Udział kalmoduliny w zależnej od Ca 2+ sygnalizacji w komórkach pobudliwych

Transkrypt

1 Udział kalmoduliny w zależnej od Ca 2+ sygnalizacji w komórkach pobudliwych STRESZCZENIE Jednym z białek sensorowych uczestniczących w sygnalizacji komórkowej zależnej od wapnia jest kalmodulina (CaM). Kalmodulina jest małym białkiem, które po związaniu jonów wapnia indukuje szereg dróg sygnalizacyjnych w komórce i jest zaangażowane w podstawowe procesy życiowe włączając wzrost, różnicowanie, proliferację, przeżywalność oraz ruchliwość. CaM uczestniczy także w wygaszaniu sygnału wapniowego bezpośrednio poprzez aktywację plazmatycznej Ca 2+ -ATPazy (PMCA) oraz pośrednio endo/sarkoplazmatycznej Ca 2+ -ATPazy (SERCA). CaM moduluje również aktywność kanałów wapniowych m.in. kanałów wapniowych zależnych od napięcia (VGCCs), kanałów wapniowych zależnych od cyklicznych nukleotydów, receptorów NMDA, receptorów z rodziny TRP (ang. transient receptor potential channel) oraz receptorów zlokalizowanych w siateczce śródplazmatycznej: rianodynowego i wszystkich izoform receptora zależnego od IP 3. WPROWADZENIE Wapń jest jednym z przekaźników sygnału w komórce działającym dzięki wrażliwości komórki na niewielkie nawet, miejscowe zmiany jego stężenia. Regulacja zmian stężenia Ca 2+ oraz precyzyjne odczytywanie sygnału wapniowego przez wewnątrzkomórkowe sensory są czynnikami regulatorowymi szlaków sygnalizacyjnych i ostatecznie determinującymi również fizjologiczną odpowiedź komórki na zewnątrzpochodne substancje aktywujące. Homeostaza wapniowa utrzymywana jest w komórce dzięki zrównoważonej regulacji napływu jonów wapnia z przestrzeni zewnątrzkomórkowej i uwalniania z magazynów wewnątrzkomórkowych oraz usuwaniu jego nadmiaru z cytosolu. Za wzrost cytoplazmatycznego stężenia Ca 2+ odpowiedzialny jest system kanałów obecnych w błonie plazmatycznej (kanały wapniowe zależne od napięcia (VDCC, ang. voltage-dependent calcium channel), kanały wapniowe zależne od ligandu (NMDAR, ang. N-methyl-D-aspartate receptor; AMPAR, ang. α-amino-3-hydroxy- 5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor) oraz w błonie siateczki śródplazmatycznej (kanały zależne od IP 3, kanały rianodynowe). Zmniejszanie zaś stężenia Ca 2+ w cytosolu zachodzi przy udziale pomp wapniowych i wymienników sodowo-wapniowych. Niezaprzeczalną rolę w regulacji homeostazy wapniowej odgrywają także białka wiążące Ca 2+. Obecnie sklasyfikowano wiele rodzin białek wiążących wapń, z wysoce specyficzną lokalizacją tkankową. W komórkach pobudliwych elektrycznie takich, jak neurony i siatkówka oka, większość tych białek tworzy grupę określaną jako ncabp (ang. neuronal calcium-binding protein) lub NCS (ang. neural calcium sensors). Uczestniczą one w takich procesach jak: fototransdukcja, uwalnianie neuroprzekaźników, metabolizm cyklicznych nukleotydów i fosfatydyloizozytoli, kontrola ekspresji genów czy regulacja aktywności kanałów jonowych [1]. Wyróżniamy kilka klas białek wiążących wapń w różnych rejonach mózgu. Do białek NCS zaliczana jest frequenina (NCS-1), białka VILIPs (ang. visinin- -like proteins): hippokalcyna, neurokalcyna δ, VILIP 1-3; rekoweryna, trzy białka GCAP (ang. guanylate cyclase activating proteins) i 4 rodzaje kanałów potasowych zależnych od potencjału błonowego. Do białek ncabp należą m.in. kaldendryna, białka CaBPs 1 5, kalneurony 1 i 2 (CaBP7 i 8). Wszystkie te białka wykazują mniejsze (NCS <20%) lub większe (ncabp > 20%) podobieństwo w budowie do kalmoduliny, która w przeciwieństwie do pozostałych jest białkiem obecnym we wszystkich komórkach eukariotycznych. Dlatego też przypisuje jej się największe znaczenie i udział w sygnalizacji komórkowej zależnej od wapnia. Inaczej niż większość NCS i ncabp, które zlokalizowane są w specyficznych przedziałach komórkowych, kalmodulina jest rozpuszczalna i rozprzestrzeniona w Podziękowanie: Praca powstała w trakcie realizacji projektu badawczego nr / / , 503/ / Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Elżbieta Rębas Tomasz Boczek Antoni Kowalski Kinga Kuśmirowska Malwina Lisek Ludmiła Żylińska Zakład Neurochemii Molekularnej, Katedra Biochemii Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Łódź Zakład Neurochemii Molekularnej, Katedra Biochemii Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, ul. Mazowiecka 6/ Łódź; tel.: (42) , elzbieta.rebas@umed. lodz.pl Artykuł otrzymano 20 października 2012 r. Artykuł zaakceptowano 22 października 2012 r. Słowa kluczowe: kalmodulina, kanały VGCC, NMDA, TRP, IP 3 R, RyR Wykaz skrótów: AMPAR (ang. α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor) receptor kwasu α-amino-3-hydroksy- 5-metylo-4-izoksazolopropionowego; CaM kalmodulina; CaMK (ang. Ca 2+ /calmodulin- -dependent protein kinases) kinazy zależne od kompleksu wapń-kalmodulina; CREB (ang. camp response element-binding protein) białko wiążące element odpowiedzi na camp; GAP- 43 (ang. growth associated protein 43) neuromodulina; IP 3 (ang. inositol-1,4,5-trisphosphate) inozytolotrisfosforan; IP 3 R receptor aktywowany IP 3 ; LTP (ang. long-term potentiation) długoterminowy potencjał pobudzający; ncabp (ang. neuronal calcium-binding proteins) neuronalne białka wiążące wapń; NCS (ang. neuronal calcium sensors) neuronalne sensory wapnia; NGF (ang. nerve growth factor) czynnik wzrostu nerwu; NMDAR (ang. N-methyl- -D-aspartate receptor) receptor N-metylo-D- -asparaginianowy; PKA (ang. protein kinase A) kinaza białkowa A; PKC (ang. protein kinase C) kinaza białkowa C; PLC (ang. phospholipase C) fosfolipaza C; PMCA (ang. plasma membrane calcium ATPase) Ca 2+ -ATPaza błony plazmatycznej; RyR receptor rianodynowy (ang. ryanodine receptor); SERCA (ang. sarco/ endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase) Ca 2+ - ATPaza siateczki endo/sarkoplazmatycznej; TRP ang. transient receptor potential; VGCC (ang. voltage-gated calcium channel) kanał wapniowy zależny od napięcia Postępy Biochemii 58 (4)

2 cytosolu. W wielu przypadkach kalmodulina, białka NCS i ncabp wiążą się z tymi samymi białkami docelowymi jednak z różnym funkcjonalnym skutkiem [1-3]. Kalmodulina struktura Kalmodulina jest małym białkiem o masie cząsteczkowej 16 kda, którego funkcją jest wiązanie jonów wapnia podczas indukowania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i jest zaangażowana w podstawowe procesy komórkowe włączając wzrost, różnicowanie, proliferację, przeżywalność oraz ruchliwość [4]. CaM jest białkiem o strukturze zachowanej w ewolucji, składającym się z dwóch globularnych domen połączonych centralną α-helisą. Charakterystyczny jest układ dwóch domen zawierających dwa motywy helisa-pętla-helisa (dłonie EF), każdy wiążący dwa jony wapnia [5]. Dzięki temu cząsteczka kalmoduliny kooperatywnie przyłącza 4 Ca 2+. Wiązanie Ca 2+ powoduje zmiany w strukturze każdej z domen, prowadząc do ekspozycji miejsc hydrofobowych, które odpowiadają za oddziaływanie z białkami zależnymi od CaM. Rejon C-końcowy CaM wiąże Ca 2+ z wysokim powinowactwem (K d =10 7 M) podczas gdy N-końcowy z niższym (K d =10 6 M). Z uwagi na fakt, iż wartości stałej dysocjacji mieszczą się w zakresie wewnątrzkomórkowych stężeń Ca 2+ ( M), pozwala to CaM szybko reagować na zmiany stężenia tego jonu. Wyższe powinowactwo regionu C-końcowego powoduje, że CaM może oddziaływać z niektórymi białkami nawet w niskim stężeniu Ca 2+ w komórce w stanie spoczynku [6,7]. Organizacja genów kodujących kalmodulinę Prace nad organizacją genomu szczura wykazały, iż CaM kodowana jest przez trzy niealleliczne geny (calmi, calmii, calmiii), których transkrypcja prowadzi do powstania ośmiu głównych cząsteczek mrna, z których każda koduje identyczne białko (Ryc. 1). Zarówno rejony kodujące, jak i niekodujące genów wykazują wysoką homologię międzygatunkową (80 85%), chociaż w przypadku obszarów niekodujących nie występuje znaczące podobieństwo w obrębie gatunku [8]. Sekwencja nukleotydowa rejonu promotorowego sugeruje, iż gen calmiii ma funkcję konstytutywną, podlegając silnej oraz ciągłej ekspresji, lecz niewykluczona jest również jego specyficzna regulacja. Z kolei, analiza rejonów 5 oskrzydlających genów calmi oraz calmii wskazuje na obecność kilku domniemanych elementów regulatorowych, co przypuszczalnie świadczy o kluczowej roli, jaką odgrywają one w regulacji ekspresji genu kodującego CaM [9]. Różnorodność powstających mrna kodujących CaM związana jest z występowaniem alternatywnych miejsc poliadenylacji w pierwotnym transkrypcie. Najbardziej powszechnym sygnałem poliadenylacji na końcu 3 jest sekwencja AAUAAA. Geny calmi oraz calmiii zawierają wiele takich sekwencji, np. calmi charakteryzuje się obecnością dwóch sekwencji AAUAAA oraz dwóch AUUAAA. Interesującym jest fakt, iż najmniejszy transkrypt genu calmiii podlega poliadenylacji za rzadko występującą sekwencją GAUAAA, co ma miejsce tylko w 1.3% genów człowieka [9]. Dodatkowy sygnał (AACAAA) zlokalizowany za tym Rycina 1. Transkrypty genów calmi, calmii, calmiii. Wg [9] zmodyfikowany. elementem jest oddzielony od niego dwoma nukleotydami. Zarówno w przypadku szczura, jak i człowieka geny kodujące CaM wykorzystują te same miejsca poliadenylacji, co wskazuje na ich ewolucyjnie niezmienną funkcję. Odmienna regulacja tych genów ma unikatowe znaczenie w odpowiedzi na sygnały wymagające zarówno wolnej (np. podczas wzrostu i różnicowania), jak i szybkiej (np. podczas cyklu komórkowego i przekazywania sygnału) reakcji komórki [10]. Poszczególne transkrypty wykazują różną lokalizację tkankową i subkomórkową. U szczura, szczególnie dużą liczbę transkryptów CaM stwierdza się w neuronach ośrodkowego układu nerwowego. Warto jednak zaznaczyć, że udział produktów poszczególnych genów zmienia się znacznie podczas rozwoju mózgu. We wczesnych fazach dendrytyczne zasoby mrna są najbardziej bogate w transkrypt 1.4 kpz, jednak z czasem ulegają one znacznemu obniżeniu na rzecz produktów genów calmi oraz calmiii [11]. Na tym etapie przejściowo zwiększa się również poziom transkryptu 4.2 kpz w rejonach apikalnych neuronów. Wykazano też jego specyficzną lokalizację w dendrytach warstwy zwojowej móżdżku [11]. U osobników dorosłych transkrypty CaM występują znacznie obficiej w rejonach dendrytycznych mózgu, niż w istocie białej, zawierającej głównie obszary aksonalne [12]. W pseudoneuronalnych komórkach PC12 zaobserwowano odmienną ekspresję genów CaM podczas różnicowania. Traktowanie NGF powodowało ponad 3-krotny wzrost poziomu transkryptu 1.4 kpz w porównaniu do pozostałych 394

3 Lokalizacja i stężenie CaM są ważnymi czynnikami regulującymi jej biologiczną aktywność. Obecność w komórce wielu aktywności katalitycznych, często o przeciwstawnym kierunku działania, wymaga dokładnej kontroli, jak również wzajemnego rozdziału aktywnych efektorów CaM. W celu utrzymania prawidłowych oddziaływań typu CaM białko, komórka może gromadzić CaM w mikrodomenach. Struktury te powstają w efekcie działania wielu czynników regulatorowych, wliczając w to sygnały wapniowe, odwracalne wiązanie CaM do błon lub innych białek, jej maskowanie poprzez np. fosforylację, redystrybucję zasobów pomiędzy przedziałami komórkowymi oraz syntezę de novo. Wszystkie te poziomy kontroli umożliwiają regulowanie lokalnej dostępności CaM. Wydaje się to mieć istotne znaczenie fizjologiczne, zważywszy na fakt, iż białka wiążące CaM regulowane są w szerokim zakresie stężeń wolnej CaM. CaM stanowi około 0,1% wszystkich białek komórkowych, a jej stężenie może wahać się w granicach 2 25 µm w zależności od tkanki i może być nawet większe w komórkach przechodzących podziały i różnicujących [10,14]. Tak więc jej subkomórkowa dystrybucja nie jest równomierna, a ilość białka może zmieniać się nawet w obrębie tkanki lub narządu [10]. Fakt ten wynika z istnienia odrębnych frakcji kalmodulinowych. W komórce CaM może znajdować się we frakcji rozpuszczalnej, wrażliwej na zmiany stężenia Ca 2+, bądź też pozostawać we frakcji nierozpuszczalnej, z której zostaje uwolniona w wyniku zaburzenia struktury błon komórkowych. Obecność wrażliwych bądź niewrażliwych na jony wapnia zasobów sprawia, iż CaM może pozostawać częściowo związana bądź zamaskowana, co zapobiega niespecyficznym oddziaływaniom z innymi białkami, dopóki odpowiedni sygnał np. zmiana stężenia Ca 2+ nie zainicjuje jej uwolnienia [10]. Istotnym elementem regulacji jest także okres półtrwania kalmoduliny, wynoszący 18 ± 2 godz., co lokuje CaM w grupie krótko żyjących białek [15]. Rycina 2. Zależne od Ca 2+ oddziaływanie CaM i GAP-43. W niepobudzonych neuronach, w których stwierdzono wysoką zawartość GAP-43, większość cząsteczek CaM występuje w formie niezwiązanej z wapniem i znajduje się przypuszczalnie we frakcji błonowej. Nieufosforylowany GAP-43 wiąże CaM przy niskim stężeniu Ca 2+ w komórce, a oddziaływanie to hamuje fosforylację reszty Ser 41 przez PKC. Jednakże, gdy PKC zostanie zaktywowana w wystarczającym stopniu, GAP-43 podlega fosforylacji, co prowadzi do uwolnienia CaM i blokuje możliwość ponownego związania białka z błoną. Mechanizm ten pozwala białku GAP-43 pozostawać w stanie aktywnym nawet w przypadku malejącego stężenia wtórnych przekaźników w komórce. mrna kodujących CaM [12]. W komórkach tych transkrypty calmi oraz calmii zlokalizowane są głównie wzdłuż wypustek neuronalnych, podczas gdy transkrypty calmiii pozostają bliżej jądra [13]. Zróżnicowana ekspresja genów oraz miejsce występowania transkryptów wskazują na ich zależne od genów kierowanie do poszczególnych obszarów komórki oraz sugerują, iż kontrola genów CaM zachodzi w unikalny, zależny również od czynników zewnętrznych sposób. Ta wielopoziomowa regulacja komórkowych zasobów CaM pozwala na szybką odpowiedź komórki na bodziec fizjologiczny poprzez modulowanie oddziaływania CaM-białko oraz odwracalne wiązanie CaM do białek magazynowych, z których istotną rolę pełni GAP-43 (Ryc. 2). Regulacja dostępności CaM Lokalna dostępność CaM może być regulowana poprzez jej redystrybucję pomiędzy przedziałami komórkowymi. Białko to ma zdolność przemieszczania się z frakcji cytoplazmatycznej do błonowej lub jądrowej, jak również w kierunku odwrotnym. Według modelu McGinnis a dysocjacja CaM z błony plazmatycznej do cytosolu zachodzi w odpowiedzi na uwolnienie Ca 2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych [16]. Ponadto, stosunek ilości CaM związanej z błonami do jej puli cytoplazmatycznej zmienia się w wyniku stymulacji receptorów przez hormony wzrostu i neuroprzekaźniki, co wywołuje uwolnienie CaM do cytoplazmy [17-20]. Z drugiej strony, zwiększenie asocjacji CaM z błoną plazmatyczną zmniejsza efektywność sygnalizacji zachodzącej poprzez białka G [21,22]. CaM związana z błoną może działać bezpośrednio jako przekaźnik drugiego rzędu, uwalniany po aktywacji specyficznych receptorów błonowych. Redystrybucję CaM do jądra i jej asocjację z białkami macierzy jądrowej obserwuje się podczas proliferacji komórek [23,24]. Transport jądrowy zachodzi przypuszczalnie na drodze dyfuzji ułatwionej, gdyż CaM jest dość małym białkiem i może swobodnie przechodzić przez pory jądrowe, a dodatkowo nie zawiera sekwencji kierującej ją do specyficznych organelli komórkowych. Tak więc rozmieszczenie CaM w jądrze i cytoplazmie determinowane jest przez powinowactwo, stężenie jak i lokalizację zależnych od CaM efektorów w obu tych przedziałach komórkowych. Wykazano, iż gwałtowna translokacja CaM do jądra może być indukowana poprzez zmiany stężenia Ca 2+, a towarzyszy jej zwiększona fosforylacja czynnika transkrypcyjnego CREB [25]. Dyfuzja może być zatem użytecznym i korzystnym energetycznie sposobem transportu CaM po jej uwolnieniu z zasobów błonowych, choć służy raczej redystrybucji w skali bardzo lokalnej. Odmiennym mechanizmem pozwalającym na przemieszczanie się CaM jest transport kodujących ją mrna, Postępy Biochemii 58 (4)

4 które podlegają translacji w odległych miejscach komórki. Jednakże, do chwili obecnej nie ma przekonywującego dowodu na to, że poszczególne zasoby CaM uzupełniane są w wyniku transkrypcji któregoś z genów czy są też raczej wypadkową ekspresji wszystkich trzech genów kodujących CaM. Fosforylacja jest kolejnym mechanizmem maskowania biologicznej aktywności CaM, bowiem redukuje jej oddziaływania z białkami enzymatycznymi. Wykazano, iż CaM ulega fosforylacji zarówno przez kinazy serynowo-treoninowe, jak i receptory posiadające aktywność kinaz tyrozynowych. Fosforylacja przez kinazy serynowo-treoninowe powoduje zwykle spadek powinowactwa wiązania CaM oraz obniżenie aktywności CaM-zależnych efektorów, natomiast fosforylacja specyficznych reszt tyrozyny wywołuje efekt przeciwny [26]. Działanie kalmoduliny W większości przypadków działanie kalmoduliny związane jest z napływem jonów wapnia do cytosolu i rozpoczęciem kaskady sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Kalmodulina jest aktywatorem wielu białek nieenzymatycznych, a także enzymów o różnorodnych, czasem przeciwstawnych, aktywnościach, co stanowi wyraz bardzo zorganizowanego systemu regulującego komórkową homeostazę wapniową (Tab. 1) [27-30]. Tabela 1. Białka regulowane przez Ca 2+ /CaM. Wśród białek ulegających fosforylacji indukowanej przez CaM znajdują się m. in. czynniki transkrypcyjne, których zwiększoną aktywność obserwuje się podczas rozwoju komórek nerwowych. Poprzez oddziaływanie CaM z białkiem p21 cip1, kluczowym inhibitorem kinaz zależnych od cyklin, modulowany jest cykl komórkowy, a w odpowiedzi na niektóre czynniki zewnątrzkomórkowe następuje jego zatrzymanie w fazie G1 [31]. Ponadto, CaM uczestniczy w przebudowie cytoszkieletu, wiążąc się z α-spektryną, kaldesmonem oraz białkami stabilizującymi mikrotubule: MAP 2 oraz Tau. Białka związane z błoną plazmatyczną: neuromodulina i neurogranina, istotne dla prawidłowego przebiegu funkcji neuronalnych, oddziałują z CaM przy niskim stężeniu Ca 2+, a oddziaływanie to wydaje się hamować ich fosforylację [32]. Warto podkreślić udział CaM w wygaszaniu sygnału wapniowego, bezpośrednio poprzez aktywację Ca 2+ -ATPazy oraz pośrednio endo/sarkoplazmatycznych pomp SERCA. Odrębną grupą białek regulowanych przez CaM są kanały wapniowe oraz kilka rodzin receptorów [1,33] Wpływ kalmoduliny na działanie pomp wapniowych Jednym z najlepiej poznanych mechanizmów autoregulacji sygnału wapniowego jest oddziaływanie kompleksu Ca 2+ /CaM z PMCA. W stanie spoczynku, CaM wykazuje obniżone powinowactwo do PMCA, lecz gdy stężenie Ca 2+ wzrasta powyżej 100 nm, kompleks Ca 2+ /CaM wiąże się do C-końcowej domeny autoinhibitorowej intensyfikując szybkość pracy pompy [34]. PMCA jest ponadto jedyną ATPazą typu P bezpośrednio stymulowaną przez ten kompleks [34]. Poszczególne izoformy enzymu wykazują odmienne powinowactwo do CaM. Występujące powszechnie PMCA1 i PMCA4 charakteryzują się niskim powinowactwem, natomiast PMCA2 i PMCA3 obecne w komórkach pobudliwych cechują się wysoką wrażliwością na stymulację CaM [34]. Dodatkowe różnice w oddziaływaniu Ca 2+ /CaM z PMCA występują w obrębie poszczególnych wariantów enzymu powstających w wyniku alternatywnego składania. Dla przykładu PMCA2b wykazuje najwyższe powinowactwo (K D ~ 2 nm), następnie PMCA2a oraz PMCA4b (K D ~ 5 10 nm), natomiast najniższe PMCA4a (K D ~ 50 nm) [35]. Z uwagi na fakt, że wartości powinowactwa izoform i wariantów PMCA mieszczą się w obszarze stężeń znacznie poniżej zawartości białka kalmoduliny w komórce przypuszcza się, że może ona zachowywać się jak pseudopodjednostka PMCA [36]. W mięśniu sercowym oraz mięśniach gładkich aktywność pompy SERCA może być regulowana w wyniku bezpośredniej fosforylacji przez kinazy zależne od CaM [37]. Bardziej powszechnym mechanizmem jest jednak fosforylacja pomocniczego białka, fosfolambanu, unikalnego aktywatora pompy sarko/endoplazmatycznej [38]. Fosforylacja tego białka, znosi jego efekt inhibitorowy względem SER- CA, co pozwala na intensyfikację transportu jonów wapnia do wnętrza siateczki śródplazmatycznej. Enzymy fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów (np. rodzina PDE1) cyklazy adenylanowe (AC1 i AC8) ATPazy wapniowe (pompy wapniowe) kinaza lekkich łańcuchów miozyny kinaza fosforylazy glikogenowej kalcyneuryna syntaza tlenku azotu kinazy białkowe zależne od Ca 2+ i CaM (I, II, IV) Białka nieenzymatyczne tubulina troponina I spektryna, fodryna, kaldesmon, cytosynalina Neuromodulina i neurogranina Tau białko związane z mikrotubulami (MAP2) białko regulujące sygnalizację CaM (RCS) kanały wapniowe Udział kalmoduliny w regulacji kanałów VGCC Kanały wapniowe zależne od potencjału błony znane są od roku Ze względu na swoje farmakologiczne i biofizyczne właściwości zostały przyporządkowane do poszczególnych typów. W zależności od wartości potencjału wymaganego do aktywacji, przewodnic

5 twa i czasu pobudzenia wyróżniamy kanały typu T, L, N, P/Q oraz R [39]. Udział kalmoduliny w regulacji zależnych od potencjału kanałów wapniowych najlepiej poznano na przykładzie kanałów typu L, P/Q oraz T. Kanały typu L charakteryzują się długim czasem aktywacji. Występują w mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym, neuronach oraz komórkach wydzielania dokrewnego [39]. Kalmodulina bierze udział w wielu szlakach regulacji aktywności tych kanałów. Jednym z nich jest szlak aktywacji kanałów przez kinazę białkową A (PKA). PKA, aktywowana przez wtórny przekaźnik camp, katalizuje fosforylację białka kanału, co w efekcie zwiększa czas jego otwarcia. Interesującą zależnością jest fakt, że synteza camp zachodzi przy udziale cyklaz adenylanowych, których co najmniej trzy, z dziewięciu zidentyfikowanych izoform, są zależne od Ca 2+ /CaM. Działanie camp ulega zatrzymaniu przez fosfodiesterazy (PDE), enzymy degradujące ten nukleotyd; również ten proces podlega regulacji przez kalmodulinę. Fosfodiesterazy z rodziny PDE1 są aktywowane przez kompleks Ca 2+ /CaM, czego skutkiem jest blokowanie zależnej od PKA aktywacji kanałów [38]. Jest to jeden z bardziej precyzyjnych mechanizmów zapewniających kontrolę nad napływem jonów wapniowych do komórki i ochronę przed przekroczeniem ich wewnątrzkomórkowego stężenia ponad wartości fizjologiczne. Inny sposób hamowania aktywności kanałów typu L poznano na przykładzie kanału Ca v 1.2. Jego główne miejsce regulatorowe jest zlokalizowane w regionie C-końcowym podjednostki α (tworzącej por kanału), z którym wiąże się kompleks wapń-kalmodulina. Przyłączenie wolnej kalmoduliny do miejsca w regionie N-końcowym powoduje dodatkowe, nieznaczne zahamowanie jego aktywności [40]. Rola końca N w regulacji kanału Ca v 1.2 pozostaje jednak niejasna. Wykazano, że jego mutacja może nieznacznie osłabiać zależne od wapnia zahamowanie aktywności kanału, lecz jednocześnie wzmacniać efekt hamowania zależny od napięcia [41]. W przypadku kanału Ca v 1.2 występuje ponadto możliwość jego nieznacznej aktywacji, w której bierze udział kalmodulina. Efekt ten jest trudny do wykrycia, ze względu na maskowanie przez zahamowanie aktywności zależne od wapnia. W kardiomiocytach i w komórkach mięśni gładkich słaba, zależna od CaM aktywacja Ca v 1.2 może być zmniejszana przez specyficzne inhibitory CaM-kinazy II, jak np. KN39, co wskazuje na jej udział w tym mechanizmie [40]. W regulacji kanału Ca v 1.2 przy udziale CaMKII fosforylowana jest podjednostka α. Ustalono, że fosforylacja Ser 1512 i Ser 1570 podjednostki α ma zasadnicze znaczenie dla tej drogi aktywacyjnej. Proces może być odwrócony za pośrednictwem kalcyneuryny, a ponadto jest trwale zablokowany w przypadku mutacji Ser Obie wspomniane reszty serynowe oskrzydlają sekwencję EF-hand, znajdującą się pomiędzy ostatnią domeną transbłonową a domeną wiążącą kalmodulinę. Motyw ten pośredniczy w zależnej od wapnia inaktywacji kanału Ca v 1.2, wyzwalanej przez tworzenie kompleksu Ca 2+ /CaM i wiązaniu go w rejonie C- -końcowym podjednostki α. Ważną rolę w aktywacji kanału za pośrednictwem CaMKII odgrywa również podjednostka β, której przynajmniej jedna izoforma jest fosforylowana in vitro w pozycji Thr 498 [40]. Najnowsze badania nad rolą CaM-kinazy II w komórkach mięśnia sercowego wykazały interesujący mechanizm hamowania syntezy kanału Ca v 1.2. CaMKII aktywuje bowiem wiązanie elementu regulatorowego DRE z czynnikiem transkrypcyjnym DREAM, który wycisza ekspresję genów kanałów typu L [42]. Autorzy badań wnioskują, że kaskada Ca 2+ /CaMKII-DREAM stanowi mechanizm sprzężenia zwrotnego, umożliwiający komórkom regulowanie intensywności napływu Ca 2+ do ich wewnątrzkomórkowego stężenia wykrytego przez CaMKII. Można więc mówić o podwójnej roli CaM-kinazy II, która aktywując kanały typu L poprzez fosforylację, jednocześnie wpływa na obniżenie ich wytwarzania [42]. Kanały typu P/Q pełnią rolę w regulacji uwalniania pęcherzyków wydzielniczych w synapsach i w szczególnie dużej ilości występują w móżdżku, korze mózgu i hipokampie ssaków [43,44]. Aktywowane są przez kilka następujących po sobie krótkich depolaryzacji, zaś w aktywacji podtypu Ca v 2.1 pośredniczy kalmodulina. Zależna od Ca 2+ inaktywacja Ca v 2.1 wymaga dwóch sekwencji EF-hand w domenie N-końcowej kalmoduliny, natomiast w jego aktywacji uczestniczą dwie EF-hands C-końcowe lub wszystkie cztery [40]. W przypadku kanałów Ca v 2.1 widać wyraźnie, w jaki sposób jony wapnia wpływają zarówno na aktywację, jak i na hamowanie kanału. W oba typy regulacji zaangażowana jest kalmodulina, która ma zdolność wiązania się z dwoma miejscami w C-końcowym odcinku podjednostki α kanału: tzw. domeną wiążącą kalmodulinę (CBD, ang. calmodulin binding domain) i domeną typu IQ, której nazwa odnosi się do dwóch pierwszych aminokwasów wchodzących w jej skład izoleucyny (I) oraz glutaminy (Q). Wykazano, że delecja domeny CBD całkowicie blokuje możliwość aktywacji oraz hamowania kanału [45]. Dalsze badania poświęcone wyjaśnieniu roli, jaką w regulacji kanałów Ca v 2.1 pełnią domeny EF-hand wykazały, że motywy znajdujące się w końcu C kalmoduliny okazały się kluczowe dla aktywacji zależnej od Ca 2+. Zaproponowano, że aktywacja, za którą odpowiada rejon C-końcowy jest prawdopodobnie skuteczniejsza podczas szybkiego, lokalnego napływu Ca 2+. Zgodnie z tą teorią mniej gwałtowny, globalny napływ Ca 2+ do komórki powoduje jego wiązanie do motywów końca N, wywołując zamykanie kanałów i chroniąc przed wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ do wartości toksycznych. Obecnie coraz więcej danych potwierdza powyższe przypuszczenia [46]. Kanał wapniowy Cav2.1 jest uważany za szczególnie ważny w inicjacji transmisji synaptycznej. Przypuszcza się, że jego dynamiczna regulacja zależna od Ca 2+, przy udziale mającej podwójne działanie kalmoduliny, może wpływać na przesyłanie informacji w neuronach poprzez formowanie krótkotrwałej plastyczności synaptycznej [47]. Interesującym aspektem regulacji kanałów Ca v 2.1 jest udział w niej kinazy CaMKII, kluczowego regulatora odpowiedzi synaptycznych w gęstości postsynaptycznej. Rola tego mechanizmu jest prawdopodobnie istotna w presynaptycznych zakończeniach neuronów, gdzie kanały typu P/Q inicjują wydzielanie neuroprzekaźników [48]. Postępy Biochemii 58 (4)

6 W kanałach wapniowych typu T (Ca v 3), bramkowanych przez niewielkie depolaryzacje, nie występuje mechanizm regulacji bezpośrednio zależny od kalmoduliny [46]. Na przykładzie kanałów Ca v 3.2 wykazano jednak wpływ CaM- KII, która katalizując fosforylację reszty Ser 1198, zwiększa aktywność kanałów poprzez przesunięcie potencjału aktywacji w stronę hiperpolaryzacji. Co ciekawe, mechanizm ten nie występuje w kanałach Ca v 3.1, ze względu na brak reszty seryny w tej pozycji [40,49]. Oddziaływanie kalmoduliny z receptorem NMDA Receptor NMDA jest receptorem zależnym zarówno od potencjału błonowego jak i od ligandów, którymi są glutaminian, asparaginian i glicyna. Jest to niespecyficzny kanał jonowy transportujący oprócz jonów wapniowych także jony sodowe i potasowe. Jest heterotetra- lub heteropentamerem zbudowanym z jednej lub dwóch podjednostek NR1, dwóch lub trzech podjednostek NR2 (GluN) oraz czasami jednej podjednostki NR3. Podjednostki NR2 występują w czterech izoformach NR2A-D. Receptor ten szczególną rolę odgrywa w hipokampie, zwłaszcza w neuronach glutaminergicznych, gdzie uczestniczy w tworzeniu LTP, a tym samym w procesach uczenia się i zapamiętywania. Napływ jonów wapniowych przez receptor NMDA odgrywa także znaczącą rolę w uszkodzeniach wywołanych niedotlenieniem. Kalmodulina wpływa na aktywność tego kanału głównie poprzez aktywację kinazy CaMKII, która następnie ulega przemieszczeniu i związaniu z podjednostką receptora NMDA [50]. Ustalono, że tylko izoforma α CaMKII oddziałuje z receptorem NMDA. Może się ona wiązać ze wszystkimi rodzajami podjednostek receptora. Najsilniej wiąże się z podjednostką NR2B, słabiej z podjednostkami NR1 i NR2A [50]. Wcześniejsza aktywacja kinazy przez kompleks Ca 2+ / CaM jest etapem niezbędnym do wiązania z podjednostką NR2B (znaną również pod nazwą GluN2B). Kolejnym etapem jest autofosforylacja CaMKII (reszta Thr 286 ), która nie jest konieczna, ale w efekcie prowadzi do silniejszego wiązania CaMKII z receptorem NMDA, jednocześnie uniezależniając to wiązanie od obecności Ca 2+ /CaM [50-54]. Autofosforylacja Thr 305/306 lub fosforylacja Ser 1416 przez PKC hamuje wiązanie kinazy z receptorem [55]. Zaobserwowano także, że indukowane kompleksem Ca 2+ /CaM wiązanie CaMKII z NR2B było silniejsze w obecności ADP niż ATP (AMP nie ma wpływu na to oddziaływanie) [56]. Autofosforylacja CaMKII wymagana jest również podczas przyłączania kinazy do podjednostki NR1. Autofosforylacja reszty Thr 286 kinazy obniża tempo uwalniania CaM- KII z podjednostki NR1 [57]. Autofosforylacja kinazy (reszty Thr 305/306 ) jest pobudzana podczas powrotu jonów wapniowych do poziomu podstawowego, a kalmodulina odłączana jest od ufosforylowanej na reszcie Thr 286 CaMKII. Reakcja ta hamuje wiązanie enzymu z CaM oraz znacznie obniża powinowactwo kinazy do podjednostek NR1, NR2B/P i NR2B/C. Stwierdzono także, że sam kompleks Ca 2+ /CaM może bezpośrednio oddziaływać z NR1, prawdopodobnie w tym samym miejscu, w którym wiąże się z CaMKII. Przypuszcza się, że CaMKII i kompleks Ca 2+ /CaM współzawodniczą o NR1 lub oddziałują jednocześnie. Mechanizm i rola takiego współzawodnictwa nie są jeszcze wyjaśnione i wymagają dalszych badań. Zaobserwowano także dodatkowy mechanizm regulujący działanie NR1 polegający na modulowaniu przez kalmodulinę oddziaływań pomiędzy α-aktyniną i receptorem NMDA, obniżając tym samym aktywność receptora [57,58]. Nie tylko kalmodulina, ale także CaMKII współzawodniczy z α-aktyniną o wiązanie z NR1 [59]. Badania wskazują, że CaMKII w powiązaniu z CaM prowadzi do usunięcia α-aktyniny z podjednostki receptora [50]. Opisana różnorodność modyfikacji regulujących oddziaływanie CaMKII i samej kalmoduliny z podjednostkami receptora NMDA oraz odmienność wywoływanych tymi modyfikacjami efektów świadczy o istnieniu bardzo precyzyjnych mechanizmów regulujących tak istotne procesy jak LTP, uczenie się i zapamiętywanie. W doświadczeniach wykonanych na myszach zaobserwowano, że zaburzenia w oddziaływaniu pomiędzy CaMKII i NR2B hamują fosforylację reszty Thr 286 αcamkii, obniżając w konsekwencji fosforylację ważnego substratu CaMKII, jakim jest receptor AMPA i powstawanie LTP w hipokampie [60]. Kalmodulina reguluje działanie receptora NMDA nie tylko bezpośrednio i przez aktywację kinazy CaMKII, lecz także przez aktywowanie kinazy CaMKIV. CaMKIV uczestniczy w hamowaniu alternatywnego składania eksonów podjednostki NR1 receptora NMDA. Podjednostka NR1 kodowana jest przez jeden gen, natomiast warianty powstają w wyniku alternatywnego składania trzech eksonów 5, 21 i 22. Regulacja tego procesu ma istotne znaczenie dla szybkości przemieszczania się podjednostki NR1 z siateczki śródplazmatycznej do błony, fosforylacji zależnej od kinaz C i A, oddziaływania z neurofilamentem L oraz wiązania z kalmoduliną. W eksonie piątym znajduje się sekwencja nukleotydowa kodująca fragment zewnątrzkomórkowy na końcu aminowym, odpowiedzialny za farmakologiczne właściwości receptora. Wykazano, że alternatywne składanie eksonów 5 i 21 jest zahamowane w obecności aktywnej formy CaMKIV. Odpowiedzialne za oddziaływanie z CaMKIV są dwa motywy RNA: podobny do intronowego fragment CaRRE (ang. CaMKIV-responsive RNA element) i niedawno odkryty eksonowy motyw CaRRE2 [61]. Kalmodulina a receptory zlokalizowane w siateczce śródplazmatycznej Kalmodulina odgrywa także ważną rolę w kontrolowaniu funkcji wewnątrzkomórkowych magazynów Ca 2+, poprzez regulację dwóch typów receptorów znajdujących się w siateczce endo/sarkoplazmatycznej (ER/SR) receptorów rianodynowych (RyR) oraz receptorów IP 3. Receptory rianodynowe, występujące w postaci trzech tetramerycznych izoform odpowiadają za przepływ Ca 2+ z ER/SR do cytoplazmy. Mają jedno miejsce wiązania dla kalmoduliny, zarówno zawiązanej z wapniem (Ca 2+ /CaM) jaki i wolnej (apom). RyR mogą być regulowane również 398

7 poprzez fosforylację, w tym przez CaMKII [62,63]. RyR1 występuje głównie w mięśniach szkieletowych i jest niezbędny do rozpoczęcia skurczu, uwalniając jony wapnia z SR [64]. Badania in vitro pokazały, że przyłączenie apocam aktywuje receptor i dochodzi do uwolnienia jonów wapnia, natomiast Ca 2+ /CaM jest inhibitorem tego receptora. Tak samo regulowany jest RyR3 występujący w wielu różnych komórkach. Nie dominuje on jednak w żadnej tkance tak, jak dwie pozostałe izoformy [62]. RyR2 obecny jest przede wszystkim w komórkach mięśnia sercowego, gdzie bierze udział w przemianie impulsu elektrycznego na reakcję mechaniczną [65]. Przyłączenie apocam do receptora powoduje zamknięcie kanału i taki mechanizm jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania serca. Mutacje w domenie odpowiedzialnej za przyłączenie kalmoduliny zaburzają działanie receptora, zaś ciągłe uwalnianie jonów wapniowych z siateczki endo/ sarkoplazmatycznej przyczynia się do licznych chorób serca [66]. Również wiązanie przez receptor kompleksu Ca 2+ / CaM blokuje jego działanie. RyR2 ma trzy miejsca fosforylacji (reszty seryny), z których tylko dwa podlegają działaniu CaMKII [67]. Fosforylacja receptora hamuje uwalnianie Ca 2+. Jednakże przy nieprawidłowym funkcjonowaniu mięśnia sercowego (np. migotanie przedsionków), RyR2 ufosforylowany przez CaMKII zwiększa wypływ jonów wapnia z SR [68,69]. Receptor IP 3 (IP 3 R) obecny w błonie siateczki śródplazmatycznej prawie wszystkich komórek występuje w trzech izoformach IP 3 R1-3 wykazujących 65-85% homologii. Jest to homo- lub heterotetramer tworzący kanał dla Ca 2+ [70]. Głównym ligandem receptora jest inozytolo-1,4,5-trisfosforan powstający w wyniku działania fosfolipazy C (PLC), aktywowanej czynnikami zewnątrzkomórkowymi takimi jak: hormony, czynniki wzrostu, neuroprzekaźniki i światło [70]. Oprócz domeny wiążącej IP 3, receptor zawiera kilka regionów odpowiedzialnych za regulację jego aktywności przez wiązanie Ca 2+, CaM, ATP lub fosforylację przy udziale kinaz: PKA, PKC, CaMKII i kinazy tyrozynowej. Aktywność IP 3 R zależy od stężenia jonów wapnia; niskie stężenie aktywuje kanał przez bezpośrednie wiązanie Ca 2+, natomiast wysokie stężenie hamuje jego aktywność [71]. Istnieją przynajmniej dwa miejsca specyficznego wiązania kalmoduliny w każdej podjednostce IP 3 R [72]. Możliwe jest wiązanie zarówno kompleksu Ca 2+ /CaM jak i samej apokalmoduliny [73,74]. Wiązanie kalmoduliny z receptorem może być zależne (IP 3 R1 i IP 3 R2) lub niezależne od obecności jonów wapnia (IP 3 R3) [71]. Scharakteryzowano także miejsce niezależnego od wapnia wiązania kalmoduliny w IP 3 R1 znajdujące się w końcu N-aminokwasowym podjednostek receptora [75]. CaM hamuje aktywność receptora IP 3, przez blokowanie wiązania inozytolo-1,4,5-trisfosforanu, proces ten intensywniej zachodzi przy wyższych, mikromolowych stężeniach wapnia [71]. Z drugiej strony wykazano, że usunięcie endogennie związanej z receptorem kalmoduliny powoduje całkowitą utratę aktywności IP 3 R [71]. Badania potwierdziły, że wpływ kalmoduliny na wiązanie IP 3 jest zależny od typu receptora [76]. Pośredni wpływ kalmoduliny na transport Ca 2+ przez IP 3 R polega na aktywowaniu kinaz białkowych fosforylujących receptor. Zależna od CaMKII fosforylacja podtypów IP 3 R1 oraz IP 3 R2 prowadzi do znacznego obniżenia aktywności receptora, wskazując na zależną od Ca 2+ negatywną regulację [70,77,78]. Kalmodulina a receptory TRP Kolejną grupa białek, z którymi oddziałuje CaM są kanały TRP (ang. transient receptor potential) [79]. Kanały TRP tworzą zróżnicowaną rodzinę około 30 białek, obecnych w wielu rodzajach komórek. Wyróżnia się 7 podrodzin: TRPC (ang. cannonical), TRPV (ang. vaniloid), TRPM (ang. melastatin), TRPML (ang. mucolipin), TRPP (ang. polycystic), TRPA (ang. ankyrin) i TRPN [80]. Odgrywają one rolę w regulacji fototransdukcji, osmoregulacji, przekaźnictwie bodźców bólowych, termoregulacji, utrzymywaniu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia, regulacji cyklu komórkowego i wydłużaniu aksonalnych stożków wzrostu. Ich struktura sześć transbłonowych domen, cytoplazmatyczne końce C i N oraz region porowy zalicza je do grupy kanałów jonowych zależnych od potencjału i cyklicznych nukleotydów [81]. TRPC tworzy kanał przepuszczalny dla Ca 2+ związany z receptorem RACCs. Wiązanie to prowadzi do aktywacji fosfolipazy C i hydrolizy PIP 2 do IP 3 i diacyloglicerolu. IP 3 aktywuje kanały SOCs (ang. store-operated channels) powodując wypływ jonów wapnia z siateczki śródplazmatycznej. Kanały TRPV odgrywają rolę czujników temperatury, wrażliwych na wysoką temperaturę i ph. W przeciwieństwie do nich podrodzina TRPM (biorąca nazwę od melastatyny, markera przerzutów czerniaka), odpowiada na niskie temperatury i mentol. Kanały TRP służą więc jako sensory różnych czynników środowiskowych [82]. Funkcjonalnie kanały TRP charakteryzuje się jako nieselektywne kanały kationowe. Choć wykazują one dużą różnorodność w przepuszczalności dla jonów, większość z nich jest bardziej selektywna dla Ca 2+. Dlatego też mogą być postrzegane jako kanały wapniowe, gdzie napływ Ca 2+ reprezentuje jedną z ich wspólnych ról fizjologicznych. W tym przypadku najważniejsze w utrzymaniu homeostazy wapniowej jest ujemne sprzężenie zwrotne, wspomagane przez kinazy, fosfatazy, fosfolipazy i kalmodulinę. Uznaje się, że bezpośrednie związanie Ca 2+ /CaM z cytoplazmatycznymi końcami kanału TRP powoduje spadek wrażliwości receptora [79,83]. Ten sam mechanizm występuje w różnych kanałach z podrodzin TRPC, TRPV i TRPM. Miejsce wiązania kalmoduliny w rejonie C-końcowym zaproponowano dla kanałów TRPC1-7, TRPCM4, TRPCV1, TRPCV4-6, a w rejonie N-końcowym dla TRPM2 i TRPV1 [83]. Niektóre z tych miejsc wiążą fosfatydyloinozytol (PIP), fofatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (PIP 2 ) oraz fosfatydyloinozytolo- -3,4,5-trisfosforan (PIP 3 ). W warunkach fizjologicznych PIP jest ujemnie naładowany, co pozwala na elektrostatyczne oddziaływanie z resztami aminokwasów o dodatnim ładunku. Domeny wiążące CaM często zawierają takie reszty. W kanałach TRPC6 w rejonie C-końcowym odkryto rejony wiążące zarówno CaM i PIP 2, a w TRPV1 przy przyłączaniu CaM do miejsca w rejonie C-końcowym, ma swój udział fosfatydyloinozytol, przy czym CaM i PIP 2 wiążą się z zachodzącymi na siebie, ale nie identycznymi miejscami [82]. Postępy Biochemii 58 (4)

8 W podrodzinie TRPC znajduje się przypuszczalnie od jednego do czterech miejsc wiążących kalmodulinę. Jedno z nich jest nazywane CaM-IP 3 receptor binding lub CRIB i występuje u wszystkich przedstawicieli TRPC. CaM może działać na te kanały stymulująco, jak i hamująco. Zgodnie z hipotezą sformułowaną dla TRPV4, ale być może prawdziwa także dla innych białek przepuszczalnych dla wapnia. w stanie spoczynku koniec N receptora tworzy autoinhibitorowy kompleks z końcem C, który zawiera też miejsce wiązania CaM. Na skutek zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+, następuje rozpad kompleksu utworzonego przez oba końce i przyłączenie kalmoduliny [84,85]. Takie dane sugerują, że kalmodulina odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu kanałów TRP, jednak intensywność i sposób działania jest różna dla poszczególnych podrodzin. CaM została odkryta praktycznie jednocześnie w dwóch laboratoriach w 1970 r przez zespoły Shiro Kakiuchi i Wai Yiu Cheung [86,87] jako aktywator fosfodiesterazy camp. Dalsze, lawinowo pojawiające się prace wykazały, że to niewielkie białko ma wyjątkowe znaczenie dla homeostazy wapniowej wszystkich typów komórek, co znakomicie odzwierciedla jego nazwa wprowadzona w 1979 r. calmodulin czyli Calcium modulated protein. Do dziś jednak niewiadomo, dlaczego u szczura trzy geny kodują osiem głównych transkryptów, a każdy z nich koduje identyczne białko. PIŚMIENNICTWO 1. Burgoyne RD (2001) The neuronal calcium sensor family of Ca 2+ -binding proteins. Biochem J 353: Haynes LP, McCue HV, Burgoyne RD (2012) Evolution and functional diversity of the calcium binding proteins (CaBPs). Front Mol Neurosci 5: 9 3. Raghuram V, Sharma Y, Kreutz MR (2012) Ca 2+ sensor proteins in dendritic spines: a race for Ca 2+. Front Mol Neurosci 5: Bähler M, Rhoads A (2002) Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett 513: Grabarek Z (2006) Structural basis for diversity of the EF-hand calcium-binding proteins. J Mol Biol 359: Valeyev NV, Bates DG, Heslop-Harrison P, Postlethwaite I, Kotov NV (2008) Elucidating the mechanisms of cooperative calcium-calmodulin interactions: a structural systems biology approach. BMC Syst Biol 2: Shifman JM, Mayo SL (2002) Modulating calmodulin binding specificity through computational protein design. J Mol Biol 323: Kortvely E, Gulya K (2004) Calmodulin, and various ways to regulate its activity. Life Sci 74: Palfi A, Kortvely E, Fekete E, Kovacs B, Varszegi S, Gulya K (2002) Differential calmodulin gene expression in the rodent brain. Life Sci 70: Toutenhoofd SL, Strehler EE (2000) The calmodulin multigene family as a unique case of genetic redundancy: multiple levels of regulation to provide spatial and temporal control of calmodulin pools? Cell Calcium 28: Kortvely E, Palfi A, Bakota L, Gulya K (2002) Ontogeny of calmodulin gene expression in rat brain. Neuroscience 114: Kortvely E, Varszegi S, Palfi A, Gulya K (2003) Intracellular targeting of calmodulin mrnas in primary hippocampal cells. J Histochem Cytochem 51: Bai G, Weiss B (1991) The increase of calmodulin in PC12 cells induced by NGF is caused by differential expression of multiple mrnas for calmodulin. J Cell Physiol 149: Wu X, Bers DM (2007) Free and bound intracellular calmodulin measurements in cardiac myocytes. Cell Calcium 41: Ferrington DA, Chen X, Krainev AG, Michaelis EK, Bigelow DJ (1977) Protein half-lives of calmodulin and the plasma membrane Ca-ATPase in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 237: McGinnis KM, Shariat-Madar Z, Gnegy ME (1998) Cytosolic calmodulin is increased in SK-N-SH human neuroblastoma cells due to release of calcium from intracellular stores. J Neurochem 70: Roberson MS, Bliss SP, Xie J, Navratil AM, Farmerie TA, Wolfe MW, Clay CM (2005) Gonadotropin-releasing hormone induction of extracellular-signal regulated kinase is blocked by inhibition of calmodulin. Mol Endocrinol 19: Ye XF, Lu Y, Zhang P, Liang JH (2004) Calmodulin inhibitor trifluoperazine attenuates the development and expression of morphineinduced conditioned place preference in rats. Eur J Pharmacol 486: Olson JE, Li GZ, Wang L, Lu L (2004) Volume-regulated anion conductance in cultured rat cerebral astrocytes requires calmodulin activity. Glia 46: Mangels LA, Gnegy ME (1990) Muscarinic receptor-mediated translocation of calmodulin in SK-N-SH human neuroblastoma cells. Mol Pharmacol 37: Ferré S, Woods AS, Navarro G, Aymerich M, Lluís C, Franco R (2010) Calcium-mediated modulation of the quaternary structure and function of adenosine A2A-dopamine D2 receptor heteromers. Curr Opin Pharmacol 10: Ritter SL, Hall RA (2009) Fine-tuning of GPCR activity by receptorinteracting proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 10: Mermelstein PG, Deisseroth K, Dasgupta N, Isaksen AL, Tsien RW (2001) Calmodulin priming: nuclear translocation of a calmodulin complex and the memory of prior neuronal activity. Proc Natl Acad Sci USA 98: Kahl CR, Means AR (2003) Regulation of cell cycle crogression by calcium/calmodulin-dependent pathways. Endocr Rev 24: Zhang J, Sutachan JJ, Montoya-Gacharna J, Xu CF, Xu F, Neubert TA, Recio-Pinto E, Blanck TJ (2009) Isoflurane inhibits cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein phosphorylation and calmodulin translocation to the nucleus of SH-SY5Y cells. Anesth Analg 109: Benaim G, Villalobo A (2002) Phosphorylation of calmodulin. Functional implications. Eur J Biochem 269: Sharma RK, Das SB, Lakshmikuttyamma A, Selvakumar P, Shrivastav A (2006) Regulation of calmodulin-stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE1): review. Int J Mol Med 18: Xiao H, Zhou H, Chen G, Liu S, Li G (2007) Interaction between inducible nitric oxide synthase and calmodulin in Ca 2+ -free and -bound forms. J Proteome Res 6: Swulius MT, Waxham MN (2008) Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinases. Cell Mol Life Sci 65: Sindreu CB, Storm DR (2008) How I learned to stop worrying and love calcineurin. Nat Neurosci 11: Rodríguez-Vilarrupla A, Jaumot M, Abella N, Canela N, Brun S, Díaz C, Estanyol JM, Bachs O, Agell N (2005) Binding of calmodulin to the carboxy-terminal region of p21 induces nuclear accumulation via inhibition of protein kinase C-mediated phosphorylation of Ser153. Mol Cell Biol 25: Díez-Guerra FJ (2010) Neurogranin, a link between calcium/calmodulin and protein kinase C signaling in synaptic plasticity. IUBMB Life 62: Haiech J, Audran E, Feve M, Ranjeva R, Kilhoffer M-C (2011) Revisiting intracellular calcium signaling semantics. Biochimie 93: Brini M, Carafoli E (2009) Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev 89: Strehler EE, Treiman M (2004) Calcium pumps of plasma membrane and cell interior. Curr Mol Med 4:

9 36. Strehler EE, Zacharias DA (2001) Role of Alternative Splicing in Generating Isoform Diversity Among Plasma Membrane Calcium Pumps. Physiol Rev 81: Grover AK, Xu A, Samson SE, Narayanan N (1996) Sarcoplasmic reticulum Ca 2+ pump in pig coronary artery smooth muscle is regulated by a novel pathway. Am J Physiol 271: MacLennan DH, Kranias EG (2003) Phospholamban: a crucial regulator of cardiac contractility. Nat Rev Mol Cell Biol 4: Treinys R, Jurevicius J (2008) L-type Ca 2+ channels in the heart: structure and regulation. Medicina (Kaunas) 44: Dai S, Hall DD, Hell JW (2009) Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev 89: Benmocha A, Almagor L, Oz S, Hirsch JA, Dascal N (2009) Characterization of the calmodulin-binding site in the N terminus of CaV1.2. Channels (Austin) 3: Ronkainen JJ, Hänninen SL, Korhonen T, Koivumäki JT, Skoumal R, Rautio S, Ronkainen VP, Tavi P (2011) Ca 2+ -calmodulin-dependent protein kinase II represses cardiac transcription of the L-type calcium channel alpha(1c)-subunit gene (Cacna1c) by DREAM translocation. J Physiol 589: Nimmrich V, Gross G (2012) P/Q-type calcium channel modulators. Br J Pharmacol 167: Rajakulendran S, Kaski D, Hanna MG (2012) Neuronal P/Q-type calcium channel dysfunction in inherited disorders of the CNS. Nat Rev Neurol 8: Lee A, Zhou H, Scheuer T, Catterall WA (2003) Molecular determinants of Ca 2+ /calmodulin-dependent regulation of Ca(v)2.1 channels. Proc Natl Acad Sci USA 100: Dunlap K (2007) Calcium channels are models of self-control. J Gen Physiol 129: Chaudhuri D, Issa JB, Yue DT (2007) Elementary mechanisms producing facilitation of Cav2.1 (P/Q-type) channels. J Gen Physiol 129: Jiang X, Lautermilch NJ, Watari H, Westenbroek RE, Scheuer T, Catterall WA (2007) Modulation of CaV2.1 channels by Ca 2+ /calmodulindependent protein kinase II bound to the C-terminal domain. Proc Natl Acad Sci USA 105: Welsby PJ, Wang H, Wolfe JT, Colbran RJ, Johnson ML, Barrett PQ (2003) A mechanism for the direct regulation of T-type calcium channels by Ca2+/calmodulin-dependent kinase II. J Neurosci 23: Colbran RJ (2004) Targeting of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Biochem J 378: Bayer KU, De Koninck P, Leonard AS, Hell JW, Schulman H (2001) Interaction with the NMDA receptor locks CaMKII in an active conformation. Nature 411: Raveendran R, Devi Suma Priya S, Mayadevi M, Steephan M, Santhoshkumar TR, Cheriyan J, Sanalkumar R, Pradeep KK, James J, Omkumar RV (2009) Phosphorylation status of the NR2B subunit of NMDA receptor regulates its interaction with calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. J Neurochem 110: Pradeep KK, Cheriyan J, Suma Priya SD, Rajeevkumar R, Mayadevi M, Praseeda M, Omkumar RV (2009) Regulation of Ca 2+ /calmodulin- -dependent protein kinase II catalysis by N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Biochem J 419: Sessoms-Sikes S, Honse Y, Lovinger DM, Colbran RJ (2005) CaMKI- Ialpha enhances the desensitization of NR2B-containing NMDA receptors by an autophosphorylation-dependent mechanism. Mol Cell Neurosci 29: Hudmon A, Schulman H (2002) Neuronal Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase II: the role of structure and autoregulation in cellular function. Annu Rev Biochem 71: O Leary H, Liu WH, Rorabaugh JM, Coultrap SJ, Bayer KU (2011) Nucleotides and phosphorylation bi-directionally modulate Ca 2+ / Calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) binding to the N- methyl-d-aspartate (NMDA) receptor subunit GluN2B. J Biol Chem 286: Leonard AS, Bayer KU, Merrill MA, Lim IA, Shea MA, Schulman H, Hell JW (2002) Regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II docking to N-methyl-D-aspartate receptors by calcium/ calmodulin and α-actinin. J Biol Chem 277: Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ (2005) Multivalent interaction of calcium/calmodulindependent protein kinase II with the postsynaptic density proteins NR2B, densin-180, and α-actinin-2. J Biol Chem 280: Robison AJ, Barlett RK, Bass MA, Colbran RJ (2005) Differential modulation of Ca/calmodulin-dependent protein kinase II activity by regulated interactions with N-methyl-D-aspartate receptor NR2B subunits and α-actinin. J Biol Chem 280: Zhou Y, Takahashi E, Li W, Halt A, Wiltgen B, Ehninger D, Li GD, Hell JW, Kennedy MB, Silva AJ (2007) Interactions between the NR2B receptor and CaMKII modulate synaptic plasticity and spatial learning. J Neurosci 27: Lee JA, Xing Y, Nguyen D, Xie J, Lee CJ, Black DL (2007) Depolarization and CaM Kinase IV modulate NMDA receptor splicing through two essential RNA elements. PLoS Biology 5: e Ozawa T (2010) Modulation of ryanodine receptor Ca 2+ channels. Mol Med Report 3: Lanner JT, Georgiou DK, Joshi AD, Hamilton SL (2010) Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb Perspect Biol Cold Spring Harb Perspect Biol 2: a Jiang J, Zhou Y, Zou J, Chen Y, Patel P, Yang JJ, Balog EM (2010) Sitespecific modification of calmodulin Ca 2+ affinity tunes the skeletal muscle ryanodine receptor activation profile. Biochem J 432: Prosser BL, Hernández-Ochoa EO, Schneider MF (2011) S100A1 and calmodulin regulation of ryanodine receptor in striated muscle. Cell Calcium 50: Xu X, Yano M, Uchinoumi H, Hino A (2010) Defective calmodulin binding to the cardiac ryanodine receptor plays a key role in CPVTassociated channel dysfunction. Biochem Biophys Res Commun 394: Yamaguchi N, Takahashi N, Xu L, Smithies O, Meissner G (2007) Early cardiac hypertrophy in mice with impaired calmodulin regulation of cardiac muscle Ca release channel. J Clin Invest 117: Huke S, Bers DM (2008) Ryanodine receptor phosphorylation at Serine 2030, 2808 and 2814 in rat cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun 376: Chelu MG, Sarma S, Sood S (2009) Calmodulin kinase II-mediated sarcoplasmic reticulum Ca 2+ leak promotes atrial fibrillation in mice. J Clin Invest 119: Zhang S, Fritz N, Ibarra C, Uhle n P (2011) Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor subtype-specific regulation of calcium oscillations. Neurochem Res 36: Kasri NN, Torok K, Galione A, Garnham C, Callewaert, Missiaen L, Parys JB, De Smedt H (2006) Endogenously bound calmodulin is essential for the function of the inositol 1,4,5-triphosphate receptor. J Biol Chem 281: Cardy TJA, Taylor CW (1988) A novel role for calmodulin: Ca 2+ -independent inhibition of type-1 inositol triphosphate receptor. Biochem J 334: Jurado LA, Chockalingam PS, Jarrett HW (1999) Apocalmodulin. Physiological Rev 79: Kang S, Kwon H, Wen H, Sonh Y, Frueh D, Ahn HC, Yoo SH, Wagner G, Park S (2011) Global dynamic coformational changes in the suppressor domain of IP3 receptor by stepwise binding of the two lobes of calmodulin. FASEB J 25: Sienaert I, Kasri NN, Vanlingen S, Parys JB, Callewaert G, Missiaen L, De Smedt H (2002) Localization and function of a calmodulin-apokalmodulin-binding domain in the N-terminal part of the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Biochem J 365: Vanlingen S, Sipma H, De Smedt P, Callewaert G, Missiaen L, De Smedt H (2000) Ca 2+ and calmodulin differentialy modulate myoinositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3 )-binding to the recombinant ligand- Postępy Biochemii 58 (4)