O C E N A. Poznań

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Anna Goździcka-Józefiak Instytut Biologii Eksperymentalnej Wydział Biologii Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Poznań O C E N A rozprawy doktorskiej Wysoce wydajne sekwencjonowanie DNA nowa platforma diagnostyczna do badań pacjentów na środki anestetyczne wykonanej przez mgr inż. OLIWIĘ ZAKERSKĄ-BANASZAK Przedstawiona do oceny praca doktorska została wykonana pod kierunkiem Pana prof. dra hab. Ryszarda Słomskiego i promotora pomocniczego Pani dr n. med. Marzeny Skrzypczak-Zielińskiej w Centrum NanoBioMedycznym Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu oraz Katedrze Biochemii i Biotechnologii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, przy współpracy z Instytutem Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu oraz Uniwersytetem Medycznym w Poznaniu. Metody szybkiego, wysoce przepustowego sekwencjonowania DNA nowej generacji znalazły szerokie zastosowanie nie tylko w diagnostyce chorób na poziomie genomu, transkryptomu, epigenomu, ale również na podstawie otrzymanych danych możliwe staje się opracowanie, jak też stosowanie lepiej dobranej terapii, czy opracowanie nowych markerów licznych chorób. Dane te stały się także podstawą rozwoju nowej dziedziny nauki, jaką jest farmakogenetyka oraz medycyna spersonalizowana, uwzględniająca efektywną dawkę leku od genotypu konkretnej osoby, tempa biotransformacji u danego chorego oraz indywidualnej reakcji na określony lek. W zaprezentowaną powyżej tematykę doskonale wpisuje się rozprawa doktorska Pani mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszk. Głównym celem przedłożonej do oceny pracy doktorskiej było zbadanie, jak określone czynniki genetyczne mogą wpływać na podatność badanych pacjentów populacji polskiej na takie środki anestetyczne, jak: sewofluran (1,1,1,3,3,3-heksa fluoro-2- (fluorometoksy)-propan) i propofol. Wybierając do analizy konkretne geny, Doktorantka kierowała się przede wszystkim funkcją, jaką pełnią kodowane przez nie białka w pobieraniu i transporcie leków do komórki, biotransformacji i eliminacji z ustroju człowieka. W doborze tym pomocne były dane literaturowe, wskazujące na wpływ określonych białek na zróżnicowaną reakcję pacjentów na leki anestezjologiczne. I tak, wiadomo na przykład, że różnice w osobniczej reakcji na

2 działanie anestetyków są zależne między innymi od polimorfizmu w genie CYP2E1 kodującym enzym należący do nadrodziny enzymów P450, monooksygenaz katalizujących liczne reakcje związane z metabolizmem i bioaktywacją substancji egzogennych i endogennych, w tym syntezę cholesterolu i steroidów. Enzym ten bierze udział w pierwszej fazie biotransformacji oraz bioaktywacji licznych toksyn, prokancerogenów, wziewnych anestetyków. Innymi genami są geny kodujące białka z rodziny S-transferaz glutationowych (GSTP1, GSTA1), które są zaangażowane w procesach detoksykacji licznych związków, jak również determinują indywidualną podatność na kancerogeny i toksyny. Ważnymi genami są geny kodujące białka wpływające na oporność na leki, jak na przykład ABCB1, czy geny albumin zaangażowane w transport leków w ustroju człowieka. Dane te mgr inż. Oliwia Zakerska-Banaszk szczegółowo przedstawia we wstępie pracy, który obejmuje 51 stron maszynopisu i oparty jest na najnowszych doniesieniach z literatury przedmiotu. Opisane są w nim również stosowane dotychczas techniki sekwencjonowania DNA, w tym najnowszej generacji. Wstęp ten stanowi doskonałe wprowadzenie do dalszych badań. Przystępując do realizacji badań, Doktorantka postanowiła zanalizować sekwencje kodujące i promotorowe licznych genów, w tym: - UGT1A9, CYP2B6, CYP2C9, ADRA1A, SULT1A1, NQO1, GARBA, ABCB1, ALB w DNA izolowanym z komórek krwi 89 pacjentów populacji polskiej poddanych znieczuleniu ogólnemu propofolem, - GSTA1, GSTP1, CYP2E1 w DNA 84 pacjentów polskich poddanych znieczuleniu ogólnemu sewofluranem, - określić wpływ sewofluranu na integralność hepatocytów osób poddanych znieczuleniu nim na podstawie wyników analizy poziomu enzymu alfa GST w surowicy pacjentów, - zanalizowaniu asocjacji pomiędzy zmianami w sekwencji genów GSTA1, GSTP1, CYP2E1 a poziomem enzymu alfa-gst u osób znieczulanych sewofluranem, - określeniu wpływu zmian w sekwencji w genach UGT1A9, CYP2B6, CYP2C9, SULT1A1, NQo1 (kodujących białka enzymatyczne), ABCB1 i ALB (kodujących białka transportujące) na profil farmakokinetyczny propofolu u osób poddanych znieczuleniu tym anestetykiem, - określenie wpływu zmian w sekwencji w genach ADRA1A i GABRA1 (kodujących białka receptorowe) na farmakodynamikę propofolu u pacjentów po znieczuleniu propofolem. Cel badań uważam za uzasadniony i bardzo interesujący. Wytyczone cele badawcze Doktorantka realizowała z wykorzystaniem najnowszych, wysoce wydajnych technik sekwencjonowania DNA : jak pirosekwencjonowanie czy sekwencjonowanie z użyciem platformy MiSeq Illumina. DNA do badań izolowała natomiast z leukocytów krwi obwodowej osób poddanych znieczuleniu sewofluranem lub propofolem. Fragmenty DNA wybranych genów były powielane w reakcji PCR. Warunki reakcji amplifikacji były starannie dobrane, a jakość powielonych fragmentów sprawdzano z zastosowaniem elektroforezy w żelu agarozowym, po czym poddano je sekwencjonowaniu. Przygotowanie amplikonów obejmujących sekwencje kodujące i promotorowe wybranych genów stanowiło bardzo ważny i pracochłonny etap badań Doktorantki. Do analizy znanych, krótkich sekwencji mgr inż. Oliwia Zakerska-Banaszak zastosowała pirosekwencjonowanie, natomiast fragmenty dłuższe sekwencjonowała metodą Sangera. Zastosowanie w badaniach przez Doktorantkę wysoce przepustowego sekwencjonowania z użyciem platformy Misq System Illumina pozwalało na równoczesne sekwencjonowanie całej puli genów. W badaniach Doktorantka stosowała także technikę ELISA do pomiaru stężenia enzymu alfa-gst w surowicy badanych pacjentów oraz wysoko sprawną chromatografię

3 cieczową HPLC do analizy pomiaru poziomu propofolu w osoczu krwi znieczulanych pacjentów. Wszystkie stosowane w badaniach techniki zostały przez mgr inż. Oliwię Zakerską- Banaszak bardzo starannie opisane w rozdziale Metody, obejmującym 27 stron maszynopisu, oraz opatrzone często komentarzem podającym zasadę działania stosowanej techniki. Jest to bardzo ważne i pomocne, zwłaszcza dla osób zamierzających daną metodę wykorzystać w swojej pracy. Stosowanie najnowszych technik badawczych, odpowiednio dobranych do wytyczonych celów badań, stanowi bardzo silną stronę ocenianej pracy, jak również innych publikacji powstających pod kierunkiem Pana prof. dra Ryszarda Słomskiego. Dobrze zaplanowane i konsekwentnie wykonywane przez mgr inż. Oliwię Zakerską- Banszak badania pozwoliły na pełne zrealizowanie wytyczonych na wstępie celów. Otrzymane wyniki zostały zaś starannie opracowane i przedstawione na odpowiednich rycinach( histogramach i pirogramach) oraz zebrane w tabelach. Bardzo to ułatwia analizę dużej ilości wyników Doktorantki otrzymanych w trakcie realizacji rozprawy. Podczas samego tylko sekwencjonowania nowej generacji, w grupie badanych mgr inż. Oliwia Zakerska Banaszak wykryła15471 zmian polimorficznych. Przy przyjęciu, że minimalne pokrycie odczytywanej sekwencji wynosi 30, łącznie wykryła 1513 różnych zmian polimorficznych, w różnych rejonach badanych genów. Z czego następnie wyselekcjonowała 37 zmian, które zostały zakwalifikowane do jednej z grup: zmian niesynonimicznych lub zmian odnotowanych w bazie HGMD o istotnym znaczeniu klinicznym. Zmiany takie wykorzystała do dalszej analizy korelacji polimorfizmu z profilem metabolizmu badanego anestetyku. Za najważniejsze wśród wyników badań mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszak uważam wykazanie, że dwa polimorfizmy pi105v(c.313a>g) i p.a114v (c.341c>t) w genie GSTP1 mają istotny wpływ na poziom enzymu alfa-gst w surowicy pacjentów znieczulanych sewofluranem w okresie okołooperacyjnym. Z kolei, homozygota GG w locus c.313 genu GSTP1 koreluje istotnie statystycznie z podwyższonym poziomem enzymu alfa-gst bezpośrednio po zakończonym znieczulaniu sewofluranem. Można zatem uznać, że u takich osób po podaniu tegoż znieczulenia dochodzi do tymczasowego zaburzenia integralności hepatocytów. Nie wpływa na to polimorfizm obserwowany w genie CYP2E1. Zidentyfikowane zmiany w 9 genach badanych u osób poddanych znieczuleniu propofolem występowały w populacji polskiej z częstością podobną do innych populacji. Doktorantka wykazała, że dwie zmiany p.gln172his(c516g>t) w genie CYP2B6 oraz p.ser893ala(c2677t>g) w genie ABCB1 mają wpływ na farmakokinetykę propofolu. Z tego względu Doktorantka analizując farmakokinetykę propofolu u badanych osób stwierdziła różnice międzyosobnicze w tempie eliminacji propofolu z osocza. Propofol jest metabolizowany szybciej przez osoby będące homozygotami c.516tt genu ABCB1, natomiast pacjenci z genotypem c.2677t/g znacznie wolniej. Farmakokinetyka propofolu zależy także od BMI pacjentów. Realizacja badań odnośnie niniejszej pracy nie byłaby zapewne możliwa bez pomocy Pani dr hab. Marzeny Skrzypczak-Zielinskiej, pełniącej rolę promotora pomocniczego, jak również dbającej o właściwy dobór pacjentów do badań. Praca ta wskazuje także na umiejętność współpracy i koordynacji badań Doktorantki z różnymi ośrodkami naukowymi. Pracę doktorską mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszak oceniam bardzo wysoko. Wnosi ona szereg nowych danych, pozwalających na lepsze zrozumienie działania leków w organizmie poszczególnych pacjentów, co ma istotne znaczenie terapeutyczne i diagnostyczne

4 oraz stwarza możliwości zabezpiecza chorych przed wystąpieniem u nich niepożądanych skutków ubocznych. Doktorantka wykazała, że zmienność polimorficzna genów kodujących enzymy szlaku metabolicznego anestetyki, a także białka pośredniczące w ich działaniu jest odpowiedzialny za indywidulaną reakcję pacjentów na powszechnie stosowane leki anestetyczne: sewofluran i propofol. Rozprawa doktorska mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszak była realizowana w ramach projektu, zatytułowanego: Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski. Poddziałanie Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Doktorantka uzyskała stypendium w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki. Ponadto, praca mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszak uzyskała wsparcie projektu: Międzynarodowe Projekty Doktoranckie Fundacji na rzecz Nauki Polskiej, w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka na lata Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. Świadczy to o ważności zagadnienia, jakiego realizacji podjęła się Doktorantka i w pełni je urzeczywistniła. Przedstawioną do oceny rozprawę doktorską otrzymałam w formie 150- stronicowego wydruku komputerowego, a jej układ jest typowy dla tego typu rozpraw. Na uwagę zasługuje strona graficzna niniejszej pracy bogato ilustrowana 42 rycinami i 44 tabelami. W pracy nie znalazłam istotnych usterek redakcyjnych, jak również merytorycznych. W mojej ocenie, rozprawa doktorska Pani mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszak spełnia wszystkie kryteria określone w Ustawie z 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym (DzU nr 65, poz. 595). Z powyższych względów zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Rolnictwa i Bioinżynierii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Równocześnie, z uwagi na ważne znaczenie poznawcze, jak i kliniczne badań mgr inż. Oliwii Zakerskiej-Banaszak, zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Rolnictwa i Bioinżynierii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu o rozważenie możliwości wyróżnienia ocenianej pracy stosowną nagrodą.

5