Reaktywne formy tlenu i ich powstawanie w komórkach

Transkrypt

1 Reaktywne formy tlenu i ich powstawanie w komórkach Wykład Biochemia stresu oksydacyjnego Dr hab. Agnieszka Łoboda Literatura: Grzegorz Bartosz Druga twarz tlenu Barry Halliwell & John Gutteridge Free radicals in biology and medicine

2 Dawno, dawno temu.. Miliony lat temu 3500 Promieniowanie słoneczne bombarduje powierzchnię Ziemi Początki życia anaerobowego >2500 Cyjanobakterie uwalniają O 2 : 2H 2 O O 2 + 4H + + 4e Poziom tlenu atmosferycznego osiąga 1% Początek ewolucji eukariontów 500 Poziom tlenu atmosferycznego osiąga 10% Warstwa ozonowa pochłania wystarczająco dużo UV, aby umożliwić wyjście organizmów na ląd 65 Pojawienie się naczelnych 5 Poziom tlenu atmosferycznego osiąga 21% Pojawienie się człowieka Zysk przejścia do życia tlenowego: efektywna produkcja energii uszkodzenia oksydacyjne nieunikniona konsekwencja życia w warunkach tlenowych

3 Tlen trypletowy podstawowa (o najniższej energii) forma tlenu cząsteczkowego (O 2 ), zawierająca dwa niesparowane elektrony Forma trypletowa: O:O lub O-O oznaczana jest jako: 3 O 2 Tlen singletowy forma tlenu cząsteczkowego (O 2 ) na najniższym stanie wzbudzonym. Forma singletowa O::O lub O=O oznaczana symbolicznie jako 1 O 2

4 Tlen i jego pochodne σ*2p π*2p π2p σ2p σ*2s σ2s σ*1s σ1s O 2-2 delta sigma tlen trypletowy anionorodnik ponadtlenkowy jon nadtlenkowy rodnik hydroksylowy tlen singletowy tlen singletowy

5 Reaktywność tlenu

6 Tlen trypletowy i tlen singletowy Stan singletowy nie jest w przypadku O 2 stanem podstawowym, lecz wzbudzonym, o wyższej energii, natomiast stanem podstawowym jest stan trypletowy. Jest to układ odwrotny niż dla większości cząsteczek chemicznych. Dlaczego tlen trypletowy jest mało reaktywny? Aby tlen trypletowy utlenił inną cząsteczkę i uległ dwuelektronowej redukcji, musi przyjąć od niej dwa elektrony. Zgodnie z prawami mechaniki kwantowej, oba te elektrony muszą mieć równoległe spiny, antyrównoległe w stosunku do spinów niesparowanych elektronów w cząsteczce tlenu => utleniana cząsteczka też musi być w stanie trypletowym (o co nie jest łatwo) lub musi nastąpić odwrócenie spinu jednego z elektronów takiej cząsteczki (co wymaga energii). Dlatego tlen trypletowy jest mało reaktywny.

7 Tlen trypletowy i tlen singletowy tlen singletowy Σ Tlen singletowy powstaje w wyniku wzbudzenia cząsteczki tlenu trypletowego. 157 kj/mol tlen singletowy Δ 94 kj/mol tlen trypletowy Dostarczona energia musi wystarczyć na przegrupowania elektronów w cząsteczce (wypadkowy spin = 0). Wzbudzenie cząsteczki do stanu singletowego może nastąpić po zaabsorbowaniu kwantu promieniowania nadfioletowego (lub promieniowania o wyższej energii) lub w wyniku niektórych reakcji chemicznych. TLEN SINGLETOWY MOŻE ŁATWO REAGOWAĆ Z INNYMI CZĄSTECZKAMI SINGLETOWYMI

8 Redukcja tlenu Całkowita redukcja tlenu to przyłączenie do cząsteczki tlenu 4 elektronów i 4 protonów, w wyniku czego powstają 2 cząsteczki wody: O 2 + 4e - + 4H + 2H 2 O Reakcja jest egzoergiczna, a powstająca woda jest nieaktywna względem składników komórki. Powyższa reakcja nie zachodzi jednak łatwo (kłopot ze znalezieniem partnerów do reakcji dwuelektronowych). Dlatego tlen trypletowy reaguje ze związkami jednoelektronowo, a produktem jest anionorodnik ponadtlenkowy. O 2 + e - O 2 -

9 Redukcja tlenu - Tlen tripletowy może reagować z wieloma związkami jednoelektronowo. Powstaje wówczas:. * anionorodnik ponadtlenkowy 0 2, wolny rodnik będący anionem. O 2 + e - O 2 superoxide radical anion - Anionorodnik ponadtlenkowy w roztworze wodnym może też przyłączyć proton, tworząc obojętny: * rodnik ponadtlenkowy (rodnik wodoronadtlenkowy). hydroperoxyl radical - Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego daje (po dołączeniu do produktu reakcji protonów): * nadtlenek wodoru H 2 O 2, mniej reaktywny od większości rodników, ale bardziej reaktywny niż tlen cząsteczkowy. Jest produktem dwuelektronowej redukcji tlenu. hydrogen peroxide - Przyłączenie trzech elektronów do cząsteczki tlenu daje: * rodnik hydroksylowy, jedną z najbardziej reaktywnych cząstek w układach biologicznych hydroxyl radical

10 Redukcja tlenu - Tlen tripletowy może reagować z wieloma związkami jednoelektronowo. Powstaje wówczas: * anionorodnik ponadtlenkowy, wolny rodnik będący anionem - Anionorodnik ponadtlenkowy w roztworze wodnym może też przyłączyć proton, tworząc obojętny: * rodnik ponadtlenkowy (rodnik wodoronadtlenkowy).. O 2 + H + HO 2 hydroperoxyl radical - Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego daje (po dołączeniu do produktu reakcji protonów): * nadtlenek wodoru H 2 O 2, mniej reaktywny od większości rodników, ale bardziej reaktywny niż tlen cząsteczkowy. Jest produktem dwuelektronowej redukcji tlenu. - Przyłączenie trzech elektronów do cząsteczki tlenu daje: * rodnik hydroksylowy, jedną z najbardziej reaktywnych cząstek w układach biologicznych

11 Redukcja tlenu - Tlen tripletowy może reagować z wieloma związkami jednoelektronowo. Powstaje wówczas: * anionorodnik ponadtlenkowy, wolny rodnik będący anionem - Anionorodnik ponadtlenkowy w roztworze wodnym może też przyłączyć proton, tworząc obojętny: * rodnik ponadtlenkowy (rodnik wodoronadtlenkowy) - Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego daje (po dołączeniu do produktu reakcji protonów): * nadtlenek wodoru H 2 O 2, mniej reaktywny od większości rodników, ale bardziej reaktywny niż tlen cząsteczkowy. Jest produktem dwuelektronowej redukcji tlenu.. O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + e - + 2H + hydrogen peroxide - Przyłączenie trzech elektronów do cząsteczki tlenu daje: * rodnik hydroksylowy, jedną z najbardziej reaktywnych cząstek w układach biologicznych

12 Redukcja tlenu - Tlen tripletowy może reagować z wieloma związkami jednoelektronowo. Powstaje wówczas:. * anionorodnik ponadtlenkowy, wolny rodnik będący anionem 0 2 superoxide radical anion - Anionorodnik ponadtlenkowy w roztworze wodnym może też przyłączyć proton, tworząc obojętny: * rodnik ponadtlenkowy (rodnik wodoronadtlenkowy). hydroperoxyl radical - Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego daje (po dołączeniu do produktu reakcji protonów): * nadtlenek wodoru H 2 O 2, mniej reaktywny od większości rodników, ale bardziej reaktywny niż tlen cząsteczkow. Jest produktem dwuelektronowej redukcji tlenu. hydrogen peroxide - Przyłączenie trzech elektronów do cząsteczki tlenu daje: * rodnik hydroksylowy, jedną z najbardziej reaktywnych cząstek w układach biologicznych. H 2 O 2 + e - + H + H 2 O + OH hydroxyl radical

13 Redukcja tlenu 2e - 2H + Reaktywne formy tlenu są produktami kolejnych stopni redukcji cząsteczki tlenu. Produkty redukcji i wzbudzenia tlenu są bardziej reaktywne niż tlen trypletowy. Reaktywne formy tlenu lepsza nazwa, niż wolne rodniki tlenowe, gdyż tlen singletowy (bardzo reaktywny) i nadtlenek wodoru (reaktywny) nie są rodnikami. Reaktywne formy tlenu reagują ze składnikami organizmów żywych.

14 Reakcje wolnorodnikowe - Są z reguły szybkie, ale mało specyficzne (zwykle im szybsze tym mniej specyficzne) - Reakcje wolnorodnikowe obejmują: * Reakcje inicjacji * Reakcje propagacji * Reakcje terminacji Reakcje inicjacji Reakcje, w których z cząsteczek nie będących wolnymi rodnikami powstają wolne rodniki. Zachodzą w wyniku: * Homolizy * Radiolizy * Fotolizy * Sonolizy * Jednoelektronowych reakcji redoks

15 Reakcje wolnorodnikowe Homoliza - Rozpad cząsteczek zawierających słabe wiązania, w którego wyniku z dwóch elektronów zaangażowanych w utworzenie wiązania powstające fragmenty otrzymują po jednym... A B A + B - W temperaturze fizjologicznej tylko związki o bardzo słabych wiązaniach mogą ulegać homolizie. - Homoliza inicjatorów nie ma znaczenia jako fizjologiczne źródło wolnych rodników.

16 Radioliza Reakcje wolnorodnikowe - Rozpad cząsteczek pod wpływem promieniowania jonizującego. Fotoliza - Rozpad cząsteczek związku chemicznego wywołany absorpcją fotonu. Sonoliza - Rozpad cząsteczek związku chemicznego pod wpływem ultradźwięków. Jednoelektronowe reakcje redoks - Zredukowane formy wielu związków niskocząsteczkowych (RH 2 ) reagują z tlenem ulegając jednoelektronowemu utlenieniu, co prowadzi do powstania anionorodnika ponadtlenkowego i wolnego rodnika: RH 2 + O 2 RH + H + + O 2 - Reakcje tego typu są główną drogą powstawania anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach.

17 Anionorodnik ponadtlenkowy - Powstaje w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu.. O 2 + e - O 2 - Jego aktywność jako czynnika utleniającego jest niewielka, częściej działa jako czynnik redukujący. - Może utleniać: * centra siarkowo-żelazowe enzymów (np. akonitazy) ich utlenienie prowadzi do utlenienia żelaza i inaktywacji enzymów; * NO powstaje nadlenoazotyn - W roztworach wodnych znajduje się w równowadze ze swą uprotonowaną formą, rodnikiem wodoronadtlenkowym.. O 2 + H + HO 2 - W ph = 7,4 ok. 0,2% anionorodników ponadtlenkowych jest w formie uprotonowanej, łatwiej przenikającej przez błony niż obdarzony ładunkiem anionorodnik ponadtlenkowy.

18 Anionorodnik ponadtlenkowy - Stężenie bazalne anionorodnika ponadtlenkowego w typowej komórce to ok mol/l, w chloroplastach ok mol/l. - W obecności żelaza reaguje z nadtlenkiem wodoru dając rodnik hydroksylowy (reakcja Habera-Weissa) Lub: (reakcja Fentona) - Anionorodnik ponadtlenkowy reaguje z większą liczbą substancji i zwykle znacznie szybciej niż tlen. Może też reagować sam ze sobą. - Ulega spontanicznej dysmutacji do nadtlenku wodoru i tlenu; reakcja ta jest katalizowana przez dysmutazy ponadtlenkowe (SOD)

19 Dysmutaza ponadtlenkowa Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD z ang. superoxide dismutase) enzym, który katalizuje dysmutację anionorodnika ponadtlenkowego wyizolowana w 1939 roku z erytrocytów wołu, a największa jego zawartość jest w komórkach wątroby to pierwszy odkryty enzym, którego substratem jest wolny rodnik jest metaloproteiną - składa się z części białkowej (apoenzym) oraz katalitycznej grupy prostetycznej w formie atomu metalu pełniącej funkcję centrum aktywnego. Znane są trzy typy (izoformy) dysmutaz ponadtlenkowych: cytoplazmatyczna SOD-1 zawierająca miedź (Cu) i cynk (Zn) CuZnSOD-1 mitochondrialna SOD-2 zawierająca mangan (Mn) MnSOD-2 wydzielana na zewnątrz komórki SOD-3, inaczej EC SOD zawierająca miedź (Cu) i cynk (Zn) CuZnSOD-3,

20 Nadtlenek wodoru - Powstaje w wyniku spontanicznej lub katalizowanej przez SOD dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego. - Nie jest silny utleniaczem, ale może bezpośrednio utleniać: * grupy siarkowo-wodorowe (SH) enzymów, prowadząc do zahamowania aktywności np. fosfataz. - W stanie czystym jest niebieskawym, lepkim płynem, wrzącym w temperaturze +150 C, absorbującym światło w zakresie UV. - Jest stosunkowo stabilny, ale w obecności metali przejściowych może ulegać dysproporcjonowaniu: H 2 O 2 + H 2 O 2 H 2 O + O 2 Perhydrol (od 1907 roku zastrzeżona prawem patentowym nazwa handlowa), czyli 30% wodny roztwór, oraz 3 5% roztwory do użytku domowego o nazwie woda utleniona.

21 Nadtlenek wodoru - Jest źródłem rodnika hydroksylowego powstającego w obecności żelaza w reakcji Fentona lub w obecności miedzi Cu + : Fe 2+ + H 2 O 2 'OH + OH - + Fe 3+ Cu + + H 2 O 2 'OH + OH - + Cu 2+ - Reaguje z jonem chlorkowym Cl - tworząc kwas podchlorawy w reakcji katalizowanej przez mieloperoksydazę (zwłaszcza w fagocytach): - Jest rozkładany do wody przez: * katalazy * peroksydazy glutationowe * peroksyredoksyny

22 Nadtlenek wodoru - Stężenie H 2 O 2 w typowej komórce to ok mol/l. - Skrajnie wysokie stężenia obserwuje się w zdrowych soczewkach oka ludzi - ok mmol/l. - Sporo H 2 O 2 jest też w miodzie (efekt antyseptyczny, w miodzie występuje oksydaza glukozy prowadząca do powstania nadtlenku wodoru)

23 Rodnik hydroksylowy - Powstaje w wyniku: * jednoelektronowej redukcji nadtlenku wodoru (najważniejsze źródło rodnika hydroksylowego w komórkach) H 2 O 2 + e - + H +. H 2 O + OH * homolizy wody pod wpływem promieniowania jonizującego * homolizy nadtlenku wodoru pod wpływem światła UV * reakcji kwasu podchlorawego z anionorodnikiem ponadtlenkowym (reakcja istotna zwłaszcza w fagocytach)

24 Rodnik hydroksylowy - Jest jednym z najbardziej reaktywnych utleniaczy i może reagować praktycznie ze wszystkimi substancjami w komórce. - Reakcje są bardzo szybkie i mało specyficzne - OH utleni prawdopodobnie pierwszą cząsteczkę organiczną (lub jon metalu), którą napotka

25 Rodnik hydroksylowy - Powstaje w wyniku: * rozkładu kwasu nadtlenoazotawego (powstającego w wyniku protonowania nadtlenoazotynu) * reakcji wzbudzonego dwutlenku azotu z wodą: - Ze względu na reaktywność jest bardzo nietrwały. - Stężenia rodnika hydroksylowego w komórkach są tak małe, że nie można go wykryć metodami bezpośrednimi

26 Tlen singletowy - Tlen singletowy jest wzbudzoną formą tlenu cząsteczkowego, nie jest wolnym rodnikiem. - Powstaje w wyniku: * reakcji fotouczulania, w której endogenny fotouczulacz (PS) (np. porfiryna) jest wzbudzany (PS*) pod wpływem światła. Energia wzbudzenia przekazywana jest następnie na tlen, przekształcając go w tlen singletowy. Fotouczulacz powraca natomiast do stanu podstawowego. * wybuchu tlenowego w fagocytach, kiedy w trakcie reakcji zapalnej powstaje kwas podchlorawy, reagujący z nadtlenkiem wodoru. * peroksydacji lipidów reakcji dwóch rodników peroksylowych (z jednoczesnym tworzeniem alkoholu (LOH) i ketonu (LO):

27 Tlen singletowy - Tlen singletowy oddziałuje z innymi cząsteczkami poprzez: * przekazanie energii wzbudzenia (przechodzi przy tym w stan tripletowy; jest to tzw. gaszenie tlenu singletowego) * wejście w rekcję chemiczną - Tlen singletowy jest silnym utleniaczem. Reaguje z: * lipidami (prowadząc do peroksydacji) * białkami (prowadząc do utleniania łańcuchów bocznych, inaktywacji, złego fałdowania, nasilonej degradacji w proteasomach) * kwasami nukleinowymi (prowadząc do modyfikacji zasad i pęknięć nici) - Najbardziej podatne na uszkodzenie przez tlen singletowy są: * reszty histydyny * reszty metioniny * reszty tryptofanu * reszty tyrozyny * reszty cysteiny * guanina - Tlen singletowy reaguje z antyoksydantami. Inaktywowany jest przez karotenoidy (z marchewek) i likopen (z pomidorów).

28 Reaktywne Formy Azotu RFA tlenek azotu -. NO nadtlenoazotyn - ONOO - dwutlenek azotu -. NO 2

29 Tlenek azotu - Tlenek azotu jest wolnym rodnikiem (ma niesparowany elektron). - Odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu krążenia, układu nerwowego i i układu odpornościowego: * jest wazodylatorem * jest neurotransmiterem * jest czynnikiem toksycznym dla patogenów - Produkowany jest: * przez syntazy tlenku azotu (NOS) * z azotanów i azotynów - Tlenek azotu reaguje z białkami, zwłaszcza zawierającymi: * centra żelazowo-siarkowe * jony metali przejściowych * grupy hemowe - Tlenek azotu może uwalniać żelazo z ferrytyny

30 Tlenek azotu

31 Tlenek azotu

32 Tlenek azotu

33 Tlenek azotu - Tlenek azotu jest nietrwały w obecności tlenu. W natlenionych roztworach wodnych jego okres półtrwania wynosi kilka sekund, a tlenek azotu reaguje z tlenem dając dwutlenek azotu: 2NO + O 2 2NO 2 - Dwutlenek azotu reaguje ze związkami nienasyconymi tworząc wolne rodniki, w których niesparowany elektron jest zlokalizowany na atomie węgla. - W roztworach wodnych o ph obojętnym dwutlenek azotu ulega dysproporcjonowaniu, tworząc anion azotynowy i azotanowy: NO + H 2 O NO NO H + - Tlenek azotu bardzo szybko reaguje z anionorodnikiem ponadtlenkowym tworząc nadtlenoazotyn: NO + O 2- ONOO -

34 Nadtlenoazotyn - Nadtlenoazotyn jest silnym utleniaczem, reagującym przede wszystkim z: * grupami SH i centrami żelazowo-siarkowymi białek * resztami nienasyconych kwasów tłuszczowych lipidów * anionem HCO 3-, tworząc rodnik wodorowęglanowy H + + ONOO - + HCO 3 - HCO 3 + NO 2 + OH - - Rodnik węglanowy jest silnym utleniaczem i ze względu na dużą zawartość CO 2 w komórkach może odgrywać ważną rolę w uszkodzeniach wywoływanych przez nadtlenoazotyn. - Może być źródłem rodnika hydroksylowego - Nadtlenoazotyn jest nietrwały (okres półtrwania to ok. 1 s), ale może dyfundować na znaczne odległości w komórce. - Charakterystyczna reakcja nadtlenoazotynu to nitrowanie reszt tyrozynowych w białkach.

35 Nadtlenoazotyn - Nadtlenoazotyn hamuje działanie między innymi: * oksydazy cytochromowej (i innych składników łańcucha oddechowego) * akonitazy (kluczowego enzymu cyklu Krebsa) * innych białek zawierających centra żelazowo-siarkowe. - Najważniejszym antyoksydantem usuwającym nadtlenoazotyn jest glutation i reakcje katalizowane przez peroksyredoksyny i peroksydazy glutationowe.

36 Nadtlenoazotyn - Jest mało selektywnym oksydantem utleniającym wszystkie typy makrocząsteczek i antyoksydanty niskocząsteczkowe. Nrf2

37 Rodniki peroksylowe i alkoksylowe - Powstają w wyniku peroksydacji lipidów przez rodnik hydroksylowy. Rodnik odbiera atom wodoru z cząsteczki lipidu (LH), prowadząc do utworzenia rodnika alkilowego (L ). W obecności tlenu rodnik ten przekształca się w rodnik peroksylowy (LOO ). - Rodnik peroksylowy może odbierać atom wodoru z sąsiednich cząsteczek lipidów, prowadząc do propagacji peroksydacji. Jednocześnie rodnik peroksylowy jest redukowany do nadtlenku lipidu. Rozkład nadtlenku lipidu w obecności jonów metali prowadzi do powstawania rodnika alkoksylowego (LO ) lub peroksylowego (LOO ).

38 Rodniki peroksylowe i alkoksylowe - Są silnymi utleniaczami. Wywołują: * peroksydację lipidów * utleniania białek (prowadzące do dysfunkcji białek strukturalnych i inaktywacji enzymów) * utlenianie DNA (prowadzące do modyfikacji zasad azotowych) - Reagując ze sobą rodniki peroksylowe dostarczają tlen singletowy. - Inaktywacja rodników peroksylowych i alkoksylowych zachodzi poprzez reakcje z przeciwutleniaczami: * witaminą E * witaminą C * glutationem * bilirubiną

39 Kwas podchlorawy - Kwas podchlorawy powstaje w reakcji nadtlenku wodoru i chlorku, w reakcji katalizowanej przez mieloperoksydazę w fagocytach. - MPO wykorzystuje również nadtlenek wodoru do utleniania bromku i tiocyjanianu w wyniku czego powstają silne utleniacze: * kwas podbromawy HOBr * kwas podtiocyjanawy HOSCN - Kwas podchlorawy jest silnym utleniaczem, reagującym z białkami, lipidami, kwasami nukleinowymi i węglowodanami. - Produkcja kwasu podchlorawego w czasie wybuchu tlenowego w fagocytach stanowi istotny mechanizm obrony przed patogenami. W warunkach chronicznego zapalenia (np. w miażdżycy) może prowadzić do uszkodzenia tkanek organizmu. - Inaktywacja kwasu podchlorawego zachodzi w wyniku reakcji z glutationem lub tauryną (obecną zwłaszcza w neutrofilach).

40 Tauryna i stres oksydacyjny Chloramina tauryny (TauCl) - to główna haloamina produkowana in vivo przez aktywowane neutrofile w wyniku reakcji tauryny z kwasem podchlorawym (HOCl) Tauryna działa więc ochronnie na tkanki wykazując właściwości detoksykacyjne dzięki temu, że wychwytuje kwas podchlorawy (HOCl) i kwas podbromawy (HOBr) dając w wyniku mniej toksyczne haloaminy, chloraminę tauryny (TauCl) i bromaminę tauryny (TauBr)

41 Etapy powstawanie reaktywnych form tlenu Reaktywne formy tlenu są pośrednimi produktami kolejnych etapów redukcji tlenu

42 Źródła ROS w komórce - Reakcje enzymatyczne Enzymy generujące H 2 O 2 : np. * oksydaza aldehydowa * oksydaza D-aminokwasowa * okydaza a-hydroksykwasowa * oksydaza ksantynowa * oksydaza acetylokoenzymu A * oksydaza glutarylokoenzymu A * oksydaza galaktozowa * oksydaza glikolanowa. Enzymy generujące O 2 np. * oksydaza ksantynowa * oksydaza aldehydowa * oksydaza diaminowa * reduktaza cytochromu P450 * reduktaza glutationowa * oksydaza galaktozowa * mieloperoksydaza * oksydoreduktaza NADPH * hydroperoksydaza prostaglandynowa * tyrozynaza * syntaza tlenku azotu * reduktaza cytochromu b5 * lipooksygenaza * dioksygenaza tryptofanowa

43 Wybuch oddechowy fagocytów Komórki fagocytujące organizmu (granulocyty, monocyty, makrofagi) reagują na intruza kilkudziesięciokrotnym wzrostem zużycia tlenu (wybuch oddechowy wybuch tlenowy, ang. respiratory burst) Fagocyty wytwarzają i uwalniają na zewnątrz ogromne ilości anionorodnika ponadtlenkowego, który częściowo ulega dysmutacji do nadtlenku wodoru. Kwas podchlorawy powstaje w reakcji nadtlenku wodoru i chlorku, w reakcji katalizowanej przez mieloperoksydazę w fagocytach Wiele gatunków bakterii zabijanych jest bezpośrednio przez układ mieloperoksydaza - nadtlenek wodoru-kwas podchlorawy. Celem dla tego systemu są przede wszystkim bakteryjne białka żelazowo-siarkowe, błonowe białka transportujące, systemy generujące ATP oraz miejsca startu replikacji DNA. - Kwas podchlorawy jest silnym utleniaczem, reagującym z białkami, lipidami, kwasami nukleinowymi i węglowodanami. - Produkcja kwasu podchlorawego w czasie wybuchu tlenowego w fagocytach stanowi istotny mechanizm obrony przed patogenami. W warunkach chronicznego zapalenia (np. w miażdżycy) może prowadzić do uszkodzenia tkanek organizmu. - Inaktywacja kwasu podchlorawego zachodzi w wyniku reakcji z glutationem lub tauryną (obecną zwłaszcza w neutrofilach).

44 Wybuch tlenowy fagocytów Oksydaza NADPH produkuje anionorodnik ponadtlenkowy przez przeniesienie elektronów z cytoplazmatycznego NADPH na tlen znajdujący się po wewnętrznej stronie fagolizosomu Anionorodnik ponadtlenkowy spontanicznie łączy się z innymi molekułami produkując wolne rodniki, a także reaguje z tlenkiem azotu tworząc nadtlenoazotyn (ONOO - ) zmniejszając pulę wolnego bioreaktywnego NO. Sugeruje się, że aktywacja oksydazy NADPH jest zależna od kinazy białkowej C (PKC). Większość nadtlenku wodoru wyprodukowanego przez neutrofile konsumowana jest przez mieloperoksydazę. Enzym ten jest głównym składnikiem azurofilnych ziarnostości cytoplazmatycznych neutrofili oraz jest to klasyczna peroksydaza hemowa wykorzystująca nadtlenek wodoru do tworzenia kwasu podchlorawego, najbardziej zabójczego czynnika antybakteryjnego produkowanego przez neutrofile. Brak oksydazy NADPH w organizmie ludzkim uniemożliwia tworzenie reaktywnych form tlenu oraz jest przyczyną przewlekłej choroby ziarniniakowej

45 Oksydazy NADPH - NOX. O 2 NOX2 - gp91phox Do oksydazy przyłączona jest podjednostka p22phox, a do funkcjonowania całego kompleksu niezbędne są jeszcze cytoplazmatyczne białka p47phox, p40phox, które odpowiadają za organizację kompleksu oraz białko p67phox, do którego dołączają się białka z rodziny Rac, wiążące GTP Phox phagocyte oxidase Nox Przybylska & Mosieniak, Postępy Biochemii 60 (1) 2014

46 Oksydazy NADPH - NOX Przybylska & Mosieniak, Postępy Biochemii 60 (1) 2014

47 NOX i starzenie wolnorodnikowa teoria starzenia Harman D (1956) Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol rola mitochondriów jako głównego źródła RFT w komórce ulegającej starzeniu prace prowadzone w ostatnich latach dowodzą, że również oksydazy NADPH mogą odgrywać istotną rolę w tym procesie Fibroblasty z nadprodukcją NOX4 mają cechy komórek starych - zmieniają swoją morfologię oraz zaprzestają podziałów. Zwiększona ilość RFT będąca wynikiem aktywności NOX4, zaburza równowagę redoks w komórkach i prowadzi także do uszkodzeń DNA, które są przyczyną starzenia W komórkach z obniżonym poziomem białka NOX4 obserwowano niższą ilość utlenionej formy guaniny (8-oxo-dG), znacznika oksydacyjnych uszkodzeń DNA, a także obniżony poziom ufosforylowanej formy histonu H2AX (γh2ax), znacznika podwójnych pęknięć DNA, niż w komórkach z normalnym poziomem tej oksydazy W komórkach mięśni gładkich naczyń, izolowanych z aorty starych szczurów poziom NOX4 jest wyższy niż w komórkach pochodzących od młodych zwierząt

48 Źródła ROS w komórce - Cykle redoks i utleniania ksenobiotyków (trucizny do zwalczania szkodników) - Utlenianie białek oddechowych (hemoglobiny, mioglobiny) hem-fe 2+ + O 2 hem-fe 3+ + O 2- > reduktaza methemoglobinowa w erytrocytach > w obecności donorów elektronów może zachodzić dwuelektronowa redukcja tlenu związanego z hemoglobiną, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru - Samoutlenianie związków niskocząsteczkowych (np. związków tiolowych)

49 Źródła ROS w komórce - Łańcuch oddechowy w mitochondriach (najważniejsze komórkowe źródło RFT; około 1-4% tlenu ulega redukcji jednoelektronowej)

50 Mitochondrium - Zewnętrzna błona mitochondrialna: * stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~1:1 * duża zawartość poryn - Cząsteczki o masie do ~6 kda mogą swobodnie dyfundować do przestrzeni międzybłonowej. Większe muszą mieć sekwencję sygnałową na N-końcu, pozwalającą na wiązanie do translokaz. - Przestrzeń międzykomórkowa: * stężenie małych cząsteczek podobne jak w cytozolu * skład białek jest odmienny niż w cytozolu - Wewnętrzna błona mitochondrialna: * stosunek wagowy białek do fosfolipidów: ~3:1 * duża zawartość kardiolipiny (zmniejszenie przepuszczalności błony) * brak poryn * transport wszystkich substancji wymaga transporterów * obecność białek odpowiedzialnych za fosforylację oksydacyjną, syntezę i hydrolizę ATP, transport białek regulatorowych. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

51 Mitochondrialny łańcuch transportu elektronów Kompleks I dehydrogenaza NADH Kompleks II - dehydrogenaza bursztynianowa Kompleks III kompleks cytochromów bc1 Kompleks IV oksydaza cytochromowa Jony Fe-S centra żelazo-siarkowe Koenzymy mononukleotyd flawinowy (FMN), dinukleotyd flawinowy (FAD), ubichinon (Q) centra oksydoredukcyjne

52 Mitochondrialny łańcuch transportu elektronów Kompleks I dehydrogenaza NADH Kompleks II - dehydrogenaza bursztynianowa Kompleks III kompleks cytochromów bc1 Kompleks IV oksydaza cytochromowa

53 Oddychanie komórkowe Glikoliza w cytozolu Cykl Krebsa w mitochondrium

54 Mitochondrium Reakcje w matriks mitochondrialnej - Pirogronian produkowany podczas glikolizy jest transportowany do matriks, dekarboksylowany oksydacyjnie i przyłączany do Co-A (powstaje CO 2, acetylo-coa i NADH). - Grupa acetylowa przyłączana jest do szczawiooctanu (C4), tworząc cytrynian (C6). Izomer cytrynianu jest następnie dekarboksylowany oksydacyjnie do a-ketoglutaranu (C5) i bursztynianu (C4), z którego regenerowany jest szczawiooctan. Przy tym 3 jony wodorowe (6 e - ) są przenoszone na NAD +, a para atomów wodoru (2 e - ) na FAD. - W cyklu Krebsa powstają 2 cząsteczki CO 2, czemu towarzyszy produkcja 3 cząsteczek NADH i 1 cząsteczki FADH 2. Powstaje też 1 wysokoenergetyczne wiązanie fosforanowe, a 9 kolejnych ATP może powstawać podczas utleniania NADH i FADH 2 za pośrednictwem łańcucha oddechowego. FADH 2 - dinukleotyd flawinoadeninowy NADH - dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy L. Stryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

55 Oddychanie komórkowe

56 Łańcuch oddechowy - Przyjmuje elektrony z NADH i przenosi je przez liczne kofaktory do pierwszego ruchliwego nośnika elektronów, utlenionego koenzymu Q. Uzyskana w ten sposób energia jest wykorzystywana do przeniesienia czterech protonów z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej. - Koenzym Q otrzymuje elektrony także z kompleksu II (dehydrogenazy bursztynianowej) oraz dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerolu. - Zredukowany koenzym Q przekazuje elektrony na kompleks III, skąd trafiają na cytochrom c, ulokowany w przestrzeni międzybłonowej. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana jest do przeniesienia czterech protonów do przestrzeni międzybłonowej. - Z cytochromu c elektrony przenoszone są na kompleks IV (oksydazy cytochromu c), gdzie cząsteczkowy tlen redukowany jest do wody. Uzyskana w ten sposób energia wykorzystywana jest do przeniesienia dwóch protonów do przestrzeni międzybłonowej.

57 Łańcuch oddechowy - Przepływ elektronów z NADH lub FADH 2 do O 2 poprzez łańcuch oddechowy powoduje wypompowywanie protonów z macierzy. Wytworzona siła protonomotoryczna obejmuje dwie składowe: gradient ph (gradient protonowy) i transbłonowy potencjał elektryczny. W łańcuchu oddechowym powstaje anionorodnik ponadtlenkowy w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu. Generowany jest w kompleksie I i III. L. Stryer. Biochemia; Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009.

58 Łańcuch oddechowy UH 2 + O 2 UH + H + + O 2- UH + O 2 U + H + + O 2- Przepływ elektronów nie jest szczelny mogą one przeciekać i reagować z cząsteczką tlenu jednoelektronowo tworząc anionorodnik ponadtlenkowy. Kompleksy I i III uczestniczą w przemianach oksydoredukcyjnych ubichinonu, w których występuje niestabilna forma semichinonu, odpowiedzialna za przeciek elektronów i prowadząca do wytworzenia RFT. Nature 414,

59 Produkcja O 2 - w kompleksie I łańcucha oddechowego Kompleks I (oksydoreduktaza NADH) - Jest transbłonowym kompleksem enzymatycznym, który: * utlenia NADH, przekazując elektrony na ubichinon * jest połączony z pompą protonową, a jego aktywność przyczynia się do powstania gradientu protonów * stanowi jedno z dwóch głównych miejsc pobierania równoważników redukcyjnych (drugie miejsce to kompleks II) * jest głównym źródłem ROS w komórce w warunkach fizjologicznych Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

60

61 Koenzym Q (ubichinon) - Ubichinon jest kluczowym transporterem elektronów w łańcuchu oddechowym i ważnym antyoksydantem - Niedobór lub dysfunkcja ubichinonu prowadzi do różnorodnych efektów klinicznych: * encefalomiopatii * niemowlęcej choroby wieloukładowej * ataksji móżdżkowej * izolowanej miopatii mitochondrialnej * zespołu nerczycowego

62 Dehydrogenaza bursztynianowa - Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH) jest zarówno częścią łańcucha oddechowego jak i cyklu Krebsa, w którym utlenia bursztynian do fumaranu - SDH zbudowana jest z czterech jednostek, wszystkie kodowane są przez geny jądrowe - Jest jedynym kompleksem łańcucha oddechowego, który nie pompuje protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną - Zaburzenia funkcji SDH są bardzo rzadkie (2-4% zaburzeń łańcucha oddechowego) i prowadzą do: * zespołu Leigha (choroba neurodegeneracyjna rozwijająca się u niemowląt) * rodzinnej paragangliomy (przyzwojaka, nowotworu układu współczulnego lub przywspółczulnego) Rutter et al. Mitochondrion 2010.

63 Produkcja O 2 - w kompleksie III łańcucha oddechowego Kompleks III (oksydoreduktaza koenzym Q:cytochrom c) - Budowa kompleksu III: * zewnętrzne miejsce chinonowe (Q o ) * wewnętrzne miejsce chinonowe (Q i ) * cytochrom b566 (cyt b566) * cytochrom b562 (cyt 562) * białko Rieske (z kompleksami Fe-S) * cytochrom c1 * cytochrom c - Działanie kompleksu III: * Ubichinon jest redukowany do QH 2 po stronie wewnętrznej (Q i ) i migruje do strony zewnętrznej (Q o ) uwalniając 2H + i przenosząc 1 e - na cyt c1 za pośrednictwem białka Rieske. Powstaje przy tym QH' i Q. * Drugi e - redukuje cytochrom b, dzięki czemu elektrony są przenoszone na wewnętrzną stronę błony, gdzie redukują chinon do QH 2. * cyt c i cyt c1 przyjmują tylko pojedynczy e-, dlatego pełna redukcja Q wymaga utlenienia dwóch cząsteczek QH 2 w dwóch kolejnych cyklach. Stove and Camara. Antioxid Redox Signal 2009

64 Mitochondria jako źródła ROS w komórce VDAC Voltage dependent anion channel IMAC Inner mitochondrial membrane anion channel

65 Mitochondria jako źródła ROS w komórce Kompleks I uwalnia anionorodnik ponadtlenkowy do matrix Kompleks III może uwalniać anionorodnik zarówno do matrix jak i do przestrzeni międzybłonowej W macierzy mitochondrialnej dawcą anionorodnika może też być dehydrogenaza alfa-ketoglutaranowa (αkgdh) Anionorodnik ponadtlenkowy może przemieszczać się do przestrzeni między błonowej poprzez kanał IMAC Anionorodnik ponadtlenkowy może generować rodnik wodoronadtlenkowy a także dysmutować w nadtlenek wodoru MnSOD jest zlokalizowana wewnątrz matriks a Cu/ZnSOD związana z błoną zewnętrzną mitochondrium H202 może też powstawać przy udziale monoaminooksydazy (MAO) H202 łatwo przenika przez błonę wewnętrzną a w obecności jonów metali ciężkich ulega reakcji Fentona dając wysoce reaktywne produkty Powstające rodniki reagując z białkami, mitochondrialnym DNA oraz inicjują proces peroksydacji lipidów Zmniejszanie ilosci anionorodnika ponadtlenkowego może nastąpić wyniku zmniejszenia jego produkcji przez kompleks III oraz na skutek aktywnego działania ATPazy oraz białka rozprzęgającego UCP (ang. uncoupling protein) Ważną rolę odgrywa też mitochondrialna peroksydaza glutationu (GPx), rozkładająca nadtlenek wodoru do wody Mimo częściowej neutralizacji wolnych rodników tlenowych w mitochondrium część z nich przenika do cytozolu wykorzystując kanał VDAC w zewnętrznej błonie mitochondrialnej

66 Białka rozprzęgające (UCP) UCP ang. Uncoupling Protein - mitochondrialne systemy rozpraszające energię Białka wewnętrznej błony mitochondrialnej Burzą protonowy gradient elektrochemiczny wytworzony przez łańcuch oddechowy Działanie UCP jest napędzane przez potencjał błonowy (ujemny wewnątrz mitochondrium) oraz kwaśne ph UCP są aktywowane przez wolne kwasy tłuszczowe (FFA free fatty acids) Upośledzenie działania białek UCP może wpływać na funkcjonowanie komórek i organów G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008

67 Białka rozprzęgające (UCP) - Białko UCP (UCP1) zostało po raz pierwszy opisane w brunatnych adipocytach, odpowiedzialnych za termogenezę bezdrżeniową. - UCP pozwala na powrót elektronów do matriks mitochondrialnej bez produkcji ATP (może więc zachodzić przy niedoborze ADP, zmniejszając ryzyko nadmiernej akumulacji H + w przestrzeni międzybłonowej). Towarzyszy temu produkcja ciepła. - UCP2 odgrywa rolę w regulacji wydzielania insuliny. - UCP3 ulega ekspresji głównie w mięśniach (szkieletowych, mięśniu sercowym) i ma działanie antyoksydacyjne. - UCP4 i UCP5 produkowane są głównie w układzie nerwowym i mają działanie antyoksydacyjne. G. Valacchi and P.A. Davis (eds). Oxidants in Biology. 2008

68 Białka rozprzęgające (UCP) - Homologi UCP znane są również u Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans - Ewolucyjnie najstarszą formą UCP jest prawdopodobnie UCP-4 (u ssaków obecny w mózgu) - Funkcje białek UCP: * regulacja termogenezy (UCP-1) * regulacja metabolizmu kwasów tłuszczowych (UCP-2 i UCP-3) * zmniejszenie produkcji ROS (UCP-1, UCP-2, UCP-3, UCP-4, UCP-5) * zahamowanie wydzielania insuliny (UCP-2) * regulacja apoptozy (UCP-4) - Myszy UCP KO mają normalny fenotyp, ale: * UCP-1 KO wrażliwe na zimno, podatne na tycie * UCP-2 KO zwiększona produkcja ROS * UCP-3 KO zwiększona produkcja ROS UCP mitochondrialne systemy rozpraszające energię Chan et al. Diabetes 2004.

69 Aktywacja UCP przez wolne kwasy tłuszczowe powoduje obniżenie poziomu produkcji H202, a zahamowanie aktywności UCP przez nukleotydy purynowe zwiększa produkcję RFT przez mitochondrialny łańcuch oddechowy UCP endogenny system antyoksydacyjny UCP rozpraszając protonowy gradient elektrochemiczny, obniża poziom redukcji nośników elektronów łańcucha oddechowego a tym samy obniża możliwość produkcji RFT na poziomie kompleksu I i III Antyoksydacyjna funkcja UCP odbywa się kosztem energii dostarczanej komórce przez mitochondria Wolkow & Isner. Aging Res Rev

70 Mitochondria jako źródła RNS w komórce PTP Permeability transition pore

71 Mitochondria jako źródła RNS w komórce Tlenek azotu powstaje pozamitochondrialnie przy udziale NOS i ulega dyfuzji do mitochondrium W matriks jest zlokalizowana syntaza NO (mtnos) i też produkuje NO Tlenek azotu hamuje odwracalnie oksydazę cytochromową (kompleks IV) konkurując o tlen, co powoduje zwiększenie ilości anionoorodnika ponadtlenkowego powstającego przez kompleksy łańcucha oddechowego NO hamuje również kompleks I i wchodząc w reakcję z tlenem indukuje pojawianie się pochodnych rodników azotowych: nadtlenozotynu, dwutlenku azotu i nadtlenku azotu Nadtlenoazotyn inicjuje peroksydację lipidów, hamuje kompleks I, II i IV łańcucha oddechowego, MnSOD i inne Działanie RFT i RFA wpływa również na homeostazę wapnia następuje wzmożony wypływ Ca2+ z matriks przez megakanał mitochondrialny PTP PTP jest także kanałem dla uciekającego cytochromu c

72 Uwalnianie cytochromu c - Cyt-c jest zakotwiczony w wewnętrznej błonie mitochondrialnej za pośrednictwem kardiolipiny (Ma 4 nasycone kwasy tłuszczowe zmniejsza przepuszczalność błon). - W obecności ROS kompleks cyt-c/kardiolipina działa jak peroksydaza kardiolipiny, tworząc wodoronadtlenki kardiolipiny, o zmniejszonym powinowactwie do cyt-c. Uwalnianie cyt-c jest jednym ważnych etapów wczesnej apoptozy. - Uwalnianie cyt-c jest procesem dwuetapowym: * utrata kontaktu z wewnętrzną błoną mitochondrialną (hamowane przez NO) * uwalnianie do cytozolu przez uszkodzoną zewnętrzną błonę mitochondrialną (nasilane przez Bid, Bax, lub Bak dezintegrujące błonę).

73 Uwalnianie cytochromu c

74 Podsumowanie Reaktywne formy tlenu są pośrednimi produktami kolejnych etapów redukcji tlenu. Łańcuch oddechowy w mitochondriach to najważniejsze komórkowe źródło RFT. W łańcuchu oddechowym powstaje anionorodnik ponadtlenkowy w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu. Generowany jest w kompleksie I i III.

75 Zapraszam na wykład 3 Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej