuwant w kilku typach antynowotworowych szczepionek np. OncoVAX czy CancerVax [7,8]. Wiele gatunków bakterii preferencyjnie kolonizuje obszary guzów nowotworowych charakteryzujące się silnym niedotlenieniem. Rozwój inżynierii genetycznej pozwolił na manipulowanie materiałem genetycznym mikroorganizmów i oszacowanie ich skuteczności jako wektorów w antynowotworowych terapiach genowych. Bakterie stosowane jako nośniki genów w omawianych terapiach należą do trzech grup: bakterie mlekowe z rodzaju Bifidobacterium, fakultatywne wewnątrzkomórkowe patogeny np. rodzaj Salmonella oraz ściśle beztlenowe bakterie rodzaju Clostridium [9,10]. Jak dotąd nie udało się skonstruować bezpiecznego i absolutnie skutecznego wektora do zastosowania w antynowotworowej terapii genowej, powodującego zniszczenie wszystkich typów komórek nowotworowych bez poważnych efektów ubocznych. Praca przeglądowa przedstawia osiągnięcia ostatnich lat dotyczące użycia żywych komórek bakteryjnych oraz spor bakterii rodzaju Clostridium

2 MECHANIZM TUMOR-TARGETING SELEKTYWNA KOLONIZACJA KOMÓREK NOWOTWOROWYCH W toku wieloletnich badań udokumentowano, że różne gatunki obligatoryjnych i fakultatywnych anaerobowych mikroorganizmów preferencyjnie kolonizują i są zdolne selektywnie replikować się w guzach litych, jeśli bakterie dostarczane są ogólnoustrojowo. Powodem tej selektywności są panujące wewnątrz guzów unikalne warunki. Rozwój guza i przerzutów stymuluje angiogenezę czyli formowanie nowych naczyń krwionośnych. Są one jednak mocno nieuorganizowane, ich wyściółka endotelialna jest niekompletna, często mają też ślepe końce. Prowadzi to do spowolnionego przepływu krwi i nieefektywnego dostarczania składników odżywczych oraz tlenu do komórek guzów nowotworowych. W efekcie w obrębie guza powstają regiony hipoksji i anoksji, co promuje wzrost bakterii fakultatywnie i obligatoryjnie beztlenowych. Jednocześnie występująca w obrębie guzów nekroza dostarcza składników odżywczych niezbędnych do wzrostu mikroorganizmów. Panujące w guzach unikalne warunki określa się często mianem sanktuarium immunologicznego, jako że obserwuje się w nich zjawisko restrykcji składników układu odpornościowego; bezpośrednim skutkiem tego zjawiska jest zahamowanie mechanizmów usuwania bakterii. Opisane cechy tego mikrośrodowiska faworyzują więc selektywne namnażanie bakterii anaerobowych. Obserwacje te spowodowały rozwój badań nad zastosowaniem niektórych gatunków bakterii jako wektorów do dostarczania odpowiednich genów specyficznie do tkanek nowotworowych (tzw. tumor targeting ) [9, 10]. SALMONELLA SPP. Jednymi z najdokładniej opisanych bakterii potencjalnie użytecznych w terapii antynowotworowej są mikroorganizmy rodzaju Salmonella, gramujemne względnie beztlenowe, wewnątrzkomórkowe patogeny, które kolonizują guzy człowieka i to zarówno te większe, jak i mniejsze, lepiej natlenione. Szczep dziki S. enterica sv. Typhimurium powoduje głównie zakażenia jelitowe, które nie leczone mogą wywoływać ogólnoustrojowe infekcje. W celu odpowiedzi na pytanie, jaki mechanizm jest odpowiedzialny za infekcje i wzrost Salmonella w guzach po iniekcji dożylnej lub iniekcji do jamy otrzewnej konieczne były badania nad rolą dwóch głównych wysp patogenności zlokalizowanych na chromosomie S. enterica sv. Typhimurium, SPI1 oraz SPI2. We wnętrzu guza znajdują się leukocyty infiltrujące makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty i neutrofile o właściwościach antybakteryjnych. Zdolność bakterii Salmonella do pokonania tych barier i przeżycia jest nieodzowna w jej zastosowaniu jako wektora antyrakowego. W obrębie SPI1 Salmonella enterica sv. Typhimurium znajdują się geny kodujące białka budujące system sekrecyjny typu III, który odgrywa kluczową rolę w procesach inwazyjności (np. wnikanie do enterocytów). Geny SPI2 warunkują przeżycie bakterii we wnętrzu makrofagów i komórek epitelialnych. Aktywność genów SPI2 jest niezbędna dla wywołania antynowotworowego efektu przez S. enterica sv. Typhimurium poprzez warunkowanie namnażania bakterii w komórkach guza. Mutanty w genach SPI1 charakteryzują się znacząco zredukowaną zdolnością do inwazji, nie wpływa to jednak na indukowany efekt antynowotworowy [9]. Pomimo poznania roli SPI2 w procesie tropizmu w stosunku do komórek nowotworowych, mechanizm działania antynowotworowego produktów genów kodowanych w obrębie tej wyspy patogenności pozostaje nadal niewyjaśniony i wymaga dalszych badań. Zdolność bakterii z rodzaju Salmonella do wewnątrzkomórkowej inwazji i proliferacji w obrębie guzów potwierdzona została w badaniach z wykorzystaniem bakterii produkujących białko GFP (ang. Green Fluorescent Protein, zielone białko fluoryzujące). Zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo na modelu mysim, bakterie z rodzaju S. enterica sv. Typhimurium, w których ekspresji ulegało GFP, były zdolne do wzrostu i replikacji wewnątrz komórek nowotworowych. Ponadto, po 6 dniach od dożylnej aplikacji szczepu S. enterica sv. Typhimurium A1, liczba bakterii w zdrowych tkankach zaczęła spadać, a po 15 dniach od iniekcji bakterie lokalizowały się jedynie w obrębie guzów [12]. Ze względu na wysoką toksyczność związaną z zastosowaniem patogennego dla człowieka mikroorganizmu, stosowanie bakterii rodzaju Salmonella w terapii antynowotworowej wymagało konstrukcji atenuowanego szczepu. Za wysoki poziom immunostymulacji odpowiedzialny jest głównie LPS, składnik błony zewnętrznej bakterii, indukujący między innymi produkcję TNF-α. W celu obniżenia toksyczności skonstruowano auksotroficzny szczep VNP20009 ze zmodyfikowanym lipidem A. Szczep ten posiada delecje w genach msbb oraz puri. Produkt genu msbb jest niezbędny do terminalnej mirystylacji lipidu A, natomiast delecja puri wywołuje konieczność dostarczenia zewnętrznego źródła adeniny. Mutanty te, badane na modelu mysim, w znacznie mniejszym stopniu indukowały produkcję TNF-α gospodarza, co skutkowało obniżeniem toksyczności przy jednoczesnym zachowaniu specyficzności wobec komórek nowotworowych oraz opóźniało wzrost guza. Kolejne badania z zastosowaniem atenuowanego szczepu S. enterica waan (uprzednio: msbb) oraz puri potwierdziły obniżoną patogenność oraz podwyższoną zdolność do kolonizacji obszarów nowotworowych ze względu na podwyższony w tych regionach poziom adeniny [13,14]. Tak więc szczep VNP20009 powinien być odpowiednim kandydatem do konstrukcji bezpiecznych wektorów o potencjalnym zastosowaniu w terapii antynowotworowej. Niemniej jednak, w trakcie pierwszej fazy testów klinicznych u pacjentów z przerzutowym czerniakiem oraz z przerzutowym rakiem nerkowokomórkowym nie potwierdzono jego właściwości terapeutycznych. U żadnego z pacjentów nie zaobserwowano regresji choroby nowotworowej po dożylnym podaniu szczepu VNP20009, a jedynie u trzech pacjentów guzy były kolonizowane przez komórki Salmonella [15]. Przyczyny tego zjawiska nie są znane. Dane z ostatnio przeprowadzonych doświadczeń z wykorzystaniem szczepu VNP20009 na modelu mysim wykazały zależność jego skuteczności od drogi podania preparatu. Po doustnej aplikacji znacząca liczba podanych bakterii lokalizowała się w rejonie guzów, skutkując spowolnieniem wzrostu guza oraz zwiększoną przeżywalnością zwierząt. Jednoczesne podanie bakterii i cyklofosfamidu zwiększyło terapeutyczny efekt chemioterapii silnie indukując apoptozę komórek nowotworowych bez istotnej toksyczności dla całego organizmu [16]. W fazie doświadczeń są inne auksotroficzne szczepy S. enterica, które także charakteryzują się preferencyjną kolonizacją nowotworów np. szczep A1, auksotrof wymagający do wzrostu Postępy Biochemii 58 (3)

3 leucyny i argininy [12,17]. Bakterie rodzaju Salmonella stosowano również w połączeniu z konwencjonalnymi metodami terapii antynowotworowej, takimi jak chemio- czy radioterapia, w wyniku czego nastąpiło podwyższenie skuteczności tych metod w badaniach na myszach [9,17,18]. CLOSTRIDIUM SPP. Innymi mikroorganizmami o potencjalnym zastosowaniu w terapii antynowotworowej są gramdodatnie, beztlenowe wytwarzające spory, bakterie rodzaju Clostridium. Wiele, z około 80 gatunków tego rodzaju, było testowanych pod kątem potencjalnego zastosowania w terapiach antynowotworowych. Pierwsze odnotowane przez Vautier a przypadki wyleczenia raka powiązane z infekcją bakteryjną miały miejsce już w 1813 roku na skutek przebycia zgorzeli gazowej. Ponad 130 lat później, w 1947 roku, po raz pierwszy zaobserwowano onkolizę i regresję mięsaka u myszy po iniekcji spor Clostridium histolyticum do guza. Zmniejszeniu masy nowotworowej towarzyszyła jednak silna toksyczność dla organizmu, powodująca śmierć większości zwierząt. Również zastosowanie w podobnych doświadczeniach spor patogennego mikroorganizmu C. tetani wywoływało śmierć zwierząt związaną z wysoką toksycznością. Badania nad niepatogennymi fakultatywnymi tlenowcami Bacillus subtilis i Bacillus mesentericus wykazały, że nie wszystkie sporujące bakterie zdolne do wzrostu w warunkach beztlenowych wykazują podobny efekt antynowotworowy, jako że spory Bacillus przygotowane w ten sam sposób, nie indukowały procesu onkolizy. Na podstawie tych badań sformułowano hipotezę, że chociaż u podstawy zastosowania bakterii rodzaju Clostridium w terapii antynowotworowej leży zdolność mikroorganizmów do namnażania w warunkach beztlenowych, istotne są również inne, nie do końca scharakteryzowane czynniki. W terapiach antynowotworowych mogłyby potencjalnie znaleźć zastosowanie również zmodyfikowane genetycznie niepatogenne gatunki rodzaju Clostridium takie jak np. C. sporogenes, C. acetobutylicum, C. oncolyticum czy C. novyi [4]. Wykazano istotne różnice w skuteczności działania spor zależnie od użytego w doświadczeniach gatunku. Z przebadanych przez Vogelstein i wsp. 26 gatunków anaerobowych bakterii najwyższym poziomem kolonizacji guzów nowotworowych charakteryzował się gatunek C. novyi [19]. Ze względu na wysoką toksyczność dzikiego szczepu, skonstruowano atenuowany szczep C. novyi-nt pozbawiony genu kodującego toksynę. Jednak efekty terapeutyczne odnotowano tylko w połączeniu z chemioterapią [19,20]. Ostatecznie kombinowana terapia w postaci aplikacji szczepu C. novyi-nt z chemioterapeutykami oddziałującymi na mikrotubule okazała się obiecująca i znajduje się obecnie w trakcie I fazy badań klinicznych [21]. Podobne doświadczenia wykonane z użyciem innych gatunków rodzaju Clostridium także udokumentowały celowość stosowania terapii łączonych. Niestety niektóre z przebadanych strategii pomimo powodowania regresji guzów prowadziły do śmierci zwierząt doświadczalnych [19, 20]. Ponadto, nie zawsze wyniki uzyskane podczas doświadczeń na modelach mysich pokrywały się z tymi otrzymanymi podczas badań klinicznych [4,5]. Ponieważ bakterie rodzaju Clostridium są obligatoryjnymi beztlenowcami spory posiadają zdolność do kiełkowania wyłącznie w guzach o odpowiednio dużych rozmiarach, gwarantujących dogodne dla tej bakterii warunki anoksji; mniejsze guzy są stosunkowo dobrze napowietrzone i odżywiane. Również zewnętrzne warstwy litych guzów po onkolitycznych terapiach pozostawały często nienaruszone, co w konsekwencji prowadziło do rozwoju nowotworu. Ta obserwacja także uzasadnia konieczność łączenia różnych strategii terapeutycznych. BIFIDOBACTERIUM SPP. Opisane dotychczas dwa rodzaje mikroorganizmów: Salmonella i Clostridium są patogenami człowieka, ich zastosowanie wiąże się więc z koniecznością konstrukcji szczepów atenuowanych, ale nadal zachowujących tropizm wobec komórek nowotworowych. Problem ten nie dotyczy bakterii rodzaju Bifidobacterium, gramdodatniego, niesporującego beztlenowego mikroorganizmu naturalnie występującego w przewodzie pokarmowym człowieka i innych ssaków. Zaliczany jest on do probiotyków oraz do grupy bakterii GRAS (ang. Generalny Regarded As Safe), jednocześnie wykazując zdolność do kolonizacji guzów nowotworowych, co czyni ten mikroorganizm potencjalnie bezpieczniejszym wektorem w terapii antyrakowej. Aby zbadać faktyczne powinowactwo bakterii do guzów nowotworowych, liofilizat Bifidobacterium wstrzyknięto myszom z rakiem Ehrlicha (rak jelita grubego i odbytu) i badano przeżywalność oraz proliferację bakterii, wstrzykując dootrzewnowo laktulozę, cukrowy substrat metabolizowany przez ten mikroorganizm, ale nie przez komórki ssaków. Dożylne podanie laktulozy zwiększyło tempo wzrostu i poziom przeżywalności bakterii, których znacząca liczba lokalizowana była w obrębie guza, potwierdzając w ten sposób zdolność Bifidobacterium do preferencyjnego kolonizowania guzów. Ponieważ zastosowanie Bifidobacterium nie przyniosło spodziewanych efektów antynowotworowych, w przeciwieństwie do opisanych uprzednio onkolitycznych właściwości związanych z podaniem bakterii z rodzaju Salmonella oraz Clostridium, kolejne badania skupiły się na ocenie potencjalnego zastosowania Bifidobacterium do dostarczania odpowiednich genów efektorowych do guzów. W tym celu Yazawa i wsp. sklonowali na plazmidzie gen warunkujący oporność na spektynomycynę. Transformowane nim bakterie B. longum wprowadzono do mysich komórek czerniaka (B16-F10) oraz raka płuc Lewis a. Kolonie bakteryjne oporne na spektynomycynę wyizolowano jedynie z komórek rakowych, co udokumentowało że bakterie są zdolne do dostarczenia kodowanych na plazmidzie genów efektorowych i potencjalnie mogą znaleźć zastosowanie w terapii antynowotworowej [22]. Trzeba jednak podkreślić, że poziom kolonizacji guzów przez mikroorganizmy rodzaju Bifidobacterium jest niższy niż ten udokumentowany dla mikroorganizmów rodzaju Salmonella i Clostridium. Dodatkowo zauważono, że mikroorganizmy rodzaju Bifidobacterium nie rozprzestrzeniają się intensywnie w obrębie guza, co może ograniczać zakres działania genu efektorowego. Ponadto, bakterie z rodzaju Bifidobacterium nie wytwarzają spor, co czyni je bardziej wrażliwymi na zmienne warunki, a w związku z tym nieco trudniejsze w hodowli i przechowywaniu [4]. ZASTOSOWANIE BAKTERII JAKO WEKTORÓW DOSTARCZAJĄCYCH GENY CYTOTOKSYCZNE Zastosowanie bakterii z rodzaju Bifidobacterium, Clostridium i Salmonella jako żywego wektora do dostarczania genów bezpośrednio indukujących śmierć komórek nowotworowych polega na wprowadzeniu genów należących do dwóch głównych kategorii, genów pro-apoptotycznych lub 316

4 tzw. genów samobójczych (ang. suicide genes). Badanych i opisanych przykładów wykorzystania bakterii w terapiach samobójczych jest wiele, opierają się one jednak na podobnym schemacie tzw. systemie prolek enzym. Zdecydowaną większość badań wykonano z użyciem atenuowanego szczepu S. enterica VNP20009 lub jego pochodnych stosowanych jako nośniki odpowiednich genów. Szczep VNP20009 wykazuje wysoką zdolność do kolonizacji guzów przy jednoczesnej stosunkowo niskiej toksyczności. Po raz pierwszy antynowotworowe właściwości tego szczepu udokumentowali w 1997 roku Pawelek i wsp., rozpoczynając serię badań z wykorzystaniem rożnych genów efektorowych i różnych pochodnych tego szczepu [13,23]. Chociaż bakterie nie mogą przeprowadzać niektórych ssaczych potranslacyjnych modyfikacji białek, jest wiele protein efektorowych, które nie wymagają takich modyfikacji i potencjalnie mogą być skuteczne w genowych terapiach antynowotworowych. Należy do nich np. kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (HSV-TK). Dostarczenie przez S. enterica sv. Typhimurium plazmidu z genem kodującym HSV-TK wraz z aplikacją proleku gancyklowiru, analogu nukleozydów, aktywowanego przez ten enzym, prowadziło do znacznego zmniejszenia rozmiaru guzów. Spowodowane było to aktywacją proleku do jego chemioterapeutycznej formy poprzez enzym kodowany przez gen dostarczony na wektorze bakteryjnym [24]. Innym przykładem o podobnym mechanizmie była konstrukcja plazmidu zawierającego gen kodujący epnp (fosforylaza nukleozydów purynowych Escherichia coli) wyrażany z silnego promotora CMV (ang. cytomegalovirus). Plazmidem tym stransformowano atenuowany szczep S. enterica sv. Typhimurium i przebadano efekt jego aplikacji wraz z MePdR (2-deoksyryboza 6-metylopurynowa). Enzym epnp powodował konwersję nietoksycznego proleku w wysoce toksyczną 6-metylopurynę (6-MeP) [25]. MeP ma właściwości cytotoksyczne i antyproliferacyjne, co prowadzi do śmierci komórek w wyniku ich spontanicznej apoptozy. W doświadczeniach in vivo, przeprowadzonych na myszach z rakiem trzustki, obserwowano znaczącą regresję guza, nawet w przypadku guzów dużych rozmiarów, w wielu przypadkach prowadzącą nawet do całkowitego zaniku guza. Działaniu temu towarzyszyły jednak silne efekty uboczne. Dalsze badania i ewentualne ulepszanie tego systemu daje jednak duże szanse opracowania skutecznej terapii dla pacjentów z rakiem trzustki, którego leczenie jak do tej pory jest bardzo mało skuteczne [26]. System epnp/mepdr w wielu eksperymentach stanowił efektywną strategię typu gen samobójczy/ prolek. Udokumentowano znaczącą jego antyrakową aktywność w przypadku raka jajnika, glejaka, czerniaka, raka prostaty, trzustki, wątroby i pęcherza. W kolejnych badaniach stosowano również system epnp/mopdr (2 -deoksyryboza 6-metoksypurynowa), w wyniku działania którego zamiast metylopuryny powstaje metoksypuryna, indukująca również spontaniczną apoptozę komórek [25]. Jest możliwe, że jednoczesna obecność komórek ulegających apoptozie, bakteryjnych produktów jak np. lipopolisacharydy oraz bakteryjnego DNA, mogłaby działać jako sygnał o niebezpieczeństwie dla infiltrujących komórek układu odpornościowego. Lokalna obfitość tych sygnałów, związana z fagocytozą martwych komórek rakowych przez makrofagi, ze sporym prawdopodobieństwem jest zdolna zainicjować odpowiedź immunologiczną wobec specyficznych rakowych antygenów i zwiększyć spontaniczną apoptozę komórek guza. W celu zwiększenia efektu terapeutycznego szczepu VNP20009, skonstruowano jego pochodną, szczep TAPET-CD niosący gen E. coli kodujący deaminazę cytozyny (CD), enzym warunkujący konwersję nietoksycznej 5-fluorocytozyny (5-FC) w 5-fluorouracyl (5-FU), fluorową pochodną uracylu, mającą działanie cytostatyczne. Działanie antynowotworowe 5-FU polega na inhibicji syntazy tymidylanowej, enzymu odpowiedzialnego za biosyntezę monofosforanu tymidyny (TMP). Niski poziom TMP powoduje zakłócenia replikacji DNA oraz zahamowanie proliferacji komórek rakowych [27]. Po pozytywnych wynikach otrzymanych na modelu mysim, we wstępnych badaniach klinicznych z wykorzystaniem TA- PET-CD, trzem pacjentom zaaplikowano badany preparat bezpośrednio do guza po czym podano im 5-FC. Pomimo zaobserwowania u dwu pacjentów kolonizacji guza przez mikroorganizmy przez okres 15 dni oraz przekształcenia 5-FC w 5-FU ta strategia nie wykazała znaczących efektów terapeutycznych [28]. Natomiast obiecujące wyniki otrzymano w badaniach z zastosowaniem pochodnej szczepu VNP20009 niosącej gen kodujący karboksypeptydazę G2 (CG2), gdy rekombinowane bakterie dostarczane były wraz z prolekiem. CG2 katalizuje przekształcenie zastosowanego proleku w silnie reaktywne związki alkilujące, które penetrują do wnętrza komórki uszkadzając DNA i powodując śmierć komórek nowotworowych, nie wpływając ujemnie na wzrost bakterii i ich dalsze powielanie. Zarówno w badaniach in vitro z użyciem ludzkich linii nowotworowych, jak i in vivo na modelu mysim odnotowano znaczny efekt onkolityczny i redukcję wzrostu guza [29]. Aby zapewnić lepszą kontrolę oraz dodatkowo zwiększyć antyrakowe właściwości wprowadzanych genów, rozpoczęto badania nad systemem regulacji ich ekspresji. W doświadczeniach dotyczących wewnątrzguzowej indukcji genów użyto dwóch systemów promotor/gen reporterowy. W pierwszym z nich zastosowano komórki rodzaju Salmonella niosące gen lucyferazy wyrażany z promotora wrażliwego na tetracyklinę [30]. Po dożylnym podaniu myszom anhydrotetracykliny obserwowano produkcję lucyferazy w komórkach nowotworu, gdzie preferencyjnie lokalizowały się bakterie niosące plazmid z genem reporterowym [9]. W drugim z badanych systemów sklonowany w komórkach Salmonella gen kodujący kolicynę E3 znajdował się pod kontrolą promotora zależnego od sygnałów naprawy DNA, SOS. Kolicyna E3 hamuje proliferację komórek nowotworowych; natomiast zastosowany promotor warunkuje ekspresję kontrolowanych przez niego genów w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W tych doświadczeniach obserwowano produkcję kolicyny wewnątrz guza po dootrzewnowej iniekcji mitomycyny C lub po potraktowaniu promieniowaniem X powodującym uszkodzenia DNA i indukcję ekspresji z promotora wrażliwego na SOS. Dodatkowe badania dotyczące mutantów recn wykazały ich zwiększoną wrażliwość na indukcję produkcji wewnątrz guza kolicyny eksprymowanej pod kontrolą analizowanego promotora [9]. Zastosowanie indukowalnych promotorów umożliwiłoby precyzyjną kontrolę ekspresji genów o właściwościach antynowotworowych pozwalając np. na włączenie ekspresji w momencie, gdy znacząca liczba bakterii dotarłaby już do guza, wywołując silniejszy efekt przy minimalizacji działania genu efektorowego poza obszarem nowotworu. Postępy Biochemii 58 (3)

5 Przykładem zastosowania bakterii do indukcji specyficznej dla nowotworu apoptozy pod kontrolą indukowalnego promotora jest wykorzystanie szczepu Salmonella VNP20009 eksprymującego TRAIL pod kontrolą prokariotycznego promotora genu reca. Zewnątrzkomórkowa domena związanego z TNF ligandu indukującego apoptozę (TRAIL) jest silnym induktorem apoptozy w komórkach nowotworowych, o minimalnej toksyczności wobec komórek zdrowych. Promotor genu reca prokariotów uczestniczy w odpowiedzi SOS włączanej w wyniku uszkodzeń DNA. Zaindukowana promieniowaniem gamma ekspresja genu kodującego TRAIL z promotora reca z wprowadzonego przez szczep VNP20009 wektora wywołała redukcję guzów u myszy [31]. Podobne wyniki otrzymano z zastosowaniem B. longum [32]. Od niedawna rozwój inżynierii genetycznej umożliwił konstruowanie rekombinowanych szczepów bakterii rodzaju Clostridium. Jeden z głównych systemów prolek/enzym opierający się na zastosowaniu Clostridium spp. jako wektora wykorzystuje deaminazę cytozynową (CD) E. coli. Gen kodujący CD sklonowano na wektorze Clostridium beijerincki pod kontrolą silnego promotora, uzyskując wysoki poziom ekspresji genu kodującego ten enzym w komórkach rakowych, co prowadziło do uszkodzeń DNA i RNA w wyniku aktywacji 5-FU. Inną strategią wykorzystującą jako wektor Clostridium beijerinckii jest system nitroreduktaza/cb1954 nitroreduktaza (NTR) E. coli. NTR metabolizuje CB1954 (5-azyrydynylo-2,4-dinitrobenzamid) w silnie alkilujący czynnik prowadzący do powstania cross-links w DNA, co doprowadza do śmierci komórki. Chociaż badane układy ekspresyjne wykazały aktywność obu systemów in vitro, to efekt terapeutyczny w badaniach na zwierzętach nie był wystarczający. Było to prawdopodobnie spowodowane niskim poziomem kolonizacji guzów in vivo. W początkowych badaniach stosowano szczepy sacharolityczne, które kolonizują guzy z częstością 1000 krotnie niższą niż szczepy proteolityczne [4]. W 2006 roku opracowano metodykę manipulacji materiałem genetycznym szczepów proteolitycznych takich jak np. C. novyi-nt, którego możliwość zastosowania w terapiach antynowotworowych jest w trakcie badań klinicznych [21,33]. Analogicznie do opisanych powyżej doświadczeń z zastosowaniem 5-FC lub NTR, znacznie lepszy efekt antynowotworowy uzyskano w przypadku szczepów proteolitycznych w porównaniu do uprzednio stosowanych szczepów sacharolitycznych [4]. Podobne badania, choć nie tak intensywne jak w odniesieniu do Salmonella i Clostridium były prowadzone z użyciem mikroorganizmów rodzaju Bifidobacterium. Skonstruowano szczepy B. longum i B. breve eksprymujące deaminazę cytozyny CD. Dożylne wstrzyknięcie tych bakterii wraz z jednoczesnym podaniem proleku 5-FC skutkowało aktywacją proleku do jego aktywnej formy w rejonach guza [34,35]. Opisana już powyżej na przykładzie Salmonella terapia z użyciem kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (HSV-TK) w połączeniu z aplikacją gancyklowiru (HSV- -TK/GCV) okazała się również efektywna w przypadku użycia Bifidobacterium infantis jako żywego wektora. Bakterie niosące gen kodujący kinazę tymidynową wstrzyknięto szczurom z nowotworem pęcherza moczowego, podając jednocześnie gancyklowir. Skutkiem tego było zahamowanie wzrostu guza oraz apoptoza komórek nowotworowych, prawdopodobnie w wyniku zwiększonej ekspresji genu kodującego kaspazę 3 [34]. ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW W CELU MODULACJI ANTYNOWOTWOROWEJ AKTYWNOŚCI UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO Układ odpornościowy ma za zadanie ochronę organizmu przed chorobami, identyfikację i likwidację czynników infekcyjnych oraz komórek nowotworowych. W celu jego prawidłowego działania niezbędne jest rozróżnienie między patogenami bądź tkankami nowotworowymi a zdrowymi komórkami i tkankami. Cechą charakterystyczną systemu odpornościowego jest tolerancja dla protein niskoimmunogennych, do których należą m.in. białka nowotworowe. Dlatego też jednym z głównych celów w terapii antyrakowej jest złamanie tej tolerancji i podwyższenie poziomu odpowiedzi odpornościowej wobec komórek nowotworowych. Obiecujące wyniki uzyskano wykorzystując do tego celu bakterie jako nośniki szczepionek DNA. Szczepionki DNA to bakteryjne plazmidy, które zostały tak skonstruowane, aby specyficzny antygen ulegał ekspresj pod kontrolą eukariotycznego promotora, co pozwala na ekspresję heterologicznych genów w komórkach ssaczych. Plazmid stosowany jako szczepionka DNA zawiera ponadto terminator warunkujący zakończenie transkrypcji genu, obszary DNA warunkujące replikację plazmidu oraz marker selekcyjny ułatwiający produkcję plazmidów w transformowanych bakteriach. Poza kodowaniem jednego lub kilku antygenów, szczepionki te mogą również zawierać geny, których produkty charakteryzują się działaniem immunostymulacyjnym bądź immunomodulacyjnym. Szczepionki DNA podawane są m.in. domięśniowo lub podskórnie, bądź też obcy plazmidowy DNA może być dostarczany do organizmu uodparnianego przez odpowiednie szczepy bakteryjne. Kodowany na plazmidzie antygen jest produkowany w komórkach gospodarza głównie w profesjonalnych komórkach prezentujących antygen (APCs), co prowadzi do stymulacji odpowiedzi odpornościowej, przede wszystkim do pobudzenia naiwnych limfocytów T CD8+ poprzez prezentację antygenu eksprymowanego wewnątrz komórki przy udziale MHC klasy I. Rozpoznanie to prowadzi do pobudzenia funkcji efektorowych limfocytów T CD8+, a w konsekwencji do produkcji cytotoksycznych cząsteczek w celu lizy eksprymujących dany antygen komórek, jak również do stymulacji sekrecji cytokin, które wpływają na poziom transkrypcji wielu genów w docelowych komórkach oraz rekrutują inne komórki układu odpornościowego. Biorą one także udział w procesie apoptozy poprzez oddziaływanie Fas-Fas ligand [36-38]. Dodatkowo, jako że wykorzystywane bakteryjne plazmidy DNA zawierają niemetylowane motywy CpG podanie tego typu preparatu prowadzi do stymulacji wrodzonego układu odpornościowego poprzez interakcję z receptorami TLR 9 (ang. Toll-like receptor 9) [36,39]. W ostatnich latach badania dotyczące zastosowania szczepionek DNA w walce z rakiem nabrały nowego wymiaru ponieważ dowiedziono, że wiele komórek nowotworowych koduje tzw. antygeny związane z nowotworem (TAA, ang. tumor associated antigens), zdolne do indukcji długotrwałej odporności. Do tej pory zidentyfikowanych zostało już wiele specyficznych dla ludzkich nowotworów antygenów, będących 318

6 celem działania dla limfocytów T CD8+. Pierwszym z nich był antygen MAGE-1 (ang. Melanoma Antigen 1). Pośród zidentyfikowanych antygenów jest wiele obiecujących kandydatów do zastosowania jako cele w immunoterapii raka. Dostarczenie szczepionek DNA kodujących nowotworowy antygen bądź jego epitopy działało skutecznie w doświadczeniach wykonywanych na modelach zwierzęcych i dotyczących terapii różnych rodzajów nowotworów, takich jak czerniak, nerwiak płodowy i wielu gruczolakorakach. Efektywną ochronę zaobserwowano m.in. w przypadku fuzji epitopu gp100 (antygen związany z czerniakiem) i TRP2 (ang. tyrosine-related protein-2) z ubikwityną; połączeniu epitopu hydroksylazy tyrozynowej z ubikwityną czy też immunizacji przy użyciu antygenu PSA (ang. prostate-specific antygen) [3,38]. Badania przeprowadzone na modelu mysim z implantowanymi guzami dostarczyły przekonywujących dowodów dokumentujących zdolność limfocytów T CD8+ do odrzucenia nowotworu. Ponadto, udowodniono, że otrzymanie in vitro autologicznych, specyficznych wobec antygenu/ów komórek nowotworowych limfocytów T CD8+, a następnie podanie ich pacjentom, w wielu przypadkach prowadziło do regresji guza. Jednak wiele badań, przeprowadzonych m.in. przez Conry- ego i wsp. pokazało, że domięśniowe bądź podskórne podanie nagich plazmidowych szczepionek wywoływało jedynie słabą odpowiedź u pacjentów z chorobą nowotworową [40,41]. Konieczne stało się wiec poszukiwanie sposobów powodujących zwiększenie immunogenności tych szczepionek. Dwie główne strategie stosowane w tym celu obejmują modyfikację sposobu podania preparatu (zastosowanie szczepów bakteryjnych jako nośników) oraz zastosowanie adiuwantów, substancji modulujących odpowiedź immunologiczną lub wręcz pozwalających na jej wywołanie. Dzięki zastosowaniu tych preparatów odpowiedź odpornościowa może zostać zaindukowana nawet wobec antygenów, które normalnie nie są zauważane przez układ odpornościowy. Niewątpliwą zaletą szczepionek zawierających plazmidowy DNA jest ich stosunkowa łatwość wytwarzania oraz potwierdzone w wielu badaniach bezpieczeństwo. Obecnie wiele z tych produktów znajduje się w później fazie testów klinicznych [1,42-44]. LBV ATENUOWANE BAKTERIE JAKO WEKTORY SZCZEPIONEK DNA W GENOWEJ TERAPII ANTYNOWOTWOROWEJ Najbardziej obiecującym sposobem wprowadzenia plazmidów eksprymujących eukariotyczny antygen (szczepionki DNA) w celu indukcji skutecznej odpowiedzi immunologicznej wobec komórek nowotworowych jest użycie szczepionek wykorzystujących atenuowane wewnątrzkomórkowe bakterie jako żywe wektory do ich dostarczenia. Mikroorganizmy stosowane są zarówno do dostarczania specyficznych dla nowotworu antygenów, antygenów blokujących procesy angiogenezy, jak również jako nośniki dostarczające substancje modulujące układ odpornościowy, głównie interleukinę 2. Odpowiedź generowana przez LBV (ang. attenuated live bacterial vaccine) skierowana jest nie tylko przeciwko heterologicznemu antygenowi, ale także przeciwko antygenom użytego jako nośnik patogenu. Wykorzystanie niektórych mikroorganizmów umożliwia dostarczenie antygenu poprzez powierzchnię śluzówki jelit do komórek APCs. Stosowane są w tym celu szczepy atenuowanych zarówno gramdodatnich, jak i gramujemnych mikroorganizmów. W badaniach in vitro potwierdzono zdolność tych bakterii do dostarczania szczepionek DNA do komórek ludzkich, a in vivo skuteczność tego procesu zweryfikowano w doświadczeniach wykonanych na modelach mysich z różnymi rodzajami nowotworów. Od lat prowadzone są testy kliniczne mające na celu ocenę bezpieczeństwa, skuteczności oraz immunogenności wybranych szczepów bakteryjnych. Strategia LBV wykorzystuje drogę administracji imitującą naturalną infekcję patogenem, co może prowadzić do długotrwałej humoralnej i komórkowej odpowiedzi zarówno lokalnej w obrębie śluzówki, jak i ogólnoustrojowej. Ponadto, podanie preparatu tą drogą powoduje mniej efektów ubocznych, a w wielu przypadkach jest też tańsze [38]. Najczęściej stosowane w badaniach szczepy wykorzystywane jako żywe wektory to atenuowane mutanty Salmonella enterica sv. Typhimurium i sv. Typhi. S. enterica sv. Typhi jest zdolna do przeżycia i replikacji we wnętrzu wakuoli komórek APCs, takich jak komórki dendrytyczne i makrofagi. Szczep Ty21a (atenuowany mutant S. enterica sv. Typhi Ty2) stosowany jest jako szczepionka przeciwko durowi brzusznemu. Szczep ten otrzymano w wyniku mutagenezy chemicznej, prowadzącej do powstania wielu nieodwracalnych mutacji, skutkujących m.in. wrażliwością na galaktozę (mutacja w genie gale), auksotrofią pod względem izoleucyny i waliny (gen ilvd), brakiem otoczki polisacharydowej (gen via) i redukcją oporności na stres (gen rpos). Nie odnotowano rewersji komórek do typu dzikiego ani w warunkach in vitro ani in vivo, otrzymany szczep jest genetycznie stabilny [45, 46]. Problemem związanym z zastosowaniem S. enterica Ty21a jest konieczność aplikacji wielu dawek w celu wywołania odpowiedzi o charakterze ochronnym. Dlatego też prowadzone doświadczenia mają na celu konstrukcję szczepu zdolnego do wywołania skutecznej odporności po zastosowaniu pojedynczej doustnej immunizacji. Wśród intensywnie badanych wymienić należy szczep CVD908, posiadający delecje w genach aroc i arod (wywołuje to auksotrofię w stosunku do aminokwasów aromatycznych) oraz szczep CVD908-htrA - z usuniętym dodatkowo genem htra, kodującym peryplazmatyczną proteazę serynową odpowiedzialną za degradację nieprawidłowo zwiniętych białek powstających w warunkach stresowych. Mutacja ta upośledza więc odpowiedź bakterii m.in na stres oksydacyjny, a w związku z tym, także zdolność do przeżycia wewnątrz makrofagów. Mutacje w genach aroc i arod limitują wzrost bakterii, jako że w ssaczych tkankach wymagane aromatyczne substraty znajdują się w niewystarczających do normalnego wzrostu ilościach. Oba atenuowane szczepy S. enterica Ty21a okazały się silnie immunogenne już po doustnym podaniu jednej dawki. Szczep CVD908, pomimo że był dobrze tolerowany, przedostawał się do krwiobiegu pacjentów po podaniu stosunkowo dużej dawki, dlatego też jego dalsze wykorzystanie w terapii okazało się niemożliwe. W przeciwieństwie do CVD908, nie odnotowano obecności szczepu CVD908-htrA w krwiobiegu, dlatego uważany jest on za bezpieczny [44,47]. Innym szczepem S. enterica sv. Typhi badanym pod względem użyteczności w zastosowaniu jako LBV jest m.in. ZH9 posiadający mutacje w genach aroc i ssva (gen kodujący proteinę biorącą udział w sekrecji białek w systemie sekrecyjnym typu III SPI2). Szczep ten jest silnie immunogenny, a zarazem bezpieczny w fazie II testów klinicznych; jego aplikacja skutkowała wywołaniem wysokiego poziomu odpowiedzi od- Postępy Biochemii 58 (3)

7 pornościowej humoralnej, komórkowej i związanej z błonami śluzowymi [48]. Innym przykładem jest pochodzący od Ty2 szczep Ty800, posiadający dodatkowo delecje w genach układu dwuskładnikowego phop-phoq, odpowiedzialnym za kontrolę przeżycia bakterii w fagosomie. W badaniach klinicznych w fazie I był dobrze tolerowany i silnie immunogenny [38]. W badaniach nad zastosowaniem mikroorganizmów jako LBV wykorzystuje się również mutanty Shigella spp. oraz Listeria monocytogenes. Bakterie te po wydostaniu się z fagosomu do cytoplazmy komórki gospodarza replikują się w niej, a następnie mogą się rozprzestrzeniać do sąsiadujących komórek. Unikalna zdolność tych bakterii do przedostania się do cytozolu czyni je potencjalnie idealnym wektorem do dostarczania specyficznych antygenów do komórek APC. Eksprymowane w cytoplazmie antygeny prezentowane są głównie z udziałem MHC klasy I, jednocześnie znaczna część bakterii pozostaje uwięziona w fagosomie, a produkowane przez nie białka prezentowane są na powierzchni komórki za pomocą MHC klasy II, co skutkuje silniejszą odpowiedzią przeciwko antygenowi [49,50]. W badaniach przedklinicznych na małpach zastosowanie pierwszych badanych mutantów Shigella, zawierających jedynie mutacje w genach aro przyniosło obiecujące wyniki, w badaniach na ochotnikach wyniki te były jednak mniej przekonujące. Mutanty aro były zbyt słabo atenuowane i niezbędne okazało się wprowadzenie dodatkowych mutacji w celu zwiększenia bezpieczeństwa preparatu. Szczep Shigella flexneri SC602, pozbawiony genu virg oraz iuca-iut, chromosomowego locus zaangażowanego w proces syntezy sideroforu (aerobaktyny) utracił zdolność do poruszania się wewnątrz komórki, a także przedostawania się do sąsiednich komórek nabłonka jelitowego. Pomimo zachęcających wyników otrzymanych w badaniach przedklinicznych, szczep ten okazał się nieprzydatny w testach klinicznych. Inny otrzymany szczep Shigella, szczep CVD1208, w pierwszej fazie badań klinicznych był dobrze tolerowany przy jednoczesnej stosunkowo silnej immunogenności. Posiada on mutację w operonie guaba, czego skutkiem jest defekt syntezy nukleotydów guaninowych. Dodatkowo mutant ten pozbawiony jest genów kodujących enterotoksyny 1 i 2, co podwyższa poziom jego bezpieczeństwa w zastosowaniu jako LBV [38]. Jednym z ostatnio badanych szczepów L. monocytogenes był podwójny mutant Lm z usuniętymi genami acta i plcb. Białko ActA odpowiada za zdolność bakterii do ruchu wewnątrz komórki eukariotycznej i wraz z fosfolipazą C, kodowaną przez plcb, uczestniczy w przemieszczaniu się bakterii do innych komórek. Fosfolipaza C bierze dodatkowo udział w lizie wakuoli w komórce gospodarza. W badaniach na myszach szczep Lm acta - plcb - okazał się bezpieczny, a jednocześnie jego podanie prowadziło do wywołania odpowiedzi immunologicznej zależnej od cytotoksycznych limfocyów T (CD8+) [51]. U ochotników, których w trakcie fazy I testów klinicznych immunizowano przy użyciu tego zmutowanego szczepu odnotowano specyficzną wobec Listeria odpowiedź odpornościową. Jednocześnie u kilku pacjentów zaobserwowano jednak zaburzenia w funkcjonowaniu wątroby, które związane mogły być ze szczepieniem [52]. Niezbędne jest przeprowadzenie dalszych badań w celu oszacowania przydatności tego szczepu w terapiach. Innym potencjalnie interesującym szczepem jest L. monocytogenes acta - inlb - z usuniętym genem kodującym internalinę, białko ułatwiające wniknięcie bakterii do wnętrza komórek niefagocytujących. Delecja w genie internaliny miała więc na celu obniżenie toksyczności wobec komórek niefagocytujących, takich jak hepatocyty. Szczep ten w badaniach na myszach okazał się bezpieczny, a zarazem immunogenny [53]. MIKROORGANIZMY JAKO NOŚNIKI SPECYFICZNYCH DLA NOWOTWORU ANTYGENÓW ORAZ BIAŁEK BLOKUJĄCYCH PROCESY ANGIOGENEZY Szczepionki DNA mają na celu złamanie tolerancji na niskoimmunogenne białka eksprymowane na powierzchni komórek nowotworowych. Odkrycie istnienia antygenów specyficznych dla różnych rodzajów nowotworów wraz z postępem w użyciu żywych bakterii jako nośników genów eukariotycznych zapoczątkowało nową erę w badaniach nad leczeniem nowotworów. Prowadzone w ostatnich latach doświadczenia nad zastosowaniem bakterii jako wektorów do dostarczania antygenów specyficznych dla nowotworów przyniosły obiecujące wyniki. Białko NY-ESO-1 często występuje na powierzchni komórek nowotworowych, nie jest natomiast odnajdywane na powierzchni normalnych komórek somatycznych. Białko to jest silnie immunogennym antygenem, jednak w wielu nowotworach jego obecność jest różna i w przypadku czerniaka, raka prostaty, płuc czy jajnika NY-ESO-1 eksprymowane jest w około 20 40% nowotworów. Rekombinowany szczep S. enterica sv. Typhimurium produkujący NY-ESO-1 został skonstruowany tak, aby umożliwić dostarczenie tego antygenu do cytoplazmy APCs poprzez system sekrecji typu III. Podanie tak skonstruowanego szczepu myszom z nowotworem, w którym NY-ESO-1 był syntetyzowany, wywoływało odpowiedź odpornościową i regresję guza. W trakcie nowatorskich badań skonstruowano rekombinowany szczep S. enterica sv. Typhimurium SL3261, w którym nukleotydowe sekwencje kodujące epitopy antygenu NY-ESO-1 wklonowane zostały w nukleotydową sekwencję genu kodującego jedno z białek tworzących fimbrie. Fimbrie występują na powierzchni wielu patogennych bakterii i posiadają zdolność do prezentowania obcych antygenów. Doustne podanie rekombinowanego szczepu SL3261 transgenicznym myszom wywoływało pobudzenie specyficznej wobec eksprymowanego epitopu cytotoksycznej odpowiedzi T-komórkowej [54]. Obiecujące wyniki otrzymano też w przypadku zastosowania rekombinowanej S. enterica sv. Typhimurium eksprymującej różne antygeny: antygen gp100 (antygen związany z czerniakiem) połączony z częścią stałą łańcucha przeciwciała [38] antygen HPV16L1 związany z nowotworem szyjki macicy [55] czy śródbłonkowy marker nowotworowy TEM8 (ang. tumor endothelial marker 8) [49]. Pierwsze obiecujące badania nad użyciem żywych bakterii Listeria monocytogenes do dostarczenia antygenów związanych z nowotworami opublikowane zostały w latach dziewięćdziesiątych, od tego czasu L. monocytogenes jest jednym z najintensywniej badanych gatunków bakterii dostarczających antygeny związane z nowotworem. W ostatnich latach skonstruowano wiele atenuowanych szczepów L. monocytogenes eksprymujących takie antygeny jak HPV-16 E7, antygen związany z nowotworem szyjki macicy, głowy oraz szyi, PSA (prostate specific antigen), antygen specyficzny dla raka prostaty, związany z czerniakiem antygen MAGE czy Her-2/neu, antygen nadeksprymowany w około 30% przypadków raka piersi. W badaniach przedklinicznych na modelu mysim szczepy te okazały się wysoce im

8 munogenne, a ich aplikacja powodowała regresję guza, w którym dochodziło do ekspresji dostarczonego przez bakterie antygenu. W ostatnich latach rekombinowany szczep Lm-HPV16 E7 (ADXS11-001) poddany został badaniom klinicznym z udziałem pacjentek z zaawansowanym nowotworem szyjki macicy. U 30% badanych pacjentek zaobserwowano redukcję rozmiaru guza, u dwóch z nich guzy zostały całkowicie wyleczone [49]. Pomimo dość obiecujących wyników, niezbędne jest przeprowadzenie dalszych badań w celu oszacowania przydatności opisanych szczepów w terapiach. Przewagą L. monocytogenes nad innymi gatunkami bakterii stosowanymi jako wektor do dostarczania antygenów specyficznych dla nowotworu jest unikalny cykl życiowy tej bakterii oraz wynikający z tego fakt prezentacji eksprymowanego przez Listeria antygenu zarówno przy udziale MHC klasy I, jak i MHC klasy II, a także zdolność do przemieszczania się bakterii do sąsiadujących komórek. Cechy te związane są jednak z wysoką wirulencją tego patogenu, stworzenie idealnego wektora wiąże się więc z uzyskaniem optymalnego balansu pomiędzy atenuacją a zachowaniem tych unikalnych cech jako wektora [56]. Proces wzrostu guza i powstawania przerzutów jest silnie związany z procesami angiogenezy. Hamowanie rozwoju naczyń zaopatrujących guz w tlen i składniki odżywcze może być doskonałą strategią walki z chorobami nowotworowymi. W pionierskich badaniach nad zastosowaniem bakterii w tym celu, skonstruowano szczepionkę z użyciem Salmonella niosącą na plazmidzie gen kodujący FLK-1 (VEGFR2, ang. vascular endothelial growth factor receptor 2, receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego) bądź jedynie epitop/y tego receptora. Doustna aplikacja tej szczepionki myszom prowadziła do stymulacji odpowiedzi odpornościowej z udziałem limfocytów T CD8+ i prowadziła do supresji angiogenezy, uniemożliwiając w ten sposób dopływ krwi do tkanki nowotworowej [57]. Doustne podanie Salmonella eksprymującej FLK-1 myszom z glejakiem wywoływało zahamowanie wzrostu guza, redukcję naczyń krwionośnych związanych z guzem oraz wydłużenie okresu życia zwierząt [58]. FLK-1 odgrywa istotną rolę w rozwoju i progresji nowotworów płuc. Białko FLK-1 kodowane jest przez gen o wielkości 4kb. Im dłuższy gen, tym większe ryzyko pojawienia się mutacji. W celu zmniejszenia ryzyka spontanicznych mutacji oraz uniknięcia pracy z dużym białkiem w przeprowadzonych niedawno badaniach z zastosowaniem atenuowanego szczepu Salmonella SL3261 na wektorze sklonowano jedynie fragment kodujący zewnątrzkomórkową domenę FLK-1. Doustne podanie tego konstruktu myszom z nowotworem płuc Lewisa spowodowało złamanie tolerancji odpornościowej wobec antygenu FLK-1, skutkując zahamowaniem wzrostu guzów oraz zwiększoną przeżywalnością zwierząt doświadczalnych [57]. Innym przykładem terapii blokującej proces angiogenezy było dostarczenie endogliny (CD105), transbłonowej glikoproteiny, będącej receptorem transformującego czynnika wzrostu (TGF)-β i ulegającej nadprodukcji w proliferujących komórkach endotelialnych nowo utworzonych naczyń krwionośnych nowotworu piersi. Jako wektor użyty został atenuowany szczep S. enterica sv. Typhimurium niosący mutację w genach aroa i dam. Na modelu mysim zaobserwowano silną odpowiedź zależną od limfocytów T CD8+, która efektywnie powstrzymała powstanie przerzutów do płuc [38]. Innym endogennym inhibitorem angiogenezy jest trombospondyna 1 (TSP-1), której zdolność do zahamowania wzrostu czerniaka oraz przerzutów została już udokumentowana in vitro i in vivo [59]. W badaniach na myszach przeprowadzonych przez Lee i wsp. dootrzewnowe wstrzyknięcie bakterii gatunku Salmonella choleraesuis niosących plazmid kodujący trombospondynę 1 powodowało zahamowanie wzrostu i zmniejszenie rozmiarów guzów (czerniaka), co związane było z redukcją unaczynienia guzów [60]. Dodatkowo badano szczepy Bifidobacterium adolescentis i longum z plazmidami zawierającymi gen kodujący endostatynę (inhibitor procesu angiogenezy). Szczepy (podane dożylnie) docierały wyłącznie do guzów wątroby hamując proces angiogenezy i wzrost tych guzów [61,62]. Innym stosunkowo nowatorskim podejściem w walce z nowotworami jest immunizacja przeciwko molekułom nadeksprymowanym przez makrofagi związane z guzem, które to molekuły stymulują proliferację komórek nowotworowych oraz proces metastazy poprzez sekrecję czynników wzrostu oraz czynników pro-angiogennych. Legumaina (ang. legumain) jest silnie nadeksprymowana przez makrofagi w tkankach wielu rodzajów nowotworów. Zaszczepienie myszy szczepem S. enterica sv. Typhimurium aroa dam kodującym gen legumainy prowadziło do odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko makrofagom związanym z guzem, prowadząc do supresji angiogenezy, zahamowania wzrostu guza i zapobiegnięcia powstawania przerzutów w wyniku zaburzeń mikrośrodowiska guza [38]. W leczeniu istniejących już guzów oraz zapobieganiu nawrotów najefektywniejszą terapią wydaje się połączenie tradycyjnej chemioterapii z immunoterapią. Przykładem takiej kombinowanej terapii było doustne zaaplikowanie myszom komórek Salmonella będących nośnikiem genu kodującego płytkopochodny czynnik wzrostu B, nadeksprymowanego w proliferujących endotelialnych komórkach naczyń krwionośnych guza, wraz z leczeniem przy użyciu cyklofosfamidu, szeroko stosowanego leku cytostatycznego. Terapia ta nie tylko spowodowała zahamowanie wzrostu wielu rodzajów nowotworów, ale także odrzucenie guza (ang. tumor rejection) [63]. Jest to jedno z wielu badań potwierdzających zasadność stosowania terapii łączonych w celu uzyskania maksymalnego efektu antynowotworowego. Jednym z głównych problemów tradycyjnej chemioterapii jest nabywanie wielolekowej oporności (MDR, ang. multidrug resistance) przez komórki nowotworowe, co uniemożliwia kontynuację konwencjonalnego leczenia. Jako alternatywę dla leczenia takich przypadków podjęto próbę wykorzystania immunoterapii z użyciem bakterii. W celu złamania obwodowej tolerancji limfocytów T, na wektorze obecnym w komórkach S. enterica sv. Typhimurium wprowadzono gen kodujący białko MRP1 (ang. multidrug resistance-associated protein 1). Doustne podanie tej szczepionki myszom, doprowadziło do wywołania specyficznej wobec antygenu odpowiedzi zależnej od limfocytów T CD8+ i wydłużyło czas życia zaszczepionych zwierząt [64]. Tak więc zastosowanie bakterii jako wektorów produkujących odpowiedni antygen stanowi obiecującą strategię do przełamania tolerancji układu odpornościowego wobec antygenów nadeksprymowanych przez komórki nowotworowe, szczególnie jeśli terapia ta łączona jest z tradycyjną chemio- czy radioterapią. Postępy Biochemii 58 (3)