Patofizjologia NOSów

Transkrypt

1 Patofizjologia NOSów Wykład 4 Biochemia stresu oksydacyjnego Literatura: Grzegorz Bartosz Druga twarz tlenu Barry Halliwell & John Gutteridge Free radicals in biology and medicine

2 Biosynteza NO Kolluru et al. Redox Biol. 2013

3 Porównanie NOSów oxygenase domain reductase domain Alderton et al. Biochem J. 2001

4 Fizjologia i patologia NO Oddychanie komórkowe - nanomolarne stężenia NO ograniczają wiązanie O 2 z oksydazą cytochromu c (kompleks IV). Podobne właściwości ma CO - NO stymuluje biogenezę mitochondriów System nerwowy - neurotransmiter - percepcja bólu, pamięć, odczuwanie pragnienia i głodu - relaksacja jelit, erkecja - uzależnienia Nowotwory - regulacja prozapalnych mediatorów transformacja nowotworowa - wpływa na angiogenezę Układ krążenia

5 Aktywność enos Forstermann U. Eur J Physiol 2010

6 Regulacja aktywności enos lokalizacja komórkowa fosforylacja dostępność substratu poziom ekspresji mrna i białka dostępność kofaktorów reakcja NO z O 2 ' - Huang PL. Trends Endocrin Metabol 2009

7 Regulacja aktywności enos przez kinazy Huang PL. Trands Endorcrin Matabol 2009.

8 Regulacja aktywności enos przez Ca 2+ i fosforylację Ca2+ PKG AMPK Więcej Ca 2+ = wzrost aktywności enos (Ca 2+ indukuje wiązanie CaM do enzymu) Shear stress aktywuje enos niezależnie od Ca 2+, poprzez jego fosforylację (Ser1177). Fosforylacja Thr 495 hamuje aktywność enzymu (interferencja z wiązaniem CaM). Forstermann U. Eur J Physiol 2010

9 Czynniki ryzyka wywołujące dysfunkcję enos Zwiększona produkcja ROS powoduje redukcję bioaktywnego NO (NO reaguje z anionorodnikiem ponadtlenkowym dając toksyczny nadtlenoazotyn). Nadtlenoazotyn powoduje przełączenie funkcji enos z produkcji NO na generowanie anionorodnika ponadtlenkowego, co nasila stres oksydacyjny w śródbłonku. Forstermann U. Eur J Physiol 2010

10 Stres oksydacyjny wywołuje dysfunkcję śródbłonka Ding and Triggle. Uer J Physiol 2010.

11 NOS - regulacja ciśnienia krwi - Wszystkie formy NOS wpływają na regulację ciśnienia krwi: * enos - bezpośrednia regulacja wazorelaksacji i funkcji mięśni gładkich (obniżanie ciśnienia krwi) * nnos - brak wpływu na ciśnienie krwi w warunkach kontrolnych, ale być może kontrola baroreceptorów (nnos jest produkowana w centrach wazomotorycznych i nerwach periwaskularnych). Być może nnos może podnosić ciśnienie krwi, chroniąc zmniejszając eyzyko hipotencji np. podczas anestezji. * inos - wywołuje hipotensję podczas szoku septycznego - Jedną z głównych przyczyn dysfunkcji śródbłonka (niewłaściwa regulacja wazorelaksacji) jest niedobór NO produkowanego przez enos. Jest to element patogenezy: * miażdżycy * nadciśnienia * cukrzycy * hipercholesterolemii * przedwczesnego starzenia blaszka miażdżycowa - Dysfunkcja pojawia się przed zmianami anatomicznymi (przed hiperplazją mięśniówki lub tworzeniem złogów lipidowych w naczyniach). Liu et al. Cardiovasc Res 2007

12 Regulacja skurczu mięśni gładkich naczyń Tang and Vanhoutte. Eur J Physiol 2010.

13 Regulacja skurczu mięśni gładkich naczyń Tang and Vanhoutte. Eur J Physiol 2010.

14 Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń - Starzenie się wpływa zarówno na komórki śródbłonka jak i mięśni gładkich (VSMC) oraz komunikację między tymi typami komórek. - Najważniejsze zmiany w VSMC to: * nasilona migracja * nasilona proliferacja * deregulacja odpowiedzi na na czynniki wzrostowe bodźce proapoptotyczne (rozrost mięśniówki) * deregulacja ekspresji kanałów wapniowych i potasowych (nasilona kurczliwość, reakcja zapalna i prozakrzepowa) EC VSMC - Najważniejsze zmiany w śródbłonku to: * zmniejszona aktywność (ale nie ekspresja) enos, zwiększona aktywność arginazy (zmniejszona produkcja i/lub dostępność NO) * zwiększona ekspresja i aktywność cyklooksygenaz (COX) i produkowanych przez nie wazokonstryktorów * nasilona produkcja ROS Herrera et al. Aging Res Rev 2010

15 Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń Herrera et al. Aging Res Rev 2010

16 Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń Herrera et al. Aging Res Rev 2010

17 Wpływ starzenia na dysfunkcję naczyń TERT: telomerase reverse transcriptase. Herrera et al. Aging Res Rev 2010

18 Czynniki ryzyka wywołujące dysfunkcję enos metylotrasferaza Utlenienie BH 4 jest głównym mechanizmem rozprzęgania enos (sprzyja temu stres oksydacyjny) dimetyloarginaza śródbłonek Forstermann U. Eur J Physiol 2010

19 Stres oksydacyjny wywołuje miażdżycę Forstermann U. Eur J Physiol 2010

20 NO a miażdżyca Komórki śródbłonka, jeśli dobrze funkcjonują, chronią nas przed zakrzepem i miażdżycą. Głównym regulatorem funkcji śródbłonka jest NO, generowany przez enos. NO: - relaksacja naczyń krwionośnych - hamowanie agregacji i adhezji płytek krwi - ograniczenie oksydacji LDL - hamowanie proliferacji mięśni gładkich ściany naczynia - osłabienie ekspresji genów prozapalnych

21 Powstawianie i inaktywacja ROS w śródbłonku Forstermann U. Eur J Physiol 2010

22 Zawał- ischemia - ischemia-reperfuzja

23 Tlenek azotu a zapalenie - Zawał powoduje naciek komórek zapalnych, które produkują ROS, proteazy i cytokiny prozapalne. Prowadzi to do uszkodenia śródbłonka. - W wyniku uszkodzenia śródbłonka dochodzi do wazokonstrykcji i ischemii w odległych od zawału miejscach mięśnia sercowego. Strefa uszkodzenia rozszerza się. - Aktywacja enos (np. przez VEGF uwalniany przez niedotlenione tkanki, czy statyny podawane przez lekarza) łagodzi te objawy (pod warunkiem, że enos produkuje NO a nie anionorodnik ponadtlenkowy). Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

24 enos i inos a uszkodzenie po ischemii i reperfuzji - Angiotensyna i cytokiny prozapalne indukują stres oksydacyjny. To prowadzi do indukcji NFκB i ekspresji inos. COX-2 PGE 2, PGI 2 - inos może stanowić drugą linię obrony. Jeśli enos jest zablokowana, inos staje się głównym źródłem NO i może dzięki temu pełnić funkcje cytoprotekcyjne (pod warunkiem, że ekspresja nie jest zbyt silna, stężenia NO byt wysokie, gdyż wtedy mogą działać toksycznie i prooksydacyjnie, np. poprzez wpływ na łańcuch oddechowy). - Istotną rolę odgrywa również indukcja COX-2 i produkcja prze nią PGE 2 i PGI 2. Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

25 Syntazy tlenku azotu, a przebudowa LV Serce po zawale - W wyniku zawału zwiększa się obciążenie pozostałej części serca. Prowadzi to do aktywacji receptorów angiotensyny i zwiększenia produkcji ROS. - Indukcja inos przez pewien czas działa ochronnie. - Szczególnie istotne w zapobieganiu przebudowie jest zwiększenie dostępności BH4 (np. kwas foliowy nasila produkcję BH4). Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

26 Tlenek azotu a neowaskularyzacja - NO zwiększa produkcję VEGF oraz nasila jego aktywność w komórkach śródbłonka (zwłaszcza migrację i morfogenezę). - VEGF chroni śródbłonek przed apoptozą, nasila angiogenezę i waskulogenezę, prowadząc do utworzenia nowych naczyń krwionośnych. - Niewystarczająca angiogeneza prowadzi do powstawania większej blizny pozawałowej i zwłóknienia. Otani H. Antioxid Redox Signal 2009

27 Insulino-oporność i cukrzyca typu 2

28 BAT i UCP-1 - BAT u gryzoni: * odpowiada za termogenezę bezdrżeniową * zwiększa wydatki energetyczne * zmniejsza otyłość * zmniejsza tworzenie białych adipocytów - Kluczowym białkiem w termogenezie bezdrżeniowej jest UCP-1, eksprymowane w BAT - Ekspresja UCP-1 jest indukowana przez kwasy tłuszczowej Tseng et al. Nat Rev Drug Discov 2010.

29 UCP3 - Ulega ekspresji głównie w mięśniach szkieletowych Argyropoulos & Harper. J Appl Physiol 2002.

30 UCP-2 w łańcuchu oddechowym - UCP-2 jest eksprymowane w różnych tkankach, w tym w komórkach b-trzustki - W komórkach β trzustki: * pobieranie glukozy przyczynia się do wzrostu aktywności łańcucha oddechowego i zwiększenia produkcji ATP z ADP. To stymuluje fuzję pęcherzyków zawierających insulinę i prowadzi do wydzielania insuliny. * Wysoki stosunek ATP/ADP aktywuje UCP2, co zmniejsza gradient protonów i obniża produkcję ATP, obniżając tym samym wydzielanie insuliny. - Czynnikiem aktywującym UCP2 jest prawdopodobnie anionorodnik ponadtlenkowy.

31 Produkcja insuliny w komórkach β Regulacja sekrecji insuliny z udziałem UCP2 w komórkach β trzustki. Glukoza jest transportowana do komórki na nośniku glukozowym. Utlenianie glukozy, na które składa się glikoliza, cykl kwasów trikarboksylowych (TCA) oraz transport elektronów w łańcuchu oddechowym (RC) mitochondrium, prowadzi do wytworzenia protonowego gradientu chemicznego ( µh+), który z kolei napędza syntezę ATP. Wzrastający poziom ATP w komórce β trzustki, jako konsekwencja podwyższonego poziomu cukru we krwi, przyczynia się do zamknięcia wrażliwych na ATP kanałów potasowych (KATP) błony plazmatycznej. Prowadzi to do depolaryzacji błony i otwarcia kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Napływ wapnia do komórki uruchamia proces wydzielania insuliny. Aktywność UCP2 rozprasza µh+ i tym samym obniża wydajność syntezy ATP. UCP2 może więc pełnić funkcję negatywnego regulatora stymulowanego glukozą wydzielania glukozy w komórkach β wysepek trzustkowych Woyda-Płoszczyca & Jarmuszkiewicz, 2008

32 Funkcje UCP2 Fizjologia Buffy et al. Br J Canc 2011.

33 Cukrzyca Funkcje UCP2

34 Transdukcja sygnału od insuliny IRS-1: insulin receptor substrate-1 Huang PL. Trands Endorcrin Matabol 2009.

35 Stres oksydacyjny indukuje insulinooporność Długotrwała hiperglikemia i hiperlipidemia prowadzi do: - wzrostu produkcji ROS i RNS - aktywacji kinaz (np. JNK, p38, IKKβ) * kinazy te fosforylują IRS-1 * IKKβ aktywuje NFκB NFκB indukuje ekspresję inos co prowadzi do: - wzrostu NO - nitrozylacji IRS-1 Fosforylacja seryny i S-nitrozylacja IRS-1 prowadzi do: - degradacji proteosomalnej IRS-1 - zmniejszenia transdukcji sygnału - braku właściwej odpowiedzi na insulinę IRS-1: insulin receptor substrate-1 Newsholme et al. J Physiol 2007.

36 Dysfunkcja śródbłonka w cukrzycy

37 Gojenie ran u myszy z cukrzycą db/db WT Surface of the wound [%] ** *** ** *** Days after wounding WT db/db *** *** *** *** *** *** *** Day 0 Day 1 Day 3 Day 8 Day 17 Grochot-Przeczek et al. PLoS ONE, 2009

38 Fazy gojenia ran Faza zapalenia (kilka dni) - Natychmiast po utworzeniu skrzepu w ranie dochodzi do wazodylatacji i nacieku leukocytarnego. Bardzo nasila się aktywność fagocytarna neutrofili. Faza proliferacji (2 dni - kilka tygodni) - Fibroblasty proliferują wypełniając ubytki i tworząc tkankę ziarninową. Nasila się angiogeneza. Keratynocyty migrują i proliferują zamykając ranę. Faza przebudowy (miesiące) - Dochodzi do wzmożonej syntezy kolagenu wzmacniającego tkankę, oraz do przekształcenia tkanki ziarninowej w typowe tkanki (lub utworzenia blizny). Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

39 Mechanisms of blood vessels formation Incorporation to pre-existing vessels Formation of blood vessels de novo paracrine stimulation of endothelial cells (VEGF, bfgf, IL-8 ) Carmeliet P. Nat Med, 2000

40 Upośledzenie gojenia ran w cukrzycy - EPC: komórki progenitorowe śródbłonka - VEGF: vascular endothelial growth factor - SDF-1: stromal cell derived growth factor - enos: endothelial nitric oxide synthase Brem & Tomic-Canic. J Clin Invest 2007.

41 Upośledzenie funkcji EPC w cukrzycy - U zdrowych osobników czynniki uwalniane przez ischemiczne lub zranione tkanki mobilizują komórki progenitorowe (w tym EPC) ze szpiku, a te po dotarciu do miejsc zranienia lub niedotlenienia uwalniają czynniki proangenne (w tym niewielkie ilości NO i ROS) oraz biorą udział w neowaskularyzacji i naprawie naczyń. - W cukrzycy sygnały wysyłane przez niedotlenione lub zranione tkanki są słabsze, przez co mobilizacja komórek progenitorowych jest mniejsza. Komórki progenitorowe które docierają do zranionych tkanek uwalniają niewiele czynników proangiogennych, natomiast dużo prozapalnych i antyangiogennych (w tym duże ilości NO i ROS). EPC: komórki progenitorowe śródbłonka Jarajapu & Grant. Circ Res 2010.

42 Mobilizacja EPC ze szpiku - EPC: komórki progenitorowe śródbłonka - VEGF: vascular endothelial growth factor - MMP-9: matrix metalloproteinase-9 - enos: endothelial nitric oxide synthase Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

43 Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

44 Regulacja mobilizacji EPC w hipoksji - W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji enos przez kinazy PI3K/Akt, przez co zmniejsza się produkcja NO. - Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnika ponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO - ) i zmniejszenia dostępności NO. - W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływ komórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się do upośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie. - Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku. WT db/db Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

45 Zapraszam na wykład 5 Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej