Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie. Biochemia ćwiczenia laboratoryjne dla kierunku: Pielęgniarstwo

Transkrypt

1 Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie Biochemia ćwiczenia laboratoryjne dla kierunku: Pielęgniarstwo Prowadząca: dr Beata Dudzińska-Bajorek Spis treści: 1. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium biochemicznym 2. Część praktyczna Ćwiczenie 1 - Biocząsteczki aminokwasy, peptydy i białka, węglowodany proste i złożone Ćwiczenie 2 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych chromatografia cienkowarstwowa (TLC) 3. Literatura Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 1

2 1. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium biochemicznym Aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu oraz uniknąć zranień lub oparzeń w trakcie wykonywania poszczególnych czynności w laboratorium wymaga się stosowania właściwych warunków pracy. W tym celu przed rozpoczęciem ćwiczeń studenci są zobowiązani do zapoznania się z następującymi zasadami bezpiecznej pracy: 1. W laboratorium biochemicznym należy przebywać w fartuchu ochronnym uszytym z naturalnego materiału oraz okularach ochronnych. Ubrania wierzchnie (płaszcze) zostawiać w szatni uczelni. 2. Na sali ćwiczeń nie wolno pić, jeść, palić, a także żuć gumy. 3. Przed przystąpieniem do ćwiczeń należy zapoznać się z metodyką ćwiczeń oraz przestrzegać wskazówek dotyczących ich wykonania. 4. Wszystkie czynności, przy których następuje wydzielanie się trujących (szkodliwych) par i gazów, należy wykonywać pod wyciągiem. 5. Nie zostawiać bez nadzoru palących się palników, włączonych przyrządów grzejnych i zwracać uwagę, czy w laboratorium nie ulatnia się gaz. W tym ostatnim przypadku należy zamknąć dopływ gazu, zgasić wszystkie palniki, uruchomić wentylację i otworzyć okna. 6. Nie zasysać ustami do pipet jakichkolwiek roztworów odczynników. Czynność tę należy wykonywać przy pomocy specjalnych końcówek do pipet lub gumowych gruszek. 7. Roztwory stężonych kwasów lub stężonych zasad pobierać do swoich probówek lub innych naczyń w miejscu ustawienia tych stężonych roztworów, nad szklanymi, porcelanowymi lub plastikowymi tacami. 8. Zabrania się przenoszenia naczyń ze stężonymi kwasami i zasadami na inne miejsca niż dla nich przewidziano. 9. Do probówek których zawartość ma być ogrzewana nad płomieniem palnika wlewać jedynie kilka cm 3 roztworu i ogrzewać je, trzymając probówki w drewnianych szczypcach. Podczas ogrzewania stale wstrząsać zawartością probówek, a ich wyloty kierować w miejsce, gdzie nie przebywa żadna osoba. 10. Przy wszystkich czynnościach laboratoryjnych zachować ostrożność i pamiętać, że brak dokładności, nieuwaga, niedostateczne zaznajomienie się ze sprzętem i odczynnikami może spowodować nieszczęśliwy wypadek. 11. Po wykonaniu doświadczeń zawartość probówek wlać do pojemników do tego przeznaczonych, odpowiednio opisanych. Nie wolno niczego wlewać do zlewu! 12. Używane szkło, szkiełka, pipety odkładać do wyznaczonych przez prowadzącego pojemników. 13. Przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy dokładnie przemyć środkiem dezynfekcyjnym. 14. Kilkakrotnie w czasie pracy i po jej zakończeniu myć ręce, stosując do ich mycia środki dezynfekcyjne. 15. Po zakończeniu zajęć uporządkować stoły, sprawdzić czy zostały zgaszone palniki. Schować używane przedmioty do szafek. Przemyć stoły środkiem odkażającym, umyć ręce. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 2

3 2. Część praktyczna Ćwiczenie 1 - Biocząsteczki aminokwasy, peptydy i białka, węglowodany proste i złożone 1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów wykrywanie obecności aminokwasów Aminokwasy są związkami chemicznymi budującymi peptydy i białka. W swojej cząsteczce mają co najmniej dwie grupy funkcyjne: grupę aminową NH 2 i grupę karboksylową COOH. Wzór ogólny aminokwasów to: 1.1. Reakcja z ninhydryną Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu, dekarboksylacji, a później deaminacji. Przejściowo powstaje iminokwas i zredukowana ninhydryna. Następnie iminokwas przekształca się w aldehyd uboższy o jeden atom węgla, uwalnia się CO 2 oraz amoniak. W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryny ulega reakcji kondensacji z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje fioletowo niebieski produkt kondensacji zwany purpurą Ruhemanna. iminokwas aldehyd ninhydryna zredukowana ninhydryna purpura Ruhemanna (fioletowo niebieska) Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 3

4 Zależnie od rodzaju aminokwasu różna jest intensywność i odcień powstającego zabarwienia. Reakcja ninhydrynowa jest czuła i dokładna - dodatni jej wynik dają wszystkie wolne aminokwasy w środowisku o ph>4. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia -aminokwasów. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę -aminową, czyli sole amonowe, aminocukry, amoniak. Peptydy i białka również mogą dawać dodatni odczyn ninhydrynowy, jednak tylko w nieznacznym stopniu. Iminokwasy, prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy -aminowej, dają w reakcji z ninhydryną produkt o barwie żółtej lub różowej. prolina 1.2. Reakcja z kwasem azotowym Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się wg reakcji pierwszej, ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. Deaminacja -aminokwasu przebiega zgodnie z drugą reakcją: Reakcja 1: NaNO 2 + HCl HNO 2 + NaCl kwas azotowy (III) Reakcja 2: hydroksykwas 1.3. Reakcja z siarczanem miedzi (II) Jony metali dwuwartościowych tworzą z -aminokwasami związki kompleksowe. Dotyczy to głównie jonu miedzi (II), który reagując z dwiema cząsteczkami aminokwasu daje barwny (niebieski), chelatowy związek kompleksowy. Jon miedzi (II) łączy się wiązaniami jonowymi z grupami karboksylowymi oraz wiązaniami koordynacyjnymi z atomami azotu grup -aminowych dwóch cząsteczek aminokwasu. 2 H 2 N-CH 2 -COOH + CuSO 4 związek kompleksowy (niebieski) Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 4

5 Przygotować 3 serie po 3 probówki, każdą serię napełnić odpowiednio 3 cm 3 : - 1% roztworu glicyny - 1% roztworu fenyloalaniny - 0,2% roztworu tryptofanu. Podziałać na nie odpowiednio roztworami ninhydryny, kwasu azotowego (III) i siarczanu miedzi (II), do każdej probówki dodać tylko jeden odczynnik. Zaobserwować i opisać w tabeli zmiany zachodzące w probówkach po dodaniu odczynników. Odczynnik Aminokwas Ninhydryna (3cm 3 2% roztworu alkoholowego) Kwas azotowy (III) (3cm 3 10% roztworu NaNO 2 i kilka kropli 5% HCl) Siarczan miedzi (II) (3cm 3 5% roztworu w buforze octanowym) Glicyna Fenyloalanina Tryptofan Narysować wzory strukturalne użytych aminokwasów i na ich podstawie napisać wnioski z przeprowadzonych reakcji. Glicyna Fenyloalanina Tryptofan Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 5

6 2. Reakcje charakterystyczne dla białek - wykrywanie obecności białka 2.1. Test biuretowy charakterystyczny dla wszystkich substancji zawierających dwa wiązania peptydowe Nazwa metody pochodzi od biuretu (bimocznika), najprostszego związku zawierającego dwa wiązania peptydowe, a powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180 C. mocznik biuret (bimocznik) Reakcja biuretowa polega na tworzeniu barwnego kompleksu z jonami miedzi(ii) w środowisku zasadowym, w którym zachodzi tautomeryzacja ugrupowania przy wiązaniu peptydowym, z utworzeniem formy enolowej, w której grupa hydroksylowa zdolna jest do dysocjacji. Z sąsiadującymi ze sobą wiązaniami tego typu jon miedzi (II) tworzy dwa wiązania jonowe (z grupami enolowymi) oraz cztery wiązania koordynacyjne (z atomami azotu). Stężenie powstającego kompleksu barwnego (nasilenie barwy fioletowo niebieskiej) jest proporcjonalne do liczby wiązań peptydowych zawartych w badanym roztworze. forma ketonowe forma enolowa związek kompleksowy (fioletowo niebieski) Do 2cm 3 roztworu białka dodać 5cm 3 10% roztworu NaOH i 2-3 krople 1% roztworu CuSO 4. Dokładnie wstrząsnąć probówką. Zapisać zaobserwowane zmiany. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 6

7 2.2. Reakcja ksantoproteinowa reakcja charakterystyczna białek zawierających aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi Aminokwasy aromatyczne zarówno wolne, jak i związane w białku podczas ogrzewania ze stężonym HNO 3 ulegają nitrowaniu, tworząc nitrowe pochodne o barwie żółtej. Czynnikiem nitrującym jest jon nitroniowy NO 2+, powstający w wyniku katalitycznego uprotonowania kwasu azotowego kwasem siarkowym, a następnie odszczepienia cząsteczki wody. Mieszanina nitrująca, zawierająca stężone kwasy azotowy (V) i siarkowy (VI) (w stosunku objętościowym 1:3), nitruje wszystkie aminokwasy, natomiast stężony kwas azotowy na zdolność nitrowanie związków zawierających aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz fenyloalaninę. tyrozyna dinitrotyrozyna (żółta) Do 2cm 3 1% roztworu białka dodać 1cm 3 stężonego HNO 3 i ogrzać. Zapisać zaobserwowane zmiany. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 7

8 2.3. Próba Millona - reakcja charakterystyczna białek zawierających aminokwasy z grupą fenolową Reakcja charakterystyczna dla fenoli, o co najmniej jednej niepodstawionej pozycji orto. Monofenole z odczynnikiem Millona ulegają reakcji nitrozowania w pozycji orto, której produkt o-nitrozopochodna tworzy barwny (czerwony) kompleks z jonami Hg 2+. Odczynnik Millona 1g rtęci w 1cm 3 dymiącego HNO 3 rozcienczony 2cm 3 H 2 O. fenol o-nitrofenol związek kompleksowy (czerwony) Do 5cm 3 1% roztworu białka dodać 6-8 kropli odczynnika Millona i ogrzać do wrzenia. Zapisać zaobserwowane zmiany. 3. Reakcje denaturacji białka Koagulacja to proces, w którym białka przechodzą ze stanu rozpuszczalnego do stanu nierozpuszczalnego. Koagulacja może być procesem odwracalnym, jeśli jednak podczas koagulacji białka utraciły nieodwracalnie swoje specyficzne właściwości wtedy proces ten nazywa się denaturacją. Białka są związkami wrażliwymi na wpływ wielu czynników, które mogą spowodować nieodwracalne zmiany w ich strukturze i utratę właściwości biologicznych czyli denaturację cząsteczki. W wyniku denaturacji zniszczona zostaje drugo-, trzecio- i czwartorzędowa struktura białka, natomiast pierwszorzędowa struktura nie ulega zmianie. Zachowane pozostają mocne wiązania peptydowe, a zniszczeniu ulegają słabe wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe oraz mostki dwusiarczkowe. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 8

9 Denaturacja białka może nastąpić pod wpływem podwyższonej temperatury, działania kwasów i zasad, wysokich stężeń soli metali ciężkich, rozpuszczalników organicznych, takich jak alkohol lub aceton. W wyniku denaturacji białko wytrąca się z roztworu w postaci osadu Denaturacja termiczna Ogrzewać 5cm 3 1% roztworu białka przez kilka minut. Zapisać zaobserwowane zmiany Denaturacja alkoholem Do 5cm 3 1% roztworu białka dodać 5 cm 3 alkoholu etylowego. Zapisać zaobserwowane zmiany Test Hellera (denaturacja stężonym kwasem) Do 5cm 3 1% roztworu białka dodać ostrożnie po ściance probówki 3cm 3 stężonego HNO 3. Zapisać zaobserwowane zmiany. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 9

10 4. Wykrywanie obecności węglowodanów W cząsteczkach cukrów występują grupy funkcyjne aldehydowa ( ) i ketonowa ( ) jako grupy główne oraz grupy hydroksylowe (-OH). Wszystkie monosacharydy możemy podzielić: ze względu na obecność grupy funkcyjnej na aldozy (grupa aldehydowa) lub ketozy (grupa ketonowa) oraz ze względu na liczę atomów węgla w cząsteczce: triozy, tetrozy, pentozy, heksozy. Dla otrzymanych roztworów cukrów należy wykonać testy Molischa, Fehlinga, Benedicta, Tollensa, próbę jodową i próbę zasadową. Węglowodan Próba Molischa Próba Fehlinga Próba Tollensa Próba Benedicta Próba zasadowa Próba jodowa Glukoza Sacharoza Skrobia 4.1. Próba Molischa Najbardziej ogólna reakcja charakterystyczna służąca do wykrywania cukrów wolnych i związanych oraz ich pochodnych: aldehydów, acetonu, kwasu szczawiowego, kwasu cytrynowego - ujemny jej wynik wyklucza obecność cukrowca, dodatni natomiast nie wystarcza do stwierdzenia jego obecności. W wyniku działania stężonego kwasu siarkowego (VI) na cukry powstaje furfural (w przypadku pentoz), hydroksymetylofurfural (w przypadku heksoz) lub inne pochodne furfuralu, w zależności od rodzaju cukru. D-glukoza 5-hydroksymetylofurfural Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 10

11 Grupa aldehydowa powstałego furfuralu reaguje z dwiema cząsteczkami -naftolu z odczynnika Molischa (roztwór -naftolu w etanolu), tworząc wielopierścieniowe produkty o barwie czerwono fioletowej. 5-hydroksymetylofurfural naftol związek wielopierścieniowy (czerwono fioletowy) Do probówki zawierającej 2cm 3 wody dodać 5 kropli roztworu badanego cukru i 2 krople reagentu Molischa, wymieszać i dodać 2cm 3 stężonego H 2 SO 4 wlewając go ostrożnie po ściance probówki, tak aby warstwy się nie mieszały. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów Próba Fehlinga Reakcja chemiczna, stosowana do jakościowego oznaczania aldehydów. Przeprowadza się ją przy użyciu odczynnika Fehlinga (alkaliczny roztwór jonów miedzi (II) skompleksowanych jonami winianowymi o zabarwieniu ciemnoniebieskim). Pozytywny wynik próby uwidacznia się przez pojawienie się czerwonego osadu tlenku miedzi (I) (Cu 2 O). Próba Fehlinga to reakcja redoks. Aldehydy ulegają utlenieniu do kwasów karboksylowych, miedź ze stopnia utlenienia II redukuje się do I, zgodnie z zapisem: 2Cu 2+ + R-CHO + NaOH + H 2 O Cu 2 O + R-COONa + 4H + roztwór Fehlinga aldehyd tlenek miedzi (I) (czerwony) Wytrącający się tlenek miedzi (I) Cu 2 O jest produktem szybkiej reakcji powstających jonów Cu + z jonami hydroksylowymi: 2Cu + + 2OH Cu 2 O + H 2 O Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 11

12 Nie jest możliwe odróżnienie aldoz, które zawierają aldehydową grupę funkcyjną od ketoz, które zawierają grupę ketonową. Niektóre ketozy, jak np. fruktoza, ulegają bowiem tautomerii ketoenolowej, a wynikiem tej izomeryzacji jest forma aldehydowa cukru. Monosacharydy i disacharydy (np. maltoza, celobioza lub laktoza) w większości dają pozytywny wynik próby, ponieważ są cukrami redukującymi, tzn. takimi, które nie mają związanego (np. wiązaniem glikozydowym) anomerycznego atomu węgla (pierwszy atom węgla w cząsteczce cukru). Do wyjątków należy sacharoza, która anomeryczny atom węgla ma związany wiązaniem glikozydowym z drugą cząsteczką węglowodanu i jest cukrem nierudukującym. Negatywny wynik próby dają też polisacharydy ze względu na zbyt małą liczbę reszt redukujących (jedna grupa aldehydowa w całym polimerze). W probówce zmieszać po 1cm 3 roztworu Fehlinga A i roztworu Fehlinga B i dodać 5 kropli badanego cukru. Próbkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów Próba Tollensa (próba lustra srebrowego) Reakcja chemiczna służąca do wykrywania aldehydów. Próba Tollensa jest prowadzona w lekko zasadowym środowisku, w którym ketozy ulegają epimeryzacji do aldoz, dzięki czemu metodą tą można wykrywać też cukry nie zawierające początkowo grup aldehydowych. Przykładem jest fruktoza (ketoza), przekształcająca się w trakcie próby w aldozy: glukozę i mannozę. Jednym z niewielu cukrów, które nie dają pozytywnego wyniku próby Tollensa jest sacharoza (cukier nieredukujący). Do wykonania próby Tollensa wykorzystuje się odczynnik Tollensa, czyli roztwór zawierający jony diaminosrebra (I) [Ag(NH 3 ) 2 ] +. Odczynnik Tollensa otrzymuje się dodając wody amoniakalnej do roztworu azotanu srebra. W pierwszym etapie wytrąca się brunatny osad tlenku srebra (I): 2 AgNO NH 3 + H 2 O Ag 2 O + 2 NH 4 NO 3 Osad ten rozpuszcza się w nadmiarze amoniaku: Ag 2 O + 4 NH 3 + H 2 O 2 [Ag(NH 3 ) 2 ] OH Powstaje jon kompleksowy diaminosrebra (I) ([Ag(NH 3 ) 2 ] + ). Roztworu tego nie wolno przechowywać, ze względu na powstawanie tzw. srebra piorunującego o właściwościach wybuchowych. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 12

13 Po wprowadzeniu do odczynnika Tollensa aldehydu, jon diaminosrebra (I) redukuje się do metalicznego srebra. Jeżeli reakcja przeprowadzana jest w czystej probówce (najlepiej odtłuszczonej wodorotlenkiem sodu) na jej ściankach powstanie "lustro srebrowe". Jeżeli probówka będzie brudna wytrąci się czarny osad srebra. 2 [Ag(NH 3 ) 2 ] + + RCHO + 3 OH 2 Ag + RCOO + 2 H 2 O + 4 NH 3 odczynnik Tollensa aldehyd srebro metaliczne Do probówki wlać 1cm 3 odczynnika Tollensa A i 1cm 3 odczynnika Tollensa B, wymieszać i dodawać rozcieńczony roztwór amoniaku, aż do rozpuszczenia powstającego w pierwszym momencie tlenku srebra. Do tak przygotowanego roztworu dodać 5 kropli badanego cukru i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów Próba Benedicta Reakcja chemiczna, która służy do wykrywania większości cukrów (oprócz cukrów nieredukujących, np. sacharozy) i aldehydów. Odczynnik Benedicta to ciemnoniebieski cytrynianowy kompleks miedzi (II) sporządzany przez rozpuszczenie w wodzie siarczanu miedzi (II), cytrynianu sodu i węglanu sodu. Po dodaniu odczynnika do badanej próby i doprowadzeniu do wrzenia duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu. 2 Cu 2+ + RCHO + OH Cu 2 O + RCOO + 3 H 2 O odczynnik Benedicta aldehyd tlenek miedzi (I) (czerwony) Do probówki zawierającej 2cm 3 roztworu Benedicta, dodać 5 kropli badanego cukru. Probówkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów Próba zasadowa Wszystkie cukry redukujące w czasie ogrzewania w środowisku zasadowym ulegają rozpadowi na szereg związków o różnych właściwościach. Tworzą się dwu- i trójwęglowe fragmenty o właściwościach silnie redukujących oraz produkty ich polimeryzacji (ciała żywicowate). Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 13

14 Oligo- i polisacharydy, w których grupy aldehydowe są zablokowane wiązaniami glikozydowymi charakteryzują się dużą opornością na działanie zasad. Do probówki zawierającej 5cm 3 badanego roztworu cukru dodać 1cm 3 25% roztworu wodnego NaOH i umieścić probówkę we wrzącej łaźni wodnej na około 5 min. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów Próba jodowa (odróżniająca polisacharydy od innych cukrów) Reakcja polisacharydu z jodem polega na adsorpcji jodu, który wnika do struktury spiralnie skręconego łańcucha polisacharydowego i zostaje uwięziony przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy. Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu, wzdłuż którego mogą przemieszczać się elektrony, co powoduje pochłanianie światła przez układ. Skrobia po adsorpcji cząsteczek jodu barwi się na kolor ciemnoniebiesko fioletowy. Obserwowana barwa zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu: reakcja jodu z amylozą powoduje powstanie niebieskiego produktu, z amylopektyną fioletowo czerwonego, a glikogen barwi się z jodem na czerwono. W probówce umieścić 1cm 3 badanego roztworu cukru, dodać kroplę roztworu jodu (J 2 w KJ w wodzie). W razie potrzeby intensywnie zabarwiony roztwór można rozcieńczyć wodą 3-10-krotnie. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 14

15 Ćwiczenie 2 Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych chromatografia cienkowarstwowa (TLC) 1. Rozdział chromatograficzny mieszaniny produktów Chromatografia jest metodą służącą do rozdzielania mieszanin substancji, w której wykorzystywane są różne fizykochemiczne oddziaływania rozdzielanych substancji z dwoma fazami: ruchomą i nieruchomą. Fazą nieruchomą może być ciało stałe (w chromatografii adsorpcyjnej) lub ciecz, unieruchomiona w stałym nośniku (w chromatografii podziałowej), fazą ruchomą bywa ciecz lub gaz. Technikę chromatografii cienkowarstwowej (TLC) wyróżnia kształt i rodzaj fazy stacjonarnej, uformowanej w postaci cienkiej warstwy nałożonej na płaskie podłoże, zapewniające dostateczną wytrzymałość mechaniczną. Płaskim podłożem zwykle są płytki szklane, płytki z folii aluminiowej lub plastykowej. Cienką warstwę złoża mogą stanowić: żel krzemionkowy, ziemia okrzemkowa, niezmodyfikowana lub zmodyfikowana chemicznie celuloza, tlenek glinu (Al 2 O 3 ), podłoża jonowymienne lub inne. Technikę chromatografii cienkowarstwowej stosuje się do rozdziału niemal wszystkich grup związków ważnych biologicznie. Technika chromatografii cienkowarstwowej polega na poruszaniu się substancji chromatografowanych z różną prędkością wraz z ciekłą fazą ruchomą przez cienką warstwę stałego adsorbenta naniesionego na płytkę. Towarzyszą temu procesy adsorpcji i desorpcji oraz podział między ciekłą fazą organiczną i wodą, która w niewielkich ilościach znajduje się na nośniku. Rozdzielenie mieszaniny substancji odbywa się głównie dzięki różnicom w ich adsorpcji przez adsorbent. Substancje słabiej adsorbowane przez adsorbent są wymywane przez rozpuszczalnik wcześniej. Natomiast silniej adsorbowane przez adsorbent pozostają z nim związane. faza stacjonarna czoło fazy ruchomej rozdzielone związki linia startu faza ruchoma Proces separacji składników próbki naniesionej na płytkę TLC nazywa się rozwijaniem. Oddziaływanie substancji znajdujących się w próbce z adsorbentem oraz z poruszającym się rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie się składników próbki na płytce i poszczególne składniki tworzą oddzielne plamki. Plami rozdzielanych składników należy z kolei uwidocznić, czyli wywołać. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 15

16 Chromatogramy wywołuje się najczęściej odczynnikami chemicznymi, które tworzą barwne związki z analitami. Często ogląda się chromatogramy oświetlane lampą wytwarzającą promieniowanie UV, aby zobaczyć substancji wykazujące właściwości fluorescencyjne pod wpływem promieniowania UV. Fluorescencja jest to zjawisko emitowania przez niektóre związki chemiczne światła pod wpływem naświetlania zewnętrznym promieniowaniem. Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, który określa położenie substancji na chromatografie, jest współczynnik opóźnienia RF. Jest to stosunek drogi migracji substancji (a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (b): RF = a/b Współczynnik opóźnienia przyjmuje wartości od 0 do 1. Jeśli RF = 0 oznacza to, że chromatografowana substancja w danym układzie chromatograficznym pozostaje na starcie, gdyż zbyt silnie oddziałuje z fazą stacjonarną i nie ma oddziaływań z fazą ruchomą. Z kolej RF = 1 świadczy o tym, że substancja nie oddziałuje z fazą stacjonarną i wędruje z czołem rozpuszczalnika. Optymalna wartość współczynnika RF powinna zawierać się w przedziale 0,2 0,8. Wówczas warunki chromatograficzne są najbardziej stabilne. Współczynnik opóźnienia jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach chromatograficznych i może służyć do jej identyfikacji. Wartość współczynnika RF, podobnie jak innych parametrów retencji, zależy od rodzaju analitu, rodzaju fazy ruchomej i fazy stacjonarnej, a także nasycenia komory i temperatury. czoło fazy ruchomej linia startu Jeżeli dana substancja ma tą samą wartość współczynnika opóźnienia, jaką ma wzorzec, wyznaczoną w takich samych warunkach chromatograficznych, to prawdopodobnie jest identyczna ze wzorcem. Najczęściej analizę jakościową wykonuje się w ten sposób, że na jedną płytkę TLC nanosi się badaną próbkę oraz obok nanosi się również wzorzec. Po rozwinięciu płytki sprawdza się, która plamka badanej próbki ma taką samą wartość współczynnika opóźnienia jak wzorzec. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 16

17 Roztarte w moździerzu tabletki o znanym składzie i otrzymaną od prowadzącego substancję o nieznanym składzie rozpuścić każdą z osobna w etanolu w kolbkach miarowych 25 ml. Zawartość kolbek przesączyć przez bibułę na lejku do fiolek. Przesączone roztwory nanieść przy pomocy kapilary na dwie płytki chromatograficzne z żelem krzemionkowym. Przygotować eluent A o składzie: octan etylu : heksan : kwas octowy (8 : 2 : 0,1 ml) oraz eleunt B o składzie: octan etylu : heksan : kwas octowy (5 : 5 : 0,1 ml). Wlać eluent A i eluent B do dwóch komór chromatograficznych i zamknąć je na chwilę, aby komora równomiernie wysyciła się parami rozpuszczalnika. Płytki z naniesionymi substancjami wstawić do komór chromatograficznych (każdą płytkę do innej komory) i poczekać aż czoło rozpuszczalnika dojdzie do wyznaczonej linii końcowej. Wysuszoną płytkę obserwować w świetle UV. Narysować poniżej wzór plamek substancji wzorcowych i analizowanych, wyznaczyć RF, opisać skład substancji analizowanej na podstawie przeprowadzonego doświadczenia. Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 17

18 3. Literatura 1. Żak I. (red): Chemia medyczna. Śląska Akademia Medyczna, Katowice Żak I. (red): Praktikum z chemii medycznej. Śląska Akademia Medyczna, Katowice Skrypt Techniki separacyjne UG 4. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii:, WNT, Warszawa 2000 Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 18