OKSYDOREDUKTAZY WPROWADZENIE

Transkrypt

1 Ćwiczenie 6 OKSYDOREDUKTAZY Część doświadczalna obejmuje: wykrywanie aktywności katalazy, peroksydazy, oksydazy polifenolowej i oksydazy cytochromowej w ekstrakcie z bulwy ziemniaka WPROWADZENIE Oksydoreduktazy katalizują przeniesienie równoważników redukcyjnych między dwoma układami redoks. Termin równoważnik redukcyjny określa kombinację elektronów i protonów, które pojawiają się w procesach redoks (Ryc. 1). Ryc. 1. Równoważniki redukcyjne w biologicznych układach redoks Procesy oksydacyjno-redukcyjne w komórkach zachodzą we wszystkich przedziałach subkomórkowych (cytozolu, wewnętrznej błonie mitochondriów, w błonie tylakoidów, błonach siateczki śródplazmatycznej, błonie jądrowej, a także w przestrzeni międzykomórkowej). Procesy te są katalizowane przez enzymy współdziałające z rozpuszczalnymi (koenzymy) lub związanymi z białkiem enzymatycznym (grupy prostetyczne) kofaktorami. Najważniejszymi kofaktorami oksydoreduktaz są: NAD +, NADP +, FMN, FAD, ubichinon (koenzym Q), plastochinon, plastocyjanina, lipoamid, hem oraz kilka rodzajów centrów żelazowo-siarkowych. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD + ) oraz jego forma ufosforylowana fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP + ), koenzymy przenoszące jony wodorkowe (2e - i 1H + ) (Ryc. 2A), wykorzystywane są przez ponad 200 oksydoreduktaz. W utlenionej formie tych koenzymów w pierścieniu aromatycznym amidu kwasu nikotynowego dodatnie ładunki są zdelokalizowane (Ryc. 2B). Jedna z dwóch przechodzących w siebie struktur ma w położeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom węgla. W to 1

2 miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane formy NADH-H + i NADPH-H +. Poprawny zapis zredukowanych koenzymów pokazuje, że przyjęciu jonu wodorkowego przez koenzym towarzyszy uwolnienie protonu. A B Ryc. 2. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. A ogólny wzór NADH.H +, B - przyłączenie jonu wodorkowego do węgla w pierścieniu kwasu nikotynowego (Koolman i Röhm, 2005) Powstawanie nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ) w komórce W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu różnych reakcjach. Jednym z jego źródeł jest reakcja katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową enzym usuwający aniony ponadtlenkowe zgodnie z reakcją: O O H + H 2 O 2 + O 2 Anion ponadtlenkowy (O - 2) jest produktem ubocznym wielu reakcji redoks powstającym w wyniku częściowej redukcji tlenu cząsteczkowego (przyjęcie jednego elektronu). W komórkach roślin aniony ponadtlenkowe powstają np. jako produkty uboczne przepływu elektronów przez centra żelazowo-siarkowe (reakcja Mehlera) w obrębie fotosystemu I, czy w reakcji katalizowanej przez oksydazę NADPH.H + zlokalizowaną w błonie komórkowej, gdzie aktywne formy tlenu służą do obrony przed patogennymi drobnoustrojami. 2

3 Ważnymi enzymami wytwarzającymi H 2 O 2 są także oksydazy flawoproteinowe, do których należą m. in. oksydazy L-aminokwasowe i D-aminokwasowe. Utlenianie aminokwasu przebiega zgodnie z reakcją: aminokwas + O 2 + H 2 O ketokwas + H 2 O 2 + NH 3 W komórkach zwierząt H 2 O 2 powstaje także w peroksysomach w reakcji utleniania kwasów tłuszczowych o dłuższym niż 18C łańcuchu węglowodorowym. W tym wypadku szlak β-oksydacji, podobnie jak utlenianie kwasów tłuszczowych u roślin, rozpoczyna się od reakcji katalizowanej przez oksydazę acylo-coa zgodnie z równaniem: acylo-coa + O 2 2 enoilo-coa + H 2 O 2 Bogatym źródłem H 2 O 2 w komórkach roślin jest szlak przemian określany jako fotooddychanie. Enzym rubisco (karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanu) może do rybulozo-1,5-bisfosforanu przyłączać CO 2 lub O 2. W pierwszym wypadku powstają 2 cząsteczki kwasu 3-fosfoglicerynowego, natomiast w reakcji, w której zamiast CO 2 uczestniczy O 2 powstaje 1 cząsteczka kwasu fosfoglicerynowego i 1 cząsteczka kwasu 2-fosfoglikolanowego. Powstający w chloroplastach 2-fosfoglikolan jest najpierw defosforylowany, a następnie powstający glikolan w peroksysomach zostaje utleniony przez oksydazę glikolanową do glioksalanu zgodnie z reakcją: glikolan + O 2 glioksalan + H 2 O 2 Nadtlenek wodoru jest związkiem szkodliwym, głównie ze względu na możliwość powstawania w obecności Fe 2+ rodników hydroksylowych. OH, a także tlenu singletowego 1 O 2. Enzymatyczne usuwanie H 2 O 2 Enzymami funkcjonującymi w usuwaniu H 2 O 2 są katalaza i peroksydaza. Katalaza, enzym zawierający hem, dysproporcjonuje dwie cząsteczki H 2 O 2 do H 2 O i O 2 zgodnie z równaniem: 2 H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Katalazy mogą także wykazywać aktywność peroksydacyjną, w której H 2 O 2 jest wykorzystywany do utleniania alkoholi, aldehydów, fenoli czy azotynów. Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru równocześnie utleniając (odwodorowując) różne substraty. Reakcję katalizowaną przez peroksydazy można zapisać: SH 2 + H 2 O 2 S + 2H 2 O SH 2 i S to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym. Grupą prostetyczną peroksydaz roślinnych jest żelazoprotoporfiryna (hemina), natomiast enzymy zwierzęce zawie- 3

4 rają inny typ heminy. Ważną funkcję ochronną w komórkach zwierząt i roślin spełnia peroksydaza glutationowa współdziałająca z glutationem w usuwaniu nadtlenku wodoru i szkodliwych nadtlenków organicznych. W centrum aktywnym tego enzymu występuje analog cysteiny (selenocysteina), w którym siarka została zastąpiona selenem. Oksydazy fenolowe przenoszą elektrony i protony z orto- lub para-dwufenoli na tlen. Oksydaza o-dwufenolwa poza utlenianiem o-dwufenolu katalizuje także reakcję hydroksylacja. Oksydaza cytochromowa (EC ) końcowe ogniwo łańcucha transportu elektronów zlokalizowanego w wewnętrznej błonie mitochondriów Łańcuch oddechowy katalizuje transport elektronów z NADH-H + lub zredukowanego ubichinonu na tlen cząsteczkowy. Ubichinon może być redukowany enzymatycznie w reakcjach, w których np. utleniany jest bursztynian bądź flawoproteina (ETF) redukowana przez dehydrogenazę acylo-coa, dehydrogenazę 3-fosfoglicerynianu lub dehydrogenazy utleniające cholinę czy dihydroorotan. Większa część energii towarzysząca reakcjom redoks wykorzystywana jest do formowania w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej gradientu protonowego, który z kolei napędza syntezę ATP katalizowaną przez syntazę ATP. Łańcuch oddechowy obejmuje 3 białkowe kompleksy (kompleks I, III i IV) oraz dwie cząsteczki przenośnikowe: ubichinon (Q) i cytochrom c (Ryc. 3). Poza tym, z błoną wewnętrzną związana jest dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks II) oraz inne dehydrogenazy przekazujące elektrony na ubichinon (Q) (nie pokazano na Ryc. 3). Ryc. 3. Transport elektronów w łańcuchu oddechowym utworzonym przez trzy kompleksy białkowe i dwa ruchome nośniki (ubichinon i cytochrom c) przenoszące elektrony z utlenianego substratu na tlen. Transportowi elektronów wzdłuż łańcucha oddechowego towarzyszy wektorowe pompowanie protonów z matriks do przestrzeni międzybłonowej (Alberts i wsp. 1999) 4

5 Oksydaza cytochromowa przejmuje elektrony z małego białka, cytochromu c, zawierającego żelazo w układzie hemowym i przekazuje je na tlen cząsteczkowy (Ryc. 3). Do redukcji cząsteczki tlenu (O 2 ) do dwóch cząsteczek wody potrzebne są 4 elektrony (4 cząsteczki zredukowanego cytochromu c). Przeniesieniu dwóch elektronów przez związane z enzymem kofaktory (dwa jony miedzi: CuA i CuB, jony żelaza w dwóch układach hemowych: hem a i hem a 3 ) towarzyszy wypompowanie z matriks do przestrzeni międzybłonowej 4 H +. WYKONANIE Odczynniki: 1. 3% roztwór H 2 O 2 2. Roztwór KCN, UWAGA! KCN jest silną trucizną! 3. Roztwór benzydyny w kwasie octowym 4. Odczynnik NADI (przygotować bezpośrednio przed użyciem, mieszając p-fenylenodwuaminę z α-naftolem w stosunku 1 : 1 (1 + 1 ) 5. 0,1M bufor fosforanowy o ph 7,4 6. Bufor fosforanowy o ph 7,4 7. Roztwór pirokatechiny Materiał: Ekstrakt z ziemniaka obrany i umyty ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do woreczka z gazy i zanurzyć w zlewce zawierającej około 200 wody, a następnie lekko wycisnąć zawartość. Roztwór łagodnie wymieszać. Po opadnięciu skrobi na dno zlewki, płyn ostrożnie zlać znad osadu. Uzyskujemy w ten sposób wodny ekstrakt enzymu. Część nadsączu (około 50 ) przelać do zlewki i zagotować, a następnie zdenaturowany termicznie ekstrakt ostudzić wkładając zlewkę do zimnej wody. Zasada wykrywania katalazy: Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H 2 O 2 katalizowanej przez katalazę, wydzielając się z roztworu powoduje jego silne pienienie: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 5

6 Postępowanie: Do trzech probówek napipetować po około 2 : a ekstraktu z ziemniaka, b zagotowanego ekstraktu z ziemniaka oraz c ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu NaCN. Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się pęcherzyki tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji. Zasada wykrywania peroksydazy: Benzydyna w obecności H 2 O 2 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego, zgodnie z poniższym równaniem reakcji: Postępowanie: Do 5 probówek odmierzyć podaną w Tabeli1 objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H 2 O 2, KCN i H 2 O. Do probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min. w temperaturze pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki. Tabela 1. Wykrywanie aktywności peroksydazy Próba Wyciąg Woda Benzydyna KCN H 2 O 2 nr 1 2,5 0 0,1 0 0,1 2 2,5 0, ,1 3 2,5 0 0,1 2 krople 0,1 4 2,5 0 0,1 0 0,1 5 2,5 0,1 0,

7 Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej (EC ) Zasada wykrywania oksydazy polifenolowej: Oksydaza polifenolowa jest metaloproteiną, zawierającą miedź i przenosi wodór bezpośrednio na tlen cząsteczkowy. Substratami w tej reakcji są fenole, które utleniają się do chinonów. W ćwiczeniu wykorzystano jako substrat pirokatechinę. Jest ona utleniana przez enzym do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne zabarwienie: Postępowanie: Do 5 probówek odmierzyć podane w Tabeli 2 objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny i 4% roztworu NaCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zagotowany. Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze pokojowej. W celu lepszego dostępu tlenu, próby 1-4 co pewien czas wstrząsnąć. Po 20 min zanotować wyniki reakcji. Tabela 2. Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej Próba Nr Wyciąg Woda Bufor ph 7,4 KCN ,1 Pirokat , krople 0, , ,1 Wykrywanie aktywności oksydazy cytochromowej Zasada wykrywania oksydazy cytochromowej: Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym można wykazać w reakcji, w której wykorzystywany jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: α-naftol i p-fenylenodwuamina zmieszane w stosunku 1:1. W wyniku nieenzymatycznej redukcji zawar- 7

8 tego w mitochondriach cytochromu c przez p-fenylenodwuaminę powstaje p-fenylenodwuimina, która w obecności α-naftolu przechodzi w barwny, niebieski kompleks: Postępowanie: Do 4 probówek odmierzyć podane w Tabeli 3 objętości poszczególnych roztworów. Do probówki nr 4 dodać zagotowany wyciąg. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Obserwować powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w tabeli. Tabela 3. Wykrywanie oksydazy cytochromowej Próba Nr Wyciąg Ml Woda Bufor ph 7,4 KCN NADI , kropla 0, , ,1 Zagadnienia do przygotowania: koenzymy oksydoreduktaz reakcje produkujące w komórce nadtlenek wodoru enzymy usuwające H 2 O 2 (różnica między katalazą a peroksydazą) łańcuch transportu elektronów w mitochondriach (przenośniki elektronów związane z kompleksem I, III i IV; generowanie transbłonowego gradientu protonowego) Literatura: Biochemia JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005 Ćwiczenia z biochemii pod redakcją L Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2005 Biochemia. Ilustrowany przewodnik J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa