Zastosowanie spektroskopii w bliskiej podczerwieni (NIR) do analizy wybranych parametrów jakościowych naturalnych miodów pszczelich Jolanta Piekut*

Transkrypt

1 Zastosowanie spektroskopii w bliskiej podczerwieni (NIR) do analizy wybranych parametrów jakościowych naturalnych Jolanta Piekut* W pracy podjęto próbę zastosowania spektroskopii w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR) umożliwiającej, poprzez analizę widm, szybkie określenie ilościowe jak i jakościowe poszczególnych składników decydujących o jakości naturalnych. W przypadku metody jakościowej analiza widm podstawowych pozwala na rozróżnienie miodów spadziowych, sztucznych oraz nektarowych, natomiast wykorzystanie specjalistycznego oprogramowania (TQ Analist) umożliwia określenie odmiany miodów nektarowych. W metodzie ilościowej przy analizie pierwszej pochodnej widm uzyskano mniejsze współczynniki niezgodności w porównaniu z analizą widm podstawowych. 1. Wprowadzenie Spektroskopia w bliskiej podczerwieni NIR (near-infrared) jest techniką badawczą, która opiera się na interpretacji widm oscylacyjno-rotacyjnych substancji w zakresie liczby falowej od do 4000 cm -1 [1]. Wykorzystywana jest w wielu branżach przemysłowych, takich jak: spożywcza, farmaceutyczna, drzewna, chemiczna, paszowa, tworzyw sztucznych itp. Analiza spektrofotometryczna w tym zakresie może być utrudniona z powodu interpretacji nakładających się na siebie wykresów widm poszczególnych składników analizowanych prób. W zakresie NIR brak jest ostrych pików na wykresach co może być spowodowane ok. 100-krotnie mniejszą czułością metody w porównaniu z zakresem średniej podczerwieni (MIR). Doniesienia literaturowe dowodzą, że analizę w zakresie NIR dotychczas wykorzystywano do badania prób, w których badane składniki były w przeważającej ilości [2-7]. Woodcock T. i współpracownicy przeprowadzili badania autentyczności w roztworach wodnych z wykorzystaniem analizy w bliskiej podczerwieni w celu wyznaczenia pasm absorpcji poszczególnych składników. Analizie poddano pierwszą i drugą pochodną widm (widmo pierwszego i drugiego rzędu). W pracy wykazano możliwość różnicowania za pomocą widm, roztworów naturalnych i fruktozy kukurydzianej [6]. Rouff K. i współpracownicy przeprowadzili ocenę miodów w zakresie bliskiej podczerwieni analizując wpływ zawartości cukrów oraz gatunku miodu na przebieg widma. Wykazali oni silne pasmo absorpcji w zakresie cm -1, odpowiadające wiązaniom C-C oraz C-O, które przypisano sacharydom. Ponadto badania wykazały, że zastosowanie spektroskopii w zakresie NIR do oceny zawartości sacharydów oraz odmiany naturalnych jest obarczone pewnym błędem [7]. Miód jest naturalnym słodkim produktem wytwarzanym przez pszczoły Apis mellifera z nektaru roślin lub wydzielin żywych części roślin ewentualnie wydalin owadów ssących soki żywych części roślin. Pszczoły wzbogacają nektar lub spadź swoimi specyficznymi substancjami. Produkt ten jest składowany, odparowywany i pozostawiony do dojrzewania w plastrach [8, 9, 10]. Miód składa się zasadniczo w 75% z sacharydów, przeważnie fruktozy i glukozy, wody oraz innych substancji takich jak enzymy, kwasy organiczne [4], stałe pozostałości pochodzące ze zbioru miodu. W miodzie występują również sole mineralne, witamin, polifenole oraz flawonoidy. Kolor miodu jest różny od prawie bezbarwnego do ciemnobrązowego. Miody posiadają swoisty smak i zapach pochodzący od nektaru lub spadzi. Pyłek kwiatowy nie powinien być z niego usunięty, z wyjątkiem miodu przefiltrowanego, chyba że było to nieuniknione w procesie usuwania obcych substancji organicznych lub nieorganicznych [11]. Miód pszczeli występuje w dwóch postaciach: płynnej zwanej patoką oraz stałej, nazywanej krupcem. Pierwotnie po odebraniu go z ula miód występuje w postaci płynnej. Następnie krystalizuje, czyli zmienia swój stan skupienia, w ciągu kilku do kilkudziesię- 25

2 ciu dni w zależności od typu i odmiany miodu. Preferencje konsumentów sprawiają, że w handlu poszukiwany jest miód w postaci patoki. Proces przygotowania tego produktu do obrotu handlowego uwzględnia operacje, które spowodują iż miód pozostanie w postaci ciekłej przez długi okres czasu. Staje się to możliwe po obróbce cieplnej miodu, jednak nieumiejętne jej przeprowadzenie może spowodować, iż miód straci swoje właściwości biochemiczne i stanie się zwykłym środkiem słodzącym. Nieumiejętne przeprowadzenie procesu dekrystalizacji oraz złe warunki przechowywania miodów mogą spowodować wzrost zawartości 5-hydroksymetylofurfuralu (o właściwościach toksycznych) i obniżenie się aktywności enzymatycznej naturalnych [8, 9, 11]. W pracy podjęto próbę zastosowania spektroskopii w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR) umożliwiającej, poprzez analizę widm, szybkie określenie ilościowe jak i jakościowe poszczególnych składników decydujących o jakości naturalnych. W badaniach wykorzystano specjalistyczne oprogramowanie do rejestracji widm OMNIC 5.2 oraz TQ Analyst do ich analizy. Miód pszczeli jest bardzo złożonym produktem spożywczym, dlatego uzyskanie wiarygodnych wyników domaga się przeprowadzenia bardziej dokładnych badań. Uwzględnienie w metodzie kalibracyjnej takich parametrów jak zawartość wody, cukrów redukujących i sacharozy może wpłynąć na jakość uzyskanych wyników. Możliwość wykonania widm dla czystego HMF i α-amylazy pozwoliłoby na precyzyjne określenie długości fal przy których następuje absorpcja promieniowania dla tych związków. Odniesienie następnie tych wyników do miodów pozwoliłoby na zaprojektowanie wiarygodnego modelu kalibracyjnego. Osiągnięcie odpowiedniej dokładności i powtarzalności wyników pozwoliłoby na stosowanie spektroskopii w bliskiej podczerwieni do oznaczania parametrów określających jakość miodu, jako metody konkurencyjnej do metod tradycyjnych. Podstawowe zastosowanie spektroskopii w zakresie bliskiej podczerwieni sprowadza się do możliwości oznaczania związków mających głównie następujące wiązania [12, 13]: a) C-H dla tego wiązania podstawowe pasmo pomiarowe jest zawarte pomiędzy 1600 a 1800 [nm] oraz pasmo o słabszej energii - pomiędzy 1100 a 1250 [nm]; wzajemne interakcje tych pasm objawiają się w zakresie pomiędzy 2000 a 2400 [nm] oraz pomiędzy 1300 a 1450 [nm], b) N-H aminy pierwszorzędowe charakteryzują się rozbudowanym widmem przy długościach fal około 1500 [nm] (N H) i około 2000 [nm] (NH 2 ); aminy drugorzędowe mają tylko pierwszą składową widma, podczas gdy aminy trzeciorzędowe nie zajmują żadnego pasma w omawianym zakresie widma, c) O-H podstawowe pasmo dla tego wiązania znajduje się przy długości fali około 1400 [nm], a słabsze przy długości około 1000 [nm]; ich wzajemna interakcja jest zauważalna przy długości około 2000 [nm]. Ustalenie obecności tego typu wiązań umożliwia oznaczanie podstawowych składników żywności (woda, białka, tłuszcze). Ponieważ spektroskopia jest wtórną techniką pomiarową, konieczne jest ustalenie korelacji pomiędzy widmem przy różnej długościach fali, a wynikami analizy prób uzyskanymi metodami referencyjnymi. Nie jest to prosta zależność, ponieważ linie absorpcji poszczególnych składników mogą zachodzić wzajemnie na siebie w mniejszym lub większym stopniu, co utrudnia znalezienie obszarów które odpowiadałyby za zmianę stężenia jednego tylko składnika [2-7]. 2. Część eksperymentalna Badaniom poddano 70 prób naturalnych różnych odmian: akacjowe, lipowe, gryczane, rzepakowe, wielokwiatowe, wrzosowe, spadziowe oraz 3 próby miodów sztucznych. Naturalne miody pszczele pochodziły z różnych regionów kraju, a dostępne były w handlu białostockim. W celu uzyskania możliwie jak największego rozrzutu w zawartości HMF oraz liczby diastazowej do badań wzięto miody jedno- i dwuletnie przechowywane w lodówce (temp. ok. 5 C) i w temperaturze pokojowej (ok. 18 C). Odmiany miodów pszczelich określono na podstawie analizy pyłkowej polegającej na oznaczeniu pyłku przewodniego, czyli występującego w przeważającej ilości [14, 15]. Wartość liczby diastazowej oraz zawartość 5-hydroksymetylofurfuralu (HMF) zbadano metodą spektrofotometryczną [16, 17]. Widma w bliskiej podczerwieni wykonano na spektrofotometrze NearlR Nexus firmy Nicolet z wykorzystaniem programu Omnic E.S.P.5.1. Próbki miodu przed pomiarem były podgrzewane w łaźni wodnej w temp. 45 C przez 20 minut, celem zlikwidowania kryształków będących w miodzie a mogących wpływać na jakość uzyskiwanych wyników, a następnie chłodzone do temp. pokojowej. Widma wykonywano w zakresie spektralnym odpowiadającym bliskiej podczerwieni cm -1, w kuwecie ze szkłami pomiarowymi wykonanymi z CaF 2. Każde widmo było zapisywane i analizowane jako widmo średnie obliczone z 50 widm próbki. Widma były zapisywane w postaci graficznej jako zależności absorpcji od liczby falowej. Grubość próbki badanego miodu wynosiła 0,5 mm. Badania podzielono na dwa etapy. Pierwszy etap obejmował: określenie zawartości HMF i wartości liczby diastazowej oraz określenie odmiany miodów poprzez oznaczenie pyłku przewodniego; wykonanie widm absorpcyjnych badanych miodów na spektrofotometrze NearIR Nexus firmy Nicolet, w zakresie spektralnym odpowiadającym bliskiej podczerwieni. Drugi etap obejmował: zaprojektowanie i zastosowanie metody analizy nieznanych próbek miodu, na pod- 26

3 stawie ich widm, w programie TQ Analyst oraz jej wykalibrowanie; analizę widm nieznanych próbek miodu za pomocą zaprojektowanej metody i odniesienie uzyskanych wyników do wyników badań referencyjnych. 3. Wyniki badań W celu wykorzystania spektroskopii w zakresie bliskiej podczerwieni do badania naturalnych, wszystkim zarejestrowanym widmom badanych próbek, przypisano zawartości HMF i wartość liczby diastazowej oraz klasyfikację melitopalynologiczną (wyniki analizy pyłkowej) [14, 15]. Z wykorzystaniem programu TQ Analyst zastosowano dwa modele kalibracyjne umożliwiające analizę ilościową i klasyfikację jakościową badanych miodów. Do analizy ilościowej wykorzystano metodę najmniejszych kwadratów (Partial Least Squeres PLS). Algorytm PLS bada określony obszar lub obszary widm wzorców w celu znalezienia obszarów statystycznie zmiennych, w postaci funkcji stężenia składnika. Zakresy spektralne do analizy ilościowej wybrano na podstawie doniesień literaturowych. W celu zbadania zawartości -amylazy wybrano zakresy długości fal wykorzystywane do badania białek wynoszące 4591 cm -1, 4816 cm -1, 5194 cm -1, 5268 cm -1. Do określenia zawartości HMF wybrano zakres od 5555 cm -1 do 6250 cm -1, odpowiadający drganiom wiązań C-H oraz od 5000 cm -1 do 5010 cm -1, odpowiadający drganiom wiązań O-H, czyli dwóch podstawowych wiązań w HMF [12, 13, 17]. Dla wybranych zakresów spektralnych, po przeprowadzeniu kalibracji metody, średnia wartość współczynnika dopasowania (performance index) w przypadku widm podstawowych (zerowego rzędu) wynosiła 22,6 natomiast w przypadku pierwszej pochodnej tych widm (pierwszego rzędu) 32,8. Przykładowe widma (podstawowe i ich pierwsze pochodne) naturalnych miodów pszczelich zostały zaprezentowane w na rys. 1. Przeprowadzone badania nad interpretacją uzyskanych widm wykazały iż widma poszczególnych miodów różnią się między sobą, a przy niektórych zakresach długości fali nawet znacząco. Jednak określenie w jakim zakresie spektralnym występujące różnice są wynikiem zmiany zawartości HMF i liczby diastazowej było trudne do sprecyzowania. Wykorzystanie danych literaturowych i sugestii programu TQ Analyst okazało się niedostateczne, gdyż rozbieżności między wynikami analizy referencyjnej miodu, a wynikami uzyskanymi z obróbki widma są znaczące i sięgają niekiedy 100%. Tym bardziej iż dane literaturowe odnośnie długości fal przy których następuje absorpcja dla poszczególnych składników żywności dotyczą produktów, w których są one głównymi składnikami. Analiza jakościowa w zakresie bliskiej podczerwieni polegała na klasyfikacji widm poszczególnych miodów (Discriminant Analysis) w celu rozróżniania ich odmian. Zadaniem tej metody było wyznaczenie klasy lub klas badanej substancji najbardziej zbliżonych do nieznanej próbki. Jest to rodzaj analizy jakościowej, która określa wartość podobieństwa. Zastosowana w pracy metoda analizy jakościowej może być wykorzystywana do klasyfikacji miodów odmianowych zastępując żmudną i pracochłonną analizę pyłkową. W przypadku zastosowania tej metody i uzyskania wartości dopasowania (Full Spectrum Fit) różnego od 100% zaleca się przeprowadzenia oznaczenia zawartości pyłku przewodniego metodą mikroskopową (analiza melisopalynologiczna) [14]. Otrzymane widma nie posiadają ostrych, charakterystycznych pików (rys. 1 i 2). Piki w dużym stopniu nakładają się na siebie, dodatkowo próbki nie są dostatecznie scharakteryzowane, co może być wynikiem obecności innych, nieoznaczonych substancji np. sacharydów, wody, zanieczyszczeń. Miody są produktem aktywnym biologicznie i z tego względu możliwe są chemiczne oddziaływania pomiędzy składnikami, co również może powodować przesunięcia lub poszerzenia pików. 3. Wnioski Przeprowadzona analiza widm, w zakresie bliskiej podczerwieni, oraz sztucznych pozwoliła na Dobra Praktyka Miareczkowania i Pipetowania (GTP i GPP) jak uniknąć ryzyka pomiarowego Cykl wiosennych seminariów organizowanych przez Mettler-Toledo Sp. z o.o. w maju 2011 roku: Wrocław Katowice Kraków Poznań Gdańsk Olsztyn Warszawa Seminaria odbywać się będą w godzinach 10:00 14:00. Uczestnictwo jest bezpłatne, przyjazd na koszt własny. Zgłoszenia prosimy przesyłać em: Polska@mt.com, faksem lub telefonicznie do Liczba miejsc ograniczona. Grażyna Czaplicka Marketing 27

4 Maria Skłodowska-Curie, kobi a niezwykła Wystawa, o życiu genialnej uczonej i jej związkach z krakowskim środowiskiem naukowym, będzie mi miejsce w Muzeum Uniwersyt u Jagiellońskiego w Krakowie, ul. Jagiellońska 15, w dniach r. Organizatorzy wystawy: Wydział Chemii UJ, Muzeum UJ, Muzeum Marii Skłodowskiej- Curie. Zapraszamy codziennie oprócz niedziel w godz WSTĘP WOLNY sformułowanie następujących wniosków. 1. W przypadku metody jakościowej analiza widm rzędu zerowego pozwala na rozróżnienie miodów spadziowych, sztucznych oraz nektarowych, natomiast wykorzystanie specjalistycznego oprogramowania (TQ Analist) umożliwia określenie odmiany miodów nektarowych. 2. W metodzie ilościowej przy analizie pierwszej pochodnej widm uzyskano mniejsze współczynniki niezgodności w porównaniu z analizą widm podstawowych. 3. Przy ustawianiu parametrów pracy metody kalibracyjnej należy uwzględnić: - interferencję pików pochodzących od absorpcji innych składników; - współzależności stężenia składników wzorca; - długość drogi optycznej w próbce; - intensywność absorpcji w analizowanych próbach. Literatura 1. Atkins P.W Chemia fizyczna. Wydawnicta Naukowe PWN Warszawa: , 2. Persano Oddo, L.; Piana, L.; Bogdanov, S.; Bentabol, A.; Gotsiu, P.; Kerkvliet, J.; Martin, P.; Morlot, M.; Valbuena, A. O.; Ruoff, K.; von der Ohe, K. Botanical species giving unifloral honey in Europe. Apidologie 2004, 35 (special issue), Cho, H. J.; Hong, S. H. Acacia honey quality measurement by near-infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectr. 1998, 6, A329-A Qiu, P. Y.; Ding, H. B.; Tang, Y. K.; Xu, R. J. Determination 28

5 Absorbance ts uni Arb itrary A) B) Rys. 1. Przebieg widma, podstawowego i pierwszej pochodnej, miodu rzepakowego (A) oraz spadziowego (B) w zakresie bliskiej podczerwieni A) B) Rys. 2. Przebieg widm (rzędu zerowego) w zakresie bliskiej podczerwieni wszystkich miodów poddanych analizie. A) cała skala zaprezentowana na wykresie (full scale), B) - dopasowana skala zaprezentowana na wykresie (match scale). of chemical composition of commercial honey by near-infrared spectroscopy. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, Davies, A. M. C.; Radovic, B.; Fearn, T.; Anklam, E. A preliminary study on the characterisation of honey by near-infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectr. 2002, 10, Woodcock T., Downey G., Kelly J. D.: Geographical Classification of Honey Samples by Near-Infrared Spectroscopy: A Feasibility Study. J. Agric. Food Chem Vol.55(no.22). 7. Ruoff, K.; Luginbühl, W.; Bogdanov, S.; Bosset, J. O.; Estermann, B.; Ziolko, T.; Amadò, R. Authentication of the Botanical Origin of Honey by Near-Infrared spectroscopy. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, Copyright 2006 American Chemical Society. 8. Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 3 października 2003 r. w sprawie szczegółowych wymagań w zakresie jakości handlowej miodu (Dz. U. Nr 181, poz. 1773). 9. Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 lutego 2004 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie szczegółowych wymagań w zakresie jakości handlowej miodu (Dz. U. Nr 40, poz. 370). 10. Council Directive 2001/ 110/EC. Relating to honey. OJ L10, , p Prabucki J. (Pod red.): Pszczelnictwo, Szczecin, Wydawnictwo Promocyjne Albatros, Tuchołka D. (pod. red.): Metody spektroskopii absorpcyjnej i odbiciowej w analizie chemicznej, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznań, Kocjan R. (pod. red.): Chemia analityczna T. 2 Analiza instrumentalna, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, Von der Ohe, W.; Persano Oddo L., Piana L., Morlot M., Martin P.: Harmonised methods of melissopalynological analysis. Apidologie 2004, 35 (special issue), Devillers, J.; Morlot, M.; Pham-Delegue, M. H.; Dore, J. C. Classification of monofloral honeys based on their quality control data. Food Chem. 2004, 86, Bogdanov S., Martin P., Lüllmann C. (1997): Harmonised methods of the European Honey Commission. Apidologie, Extra issue, Codex Alimentarius (2001): Revised codex standard for honey. Codex stan , Rev. 1 (1987), Rev. 2 (2001), Wawrzeńczyk Cz.: Chemia organiczna. Właściwości chemiczne i spektroskopowe związków organicznych, Wydawnictwo Akademii Rolniczej we Wrocławiu, Wrocław, Praca wykonana w ramach S/ IIŚ/21/07, w postaci referatu została zaprezentowana na Ogólnopolskim sympozjum Nauka i przemysł metody spektroskopowe w praktyce, nowe wyzwania i możliwości Lublin *Jolanta Piekut, Politechnika Białostocka, Zakład Chemii, Białystok, 29