Udział jonów wapnia w regulacji oddziaływań aktyny z miozyną

Transkrypt

1 Udział jonów wapnia w regulacji oddziaływań aktyny z miozyną STRESZCZENIE Skurcz komórek mięśniowych oraz różnorodne formy ruchliwości komórek niemięśniowych są uzależnione od cyklicznych oddziaływań pomiędzy filamentami aktynowymi i motorami molekularnymi z rodziny miozyn. Głównym wewnątrzkomórkowym przekaźnikiem, który pośredniczy w aktywacji oddziaływań aktyny z miozyną są jony wapnia. W zależności od typu komórki oraz rodzaju miozyny, molekularne mechanizmy regulacji są różne i zachodzą na dwóch poziomach na poziomie filamentu aktynowego oraz na poziomie miozyny. W komórkach mięśni poprzecznie prążkowanych regulacji podlega filament aktynowy, poprzez związany z nim kompleks troponiny. W mięśniach gładkich i w komórkach niemięśniowych głównym białkiem regulującym aktywność filamentu cienkiego jest kaldesmon. Kontrola aktywności miozyny w tych komórkach odbywa się na drodze fosforylacji lekkich łańcuchów oraz fosforylacji ciężkiego łańcucha miozyny. Bezpośrednie wiązanie jonów wapnia z łańcuchami lekkimi (którymi mogą być cząsteczki kalmoduliny) jest obserwowane w przypadku miozyny mięśni mięczaków oraz niektórych miozyn niekonwencjonalnych. Intensywne badania prowadzone w laboratoriach na całym świecie umożliwiają coraz bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacji oddziaływań aktyny z miozyną. W niniejszym artykule zostały omówione współczesne poglądy na ten temat. WPROWADZENIE Aktyna i miozyna są białkami szeroko rozpowszechnionymi we wszystkich komórkach eukariotycznych, co świadczy o ich doskonałym przystosowaniu do pełnienia licznych funkcji. Oddziaływania pomiędzy aktyną i miozyną leżą u podstaw różnorodnych procesów ruchliwości, począwszy od skurczu mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego, utrzymania napięcia mięśni gładkich, migracji komórek niemięśniowych, poprzez cytokinezę i transport wewnątrzkomórkowy, aż po ekspresję genów. Specyfika tych procesów jest determinowana przez różnorodność izoform miozyny oraz precyzję regulacji oddziaływań pomiędzy tymi białkami. Oba czynniki umożliwiają właściwą odpowiedź komórkową na sygnały zewnętrzne. Aktyna występuje w komórkach w dwóch formach monomerycznej i filamentowej. Przejście pomiędzy tymi formami jest procesem dynamicznym i ściśle regulowanym przez liczne białka wiążące aktynę [1,2]. Filamenty aktynowe mają postać dwóch helikalnie zwiniętych łańcuchów, po których, jak po szynach, poruszają się białkowe motory molekularne z rodziny miozyn. Dotychczas poznano sekwencje blisko 2,5 tys. ciężkich łańcuchów miozyn, które na podstawie różnic w domenie motorycznej zaklasyfikowano do ponad 35 rodzin (klas). Najbardziej znane i najliczniej reprezentowane są miozyny tworzące dwubiegunowe filamenty, zwane również miozynami konwencjonalnymi. Pozostałe miozyny zwane są miozynami niekonwencjonalnymi [3]. Wszystkie poznane dotychczas miozyny mają zbliżoną budowę domenową. Na końcu aminowym (końcu N) z reguły występuje najbardziej zachowana w ewolucji domena motoryczna, która jest zdolna do wiązania aktyny i ATP. Za domeną motoryczną znajduje się szyjka o strukturze helikalnej, do której dzięki oddziaływaniom niekonwalencyjnym przyłączają się łańcuchy lekkie. Dalej rozciąga się najbardziej zróżnicowana domena, zwana pałeczką lub ogonkiem, determinująca specyficzne funkcje danej miozyny [4]. Domena motoryczna wraz z szyjką zwana jest również główką. Hydroliza ATP zachodząca w główce miozyny, powoduje zmiany konformacyjne napędzające cykliczne oddziaływania miozyny z aktyną. Gdyby dostępność ATP była jedynym czynnikiem warunkującym te oddziaływania, wówczas wszystkie procesy zależne od miozyny byłyby konstytutywnie aktywne. Konieczność selektywnej aktywacji tylko niektórych procesów potrzebnych w danym momencie życia komórki wymusiła rozwinięcie precyzyjnych mechanizmów regulacji. Kaskada sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, którą zapoczątkowuje wzrost stężenia jonów wapnia, jest głównym mechanizmem umożliwiającym kontrolę oddziaływań pomiędzy miozynami i aktyną. Joanna Moraczewska 1,* Małgorzata Śliwińska 1 Maria Jolanta Rędowicz 2 1 Uniwersytet Kazimierza Wielkiego w Bydgoszczy, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Bydgoszcz 2 Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN w Warszawie * Uniwersytet Kazimierza Wielkiego w Bydgoszczy, Instytut Biologii Eksperymentalnej, ul. Chodkiewicza 30, Bydgoszcz; moraczjo@ukw.edu.pl Artykuł otrzymano 22 października 2012 r. Artykuł zaakceptowano 24 października 2012 r. Słowa kluczowe: aktyna, miozyna, jony wapnia, aktywność ATPazowa, regulacja Wykaz skrótów: CaD kaldesmon; l-cad izoforma lekka kaldesmonu; h-cad izoforma ciężka kaldesmonu; CaM kalmodulina; CaMK kinaza zależna od Ca 2+ i kalmoduliny; CLP (ang. calmodulin like protein) białko podobne do kalmoduliny; IQ motyw wiążący lekkie łańcuchy miozyny lub kalmodulinę; ELC (ang. essential light chain) istotny lekki łańcuch miozyny; KRP (ang. kinase related protein) białko pokrewne kinazie; MLCK (ang. myosin light chain kinase) kinaza lekkich łańcuchów miozyny; cmlck izoforma sercowa MLCK; MLCP (ang. myosin light chain phosphatase) fosfataza lekkich łańcuchów miozyny; PKA kinaza zależna od cyklicznego AMP; RLC (ang. regulatory light chain) regulatorowy lekki łańcuch miozyny; crlc izoforma RLC w mięśniu sercowym; TM tropomiozyna; Tn kompleks troponiny; TnC troponina C; TnI troponina I; TnT troponina T Podziękowania: Praca powstała w ramach działania Sieci Naukowej: Mechanizmy Ruchów Komórkowych Mobilitas.pl. Wsparcia finansowe MJR, z grantu nr N Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz dotacji statutowej dla Instytutu Nenckiego z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Postępy Biochemii 58 (4)

2 W komórkach pobudliwych jony wapnia stanowią główny wewnątrzkomórkowy przekaźnik sygnału. Odbiorcami tego sygnału są białka wiążące wapń, które z udziałem białek efektorowych, uczestniczą w różnorodnych procesach zachodzących w komórce. Aktywujące stężenia jonów Ca 2+ pojawiają się w komórce tylko przejściowo dzięki ich uwalnianiu z siateczki śródplazmatycznej oraz napływowi z zewnątrz. W stanie spoczynku Ca 2+ są magazynowane w siateczce śródplazmatycznej oraz są transportowane na zewnątrz komórki, a ich stężenie w cytoplazmie jest stosunkowo małe (poniżej 0,1 mm). Pobudzenie komórki powoduje otwarcie kanałów wapniowych, dzięki czemu następuje wzrost stężenia Ca 2+ powyżej 1 mm. Regulacja stężenia jonów wapnia w komórkach różnego typu przebiega w nieco odmienny sposób. Ponieważ mechanizmy uwalniania Ca 2+ są dość zawiłe, nie będą omawiane w tym artykule, a zainteresowane osoby odsyłamy do artykułów przeglądowych poświęconych tym zagadnieniom, również w tym numerze Postępów Biochemii. Zależna od stężenia Ca 2+ regulacja oddziaływań miozyny z filamentami aktynowymi, która funkcjonuje w mięśniach poprzecznie prążkowanych różni się w zasadniczy sposób od regulacji w mięśniach gładkich i w komórkach niemięśniowych. W mięśniach poprzecznie prążkowanych (czyli mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym) kontrola zachodzi głównie na poziomie filamentu aktynowego, poprzez kompleks troponiny, którego podjednostka troponina C, wiąże jony wapnia. To zapoczątkowuje szereg zmian konformacyjnych prowadzących do odblokowania miejsc wiązania główek miozyny w cząsteczce aktyny i w konsekwencji do skurczu. W mięśniach gładkich i komórkach niemięśniowych gen troponiny nie ulega ekspresji, a funkcję regulatora filamentów aktynowych pełni kaldesmon (CaD). Chociaż CaD bezpośrednio nie wiąże jonów wapnia, to jest on wrażliwy na ich stężenie dzięki wiązaniu kalmoduliny (CaM). Kompleks CaM/Ca 2+ wiąże się do CaD w rejonie jego oddziaływań z aktyną, co prowadzi do odblokowania miejsc wiązania miozyny w cząsteczce aktyny. W mięśniach gładkich i komórkach niemięśniowych oddziaływania miozyny z aktyną są regulowane także na poziomie miozyny. W tym przypadku odbiorcą sygnału wapniowego jest również CaM, która po związaniu Ca 2+ aktywuje kinazę lekkich łańcuchów miozyny. Kolejnym etapem jest fosforylacja jednego z lekkich łańcuchów miozyny (regulującego), oplatającego rejon szyjki, co prowadzi do aktywacji miozyny. W przypadku miozyny z mięśni mięczaków regulacja jej aktywności następuje poprzez wiązanie się jonów wapnia z innym typem łańcucha lekkiego, zwanego istotnym. Badania nad mechanizmami regulacji oddziaływań pomiędzy miozyną i aktyną są przedmiotem intensywnych badań prowadzonych na całym świecie. Nowe fakty, które wyłoniły się w ostatnich latach pozwoliły lepiej zrozumieć te procesy. Celem tego artykułu przeglądowego jest podsumowanie aktualnych poglądów na temat udziału jonów wapnia w regulacji oddziaływania miozyny z aktyną. Ca 2+ W REGULACJI SKURCZU MIĘŚNI POPRZECZNIE PRĄŻKOWANYCH Komórki mięśni poprzecznie prążkowanych, do których zaliczane są mięśnie szkieletowe oraz mięsień sercowy, kurczą się dzięki oddziaływaniom pomiędzy filamentami aktynowymi i miozynowymi regularnie upakowanymi w sarkomerach, czyli jednostkach kurczliwych komórek mięśniowych ograniczonych przez gęste struktury białkowe zwane liniami Z. Cienkie filamenty aktynowe jednym końcem są zakotwiczone w linii Z, a drugim są skierowane w stronę centrum sarkomeru. Grube filamenty miozynowe mają strukturę dwubiegunową. Oznacza to, że główki miozyny wystają po obu końcach grubego filamentu. Ponieważ filamenty miozynowe są ulokowane w centrum sarkomeru, główki znajdujące się na przeciwległych końcach oddziałują z filamentami aktynowymi powodując wnikanie filamentów miozynowych pomiędzy aktynowe, a to prowadzi do skracania sarkomeru i w konsekwencji do skurczu [5]. STRUKTURA FILAMENTÓW CIENKICH MIĘŚNI POPRZECZNIE PRĄŻKOWANYCH Centralnym białkiem filamentów cienkich jest fibrylarna aktyna (F-aktyna), powstała w wyniku polimeryzacji globularnych podjednostek aktyny monomerycznej (Ryc. 1). Filament aktynowy zbudowany jest z dwóch spiralnie zwiniętych łańcuchów podjednostek układających się w prawoskrętną helisę. Po obu stronach filamentu aktynowego układają się cząsteczki białka regulatorowego, tropomiozyny (TM). Długość jednej cząsteczki izoformy TM z mięśni prążkowanych odpowiada siedmiu monomerom aktyny. Możliwość tworzenia liniowych polimerów białka na całej długości filamentów aktynowych wynika z oddziaływań między końcami sąsiadujących cząsteczek TM [6]. Drugie białko regulatorowe filamentu cienkiego, kompleks troponiny, jest rozmieszczone na filamencie w regularnych odstępach odpowiadających długości pojedynczej cząsteczki TM. Kompleks składa się z trzech podjednostek: troponiny C (TnC) wiążącej Ca 2+, troponiny I (TnI) wykazującej zdolność hamowania oddziaływań akto-miozynowych oraz troponiny T (TnT), która poprzez wiązanie z TM zakotwicza cały kompleks na filamencie cienkim (Ryc. 1) [7,8]. Ponieważ w mięśniach szkieletowych aktywacja oddziaływań aktyny z miozyną jest wyzwalana przez przyłączanie Ca 2+ do kompleksu Tn, wyjaśnienie mechanizmu regulacji wymaga bardziej szczegółowego omówienia budowy tego białka. STRUKTURA TROPONINY Największą podjednostką całego kompleksu Tn jest TnT. Białko to odgrywa główną rolę w łączeniu wszystkich pod- Rycina 1. Schemat budowy filamentu cienkiego mięśni poprzecznie prążkowanych. Każdy z dwóch łańcuchów złożonych z podjednostek aktynowych (1) wiąże cząsteczki tropomiozyny (2) oraz kompleks troponiny, zbudowany z troponiny C (3), troponiny I (5) oraz troponiny T złożonej z dwóch funkcjonalnych domen, TnT1 (4b) i TnT2 (4a). Na podstawie [25]; zmodyfikowano

3 Rycina 2. Schemat zależnych od zmiennego stężenia jonów wapnia oddziaływań pomiędzy TnC i segmentami TnI oraz TnT wchodzącymi w skład domeny rdzeniowej kompleksu Tn. Na podstawie [10]; zmodyfikowano. jednostek Tn oraz pośredniczy w przekazywaniu aktywacji z TnC na pozostałe białka filamentu. W cząsteczce troponiny T wyróżnia się dwie zasadnicze części: TnT1 i TnT2 [9]. N-końcowa TnT1 wiąże TM i tworzy mostek pomiędzy cząsteczkami TM sąsiadującymi na filamencie (Ryc. 1). TnT2 również wiąże TM, ale jej koniec karboksylowy jest zaangażowany w oddziaływania z TnI oraz TnC (Ryc. 2). TnC ma budowę dwudomenową. Globularne domeny N- i C-końcowe są połączone przez centralnie położony łącznik, dzięki czemu białko przybiera kształt ciężarka do ćwiczeń (hantli). Obie domeny zawierają po dwa motywy EF-hand. Motyw EF-hand jest złożony z helisy-pętli-helisy, które przestrzennie koordynują jony dwuwartościowe dzięki obecności reszt aminokwasowych dostarczających mostków tlenowych dla tych jonów. Domena N-końcowa jest domeną regulatorową, a mieszczące się w jej obrębie motywy EF-hand wykazują dużą selektywność w stosunku do Ca 2+. Domena C-końcowa pełni rolę strukturalną. Miejsca wiązania jonów dwuwartościowych znajdujące się tej domenie, wykazują wyższe powinowactwo do jonów magnezu niż do jonów wapnia, co sprawia, że w warunkach fizjologicznych to właśnie jony Mg 2+ wysycają tę część cząsteczki TnC [8]. Pod nieobecność Ca 2+, helisy motywu EF-hand znajdujące się w domenie N-końcowej są ułożone równolegle do centralnego łącznika, który prawdopodobnie ma rozluźnioną konformację [10]. Wiązanie jonów wapnia powoduje, że helisy w domenie regulatorowej układają się prostopadle w stosunku do łącznika, a TnC przechodzi z konformacji zamkniętej w otwartą. Towarzyszą temu zmiany w rejonie centralnego łącznika, który przybiera konformację a-helikalną. Efektem tych zmian jest odsłonięcie hydrofobowej kieszeni, która ma zdolność wiązania segmentu TnI nazywanego przełącznikiem (Ryc. 2) [10]. W badaniach in vitro wykazano, że podjednostka TnI wiąże się z aktyną i hamuje aktywność ATPazy aktomiozynowej w sposób niezależny od stężenia jonów wapnia. Gdy TnI funkcjonuje w kompleksie z pozostałymi podjednostkami, jej oddziaływania z aktyną stają się zależne od zmian stężenia Ca 2+ [8]. Szczegółowa struktura TnI nie jest znana, jednak udało się określić, które rejony TnI są odpowiedzialne za funkcje tej podjednostki oraz w jaki sposób są one powiązane z pozostałymi podjednostkami Tn. W TnI zlokalizowano dwa miejsca oddziaływania z TnC. Pierwsze z nich mieści się w N-końcowej części cząsteczki i oddziałuje z C-końcową domeną TnC w sposób niezależny od zmian stężenia Ca 2+ [11]. Drugie miejsce to przełącznik, segment, który w łańcuchu polipeptydowym jest położony w centralnej części i wiąże się z N-końcową domeną regulatorową TnC tylko wtedy, gdy jest ona wysycona przez Ca 2+. Ma to kluczowe znaczenie dla mechanizmu regulacji, gdyż po obu stronach przełącznika znajdują się segmenty wiążące aktynę. Od strony N-końcowej przełącznika jest zlokalizowany rejon inhibitorowy, który przy niskim stężeniu Ca 2+ przybiera formę częściowo helikalną i wykazuje zdolność do wiązania z końcem N aktyny [12,13]. Drugi rejon, którym TnI oddziałuje z aktyną, jest domena C-końcowa. Badania mikroskopowe ujawniły, że pod nieobecność Ca 2+ domena ta jest rozciągnięta i tworzy pomost pomiędzy dwoma protofilamentami aktynowymi [14,15]. Orientacja podjednostek Tn w części rdzeniowej kompleksu (obejmującej fragmenty TnT2, TnI i całą TnC) oraz jego położenie na filamencie zostały określone na podstawie badań strukturalnych polegających na opracowywaniu atomowych modeli filamentu w oparciu o dane otrzymane metodami krystalograficznymi [10,16], mikroskopowymi [14,17], biochemicznymi i biofizycznymi [15,18-20]. Wzajemne powiązania pomiędzy podjednostkami i zmiany, jakie następują po przyłączeniu jonów wapnia przez TnC przedstawia rycina 2. C-końcowa helisa TnT2 splata się z centralną helisą TnI tworząc strukturę superhelikalną, która wraz z N-końcowym odcinkiem TnI przytrzymuje globularną C-końcową domenę TnC. Struktura tej części rdzenia Tn, nazywana ramieniem IT, jest niezależna od zmian stężenia Ca 2+, a w kompleksie z aktyną i tropomiozyną jest odsunięta od powierzchni aktyny [15,17,21]. Pozostałe oddziaływania podlegają zmianom zależnym od wiązania Ca 2+ przez domenę regulatorową TnC. Przejście domeny regulatorowej TnC w stan otwarty i odsłonięcie hydrofobowego rejonu prowadzi do wiązania segmentu przełącznika, co przywraca helikalną strukturę w rejonie łącznikowym TnC, a to z kolei prowadzi do rozciągnięcia struktury rejonu inhibitorowego TnI. Wiązanie przełącznika przez TnC ma również wpływ na strukturę i orientację C-końcowej domeny TnI [10]. Na filamencie N-końcowa domena regulatorowa TnC jest skierowana w stronę aktyny [15,17,21], zatem zmiany w oddziaływaniach pomiędzy tym rejonem TnC i rejonami TnI bezpośrednio wpływają na oddziaływanie TnI z pozostałymi białkami cienkiego filamentu. Troponina mięśnia sercowego charakteryzuje się podobną organizacją podjednostek do izoformy z mięśni szkieletowych, jednak istnieją wyraźne różnice w strukturze kilku elementów w części rdzeniowej tego białka. N-końcowa domena sercowej TnC wiąże tylko jeden jon wapnia [22], co sprawia, że nawet po związaniu Ca 2+ domena regulatorowa pozostaje w stanie zamkniętym Wiązanie segmentu przełącznika wspomaga otwarcie domeny EF-hand rejonu regulatorowego [23]. Różnice dotyczą również centralnego Postępy Biochemii 58 (4)

4 łącznika oraz rejonu inhibitorowego, które są słabiej ustrukturyzowane niż ich szkieletowe odpowiedniki [16]. Cechą charakterystyczną sercowej TnI jest obecność złożonego z reszt aminokwasowych przedłużenia na końcu N, które podlega fosforylacji. Te strukturalne różnice sprawiają, że sercowa izoforma Tn wykazuje niższą wrażliwość na jony wapnia, dodatkowo osłabianą przez fosforylację N-końcowego przedłużenia TnI przez kinazy zależne od camp [24]. MECHANIZM REGULACJI ODDZIAŁYWAŃ AKTOMIOZYNOWYCH PRZEZ TROPOMIOZYNĘ I KOMPLEKS TROPONINY W cienkim filamencie jeden kompleks Tn jest związany z jedną cząsteczką TM, dzięki której może kontrolować przynajmniej siedem podjednostek aktyny sąsiadujących wzdłuż filamentu [8,24,25]. W stanie relaksacji (małe stężenie jonów wapnia) Tn utrzymuje TM w pozycji, w której blokuje ona w aktynie większość miejsc oddziaływania z miozyną. Przy małych stężeniach jonów wapnia segment inhibitorowy i domena C-końcowa TnI są związane z aktyną. Rejon inhibitorowy TnI działa jak haczyk, który utrzymuje białka regulatorowe w pozycji hamującej oddziaływania aktyny z miozyną. To działanie jest wspomagane przez C-końcową domenę TnI, która konkuruje z TM o miejsca wiązania w aktynie i dodatkowo utrzymuje TM w pozycji blokującej [14,15]. Opisane powyżej zmiany konformacyjne w N-końcowej domenie TnC prowadzą do zmiany orientacji przełącznika, a w konsekwencji do zerwania kontaktów pomiędzy aktyną i TnI, które są utrzymywane w małych stężeniach Ca 2+. Odsunięcie od aktyny rejonu inhibitorowego oraz domeny C-końcowej TnI daje tropomiozynie większą swobodę ruchu, dzięki czemu może się ona przesuwać i odsłaniać miejsca wiązania główek miozyny. Dodatkowy mechanizm regulacji z udziałem Ca 2+ wykryto w mięśniach wprawiających w ruch skrzydła u muszki owocowej. W tym typie mięśni ekspresji ulega gen kodujący izoformę TnT, zawierającą, zbudowane z ok. 136 reszt aminokwasowych, C-końcowe przedłużenie bogate w reszty kwasu glutaminowego, które może bezpośrednio wiązać jony wapnia [26]. TnT w całości rozciąga się wzdłuż TM, przez co zwiększa sztywność łańcuchów tropomiozynowych. Przypuszcza się, że wiązanie Ca 2+ do TnT może wydajnie przyczyniać się do zwiększenia rytmicznej aktywacji filamentów aktynowych [27]. Dzięki tropomiozynie zmiany konformacyjne w obrębie cienkiego filamentu mają charakter allosteryczny i kooperatywny [28]. Oznacza to, że informacje o zmianach konformacyjnych zachodzących w rejonie filamentu bezpośrednio oddziałującym z troponiną, są przenoszone wzdłuż filamentu. W mięśniach szkieletowych wielkość jednostki regulatorowej, pozostającej pod wpływem jednego kompleksu Tn obejmuje 1,5-3 cząsteczki tropomiozyny i związane z nimi podjednostki aktyny. Dzięki temu cały filament odpowiada na sygnał zewnętrzny w sposób zintegrowany [25,28]. Cząsteczka aktyny jest czynnie zaangażowana w ten proces, a oddziaływania pewnych rejonów aktyny z TM oraz z TnI determinują wrażliwość filamentu na aktywujące stężenia jonów wapnia oraz siłę aktywacji ATPazy miozynowej przez cienki filament [18,29-31]. Zatem, subtelne oddziaływania pomiędzy wszystkimi białkami filamentu cienkiego są kluczowe dla precyzyjnej regulacji skurczu. Zaburzenia w tych oddziaływaniach, wynikające na przykład z defektów strukturalnych powstałych na skutek mutacji w genach kodujących białka cienkiego filamentu, bardzo często są przyczyną poważnych, nieuleczalnych chorób serca i układu ruchu [32-34]. ROLA KALDESMONU W REGULACJI ODDZIAŁYWAŃ AKTYNY Z MIOZYNĄ Kaldesmon jest białkiem regulatorowym związanym z filamentami aktynowymi, którego gen ulega ekspresji w mięśniach gładkich oraz komórkach niemięśniowych. Regulując oddziaływania aktyny i miozyny CaD kontroluje skurcz i napięcie mięśni gładkich, ruchliwość komórkową, czas i szybkość cytokinezy [35,36]. U kręgowców CaD jest kodowany przez pojedynczy gen, z którego na drodze alternatywnego składania eksonów powstają dwie izoformy tego białka. Izoforma o dużej masie cząsteczkowej (h-cad) występuje tylko w komórkach mięśni gładkich, natomiast izoforma krótsza, o mniejszej masie cząsteczkowej (l-cad) występuje zarówno w mięśniach gładkich, jak i w komórkach niemięśniowych. Obie izoformy CaD mają prawie identyczną strukturę rejonów C- i N-końcowych, natomiast różnią się helikalnym rejonem zbudowanym z ok. 160 reszt aminokwasowych, położonym w centralnej części cząsteczki, który jest usuwany z l-cad na etapie potranskrypcyjnej obróbki mrna [36-38]. Uważa się, że h-cad jest składnikiem aparatu kurczliwego, podczas gdy l-cad wiąże filamenty aktynowe budujące cytoszkielet [39]. Badania nad ekspresją genów izoform CaD w komórkach mięśni gładkich myszy transgenicznych wykazały, że kontrolowane zmniejszenie ekspresji genu h-cad jest częściowo rekompensowane przez zwiększenie ekspresji genu l-cad [40]. CaD może jednocześnie wiązać kilka białkowych ligandów aktynę, TM, miozynę i CaM/Ca 2+ (Ryc. 3). Skomplikowany wzór oddziaływań między białkami jest możliwy dzięki wielodomenowej strukturze CaD, w której wyróżnia się trzy funkcjonalne rejony: domenę N-końcową, domenę C-końcową oraz domenę łącznikową. Centralna domena łącznikowa rozdziela oba końce, które przybierają formę globularną. To sprawia, że cała cząsteczka kształtem przypomina ciężarek do ćwiczeń [41]. Obecność długiego elementu łącznikowego w h-cad pozwala na jednoczesne wiązanie CaD z filamentem aktynowym oraz oddziaływania z filamentem miozynowym. Mechanizm oddziaływania CaD z aktyną jest złożony. W domenie C-końcowej zlokalizowano dwa rejony oddziaływania z aktyną (Ryc. 3). Rejon położony bliżej środka cząsteczki wykazuje wysokie powinowactwo do aktyny. Drugi rejon, umieszczony na końcu C kaldesmonu, wiąże się z aktyną z niższym powinowactwem, ale zapewnia hamowanie ATPazy aktomiozynowej. Badania strukturalne ujawniły, że C-końcowa domena zawiera liczne zagięcia b, które nadają jej dużą konformacyjną elastyczność [42]. Badania z za

5 Rycina 3. Schemat domenowej struktury kaldesmonu. Strzałki pionowe wskazują rejony oddziaływań kaldesmonu z białkami bezpośrednio biorącymi udział w skurczu (aktyna, miozyna) i białkami regulatorowymi (tropomiozyna, CaM). Centralny rejon zawierający powtórzenia przeciwnie naładowanych reszt aminokwasowych (Glu i Lys/Arg) występuje tylko w izoformie h-cad. Na podstawie [37,38]; zmodyfikowano. stosowaniem metody trójwymiarowych rekonstrukcji obrazów uzyskanych w mikroskopie elektronowym wykazały, że C-końcowa domena CaD przyłącza się do zewnętrznej krawędzi filamentu i spina dwie podjednostki, wchodzące w skład sąsiednich protofilamentów [43]. W C-końcowej domenie CaD znajduje się również miejsce wiązania tropomiozyny. Oddziaływania pomiędzy tymi białkami mają działanie synergistyczne. Z jednej strony, TM zwiększa powinowactwo CaD do aktyny i potęguje hamowanie ATPazy aktomiozynowej. Z drugiej strony, CaD wpływa na położenie TM na filamencie blokując przesunięcie TM na powierzchni filamentu aktynowego, przez co wzmacnia hamowanie oddziaływań aktyny z miozyną [44]. Dodatkowe miejsca oddziałujące z aktyną znajdują się w domenie N-końcowej CaD [45]. Wiązanie przeciwległych końców CaD z aktyną umożliwia boczne przyleganie tego białka do filamentu. Jednak nie jest do końca jasne, czy ten rejon jest na stałe związany z aktyną, gdyż końcu aminowym znajduje się główne miejsce oddziaływania CaD z miozyną. Przyłączenie CaD do filamentu miozynowego powoduje zrywanie połączenia pomiędzy końcem aminowym kaldesmonu a aktyną [37]. Aktywność hamująca CaD została zlokalizowana w C-końcowym rejonie, obejmującym około 30 reszt aminokwasowych [46]. Odsunięcie tego rejonu od aktyny jest indukowane przez bezpośrednie wiązanie CaM/ Ca 2+ i prowadzi do aktywacji ATPazy aktomiozynowej [35,37,38,47]. W C-końcowej domenie CaD znajdują się dwa miejsca wiązania CaM/Ca 2+, określane jako miejsca A i B (Ryc. 3), które wspólnie wiążą jedną cząsteczkę CaM/Ca 2+ tworząc przeciwrównoległy kompleks. CaM/ Ca 2+ współzawodniczy z aktyną o CaD powodując częściowe oddysocjowanie CaD z filamentu. Ten proces odwraca hamujące działanie kaldesmonu [35,37]. Taki mechanizm znoszenia inhibitorowej aktywności CaD był kwestionowany. Zauważono bowiem, że CaM/Ca 2+ wykazuje niezbyt silne powinowactwo do CaD, co sprawia, że białka silnie wiążące CaM/Ca 2+ mogą skutecznie konkurować z CaD o kalmodulinę [48-50]. Jednak zwolennicy udziału CaM/Ca 2+ w procesie regulacji argumentują, że poziom CaM może lokalnie wzrastać i być wystarczający dla utworzenia kompleksu z CaD i odwrócenia hamowania oddziaływań aktyny z miozyną [51-52]. Dodatkowym mechanizmem kontroli aktywności ATPazy aktomiozynowej jest fosforylacja reszt seryny znajdujących się w pobliżu rejonów wiążących aktynę w C-końcowej domenie CaD (Ryc. 3). Fosforylacja, której ulega zarówno izoforma h-cad, jak i jej niemięśniowy odpowiednik l-cad, jest katalizowana przez liczne kinazy białkowe, poprzez które regulacja filamentu aktynowego jest powiązana z różnorodnymi drogami sygnalizacji wewnątrzkomórkowej [53]. Wspomniane wyżej trójwymiarowe rekonstrukcje obrazów mikroskopowych pozwoliły na stwierdzenie, że fosforylacja CaD prowadzi do częściowej dysocjacji C-końcowej domeny CaD od aktyny. W formie ufosforylowanej zrywane jest połączenie z jedną z podjednostek aktyny, które jest utrzymywane poprzez miejsce o słabym powinowactwie, natomiast miejsce o wysokim powinowactwie do aktyny jest w stanie wiązać CaD do filamentu niezależnie od fosforylacji [38,43]. Wiele doświadczeń sugeruje bezpośrednią korelację pomiędzy aktywnością ruchową komórek a poziomem ufosforylowania CaD, jednak istnieją dane wskazujące, że skurcz niektórych mięśni gładkich zachodzi nawet po zahamowaniu aktywności kinaz fosforylujących CaD [54], co świadczy o istnieniu alternatywnych dróg aktywacji w różnych typach komórek. Molekularny mechanizm regulacji przez CaD oddziaływań pomiędzy aktyną i miozyną wciąż jest tematem dyskusji. Prosty model sterycznego blokowania przez CaD i tropomiozynę miejsc oddziaływania aktyny z miozyną został odrzucony, gdyż jednoczesne wiązanie CaD i główek miozyny (S1-ADP-Pi) do kompleksu aktyny z tropomiozyną wzajemnie się nie wykluczają [55]. W świetle nowszych badań bardziej prawdopodobny wydaje się model allosteryczno-kooperatywny, według którego wiązanie CaM/Ca 2+ (i/lub fosforylacja CaD) wyzwala szereg zmian konformacyjnych prowadzących do przełączenia całego filamentu ze stanu OFF, w którym aktyna nie aktywuje ATPazy miozynowej, do stanu ON, w którym ATPaza osiąga poziom dużo wyższy niż poziom obserwowany dla aktyny pozbawionej białek regulatorowych. Stany OFF i ON charakteryzują się wysokim powinowactwem odpowiednio do samego CaD i do CaD związanego z CaM/Ca 2+ [56], zatem CaD można uznać za przełącznik, który w zależności od poziomu jonów wapnia stabilizuje jeden ze stanów aktywacji filamentu. JONY WAPNIA A ODDZIAŁYWANIE MIOZYNY Z AKTYNĄ Od ponad siedmiu dekad wiadomo, że oddziaływanie miozyny z aktyną sprzężone z hydrolizą ATP generuje skurcz mięśni poprzecznie prążkowanych, a blisko cztery dekady temu pojawiły się doniesienia, że podobny mechanizm generacji ruchu wykorzystywany jest przez izoformy niemięśniowe konwencjonalnej miozyny Wówczas też zaczęły się ukazywać doniesienia o istnieniu nietypowych miozyn, niezdolnych do tworzenia filamentów; zwanych obecnie miozynami niekonwencjonalnymi. Oddziaływanie miozyn niekonwencjonalnych z aktyną jest wykorzystywane podczas transportu wewnątrzkomórkowego cząstek, Postępy Biochemii 58 (4)

6 pęcherzyków i organelli, zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze komórek eukariotycznych. Na poziomie miozyny zidentyfikowano dotychczas trzy główne mechanizmy regulacji: (i) fosforylację lekkich łańcuchów miozyny przy udziale specyficznej kinazy lekkich łańcuchów miozyny zależnej od jonów wapnia i kalmoduliny (dotyczy miozyn konwencjonalnych), (ii) wiązanie Ca2+ z łańcuchami lekkimi (dotyczy miozyny konwencjonalnej mięczaków i niektórych miozyn niekonwencjonalnych) oraz (iii) fosforylację ciężkiego łańcucha miozyny (dotyczy miozyn konwencjonalnych i niektórych miozyn niekonwencjonalnych). Wszystkie te mechanizmy są mniej lub bardziej zależne od Ca2+, aczkolwiek tylko drugi z nich jest związany z bezpośrednim przyłączaniem jonów wapnia do podjednostki miozyny [57]. FOSFORYLACJA LEKKIEGO ŁAŃCUCHA MIOZYN KONWENCJONALNYCH Budowa miozyn konwencjonalnych Miozyny konwencjonalne są zbudowane z sześciu podjednostek: pary łańcuchów ciężkich i dwóch par łańcuchów lekkich, istotnych i regulujących. Koniec aminowy każdego z łańcuchów ciężkich tworzy główkę, w skład której wchodzi globularna domena motoryczna i helikalna szyjka, z którą wiążą się łańcuchy lekkie. Łańcuchy lekkie przyłączają się do motywów IQ, których nazwa pochodzi od reszt izoleucyny i glutaminy, zapoczątkowujących ten ok. 25-aminokwasowy motyw, obecny również w białkach wiążących kalmodulinę. Do każdego z motywów IQ przyłącza Rycina 5. Fosforylacja lekkiego łańcucha miozyny z mięśni gładkich. A. Schemat zmian konformacyjnych w cząsteczce miozyny, na podstawie [117], zmodyfikowano. B. Odblokowanie główek na skutek fosforylacji. Na podstawie [69]; zmodyfikowano. C. Wpływ fosforylacji na konformację lekkich łańcuchów regulujących, na podstawie [72], zmodyfikowano. się wiązaniami niekowalencyjnymi jeden łańcuch istotny (ELC, ang. essential light chain) i jeden regulujący (RLC, ang. regulatory light chain). Za szyjką następuje helikalny odcinek, który z helikalnym odcinkiem pochodzącym od drugiego ciężkiego łańcucha tworzy superhelisę, która nosi nazwę pałeczki. (Ryc. 4). Tak zbudowana cząsteczka jest traktowana w literaturze jako monomer miozyny. Pałeczka jest zaangażowana w tworzenie antyrównolegle ułożonych filamentów (Ryc. 5). Filamenty miozyny, które w mięśniach są główną składową filamentu grubego, w komórkach niemięśniowych budują struktury nazywane włóknami naprężeniowymi (ang. stress fibers). RLC, podobnie jak ELC, oplatają helikalną szyjkę, stabilizując jej strukturę, przy czym RLC jest przyłączony do dystalnego odcinka szyjki, blisko jej granicy z pałeczką. W aminowej części RLC znajdują się reszty treoninowa i/lub serynowa, które mogą ulegać fosforylacji [57]. Kinaza lekkiego łańcucha miozyny (MLCK) Rycina 4. Budowa miozyn. Górna część schemat budowy miozyny konwencjonalnej; środek schemat budowy miozyn niekonwencjonalnych; poniżej struktura krystaliczna główki miozyny z mięśni szkieletowych kury. Na podstawie [116]; zmodyfikowano. ELC i RLC, odpowiednio, istotny i regulujący lekki łańcuch miozyny, IQ, motyw IQ, P, miejsca fosforylacji w cząsteczce miozyny. 442 Głównym enzymem katalizującym reakcje fosforylacji reszty seryny RLC (Ser19 dla RLC miozyny z mięśni gładkich i komórek nięmięśniowych) jest specyficzna dla miozyn II kinaza lekkich łańcuchów miozyny (MLCK, ang. myosin light chain kinase) [58]. U ludzi MLCK kodowana jest

7 przez trzy geny: MYLK1 ulegający ekspresji w mięśniach gładkich oraz w komórkach niemięśniowych, MYLK2 z mięśni szkieletowych oraz MYLK3 wyrażany w mięśniu sercowym [59,60]. Co ciekawe, MYLK1 koduje również inne białko, telokinę, zwaną białkiem pokrewnym kinazie (KRP, ang. kinase related protein), które również jest zaangażowane w regulację aktywności miozyny z mięśni gładkich. Jest to możliwe dzięki alternatywnemu wyborowi miejsca inicjacji transkrypcji podczas składania eksonów MYLK1 [61]. Najwięcej wiadomo o strukturze i mechanizmach działania produktu genu MYLK1 [58]. Domenowa budowa produktów tego genu jest zilustrowana na rycinie 6b. MLCK1 występująca w komórkach niemięśniowych jest dłuższa od jej mięśniowego odpowiednika o zbudowany z 900 reszt aminokwasowych N-końcowy segment, w którym znajduje się miejsce wiązania aktyny i CaM. Oddziaływania z CaM osłabiają wiązanie tego rejonu do filamentu aktynowego. Główne oddziaływania z aktyną zachodzą przy udziale domeny, która w izoformie niemięśniowej jest położona w środku sekwencji białka, natomiast w krótkiej izoformie mięśniowej na końcu N. Domena katalityczna i domena wiążąca CaM mieszczą się obok siebie w centralnej części cząsteczki. Koniec C zajmuje telokina, która bierze udział w oddziaływaniu z miozyną. Rola dwóch domen sekwencji bogatej w prolinę i domeny fibronektynowej nie została jeszcze określona [58]. Substraty wiązane przez domenę katalityczną to ATP i N-końcowy odcinek RLC, który zawiera poddawaną fosforylacji resztę Ser19. MLCK jest zdolna do oddziaływania zarówno z monomerami, jak i filamentami miozyny. Wiązanie poprzez domenę telokinową zachodzi w sąsiedztwie RLC, w rejonie połączenia pomiędzy główką a pałeczką [58]. Dzięki wielodomenowej strukturze MLCK jest związana z aparatem skurczu mięśni i włóknami naprężeniowymi komórek niemięśniowych zarówno poprzez filament cienki, jak i filament gruby. Ten bliski kontakt zapewnia natychmiastową dostępność enzymu regulatorowego w momencie aktywacji komórki przez jony wapnia. Aktywacja MLCK zachodzi poprzez przyłączenie cząsteczki CaM związanej z jonami wapnia do miejsca wiązania CaM położonego tuż za domeną katalityczną [58]. In vivo, łańcuchy regulujące miozyny są jedynym substratem dla MLCK. Jednak RLC nie ulegają fosforylacji wyłącznie przy udziale MLCK, są one również substratem dla kinazy CaMK zależnej od kalmoduliny i wapnia oraz kinaz białkowych, których aktywność nie jest bezpośrednio regulowana poprzez zmiany stężenia Ca 2+. Wśród nich znajdują się m.in.: kinaza ROCK (zależna od białka Rho), kinaza PAK (zależna od białek Rac1/Cdc42) i kinaza PKA (zależna od camp) [62]. Należy nadmienić, że kinazy te obok reszty Ser19 fosforylują również resztę treoninową 18 (Thr18). Jednoczesna fosforylacja obu reszt aminokwasowych jeszcze bardziej zwiększa aktywność ATPazową miozyny oraz generację siły, co prowadzi do hiperkurczliwości [63]. W warunkach małego stężenia jonów wapnia MLCK jest zahamowana przez fragment autoinhibitorowy blokujący miejsce aktywne. Przyłączenie CaM/Ca 2+ do MLCK wywołuje zmianę konformacyjną w domenie katalitycznej, prowadzącą do odsunięcia domeny (fragmentu) autoinhibitorowej, dzięki czemu staje się ono dostępne dla substratu (Ryc. 6A) [58]. Wiązanie to powoduje również osłabienie Rycina 6. Regulacja fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny. A. Schemat działania kinazy (MLCK) i fosfatazy (MLCP) lekkich łańcuchów miozyny opracowany z wykorzystaniem dostępnych struktur krystalicznych białek zaangażowanych w tym procesie, na podstawie pracy przeglądowej [73]; zmodyfikowano. B. Schemat domenowej budowy MLCK, na podstawie [59]. C. Schemat budowy MLCP, na podstawie [65]; zmodyfikowano. Wyjaśnienia skrótów w tekście. oddziaływania domeny telokiny z miozyną, co wydaje się istotne dla dynamiki procesu fosforylacji. Obniżenie stężenia jonów wapnia powoduje odłączenie CaM, co prowadzi do inaktywacji kinazy. Fosfataza lekkiego łańcucha miozyny (MLCP) Defosforylacja reszty serynowej w łańcuchu regulującym zachodzi z udziałem specyficznej fosfatazy, MLCP (ang. myosin light chain phosphatase), należącej do fosfataz typu 1, występującej w różnych typach mięśni i w komórkach niemięśniowych [64,65]. Podobnie jak w przypadku MLCK, najwięcej wiadomo o fosfatazie występującej w mięśniach gładkich (Ryc. 6C). Białko to zbudowane jest z trzech podjednostek: z podjednostki katalitycznej, PP1Cd o m.cz. ok. 38 kda, będącej izoformą d fosfataz typu 1, podjednostki wiążącej miozynę (MYPT1, ang. myosin phosphatase target) o m. Postępy Biochemii 58 (4)

8 cz. ok. 130 kda, oraz podjednostki o m. cz. ok. 20 kda (M20), której funkcja nie została dotychczas poznana [66]. MYPT1 jest kodowana przez pojedynczy gen, z którego dzięki alternatywnemu składaniu eksonów powstaje kilka izoform białka specyficznych tkankowo. Poza MYPT1 istnieją również geny: MYPT2, który ulega ekspresji w mięśniach szkieletowych i mózgu [67] oraz MYPT3, występujący głównie w mięśniu sercowym, mózgu, nerce, jądrach, wątrobie i w białych adipocytach [68]. MLCP katalizuje defosforylację nie tylko RLC, lecz również innych białek związanych z organizacją cytoszkieletu, np. ezryny/radyksyny/moezyny, tau czy adducyny, co wskazuje, że fosfataza ta bierze udział w szerszym spektrum procesów komórkowych niż wcześniej sądzono [64]. Na końcu aminowym MYPT1 występuje motyw RVXF biorący udział w wiązaniu podjednostki katalitycznej, po którym występuje osiem powtórzeń ankirynowych [65]. Uważa się, że powtórzenia te przyspieszają oddziaływanie fosfatazy z ufosforylowanym RLC oraz oddziałują z podjednostką katalityczną wzmacniając jej aktywność enzymatyczną [66]. Rejon bogaty w ujemnie naładowane reszty kwasu asparaginowego i glutaminowego (D/E) prawdopodobnie uczestniczy w aktywacji fosfatazy. Z kolei koniec karboksylowy jest odpowiedzialny za wiązanie miozyny. Uważa się obecnie, że wiązanie N-końcowego odcinka MYPT1 z ufosforylowanym RLC jest niezbędne dla procesu defosforylacji, natomiast wiązanie poprzez rejon C-końcowy ma rolę regulatorową oraz decyduje o komórkowej dystrybucji fosfatazy [64]. Postuluje się również, że C-końcowy rejon MYPT1 bierze udział w dimeryzacji tej podjednostki, co może prowadzić do utworzenia amfipatycznej α-helisy [64]. W rejonie C-końcowym występują reszty treoninowe 697 i 855, które są substratami dla m.in. kinazy ROCK. Fosforylacja tych reszt prowadzi do zahamowania aktywności MLCP poprzez osłabienie oddziaływania z miozyną [65]. Inaktywacja fosfatazy prowadzi do aktywacji kinazy MLCK, zależnej kompleksu CaM/Ca 2+, uwrażliwiając w ten sposób aktomiozynę na jony Ca 2+ (Ryc. 6A). Równowaga pomiędzy aktywnością MLCK i MLCP zapewnia prawidłowe funkcjonowanie całego organizmu, a zwłaszcza układu sercowo-naczyniowego. Wpływ fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny na konformację i aktywność miozyny Monomery miozyny z mięśni gładkich oraz miozyn niemięśniowych, w których łańcuch lekki RLC nie jest ufosforylowany przyjmują zwiniętą konformację (10S), natomiast fosforylacja powoduje wyprostowanie monomeru (przejściowa konformacja 6S), co umożliwia utworzenie filamentu miozynowego (Ryc. 5A). W konformacji 10S pałeczka miozyny, dzięki obecności giętkich rejonów (tzw. zawiasów), owija się w charakterystyczny sposób wokół rejonu połączenia szyjki z pałeczką, uniemożliwiając w ten sposób oddziaływanie miozyny z aktyną. Zarówno w konformacji 10S, jak i w nieufosforylowanej miozynie w filamencie, w aparacie skurczu dochodzi do wzajemnego blokowania główek w ten sposób, że miejsce wiązania aktyny w jednej z główek oddziałuje z konwerterem drugiej z główek (Ryc. 5B) [69]. Konwerter jest rejonem główki przekazującym zmiany konformacyjne zachodzące w domenie motorycznej na helikalny odcinek łańcucha ciężkiego przechodzący następnie w szyjkę. Takie wzajemne ułożenie główek w cząsteczce miozyny blokuje aktywność enzymatyczną miozyny, co sprawia, że generowanie przez nią siły niezbędnej do cyklicznego oddziaływania z aktyną jest zahamowane [70]. Fosforylacja przynajmniej jednego łańcucha w cząsteczce miozyny powoduje rotację o około 70º rejonu konwertera w zablokowanej główce, co prowadzi do uwolnienia obu główek i umożliwia im wiązanie aktyny oraz hydrolizę ATP (Ryc. 5B) [69,71]. Fosforylacja Ser19 zwiększa ujemny ładunek w płacie N-końcowym RLC, a to umożliwia przekazywanie zmian konformacyjnych do płata C-końcowego i nadaje odpowiednią orientację RLC w stosunku do łańcucha ciężkiego (Ryc. 5C). W nieufosforylowanym RLC tworzony jest mostek solny pomiędzy resztami Arg4 (i/lub innymi pozytywnie naładowanymi resztami w tym rejonie łańcucha), a Asp100 i/lub Glu99 w płacie C-końcowym. Dzięki temu rejon N-końcowy RLC znajduje się zarówno w pobliżu płata C-końcowego, jak i łańcucha ciężkiego w rejonie szyjki; taka konformacja nosi nazwę zamkniętej. Po fosforylacji mostek solny ulega zerwaniu, co powoduje zmianę konformacji rejonu N-końcowego (staje się bardziej giętki) oraz zmianę ułożenia obu tych domen łańcucha względem łańcucha ciężkiego. Zwłaszcza N-końcowy segment zawierający ufosforylowaną resztę Ser19 jest bardziej oddalony od łańcucha ciężkiego i płata C-końcowego; taka konformacja nosi nazwę otwartej [72]. Izoformy MLCK oraz MLCP występują również w mięśniach porzecznie prążkowanych. Zatem, należałoby się spodziewać, że podobny mechanizm regulacji oddziaływania aktyny z miozyną poprzez fosforylację RLC jest wykorzystywany również w tych typach mięśni [73,74]. Badania biochemiczne z lat 80. ubiegłego wieku wykazały jednakże, że miozyny z mięśni poprzecznie prążkowanych wykazują aktywność enzymatyczną niezależnie od stanu ufosforylowania ich łańcuchów regulujących [75]. Skoro natura wyprodukowała podobną do występującej w mięśniach gładkich kaskadę enzymów, jaka jest więc fizjologiczna rola tej modyfikacji? Wiele danych wskazuje na to, że odwracalna fosforylacja skrlc ma funkcje modulujące działanie mięśni szkieletowych, gdyż uwrażliwia miozynę na jony wapnia przesuwając wrażliwość mięśnia w kierunku suboptymalnych stężeń Ca 2+. To powoduje przyspieszenie kinetyki procesu generowania siły podczas inicjacji skurczu oraz obniżenie szybkości relaksacji włókien przy wyższych stężeniach Ca 2+ [73]. Niewiele wiadomo o strukturze i funkcji kinazy lekkich łańcuchów miozyny, cmlck (m. cz. ok. 100 kda) występującej w mięśniu sercowym, działającej w sposób odmienny niż izoformy szkieletowa i niemięśniowa [60]. Chociaż pierwsze doniesienia na temat funkcjonowania tej izoformy MLCK wskazywały, że działa ona w sposób zależny od Ca 2+ i kalmoduliny [76], to z uwagi na brak jednoznacznych dowodów na obecność domeny wiążącej CaM, ten mechanizm aktywacji jest wciąż przedmiotem dyskusji [60,77]. Aktywacja cmlck jest prawdopodobnie zależna od receptorów α- i β-adrenergicznych, gdyż stymulacja tych receptorów podwyższa poziom fosforylacji crlc [74]. Defosforylacja crlc zachodzi z udziałem fosfatazy cmlcp zawierającej podjednostkę MYPT2; zablokowanie genu ko

9 dującego tę podjednostkę u myszy zwiększa aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy, co prowadzi do obniżenia poziomu fosforylacji crlc, a to z kolei obniża poziom wrażliwość miozyny na aktywujące stężenia Ca 2+ [78]. W dłuższym okresie prowadzi to do hypertrofii mięśnia sercowego, zmniejszenia jego kurczliwości oraz zaburzenia w organizacji sarkomeru. Wskazuje to na ważną rolę fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny z mięśnia sercowego w funkcjonowaniu tego narządu, mimo iż fosforylacja wpływa jedynie modulująco na kinetykę oddziaływania miozyny i aktyny [74]. WIĄZANIE JONÓW WAPNIA PRZEZ LEKKIE ŁAŃCUCHY MIOZYNY Miozyna z mięśni mięczaków Jak wcześniej wspomniano, łańcuchy lekkie miozyny przypominają strukturalnie cząsteczkę CaM (m. cz. ok. 16 kda), białka zawierającego cztery motywy EF-hand wiążące Ca 2+. CaM, podobnie jak łańcuchy lekkie miozyny, jest zbudowana z dwóch płatów (w każdym płacie znajdują się po dwa motywy EF-hand), połączonych ze sobą odcinkiem łączącym, tzw. linkerem. Pod nieobecność jonów wapnia CaM przyjmuje konformację zamkniętą, w której łącznik jest zagięty, a oba płaty zbliżają się do siebie. W obecności Ca 2+ CaM przyjmuje formę wyprostowaną, zdolną do oddziaływania z białkami docelowymi m.in. z MLCK [73]. Łańcuchy istotne i regulujące posiadają wprawdzie domeny EF- hand, ale preferencyjnie wiążą Mg 2+, których stężenie w komórce i włóknie mięśniowym jest co najmniej 4 rzędy wielkości większe niż aktywujące stężenie jonów wapnia. Ukazały się doniesienia, że w warunkach in vitro RLC miozyny z mięśni poprzecznie prążkowanych mogą wiązać Ca 2+, jednak oddysocjowują one tak wolno, że nie może to być wiązanie o znaczeniu regulacyjnym [79]. W mięśniach mięczaków zdolność odwracalnego wiązania Ca 2+ przez lekkie łańcuchy została zachowana i dzięki temu jony wapnia bezpośrednio wpływają na aktywność katalityczną domeny motorycznej miozyny. Mechanizm regulacji aktywności miozyny z mięśni poprzecznie prążkowanych przegrzebka zatokowego (Argopecten irradians) został opisany w latach 90. ubiegłego stulecia, dzięki pracom rentgenograficznym prowadzonym przez grupę Carolyn Cohen [80,81]. Analiza struktury domeny regulatorowej wykazała, że motywy EF-hand obu lekkich łańcuchów oplatających szyjkę miozyny wiążą Mg 2+. Odkryto jednak, że jedno miejsce wiązania kationów dwuwartościowych znajdujące się w końcu aminowym płata ELC preferencyjnie wiąże Ca 2+. Miejsce to jest położone w pobliżu C-końcowego płata RLC (Ryc. 7A). Co więcej, reszty aminokwasowe z tego rejonu cząsteczki RLC są zaangażowane w wiązanie Ca 2+. W obecności jonu wapnia reszty Asp117 i Gly118 RLC oddziałują z Arg24 w ELC, znajdującą się w pobliżu miejsca wiązania Ca 2+ (Ryc. 7B). W wiązaniu jonu wapnia pośredniczy również fragment łańcucha ciężkiego miozyny. W obecności Ca 2+ wytwarzane jest dodatkowe połączenie pomiędzy resztą Gln812 łańcucha ciężkiego a resztą Leu113 w RLC. Oddziaływania, ELC-RLC i RLC-łańcuch ciężki, zanikają pod nieobecność jonu Ca 2+ (Ryc. 7C) [82]. Stwierdzono również, że sam ELC nie wiąże Ca 2+, co dodatkowo potwierdza, że powyższe oddziaływania są niezbędne dla wiązania tego jonu [81]. Analiza struktur domeny regulatorowej wykazała, że pod nieobecność jonu Rycina 7. Wiązanie jonów wapnia do łańcuchów istotnych miozyny mięczaków. A. Struktura krystaliczna domeny regulatorowej w obecności jonów Ca 2+. B i C, schemat oddziaływań pomiędzy podjednostkami domeny regulatorowej, odpowiednio, w obecności i pod nieobecność jonów wapnia. Oznaczenia aminokwasów wg kodu jednoliterowego: D, kwas asparaginowy; G, glicyna; F, fenyloalanina; L, leucyna; N, asparagina; M, metionina; R, arginina; Q, glutamina. Na podstawie [82]; zmodyfikowano. wapnia jest ona bardziej giętka [82]. Utrata sztywności szyjki uniemożliwia miozynie przekazanie zmian konformacyjnych zachodzących w główce do reszty cząsteczki, w konsekwencji nie dochodzi więc do generacji siły niezbędnej do przesuwu filamentów aktynowych. Miozyny niekonwencjonalne Łańcuchy lekkie większości miozyn niekonwencjonalnych to cząsteczki kalmoduliny. Na podstawie liczby motywów IQ zidentyfikowanych w sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego przyjmuje się, że w zależności od typu miozyny, do łańcucha ciężkiego przyłącza się od jednej (np. w miozynie I) do siedmiu (np. w miozynie XII występującej w roślinach) cząsteczek CaM [4]. Można się zatem spodziewać, że jony wapnia mają istotne znaczenie dla regulacji aktywności miozyn niekonwencjonalnych. Izoformy miozyny I są najwcześniej wykrytymi i najliczniej reprezentowanymi miozynami niekonwencjonalnymi, występującymi od ameb po komórki ssaków. U człowieka zidentyfikowano aż 8 genów kodujących łańcuchy ciężkie miozyny I przy 14 genach kodujących łańcuchy miozyn konwencjonalnych [4]. Łańcuchy ciężkie izoform miozyny I różnią się między sobą liczbą wiążących CaM motywów IQ (od jednego do sześciu) i budową domenową ogonka. Ich cechą wspólną jest obecność w ogonku miozyn I drugiego miejsca wiążącego aktynę, lecz w sposób niezależny od ATP, co umożliwia tym miozynom również udział w organizacji filamentów aktynowych [4]. Badania nad aktywnością ATPazową miozyny I z Postępy Biochemii 58 (4)

10 rąbka szczoteczkowego kosmków jelitowych (Myo1b) wykazały, że jest ona regulowana przez jony wapnia, poprzez CaM. W obecności 2 3 μm Ca 2+ dochodzi do oddysocjowania jednej z czterech cząsteczek CaM, co prowadzi do wzrostu aktywności ATPazy aktynowej oraz obniżenia zdolności do przesuwania filamentów aktynowych, co może być skutkiem odłączenia w tych warunkach cząsteczki miozyny od filamentu aktynowego [83,84]. Zjawisko to nie było obserwowano przy niższym stężeniu Ca 2+ lub nadmiarze egzogennej kalmoduliny. Jony wapnia zmniejszają również wrażliwość tej miozyny na naprężenia [85]. W przypadku innej izoformy, Myo1C, zawierającej cztery motywy IQ wykazano, że tylko trzy pierwsze z nich są zaangażowane w wiązanie CaM, a w regulacji aktywności tej miozyny poprzez jony wapnia uczestniczy CaM związana z pierwszym motywem IQ, położonym najbliżej domeny motorycznej [86,87]. Oddziaływanie izoform miozyny I z aktyną jest również regulowane poprzez fosforylację reszt seryny lub treoniny w łańcuchu ciężkim. Temu zagadnieniu poświęcona jest kolejna część niniejszego artykułu. Miozyna III, niezbędna w procesie fototransdukcji, w swoim łańcuchu ciężkim zawiera domenę o aktywności kinazy serynowo-treoninowej, poprzedzającą klasyczną domenę motoryczną, po której znajdują się dwa wiążące CaM motywy IQ. Międzycząsteczkowa autofosforylacja domeny kinazowej powoduje obniżenie aktywności ATPazowej miozyny i jej powinowactwa do aktyny, natomiast zahamowanie aktywności kinazy nie wpływa na aktywność ATPazową, ale zaburza aktywność motoryczną białka [88]. Stwierdzono także, że miozyna III w sposób zależny od Ca 2+ i kalmoduliny hamuje aktywność metarodopsyny, białka zaangażowanego w proces fototransdukcji [89]. Uważa się, że miozyna III stanowi swojego rodzaju ruchomy rezerwuar kalmoduliny, gdyż CaM/Ca 2+ po oddysocjowaniu od łańcucha ciężkiego może być wykorzystywana przez metarodopsynę i inne białka [90]. Miozyna V jest złożona z dwóch łańcuchów ciężkich, które dimeryzują w C-końcowej części cząsteczki, i sześciu par łańcuchów lekkich, z czego cztery pary to cząsteczki kalmoduliny, a dwie to łańcuchy istotne miozyn konwencjonalnych. Jest to typowa miozyna transportująca, progresywna, co oznacza, że pozostaje ona w kontakcie z filamentami aktynowymi podczas kilku cykli hydrolizy ATP w główce miozyny. Przenoszone przez miozynę V organelle i pęcherzyki łączą się z domeną cargo, która znajduje się w C-końcowej części białka [91]. Pod nieobecność jonów wapnia cząsteczki kalmoduliny są związane z łańcuchem ciężkim, a miozyna przyjmuje konformację zwiniętą, w której domena motoryczna oddziałuje z domeną cargo. To powoduje, że miozyna nie jest zdolna do hydrolizy ATP i wiązania aktyny. W obecności 1 μm Ca 2+ dochodzi do zmian konformacyjnych w cząsteczkach kalmoduliny, następuje dysocjacja kalmoduliny związanej z drugim motywem IQ, co wywołuje zmiany konformacyjne w szyjce, które są przekazywane do domeny motorycznej [92]. Zmiany konformacyjne zachodzą również w cząsteczkach kalmoduliny związanych z motywami IQ1, IQ3 i IQ5 [93]. Zmiany te są odpowiedzialne za wyprostowanie się cząsteczki miozyny, co prowadzi do wzrostu jej aktywności ATPazowej [91]. Do aktywacji zależnej od aktyny aktywności ATPazowej miozyny V wymagane są mikromolowe stężenia jonów wapnia. W małych stężeniach Ca 2+ oddziaływanie miozyny z aktyną jest bardzo słabe, nawet w dużym nadmiarze aktyny [91]. Jednakże w obecności jonów wapnia dochodzi również do oddysocjowania miozyny od filamentu aktynowego i w konsekwencji do zahamowania jej ruchu [94]. Nie znamy jeszcze mechanizmu tej paradoksalnej obserwacji. Miozyna VI jest jedyną z dotychczas poznanych miozyn, która się porusza w kierunku końca ostrego (ang. pointed end) filamentu aktynowego, co jest możliwe dzięki obecności w rejonie konwertera wstawki złożonej z 53 reszt aminokwasowych, która stanowi również niekonwencjonalne miejsce wiązania kalmoduliny [95]. W szyjce natomiast znajduje się klasyczny motyw IQ, również wiążący kalmodulinę. Uważa się, że cząsteczka kalmoduliny znajdująca się we wstawce pełni rolę strukturalną, istotną podczas generacji ruchu, podczas gdy kalmodulina w szyjce może być zaangażowana w regulację aktywności miozyny VI poprzez jony wapnia [96]. Wykazano, że obecność tych jonów prowadzi do spowolnienia ruchu miozyny VI wzdłuż filamentów aktynowych, nie wpływając w znaczący sposób na jej aktywność ATPazową i uwalnianie ADP [97,98]. Wprawdzie wiązanie kalmoduliny do całej cząsteczki miozyny VI nie jest zależne od Ca 2+, zachodzi bowiem nawet przy 100 μm stężeniu tych jonów, wykazano jednak, że w obecności jonów wapnia kalmodulina wiąże się z dużo większym powinowactwem do rejonu wstawki, z jednoczesnym osłabieniem wiązania tej cząsteczki związanej z szyjką. Nie dochodzi jednak do jej oddysocjowania, jak to ma miejsce w przypadku miozyny I i V [95]. Uważa się, że zmiany konformacyjne zachodzące w cząsteczce kalmoduliny są wyczuwane przez domenę motoryczną, nie wyklucza się również, że te zmiany są przekazywane na filament aktynowy i allosterycznie modulują sztywność filamentu aktynowego [96]. Miozyna VII zawiera w łańcuchu ciężkim pięć motywów IQ, co sugeruje, że potencjalnie może on wiązać nawet pięć cząsteczek kalmoduliny [4]. Wykazano natomiast, że do cząsteczki miozyny VI przyłącza się średnio 3,2 cząsteczki kalmoduliny [99]. Powinowactwo miozyny VII do kalmoduliny maleje w obecności jonów wapnia, co wskazuje na rolę tego oddziaływania w regulacji aktywności miozyny [99]. Badania ostatnich lat wskazują, że miozyny VII występują w komórkach jako monomer, który może przyjmować konformację otwartą i zwiniętą, w której koniec karboksylowy ogonka oddziałuje z domeną motoryczną. Wyniki badań wskazują na to, że ogonek bierze udział w regulacji aktywności ATPazowej. Aktywność fragmentu pozbawionego ogonka maleje, gdy ogonek jest dodawany w obecności małego stężenia Ca 2+ (pca7), natomiast nie ulega zmianie gdy ogonek jest dodawany w wysokich (pca4) stężeniach Ca 2+ [91]. Sądzi się, że w małych stężeniach jonów wapnia również in vivo dochodzi do oddziaływania główki z ogonkiem, co prowadzi do inaktywacji miozyny. Miozyna IX to unikalna miozyna niekonwencjonalna, zawierająca w ogonku domeny wiążące jony cynku oraz aktywną domenę RhoGAP, która uczestniczy w wymianie GTP na GDP w małych GTPazach z rodziny Rho, wpływając na dynamikę cytoszkieletu aktynowego [90]. W główce, w rejonie miejsca oddziaływania z aktyną, zidentyfikowano długą wstawkę (ok. 150 reszt aminokwasowych), wspomagającą wiązanie z aktyną i zapewniającą tej monomerycznej miozynie ruch procesywny. W szyjce występują cztery mo