Enzymy. Ogólne właściwości Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych Regulacja aktywności enzymatycznej

Transkrypt

1 Enzymy Ogólne właściwości Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych Regulacja aktywności enzymatycznej

2 Enzymy jako biokatalizatory głównie białka (także RNA rybozymy, DNA DNA-zymy) wytwarzane tylko przez żywe komórki (ale mogą działać pozakomórkowo) przyspieszają reakcje biochemiczne, aby zachodziły z dostateczną wydajnością ( razy) wysoka efektywność nie zużywają się, nie zmieniają się trwale podczas reakcji działają selektywnie regulują procesy metaboliczne wspomagają utrzymanie homeostazy

3 Enzymy jako biokatalizatory nie zmieniają końcowego składu mieszaniny (odtwarzają się po reakcji) nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji odwracalnej przyspieszają osiągnięcie równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych zmieniają mechanizm reakcji tworzą związki przejściowe Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

4 Nazewnictwo enzymów Nazwy powszechnie używane: oksydaza ksantynowa (substrat) lipaza (gr. lípos tłuszcz) rybonukleaza trzustkowa (źródło) lipaza wrażliwa na hormon (regulacja) proteaza cysteinowa (mech. działania) pepsyna (gr. pepsis trawienie) - (funkcja w organizmie) lizozym (od lizujących właściwości wobec bakterii)

5 Nazewnictwo enzymów hydrolaza acetylocholiny katalizowana reakcja przyrostek -aza substrat/y oksydoreduktaza alkohol:nad

6 Numer EC Nazewnictwo enzymów numer przypisany każdemu enzymowi wg zasad klasyfikacji opracowanej przez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB), 1984 Enzyme Commission (Komisja Enzymatyczna) lub Enzyme Catalogue XX.XX.XX.XX klasa. podklasa. podpodklasa. nr w podpodklasie Transferazy Przenoszące grupy azotowe Transaminazy (aminotransferases) Transaminaza asparaginianowa

7 Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji EC 1- Oksydoreduktazy przenoszą ładunki (elektrony i jony H 3 O+ - protony) z cząsteczki substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy) EC 2 Transferazy przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy) EC 3 Hydrolazy powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza) rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, innych EC 4 Liazy powodują rozpad substratu bez hydrolizy rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N,inne) przez eliminację atomu i wytworzenie wiązania podwójnego) EC 5 Izomerazy zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząteczki) EC 6 Ligazy (syntetazy) powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP

8 Enzymy proste Klasyfikacja enzymów ze względu na budowę chemiczna zbudowane tylko z aminokwasów grupa czynna specyficzne zespoły aminokwasów przykłady: proteazy, amylaza, RNaza Enzymy złożone złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor) cz. niebiałkowa trwale związana z białkową grupa prostetyczna gr. prostetyczna integralna część enzymu przykłady: katalaza, peroksydaza,oksydaza cytochromowa cz. niebiałkowa luźno związana z białkową koenzym obie części dają łatwo się oddzielić żadna z nich nie jest czynna katalitycznie ponowne połączenie przywraca aktywność przykład: dehydrogenazy

9 Budowa enzymu substrat - H 2 O 2 centrum aktywne substrat centrum aktywne Centrum aktywne zgrupowanie wlaściwych reszt aa (często z odległych łańcuchów polipeptydowych) o odpowiednim ułożeniu przestrzennym decyduje o właściwościach katalitycznych enzymu determinuje wysoką sprawność katalityczną odpowiada za specyficzność reakcji

10 Budowa enzymu miejsce wiązania substratu miejsce katalityczne (grupa czynna) metalo-β-laktamaza, MβL (model wstęgowy) centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne

11 Centrum aktywne 1. W konformacji natywnej enzymu aminokwasy, które są rozproszone zgodnie z sekwencją struktury pierwszorzędowej skupiają się i formują centrum aktywne. Centrum to wiąże i aktywuje substraty. 2. Wiązanie substratów powoduje często zmiany konformacji w enzymie (indukowane dopasowanie), które umacniają to połączenie. 3. Stan przejściowy prezentuje aktywna formę substratów, bezpośrednio poprzedzającą formowanie się produktu. 4. Precyzyjna orientacja łańcucha bocznego aminokwasów w centrum aktywnym enzymu zależy od sekwencji aminokwasów, ph, temperatury, siły jonowej. 5. Mutacja lub niefizjologiczne czynniki, które zmieniają centrum aktywne zmieniają też aktywność enzymu.

12 KOFAKTORY Koenzymy - niebiałkowe składniki enzymów (białek) niezbędne dla ich aktywności, rodzaj kofaktorów. W przeciwieństwie do grup prostetycznych, s ą nietrwale (niekowalencyjnie), luźno związane z białkami. Białko bez swojego koenzymu to apobiałko (apoproteina,apoenzym), natomiast wraz z nim - holoenzym (holobiałko). Biorą udział w reakcjach przez oddawanie lub przyłączanie reagentów (atomów, grup atomów czy elektronów). Koenzymy mogą mieć charakter zarówno organiczny (np. nukleotydy i ich pochodne) lub nieorganiczny (np. jony metali). Wiele organicznych koenzymów to pochodne witamin.

13 P r z y k ł a d y k o e n z y m ó w Koenzym A (CoA) Koenzym Q 10 (CoQ 10, ubichinon) NAD pochodna witaminy B 3 NADP pochodna witaminy B 3 Fosforan pir ydoksalu (PLP) pochodna witaminy B 6 Pirofosforan tiaminy (TPP) pochodna witaminy B 1 S-adenozylometionina (SAM) przen. grup metylowych Tetrahydrofolian pochodna k w a s u foliowego

14 Grupy prostetyczne - niebiałkow e składniki enzymów (białek) niezbędne dla ich aktywności, rodzaj kofaktorów. W przeciwieństwie do koenzymów, s ą trwale związane z białkami (np. miejscem aktywnym enzymów), często za pomocą wiązań kowalencyjnych lub koordynacyjnych, i nie opuszczają one swojego miejsca wiązania w trakcie reakcji. Białko bez swojej grupy prostetycznej to apobiałko (apoproteina, apoenzym, wraz z nią holobiałko (holoproteina). Grupy prostetyczne mogą mieć charakter zarówno organiczny (np. cukry czy lipidy) lub nieorganiczny (jony metali i małe cząsteczki nieorganiczne). Wiele organicznych grup prostetycznych to pochodne witamin.

15 Jony metali Kofaktory- jony metalu zasocjowane są niekowalencyjnie z enzymami i mogą pomagać w zorientowaniu substratu lub funkcjonować jako nośnik elektronów. 1. Magnez (Mg): kinazy 2.Cynk (Zn): anhydraza węglanowa, kolagenaza, dehydrogenaza alkoholowa, dysmutaza ponadtlenkowa (neutralizuje wolne rodniki tlenowe) 3.Miedź (Cu): oksydazy (np. oksydaza lizylowa dla mostków krzyżowych w syntezie kolagenu), ferroksydaza (przekształca Fe 2+ w Fe 3+ podczas łączenia z transferyną). 4. Żelazo (Fe): cytochromy 5. Selen (Se): peroksydaza glutationowa

16

17

18 ATP i ADP zawsze z magnezem

19 Grupy funkcyjne w centrum aktywnym Grupa funkcyjna Intermediaty kowalencyjne Cys-SH Ser-OH Lyz-NH 2 His-NH Kwasowe i zasadowe His - NH Asp - COOH Formowanie anionu Reszta NH Arg-NH Ser-OH Formowanie kationu Asp-COO - E Dh aldehydu 3- P-glicerolowego Acetylocholinesteraza Aldolaza Fosfoglukomutaza Chymotrypsyna Pepsyna Chymotrypsyna Karboksypeptydaza A Dehydrogenaza alkoholowa Lizozym

20 Mononukleotyd flawinowy (FMN) Dinukleotyd flawinoadeninowy(fad) Reakcje redoks Reakcje redoks Funkcja Fosforan pirydoksalu Biotyna Metylkobalamina Pirofosforan tiaminy Porfiryna Tetrahydrobiopteryna Kwas liponowy Transaminacja, dekarboksylacja i deaminacja Karboksylacja Metylacja i izomeryzacja Dekarboksylacja Wiązanie tlenu i reakcje redoks Hydroksylacja Dekarboksylacja -ketokwasów

21 Specyficzność enzymów Specyficzność substratowa określa, jaki rodzaj substratu ulega przemianie przy udziale danego enzymu zależy od budowy miejsca wiązania Specyficzność działania katalizowanie reakcji tylko jednego typu katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji (cz. białkowa enzymu) zależna od budowy centrum katalitycznego

22 Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894) enzym i jego substrat są do siebie geometrycznie dopasowane w taki sposób, że idealnie pasują do siebie jak klucz i zamek model wyjaśnia specyficzność enzymów nie wyjaśnia, w jaki sposób stabilizowany jest stan przejściowy podczas reakcji enzymatycznej

23 Model klucza i zamka sztywność miejsca aktywnego ogranicza zmiany Heksokinaza GLU ADP produkty SUBSTRATY Glukozo6P ATP Uwolnienie produktu Centrum aktywne Kompleks E-S Substraty przyłącząne do enzymu Przekształcenie substratu w produkt

24

25 Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958) pod wpływem przyłączenia substratu enzym konformację niezbędną do katalizy (jak zakładana na rękę) rękawiczka przybiera powoduje to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji substratu i grup czynnych enzymu, a także niekiedy wzrost naprężeń w substracie, co ułatwia rozerwanie określonych wiązań (kataliza przez odkształcanie substratu)

26 Reakcje RReeaakckcjjee s esseekwkweennccyyjjnnee k w e n c y j n e wgwwgg Clelanda CCleelananddaa Podwójne przeniesienie p i n g - p o n g jeden lub więcej produktów jest uwalnianych przed związaniem przez enzym wszystkich substratów aminotransferazy

27 Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948) enzymy reagują z tylko jedną odmianą substratu stereoizomeryczna danego połaczenie enzymu z substratem musi zachodzić co najmniej w 3 miejscach nawet symetryczna cząsteczka staję się asymetryczną dla centrum aktywnego możliwe jest tylko jedno właściwe położenie substratu STEREOSPECYFICZOŚĆ

28 Teoria kinetyczna teoria zderzeń 1.reakcja może zajść tylko gdy reagujące cząsteczki się zderzają wtedy, 2.dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona, aby zaszła reakcja 3.reagujące cząsteczki muszą mieć dostateczną ilość energii, aby przekroczyć tę barierę Wszystko, co zwiększa energię lub częstość zderzeń substratów, zwiększa szybkość reakcji.

29 Enzymy jako biokatalizatory Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez: lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji, która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

30 Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej sprzyjający zajściu reakcji Zapewniają ścisłą orientację przestrzenna reagujących cząsteczek (eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia) Zwiększają bliskość substratów i ich lokalne stężenie

31 Teoria kinetyczna teoria zderzeń Enzymy obniżają energię aktywacji i ułatwiają zajście reakcji.

32

33 substrat enzym wolny enzym centrum aktywne kofaktor wiązania dodatkowe kompleks przejściowy miejsce wiązania substratu produkt kompleks E-S wolny enzym Kataliza e n z y m a t y c z n a W centrum aktywnym może znajdować się kofaktor. W wyniku przyłączenie substratu do enzymu, zmienia się jego konformacja. Po odłączeniu produktu enzym wraca do konformacji początkowej Enzymy m o g ą składać się z podjednostek: katalitycznej i regulatorowej.

34 Kinetyka reakcji enzymatcznej opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty kinetyka Michaelisa-Menten - dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k1, kompleks enzym-substrat (ES) kompleks ES może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może dysocjować do E i S ze stałą szybkości k-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k2, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat.

35 Model Michaelisa-Menten

36

37

38 Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych zwiększają energię kinetyczna reagujących cząsteczek obniżają barierę energetyczną zwiększają częstość zderzeń stężenie substratu stężenie produktu stężenie enzymu temperatura ph obecność inhibitorów i aktywatorów

39

40 Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnych wzrost prędkości reakcji mam miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu

41 Wpływ temperaurty na szybkość reakcji enzymatycznej zwiększenie energii kinetyczne reagujących cząsteczek zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna zwiększenie częstości zderzeń wzrost możliwości wytwarzania połączeń, które są mało prawdopodobne w normalnych warunkach zbyt wysoka temperatura denaturacja białka enzymatycznego gorączka, hipotermia zmiana aktywności enzymów organizmu

42 Wpływ ph na szybkość reakcji enzymatycznej optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 9,0 zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych zmiana układ łańcucha zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach ph kwasica, zasadowica zmiana aktywności enzymów organizmu

43 Inhibicja Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory) Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych! Inhibicja odwracalna: kompetycyjna niekompetycyjna akompetycyjna Inhibicja nieodwracalna - cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale (np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności danej cząsteczki enzymu na stałe

44 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

45 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia związanie substratów (i vice versa) maksymalna szybkość reakcji, Vmax, nie zmienia się V max może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów, które przezwycięży inhibicję wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość Km 1/v 0 1/V max -1/K M

46 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) inhibitor jest strukturalnie bardzo podobny do prawdziwego substratu dla danego enzymu przykład: metotreksat inhibitor kompetycyjny reduktazy dihydrofolianu (dihydrofolian tetrahydrofolian) kwas foliowy(koenzym) metotreksat

47 Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) Glikol etylenowy składnik płynów niezamarzających do chłodnic silników Etanol inhibitor kompetycyjny dla dehydrogenazy alkoholowej stos. w zatruciach glikolem HO O e t h yl e n e g l y c o l H A l c o h o l dehydrogenase HO O g l y c o a l d e h y d e O HO OH g l y c o l i c a c i d O OH O glyoxylic acid HO O o x a l i c a c i d

48 Inhibicja niekompetycyjna

49 Inhibicja niekompetycyjna inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca aktywnego brak konkurencji z substratem kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są enzymatycznie nieaktywne wiązanie inhibitora całkowicie niezależne od substratu wartość Km ł pozostaje stała, wartość Vmax maleje 1/v 0-1/K M 1/V max 1/[S]

50

51 Inhibitory nieodwracalne - trucizny enzymów inhibitor wiąże się kowalencyjnie (a więc nieodwracalnie) do łańcuchów białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu EI jest bardzo powolna trwałe unieczynnienie enzymu chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie nie daje się odwrócić ani przez usuniecie inhibitora ze środowiska, ani przez zwiększenie ilości substratu penicylina - inhibitor enzymów zawierających serynę aspiryna inhibitor cyklooksygenazy zw. fosforoorganiczne (insektycydy) inhibitory acetylocholinoesterazy

52 Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej Wpływ na ilość: regulacja syntezy enzymów (indukcja lub represja genu kodującego białko enzymu) i degradacji (półokres rozpadu białka t ½ ) Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne: kompartmentacja Wpływ na aktywność katalityczną: przez sprzężenie zwrotne (hamowanie) przez efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne - regulatorowe) przez zmianę struktury enzymu odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, defosforylacja), aktywacja proteolityczna (proenzymy = zymogeny) kompleksy (układy) wieloenzymowe

53 Kompartmentacja fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych w obrębie komórki: biosyteza kw. tłuszczowych cytozol utlenianie kw. tłuszczowych mitochodrium w organizmie: niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych typach komórek kompartmentacja chemiczna przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie rozdzielenie molekuł przeznaczonych do szlaku katabolicznego i anabolicznego

54 Regulacja przez sprzężenie zwrotne produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał zwykle dotyczy szlaków syntezy (etapu imitującego) hamowany jest początkowy etap syntezy inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego Hamowanie przez sprzężenie zwrotne produkt powoduje represję genu kodującego dany enzym nie wpływa na jego aktywność katalityczną, ale na jego ilość przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA

55 Efektory allosteryczne zwykle nie podobne od substratów czy koenzymów danego enzymu łączą się z miejscem allosterycznym ( inna przestrzeń ) powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (podjednostki z którą się łączą) zmiana powinowactwa innych podjednostek do substratu enzymy allosteryczne nie dają się opisać kinetyką M-M krzywa sigmoidalna

56 Regulacja allosteryczna E n z y my a l l o s t e r y c z n e e n z y my, k t ó r y c h a k t y w n o ś ć m o ż e by ć r e g u l owa n a na d r o d z e o d d z i a ł y wa ń a l l o s t e r y c z ny c h, czyli o d d z i a ł y wa ń m i ę d z y o d d a l o ny m i o d s i e b i e m i e j s c a m i w e n z y m i e c e n t r u m k a t a l i t y c z ny m i m i e j s c e m a l l o s t e r y c z ny m. Aktywność miejsca katalitycznego może być regulowana przez efektory allosteryczne w miejscu allosterycznym aktywatory lub inhibitory allosteryczne. E fe k t o r y a l l o s t e r y c z n e są drobnocząsteczkowymi metabolitami, które łącząc się z białkiem enzymatycznym w miejscu allosterycznym modyfikują jego strukturę IV-rzędową lub III-rzędową - indukują w enzymie zmiany konformacyjne w centrum katalitycznym. Efektem jest zmiana powinowactwa enzymu dosubstratu Efektory allosteryczne: Dodatnie aktywatory allosteryczne szybkość maksymalna reakcji zostaje osiągnięta przy niższym stężeniu substratu Ujemne inhibitory allosteryczne Negatywna kontrola allosteryczna Pozytywna kontrola allosteryczna

57 Efektory allosteryczne inhibitory aktywatory

58 Efektory allosteryczne + ATP Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwszą reakcje na szlaku syntezy pirymidyn złożona z 5 podjednostek 3 regulatorowe i 2 katalityczne no effector - CTP

59 Efektor a l l o s t e r y c z n y interpretacj a + lub - Aktywność enzymu Allosteryczna aktywacja Allosteryczna inhibicja + lub - Kataliza szybsza lub wolniejsza Stężenie substratu Podjednostka regulatorowa Kataliza szybsza lub wolniejsza W p r z y p a d k u e n z y m ó w alloster y c z nyc h, wykres zależności Szybkości reakcji V odstężenia substratu [S] często przybiera kszta łt sigmoidalny, w odróżnieniu odkształtu hiperbolicznego, przewidzianego równaniem Michaelisa Menten.

60 R e g u l a c j a prze z w i ą z a n i e /odłączanie p o d j e d n o s t e k r e g u l a c y j ny c h Aktywność niektórych enzymów zależy od białek regulacyjnych. Mogą mieć one strukturę IV-rzędową i składać się z podjednostek katalitycznych i regulacyjnych. Podjednostki regulacyjne hamują aktywność podjednostek katalitycznych. Całość jest nieaktywna. Aktywacja enzymu polega na dysocjacji kompleksu i uwolnieniu podjednostek katalitycznych spod hamującego wpływu podjednostek regulacyjnych. Przykład: kinaza białkowa kalmodulina białko regulatorowe powszechnie występujące w organizmach eukariotycznych, wiąże cztery jony wapnia. Kompleks kalmoduliny z wapniem wiąże się z enzymem i zmniejsza lub zwiększa aktywność enzymu.

61 Modyfikacje kowalencyjne odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu przebiega po zakończeniu translacji modyfikacje kowalencyjne - dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych: fosforylacja glikozylacja ADP-rybozylacja metylacja zmiana właściwości funkcjonalnych białek (zmiana konfrmacji, ładunku) zmiana sprawności katalitycznej, powinowactwa do substratu, wewnątrzkomórkowej lokalizacji, regulacji przez ligandy allosteryczne w momencie fizjologicznego zapotrzebowania

62 Ograniczona proteoliza - proenzymy proenzym (zymogen) nieaktywny prekursor enzymu do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy powstanie centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha polipeptydowego zmiana konformacji) przykłady: pepsynogen ( pepsyna) trypsynogen ( trypsyna) proinsulina ( insulina) prokolagen ( kolagen) czynniki krzepnięcia i fibrynolizy możliwe szybkie zaktywowanie w momencie zapotrzebowania ochrona tkanek produkujące proenzymy przed samostrawieniem

63 Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe Enzym wielofuncyjny jeden łańcuch polipeptydowy posiadający co najmniej dwie różne aktywności katalityczne i dwa miejsca aktywne Przykład: syntaza kw. tłuszczowych 3 domeny (1- transferaza acetylowa, syntaza ß- ketoacylowa, transferaza malonylowa; 2- reduktaza ketoacylowa, dehydrataza, reduktaza enoilowa, 3- tioesteraza) Kompleks wieloenzymowy układ kilku białek eznymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połaczone niekowalencyjnie Przykład: synataza kw. tłuszczowych u E.coli (α6β6) Intemediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji (reagujące cząsteczki nie ulegają rozcieńczeniu w cytozolu, nie muszą odnajdywać się w przypadkowym procesie dyfuzji) Oddzielenie intermediatów od innych substancji ochrona przed reakcjami współzaodniczącymi

64 Izoenzymy, izoformy, makroenzymy Enzymy w diagnostyce laboratoryjnej

65 Znaczenie enzymów w diagnostyce klinicznej zmiany aktywności enzymów we krwi odbicie zmian zachodzących w narządach rodzaj uszkodzenia determinuje rodzaj enzymów uwalnianych z uszkodzonej tkanki - konstelacja zmian enzymatycznych uszkodzenie narządu = uszkodzenie struktur komórkowych lub zmiana przepuszczalności błon komórkowych ucieczka enzymów spadek syntezy enzymów zwiększenie zmniejszenie ich ilości w płynach ustrojowych i wydalinach

66 Izoenzymy enzymy katalizujące tę samą reakcję, które występują w różnych tkankach/typach komórek, mogą różnić się strukturą cząsteczki produkty różnych, choć blisko spokrewnionych genów różne właściwości fizyczne i chemiczne: punkt izoelektryczny ruchliwość elektroforetyczna powinowactwo do substratów wrażliwość na czyniki regulatorowe wykrywanie: bad. aktywności po zablokowani za pomocą mab niepożądanych izoenzymów dotyczy dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fostataz i proteaz. znacznie zwiększa swoistość tkankowa niż ta, którą można przypisać ich aktywności enzymatycznej!

67 Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) enzym cytoplazmatyczny, wyst. we wszystkich komórkach organizmu katalizuje odwracalną reakcję mleczan pirogronian największa aktywność w tkankach o wysokim metabolizmie energetycznym mózg, mięsień sercowy, erytrocyty, leukocyty, płytki krwi (hemoliza akt.) nerki, wątroba, płuca występuje 5 izoenzymów wykrywanie: elekroforeza (różna ruchliwość elektroforetyczna poszczególnych izoenzymów) dla LDH1 reakcja z β-hydroksymaślanem (swoisty substrat) kiedyś w diagnostyce zawału mm sercowego

68 Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) cząsteczka zbudowana z 4 podjednostek tetramer dwie różne podjednostki syntetyzowane w organizmie: M typu mięśniowego, (ang. muscle); gen LDHA (chr. 11) H typu sercowego (ang. heart); gen LDHB (chr. 12) geny LDHA i LDHB podlegają różnej ekspresji w różnych tkankach w różnych tkankach różne ilości różnych podjednostek enzymu wytwarzane rożne połączenia podjednostek 5 izoenzymów: LDH1 HHHH LDH2 HHHM LDH3 HHMM LDH4 HMMM LDH5 MMMM

69 Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) w surowicy ludzkiej obecne wszystkie izoenzymy LDH ich proporcje zmieniają się w różnych stanach chorobowych, w zależności od tego, które izoenzymy są produkowane przez uszkodzony narząd u osób zdrowych - LDH2>LDH1 zawał serca, uszkodzenie mięśnie szkieletowych LDH1>LDH2 anemia hemolityczna - LDH1, LDH2, LDH2>LDH1 dystrofia mięśniowa, nowotwory, ch. wątroby - LDH4, LDH5 (10-20x) zawał serca z niewydolnością w krążeniu wrotnym LDH1, LDH2, LDH5 nasieniak najądrza LDH1 izolowany

70 Izoformy enzymów produkty tego samego genu katalizują tę samą reakcję chemiczną inna budowa cząsteczki enzymu na skutek: zmian posttranslacyjnych struktury białka fosfataza alkaliczna (ALP) izoformy kostna i wątrobowa degradacji proteolitycznej po ich wydzieleniu do pł.śródtkankowego i osocza kinaza kreatynowa CKMM1, CK-MM2, CK-MM3, CK-MB1, C-MB2 wykrywanie: elektroforeza, oznaczenia immunochemiczne z użyciem przeciwciał moloklonalnych

71 Fosfataza zasadowa (ALP) hydrolaza odszczepia monofosforany od reszt organicznych w środowisku silnie zasadowym (ph 10) białko zewnętrznej błony plazmatycznej lub w kompleksach z innymi białkami błonowymi funkcja: transport jonów fosforanowych przez błony uczestniczy w interakcji między osteoblastami a macierzą nieorganiczną transport IgG z osocza matki do płodu (?) występują izoenzymy, izoformy i frakcje hemoliza, tłusty posiłek, menstruacja, doustne estogeny podwyższenie akt. ALP

72 Fosfataza zasadowa (ALP) 1. Izoenzym tkankowoniespecyficzny wyst. praktycznie w każdej tkance cztery izoformy (glikozylacja): kostna, wątrobowa i nerkowa izoforma kostna uwalniana przez aktywne osteoblasty dominuje u dzieci w okresie wzrostu wzrost akt. w chorobach kości (osteomalacja, krzywica, osteoporoza) wzrasta w okresie rekonwalescencji, podczas zrastania kości, po zabiegach operacyjnych Obecnie oznacza się masę izoformy tech. immunoenzymatycznymi

73 Fosfataza zasadowa (ALP) izoforma wątrobowa produkowana przez hepatocyty wzrost akt. w chorobach wątroby i cholestazie w cholestazie i przerzutowych guzach wątroby pojawać się mogą frakcje (nawet, gdy całkowita ALP w normie) f. żółciowa wielonzymatyczny kompleks błonowy f. makromolekularna kompleks e. z lipoproteiną X izoforma nerkowa nie wyst. u osób zdrowych w chorobach nerek (bez znaczenia diagnostycznego)

74 Fosfataza zasadowa (ALP) 1. Izoenzym tkankowo niespecyficzny 2.Izoenzym jelitowy gr. krwi O i B produkowana przez enterocyty wzrost w chorobach wątroby: przewlekłe zap. wątroby, marskość (osłabione usuwanie przez wątrobę) 3.Izoenzym komórek zarodkowych nie obecny w osoczu osób zdrowych ektopowo w nowotworach zarodkowych, przysadki i grasicy 4.Izoenzym łożyskowy fizjologicznie u ciężarnych, od II trymestru, zanika wkrótce po porodzie ektopowo w nowotworach płuc, jajnika, macicy, jąder, ukł. żołądkowo-jelitowego

75 Makroenzymy enzymy występujące we krwi, które tworzą kompleksy o dużej masie cząsteczkowej poprzez: polimeryzację łączenie z immunoglobulinami (IgG, rzadziej IgA) lub lipidami prawdopodobnie związane z powstawaniem autoprzeciwciał, niekiedy u chorych z nowotworami u 1,5 2,5% populacji ogólnej, najczęściej u osób starszych dotyczy przede wszystkim amylazy i aminotransferazy asparaginowej (AspAT) najczęściej zjawisko niezwiązane z chorobą kiedy? - izolowana, kilkakrotnie stwierdzana podwyższona aktywność enzymu bez objawów klinicznych lub z symptomami nietypowymi dla danej enzymopatii duża masa cząsteczkowa osłabiona filtracja kłębkowa wydłużony czas półtrwania podwyższona aktywność wykrywanie: strącanie makromolekuł glikolem etylenowym, HPLC, elektroforeza

76 Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji EC 1 oksydoreduktazy EC 2 transferazy EC 3 hydrolazy EC 4 liazy EC 5 izomerazy EC 6 ligazy (syntetazy) ze względu na sposób, w jaki dostają się ne do przestrzeni pozakomórkowej (podział kliniczny) e. wskaźnikowe e. sekrecyjne e. ekskrecyjne

77 Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe) enzymy wewnątrzkomórkowe uwalniane w wyniku uszkodzenia bł. komórkowej lub rozpadu komórki wzrost aktywności we krwi zawartość enzymu wskaźnikowego w pł. pozakomórkowym jest zależna od: jego ilości w uszkodzonej tkance liczby uszkodzonych komórek i stopnia ich uszkodzenia rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego enzymów przykłady: kinaza kreatynowa (CK) dehydrogenza mleczanowa (LDH) aminotrasferazy asparaginianowa (AspAT) i alaninowa (AlAT)

78 Aminotransferaza alaninowa (AlAT, ALT) występowanie: cytoplazma komórek wątroby komórki ścian cewek nerkowych mięśnie poprzecznie prążkowane, w tym serce w niewielkich ilościach wszystkie tkanki (hemoliza zawyża wynik) fizjologicznie niewielkie ilości w osoczu, pł. mózgowo-rdzeniowym, moczu wzrost akt. w osoczu gł. przyczyny wątrobowe uszkodzenie wątroby (stany zapalne, gł. zakażenia HBV, HCV, poalkoholowe, toksyczne uszkodzenia) uszkodzenie mięśni szkieletowych (urazy, niedokrwienie, mioliza) zawał serca często oznacza się wraz z akt. aminotransferazy asparaginianowej (AspAT) wskaźnik de Ritisa

79 Enzymy sekrecyjne fizjologicznie wydzielane do pł. pozakomórkowego, np. do krwi tam pełnia swą funkcję - funkcjonalne enzymy osocza niewydolność narządu produkującego i wydzielającego powoduje obniżenie ich aktywności (synteza na rybosomach wątroby) przykłady: czynniki krzepniecia i fbrynolizy esteraza cholinowa ceruloplazmina lipaza lipoproteinowa

80 Cholinoesteraza, pseudocholinoesteraza (ChE) katalizuje hydrolizę estrów choliny do choliny i kw. tłuszczowego acetylocholinesteraza (AchE) ukł. nerwowego i erytrocytów, rozkłada acetylocholinę pseudocholinoeateraza (ChE) produkowana przez wątrobę, wydzielana do krwi, funkcja nieznana znaczenie diagnostyczne: diagnostyka/monitorowanie osób narażonych na kontakt ze związkami fosforoorganicznymi (niodwracalne inhibitory AchE) aktywności miąższowe choroby wątroby niedożywienie wstrząs pourazowy terapia promieniami X, lekami cytotoksycznymi

81 Enzymy ekskrecyjne produkowane przez gruczoły i wydzielane do wydzielin ustrojowych: śliny światła przewodu pokarmowego (żółć, sok trzustkowy) płynu nasiennego ich pojawienie się w osoczu świadczy o zaburzeniu procesu wydzielania (zastój wydzieliny) i/lub niszczeniu struktury gruczołu przykłady: amylaza lipaza fosfataza zasadowa γ-glutamylotranspeptydaza

82 α-amylaza i lipaza enzymy ekskrecyjne lipaza trzustka, zoładek, jelita α-amylaza trzustka, ślinianki, wątroba, mięśnie, neutrofile akt. amylazy ostre zapalenie trzustki (max. po 12 h., potem - wyczerpanie zdolności wydzielniczej trzustki kolka nerkowa kolka zółciowa perforacja wrzodu niedrożnośc jelit zapalenie ślinianek (izoenzym śliniankowy) akt. Lipazy proces zapalny trustki (wyższa swoistośc narżdowa niż amylaza) hemoliza zaniża akt. lipazy

83 α-amylaza i lipaza MAKROAMYLAZEMIA stan nie związany z chorobą akt. we krwi bez w moczu polimeryzowanie cz. enzymu lub łączenie się z immunoglobulinami duże kompleksy białkowe nie przechodzą do moczu Triacyloglicerole (hipertriglicerydemia) hamują aktywność amylazy Amylaza w moczu odzwierciedla akt. we krwi monitorowanie przebiegu ostrego zapalenia trzustki

84 Oznaczanie enzymów Pośrednio - aktywność badanie przemiany chemicznej substratu katalizowanej przez dany enzym pomiar ilości enzymu w układzie na podstawie pomiaru szybkości reakcji w określonych warunkach szybkość reakcji jest proporcjonalna do ilości enzymu szybkość reakcji wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu szybkość rekcji maleje z czasem (hamujący wpływ produktu, stopniowa inaktywacja enzymu) mierzona jest prędkość początkowa v o, dostateczni duże stężenie substratu dla wysycenia enzymu prędkość początkową przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu umożliwiającej zachodzenie reakcji odwrotnej Bezpośrednio - masa oznaczanie ilości białka enzymatycznego met. immunochemicznymi

85 Badanie aktywności enzymatycznej w płynach ustrojowych surowica/osocze mocz płyn mózgowo-rdzeniowy aktywność w surowicy/osoczu <<< aktywność w tkankach (także w kwinkach) surowica z hemolizą wyniki zawyżone białka osocza, składniki surowicy (w tym leki) mogą być aktywatorami/inhibitorami reakcji enzymatycznych antykoagulanty (heparyna, fluorek) pływ +/- na akt. enzymów izoenzymy różne powinowactwo do substratu i maks. aktywność przy różnych stężeniach substratu niekiedy krótki czas, w którym obserwuje się zmiany akt. enzymatycznej związane ze stanem chorobowym

86 Katal (kat) Jednostki aktywności enzymatycznej ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy układ SI; [mol/s] duża jednostka używane mikro-, nano-, pikokatal Jednostka enzymu, jednostka enzymatyczna, międzynarodowa jednostka standardowa (U, ang. unit) ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu (lub odpowienich grup chemicznych) w czasie 1 minuty w warunkach standardowych (30 C, optymalne ph, maksymalne wysycenie enzymu substratem) 1U = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala

87 Jednostki aktywności enzymatycznej Aktywność właściwa liczba jednostek enzymu na 1 mg białka określa czystość preparatu enzymatycznego Aktywność molekularna liczba cząsteczek substratu (lub odpowiednich grup chemicznych) przekształconych przez 1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty (przy optymalnym stężeniu substratu) Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze kat(lub U)/1 ml roztworu

88 Test optyczny Warburga wykorzystuje różnice w absorpcji światła o dł. fali 340 nm między formą utlenioną a zredukowaną NAD i NADP utenianie/redukcja NAD + /NADH proporcjonalny spadek/wzrost absorbancji przy 340 nm Pierścienie purynowy i pirmidynowy Pierścień pirydynowy w amidzie kw. nikotynowego w NADH układ dihydropirydy

89 Test optyczny Warburga ilościowa analiza dehydrogenaz zależnych od NAD + i NADP + lub innych enzymów o reakcjach sprzężonych z dehydrogenazami aktywność heksokinazy proporcjonalna do wzrostu absorbancji przy 340 nm