Enzymy. Ogólne właściwości Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych Regulacja aktywności enzymatycznej

Transkrypt

1 Enzymy Ogólne właściwości Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych Regulacja aktywności enzymatycznej

2 Enzymy jako biokatalizatory głównie białka (także RNA rybozymy, DNA DNA-zymy) wytwarzane tylko przez żywe komórki (ale mogą działać pozakomórkowo) przyspieszają reakcje biochemiczne, aby zachodziły z dostateczną wydajnością ( razy) wysoka efektywność nie zużywają się, nie zmieniają się trwale podczas reakcji działają selektywnie regulują procesy metaboliczne wspomagają utrzymanie homeostazy

3 Enzymy jako biokatalizatory nie zmieniają końcowego składu mieszaniny (odtwarzają się po reakcji) nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji odwracalnej przyspieszają osiągnięcie równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych zmieniają mechanizm reakcji tworzą związki przejściowe Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

4 Nazewnictwo enzymów Nazwy powszechnie używane: oksydaza ksantynowa (substrat) lipaza (gr. lípos tłuszcz) rybonukleaza trzustkowa (źródło) lipaza wrażliwa na hormon (regulacja) proteaza cysteinowa (mech. działania) pepsyna (gr. pepsis trawienie) - (funkcja w organizmie) lizozym (od lizujących właściwości wobec bakterii)

5 Nazewnictwo enzymów hydrolaza acetylocholiny katalizowana reakcja przyrostek -aza substrat/y oksydoreduktaza alkohol:nad

6 Nazewnictwo enzymów Numer EC numer przypisany każdemu enzymowi wg zasad klasyfikacji opracowanej przez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB), 1984 Enzyme Commission (Komisja Enzymatyczna) lub Enzyme Catalogue XX.XX.XX.XX klasa. podklasa. podpodklasa. nr w podpodklasie Transferazy Przenoszące grupy azotowe Transaminazy (aminotransferases) Transaminaza asparaginianowa

7 Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji EC 1- Oksydoreduktazy przenoszą ładunki (elektrony i jony H 3 O+ - protony) z cząsteczki substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy) EC 2 Transferazy przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy) EC 3 Hydrolazy powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza) rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, innych EC 4 Liazy powodują rozpad substratu bez hydrolizy rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N,inne) przez eliminację atomu i wytworzenie wiązania podwójnego) EC 5 Izomerazy zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząteczki) EC 6 Ligazy (syntetazy) powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP

8 Enzymy proste Klasyfikacja enzymów ze względu na budowę chemiczna zbudowane tylko z aminokwasów grupa czynna specyficzne zespoły aminokwasów przykłady: proteazy, amylaza, RNaza Enzymy złożone złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor) cz. niebiałkowa trwale związana z białkową grupa prostetyczna gr. prostetyczna integralna część enzymu przykłady: katalaza, peroksydaza,oksydaza cytochromowa cz. niebiałkowa luźno związana z białkową koenzym obie części dają łatwo się oddzielić żadna z nich nie jest czynna katalitycznie ponowne połączenie przywraca aktywność przykład: dehydrogenazy

9 Budowa enzymu substrat - H 2 O 2 centrum aktywne substrat centrum aktywne Centrum aktywne zgrupowanie wlaściwych reszt aa (często z odległych łańcuchów polipeptydowych) o odpowiednim ułożeniu przestrzennym decyduje o właściwościach katalitycznych enzymu determinuje wysoką sprawność katalityczną odpowiada za specyficzność reakcji

10 Budowa enzymu miejsce wiązania substratu miejsce katalityczne (grupa czynna) metalo-β-laktamaza, MβL (model wstęgowy) centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne

11 Specyficzność enzymów Specyficzność substratowa określa, jaki rodzaj substratu ulega przemianie przy udziale danego enzymu zależy od budowy miejsca wiązania Specyficzność działania katalizowanie reakcji tylko jednego typu katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji (cz. białkowa enzymu) zależna od budowy centrum katalitycznego

12 Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894) enzym i jego substrat są do siebie geometrycznie dopasowane w taki sposób, że idealnie pasują do siebie jak klucz i zamek model wyjaśnia specyficzność enzymów nie wyjaśnia, w jaki sposób stabilizowany jest stan przejściowy podczas reakcji enzymatycznej

13 Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958) pod wpływem przyłączenia substratu enzym przybiera konformację niezbędną do katalizy (jak rękawiczka zakładana na rękę) powoduje to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji substratu i grup czynnych enzymu, a także niekiedy wzrost naprężeń w substracie, co ułatwia rozerwanie określonych wiązań (kataliza przez odkształcanie substratu)

14 Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948) enzymy reagują z tylko jedną odmianą stereoizomeryczna danego substratu połaczenie enzymu z substratem musi zachodzić co najmniej w 3 miejscach nawet symetryczna cząsteczka staję się asymetryczną dla centrum aktywnego możliwe jest tylko jedno właściwe położenie substratu STEREOSPECYFICZOŚĆ

15 NO + NO 3 2 NO 2

16 Teoria kinetyczna teoria zderzeń 1. reakcja może zajść tylko wtedy, gdy reagujące cząsteczki się zderzają 2. dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona, aby zaszła reakcja 3. reagujące cząsteczki muszą mieć dostateczną ilość energii, aby przekroczyć tę barierę Wszystko, co zwiększa energię lub częstość zderzeń substratów, zwiększa szybkość reakcji.

17 Enzymy jako biokatalizatory Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

18 Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej sprzyjający zajściu reakcji Zapewniają ścisłą orientację przestrzenna reagujących cząsteczek (eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia) Zwiększają bliskość substratów i ich lokalne stężenie

19 Teoria kinetyczna teoria zderzeń Enzymy obniżają energię aktywacji i ułatwiają zajście reakcji.

20 Kinetyka reakcji enzymatcznej opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty kinetyka Michaelisa-Menten - dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k1, kompleks enzym-substrat (ES) kompleks ES może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może dysocjować do E i S ze stałą szybkości k-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k2, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat.

21 Model Michaelisa-Menten

22 Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych zwiększają energię kinetyczna reagujących cząsteczek obniżają barierę energetyczną zwiększają częstość zderzeń stężenie substratu stężenie produktu stężenie enzymu temperatura ph obecność inhibitorów i aktywatorów

23 Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnych wzrost prędkości reakcji mam miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu

24 Wpływ temperaurty na szybkość reakcji enzymatycznej zwiększenie energii kinetyczne reagujących cząsteczek zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna zwiększenie częstości zderzeń wzrost możliwości wytwarzania połączeń, które są mało prawdopodobne w normalnych warunkach zbyt wysoka temperatura denaturacja białka enzymatycznego gorączka, hipotermia zmiana aktywności enzymów organizmu

25 Wpływ ph na szybkość reakcji enzymatycznej optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 9,0 zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych zmiana układ łańcucha zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach ph kwasica, zasadowica zmiana aktywności enzymów organizmu

26 Inhibicja Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory) Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych! Inhibicja odwracalna: kompetycyjna niekompetycyjna akompetycyjna Inhibicja nieodwracalna - cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale (np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności danej cząsteczki enzymu na stałe

27 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

28 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia związanie substratów (i vice versa) maksymalna szybkość reakcji, Vmax, nie zmienia się V max może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów, które przezwycięży inhibicję wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość Km 1/v 0-1/K M 1/V max

29 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) inhibitor jest strukturalnie bardzo podobny do prawdziwego substratu dla danego enzymu przykład: metotreksat inhibitor kompetycyjny reduktazy dihydrofolianu (dihydrofolian tetrahydrofolian) kwas foliowy (koenzym) metotreksat

30 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) Glikol etylenowy składnik płynów niezamarzających do chłodnic silników Etanol inhibitor kompetycyjny dla dehydrogenazy alkoholowej stos. w zatruciach glikolem HO OH Alcohol dehydrogenase HO O ethyleneglycol glycoaldehyde O HO OH glycolicacid O OH O glyoxylicacid HO O O OH oxalicacid

31 Inhibicja niekompetycyjna

32 Inhibicja niekompetycyjna inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca aktywnego brak konkurencji z substratem kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są enzymatycznie nieaktywne wiązanie inhibitora całkowicie niezależne od substratu wartość Km ł pozostaje stała, wartość Vmax maleje 1/v 0-1/K M 1/V max 1/[S]

33 Inhibitory nieodwracalne - trucizny enzymów inhibitor wiąże się kowalencyjnie (a więc nieodwracalnie) do łańcuchów białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu EI jest bardzo powolna trwałe unieczynnienie enzymu chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie nie daje się odwrócić ani przez usuniecie inhibitora ze środowiska, ani przez zwiększenie ilości substratu penicylina - inhibitor enzymów zawierających serynę aspiryna inhibitor cyklooksygenazy zw. fosforoorganiczne (insektycydy) inhibitory acetylocholinoesterazy

34 Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej Wpływ na ilość: regulacja syntezy enzymów (indukcja lub represja genu kodującego białko enzymu) i degradacji (półokres rozpadu białka t ½ ) Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne: kompartmentacja Wpływ na aktywność katalityczną: przez sprzężenie zwrotne (hamowanie) przez efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne - regulatorowe) przez zmianę struktury enzymu odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, defosforylacja), aktywacja proteolityczna (proenzymy = zymogeny) kompleksy (układy) wieloenzymowe

35 Kompartmentacja fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych w obrębie komórki: biosyteza kw. tłuszczowych cytozol utlenianie kw. tłuszczowych mitochodrium w organizmie: niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych typach komórek kompartmentacja chemiczna przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie rozdzielenie molekuł przeznaczonych do szlaku katabolicznego i anabolicznego

36 Regulacja przez sprzężenie zwrotne produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał zwykle dotyczy szlaków syntezy (etapu imitującego) hamowany jest początkowy etap syntezy inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego Hamowanie przez sprzężenie zwrotne produkt powoduje represję genu kodującego dany enzym nie wpływa na jego aktywność katalityczną, ale na jego ilość przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA

37 Efektory allosteryczne zwykle nie podobne od substratów czy koenzymów danego enzymu łączą się z miejscem allosterycznym ( inna przestrzeń ) powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (podjednostki z którą się łączą) zmiana powinowactwa innych podjednostek do substratu enzymy allosteryczne nie dają się opisać kinetyką M-M krzywa sigmoidalna

38 Efektory allosteryczne inhibitory aktywatory

39 Efektory allosteryczne + ATP Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwszą reakcje na szlaku syntezy pirymidyn złożona z 5 podjednostek 3 regulatorowe i 2 katalityczne no effector - CTP

40 Modyfikacje kowalencyjne odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu przebiega po zakończeniu translacji modyfikacje kowalencyjne - dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych: fosforylacja glikozylacja ADP-rybozylacja metylacja zmiana właściwości funkcjonalnych białek (zmiana konfrmacji, ładunku) zmiana sprawności katalitycznej, powinowactwa do substratu, wewnątrzkomórkowej lokalizacji, regulacji przez ligandy allosteryczne w momencie fizjologicznego zapotrzebowania

41 Ograniczona proteoliza - proenzymy proenzym (zymogen) nieaktywny prekursor enzymu do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy powstanie centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha polipeptydowego zmiana konformacji) przykłady: pepsynogen ( pepsyna) trypsynogen ( trypsyna) proinsulina ( insulina) prokolagen ( kolagen) czynniki krzepnięcia i fibrynolizy możliwe szybkie zaktywowanie w momencie zapotrzebowania ochrona tkanek produkujące proenzymy przed samostrawieniem

42 Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe Enzym wielofuncyjny jeden łańcuch polipeptydowy posiadający co najmniej dwie różne aktywności katalityczne i dwa miejsca aktywne Przykład: syntaza kw. tłuszczowych 3 domeny (1- transferaza acetylowa, syntaza ß- ketoacylowa, transferaza malonylowa; 2- reduktaza ketoacylowa, dehydrataza, reduktaza enoilowa, 3- tioesteraza) Kompleks wieloenzymowy układ kilku białek eznymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połaczone niekowalencyjnie Przykład: synataza kw. tłuszczowych u E.coli (α6β6) Intemediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji (reagujące cząsteczki nie ulegają rozcieńczeniu w cytozolu, nie muszą odnajdywać się w przypadkowym procesie dyfuzji) Oddzielenie intermediatów od innych substancji ochrona przed reakcjami współzaodniczącymi