Znaczenie jonów wapnia w śródbłonku naczyń

Transkrypt

1 Znaczenie jonów wapnia w śródbłonku naczyń Beata Drabarek Dorota Dymkowska Pracownia Metabolizmu Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, Warszawa Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, Warszawa; tel.: (22) , d.dymkowska@nencki.gov.pl Artykuł otrzymano 30 września 2012 r. Artykuł zaakceptowano 16 października 2012 r. Słowa kluczowe: śródbłonek naczyniowy, wapń, tlenek azotu, regulacja sygnalizacji wapniowej, stres oksydacyjny Wykaz skrótów: EDHF (ang. endothelium derived hyperpolarisation factor) śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący; enos (ang. endothelial nitric oxide synthase) śródbłonkowa syntaza tlenku azotu; ER (ang. endoplasmic reticulum) siateczka śródplazmatyczna; MAPK (ang. mitogen- -activated protein kinase) kinaza białkowa aktywowana mitogenem; NO tlenek azotu; PMCA (ang. plasma membrane calcium ATPase) ATPaza wapniowa błony plazmatycznej; PGI 2 prostacyklina 2; RFT reaktywne formy tlenu; TRPC (ang. transient receptor potential canonical) kanały TRP z rodziny C; SOCE (ang. store operated calcium entry) pojemnościowy napływ jonów wapnia Podziękowania: Praca powstała podczas realizacji projektu badawczego własnego nr N N finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki, przyznanego Dorocie Dymkowskiej. STRESZCZENIE Śródbłonek naczyniowy pełni wiele ważnych funkcji, a jego mechaniczne uszkodzenie czy też zaburzenia w działaniu mogą mieć poważne konsekwencje ogólnoustrojowe, niebezpieczne dla zdrowia, a nawet życia. Organ ten kontroluje skurcz i rozluźnienie naczyń krwionośnych, wpływa na przebieg procesów zapalnych, odpowiedź immunologiczną, a także proces krzepnięcia krwi czy regulację przepuszczalności i integralności ścian naczynia. Upośledzenie wydzielania tlenku azotu i prostacykliny 2, które następuje na drodze zależnej od wapnia, świadczy o dysfunkcji śródbłonka. Wapń jest niezwykle istotny w wielu procesach charakterystycznych dla śródbłonka naczyniowego i jest niezbędny do prawidłowego jego funkcjonowania. Stres oksydacyjny, indukcja odpowiedzi prozapalnej i związany z tym istotny wzrost wytwarzania reaktywnych form tlenu są powodem powstawania uszkodzeń śródbłonka naczyniowego. W pracy omówimy wybrane zagadnienia dotyczące funkcjonowania śródbłonka naczyniowego w normie i patologii, jak również wskażemy na ich związek z regulacją sygnalizacji wapniowej w tych komórkach. WPROWADZENIE Śródbłonek naczyniowy należy do grupy nabłonków płaskich. Wyściela wszystkie naczynia krwionośne od dużych tętnic po małe naczynia włosowate, oraz naczynia limfatyczne, przedsionki i komory serca. U człowieka całkowita powierzchnia tej warstwy wynosi około 5000 m 2, a masa około 1 kg [1]. Uważa się, że obok wątroby, śródbłonek naczyniowy to największy organ wydzielniczy człowieka. Nie jest to bowiem, jak myślano przed laty, tylko wyściółka naczynia krwionośnego, ale aktywna warstwa komórek odgrywająca bardzo istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu całego organizmu. Śródbłonek, jak pokazano na rycinie 1, wytwarza i wydziela szereg różnorodnych substancji bioaktywnych działających w świetle naczynia, a także wpływających na komórki mięśni gładkich znajdujących się w jego bezpośrednim sąsiedztwie i współtworzących naczynie krwionośne. [2]. Jednym z podstawowych zadań śródbłonka jest utrzymanie równowagi pomiędzy skurczem i rozluźnieniem ścian naczynia krwionośnego w odpowiedzi na bodźce. Ponadto śródbłonek wpływa na przebieg procesów zapalnych i odpowiedź immunologiczną regulując adherencję komórek układu odpornościowego. Do jego kolejnych ważnych funkcji zalicza się kontrolę nad procesami krzepnięcia krwi, regulację przepuszczalności i integralności ścian naczynia, wśród których na uwagę zasługuje tworzenie bariery krew-narządy oraz kontrola wymiany substancji Rycina 1. Czynniki wydzielane przez śródbłonek związane z fizjologią naczyń. ACE enzym konwertujący angiotensynę; AT III antytrombina III; EDCF śródbłonkowy czynnik wywołujący skurcz miocytów; EDGF czynnik wzrostowy wydzielany przez śródbłonek; EDHF śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący; FGF czynnik wzrostu fibroblastów; IGF insulinopodobny czynnik wzrostu; PDGF płytkowy czynnik wzrostu; IL-1,6,8 interleukina (1,6,8); MHC II główny układ zgodności tkankowej klasy II; NO tlenek azotu; PGI 2 prostacyklina 2; TNF-alpha czynnik martwicy nowotworu alfa; TXA2 tromboksan A2; vwf czynnik von Willebranda. między osoczem a innymi narządami. Z racji pełnienia tylu istotnych funkcji, mechaniczne uszkodzenie oraz zaburzenia w działaniu śródbłonka naczyniowego 418

2 Rycina 2. Czynniki powodujące rozwój dysfunkcji śródbłonka naczyniowego. Groty strzałek wskazują kierunek zmian. Niektóre czynniki wskazane na schemacie mogą być przyczyną uszkodzenia śródbłonka. W wielu przypadkach indukujący uszkodzenia czynnik chorobowy może w dalszej kolejności być skutkiem powstałej dysfunkcji. mogą mieć poważne konsekwencje ogólnoustrojowe, niebezpieczne dla zdrowia, a nawet życia organizmu. Dysfunkcja śródbłonka naczyniowego stanowi podłoże wielu chorób układu sercowo-naczyniowego, w tym miażdżycy oraz niewydolności serca (Ryc. 2). Stres oksydacyjny, indukcja odpowiedzi prozapalnej i związany z tym istotny wzrost wytwarzania reaktywnych form tlenu (RFT) przyczyniają się do powstawania uszkodzeń śródbłonka naczyniowego, a utrata integralności warstwy komórek wyścielającej naczynia krwionośne może stanowić czynnik determinujący zmiany patologiczne związane ze stanem zapalnym, posocznicą czy wstrząsem septycznym. Do zaburzeń funkcjonowania śródbłonka naczyniowego przyczyniają się zarówno naturalne procesy fizjologiczne (starzenie), stany patologiczne (cukrzyca czy nadciśnienie), oraz czynniki środowiskowe, na przykład dieta. Według Gomułki i wsp., prawidłowe funkcjonowanie śródbłonka można najogólniej zdefiniować jako zdolność do utrzymania homeostazy naczyniowej, a w związku z tym zdolność do utrzymania w równowadze wzajemnie powiązanych i często przeciwstawnych procesów [3]. Jednym z czynników świadczących o dysfunkcji śródbłonka jest upośledzenie wytwarzania tlenku azotu (NO). Enzymem katalizującym wytwarzanie NO jest syntaza tlenku azotu, którego aktywność jest związana z obecnością jonów wapnia. Zwiększenie ich stężenia w komórce powoduje aktywację tego enzymu i wzmożone uwalnianie NO. Obecnie wiadomo, że skurcz naczyń zależny od funkcji śródbłonka jest ściśle związany z wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia, a także z wytwarzaniem reaktywnych form tlenu w tych komórkach [4]. Nie ma zatem wątpliwości, że regulacja szlaków sygnałowych związanych z regulacją napływu Ca 2+ do komórek jest niezwykle istotnym elementem kontroli funkcji śródbłonka i napięcia naczyń. JON WAPNIA REGULUJE PROCESY ŻYCIOWE W komórkach eukariotycznych, w tym również w śródbłonku naczyniowym, kluczową rolę jako wtórny przekaźnik informacji odgrywają jony wapnia. Zmiany stężenia tego jonu kontrolują różne procesy życiowe, między innymi: poziom cyklicznych nukleotydów, wydzielanie hormonów i neurotransmiterów, wzrost, podział czy różnicowanie [5]. Każda komórka zawiera wysoko wyspecjalizowany system mechanizmów umożliwiających regulację stężenia jonów wapnia w cytoplazmie i organellach komórkowych. Wśród nich są systemy wydajnie usuwające Ca 2+ do przestrzeni międzykomórkowej, jak również umożliwiające ich magazynowanie w wyspecjalizowanych przedziałach komórkowych [6]. Niezwykle ważne są także mechanizmy pozwalające na kontrolowane zwiększanie stężenia Ca 2+ w cytoplazmie. Zagadnienia te są szerzej omówione w innych artykułach opublikowanych w tym samym zeszycie Postępów Biochemii. Istnieje również udokumentowana ścisła zależność między stężeniem jonów wapnia w komórkach śródbłonka naczyniowego, a stanem układu sercowo-naczyniowego. Obecnie nie ulega wątpliwości, że wiele fizjologicznych funkcji tego organu, takich jak wspomniane wcześniej wytwarzanie tlenku azotu, ale także synteza prostacykliny 2 (PGI 2 ), czynnika aktywującego płytki krwi czy czynnika Willebranda, jest regulowana poprzez kontrolowane zmiany stężenia jonów wapnia w cytoplazmie komórek śródbłonka. W komórkach spoczynkowych (niestymulowanych) stężenie Ca 2+ wynosi około nm, co jest wartością typową również dla innych rodzajów komórek [7]. Aktywacji, a także uszkodzeniu komórek śródbłonka naczyniowego towarzyszy pojawienie się we krwi rozpuszczalnych cząsteczek adhezyjnych. Wśród wielu czynników aktywujących, wymienia się niedokrwienie, aminy katecholowe, angiotensynę II, cytokiny (IL-1, IL-6, TNF-α, TGF-β) i endotoksyny. W pobudzonych komórkach śródbłonka, w odpowiedzi na wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia (uwolnionego z wewnątrzkomórkowych zasobów) lub w wyniku powstania kompleksu Ca 2+ /kalmodulina, następuje wytwarzanie endoteliny-1 (ET-1). Jest to zjawisko opisywane w nadciśnieniu płucnym, miażdżycy, niewydolności nerek, ostrym zespole wieńcowym czy migrenie [8]. Wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie, a także wzrost ilości wapnia w komórce są wynikiem kilku zależnych od siebie procesów, takich jak uwalnianie jonów wapnia z wewnątrzkomórkowych magazynów w siateczce śródplazmatycznej (ER) oraz napływ Ca 2+ z macierzy pozakomórkowej przez kanały zlokalizowane w błonie plazmatycznej. W regulacji sygnalizacji wapniowej biorą udział także mitochondria, które przejściowo magazynując jony wapnia, stają się ich źródłem w komórce w stanach pobudzenia, wzmacniając sygnał wapniowy w cytoplazmie. Co więcej, właśnie w pierwotnych komórkach śródbłonka HU- VEC (ang. human umbilical vein endothelial cells) wykazano, że mitochondria uczestniczą w uzupełnianiu wewnątrzkomórkowych magazynów w ER, stanowiąc przejściowy magazyn wapnia, a jednocześnie drogę jego transportu od błony plazmatycznej do siateczki śródplazmatycznej [9,10]. Wydaje się jednak, że mechanizm ten nie jest osobliwością komórek śródbłonka, lecz jest także istotny w innych rodzajach komórek. Buforowanie jonów wapnia w mitochondriach, a w efekcie udział mitochondriów w przekazywaniu sygnału wapniowego, zależy od stanu energetycznego tych Postępy Biochemii 58 (4)

3 organelli. Wzrastająca pula magazynowanego w macierzy mitochondrialnej Ca 2+ wpływa na aktywność kluczowych enzymów mitochondrialnych, w tym enzymów cyklu kwasów trikarboksylowych. Przyczynia się to do zwiększenia ilości równoważników redukujących utlenianych w mitochondrialnym łańcuchu transportu elektronów, czego efektem jest wzrost potencjału mitochondrialnego (ΔΨ m ) i wytwarzania ATP. Z drugiej jednak strony, nadmierne nagromadzanie wapnia w mitochondriach wiąże się z wieloma patologiami. Czynnikami bezpośrednio powodującymi obniżenie ΔΨ m są między innymi tlenek azotu i cykliczny GMP, które w efekcie zmniejszają zdolność mitochondriów do pobierania jonów wapnia i ich magazynowania. NO jest w tym przypadku ogniwem w układzie sprzężenia zwrotnego, o którym będzie mowa w dalszej części pracy. Jony wapnia znajdujące się w mitochondriach sprzyjają aktywacji mitochondrialnej izoformy syntazy tlenku azotu. Wzrastające stężenie NO prowadzi do zahamowania szybkości zużywania tlenu, obniżając potencjał wewnętrznej błony mitochondrialnej, co z kolei ogranicza zdolność buforowania wapnia w tych organellach [11,12]. Badając mechanizmy sygnalizacji wapniowej w komórkach śródbłonka tętnicy płucnej wykazano, że zwiększenie wytwarzania NO prowadzi do zmniejszenia szybkości pojemnościowego napływu jonów wapnia do tych komórek, zmniejsza amplitudę sygnału wapniowego indukowanego w wyniku stymulacji przez ATP receptorów nukleotydowych i związanego z uwalnianiem wapnia z siateczki śródplazmatycznej oraz obniża aktywność ATPazy wapniowej w błonie plazmatycznej (PMCA, ang. plasma membrane calcium ATPase). Jednocześnie dochodzi do nadmiernego nagromadzania wapnia w magazynach wewnątrzkomórkowych. A zatem, wzrost stężenia tlenku azotu w komórce zmniejsza intensywność sygnału wapniowego i przez to zwrotnie hamuje aktywność zależnej od Ca 2+ śródbłonkowej izoformy syntazy tlenku azotu [13]. Nie ulega wątpliwości, że wapń odgrywa istotną rolę w wielu procesach typowych dla śródbłonka naczyniowego i jest on niezbędny do prawidłowego funkcjonowania komórek tworzących ten organ. Niektóre z tych zagadnień będą omówione poniżej. JONY WAPNIA REGULUJĄ FIZJOLOGICZNE FUNKCJE ŚRÓDBŁONKA REGULACJA NAPIĘCIA ŚCIAN NACZYNIA Jedną z podstawowych fizjologicznych funkcji śródbłonka naczyniowego jest regulacja napięcia ściany naczynia krwionośnego, co polega na kontrolowaniu procesów skurczu i relaksacji mięśni gładkich okalających naczynie. Krążenie krwi jest procesem dynamicznym, charakteryzującym się dużą zmiennością. Istotne jest zatem, aby naczynia odpowiednio reagowały na zachodzące zmiany w przepływie i ciśnieniu krwi. Śródbłonek, jako pierwsza warstwa naczynia, jest szczególnie narażony na hemodynamiczne naprężenia i napięcia ścinające związane z przepływem krwi, które mogą doprowadzić do uszkodzeń strukturalnych i dysfunkcji czynnościowej. Komórki śródbłonka wytwarzają i wydzielają tlenek azotu oraz prostacyklinę 2, dwa główne czynniki odpowiedzialne za rozluźnianie mięśniówki naczynia. NO powstaje w reakcji rozkładu argininy katalizowanej przez śródbłonkową syntazę tlenku azotu (enos, ang. endothelial nitric oxide synthase), której działanie zależy od wapnia i kalmoduliny. Spośród trzech izoform tego enzymu, właśnie izoforma śródbłonkowa jest najbardziej wrażliwa na zmiany stężenia tego jonu w cytoplazmie [14]. enos ulega aktywacji wtedy, gdy stężenie Ca 2+ w komórce zwiększa się. Wykazano, że stymulacja produkcji NO towarzyszy długotrwałej aktywacji pojemnościowego napływu jonów wapnia (SOCE, ang. store operated calcium entry) [15]. Jak już wspomniano wcześniej, nadmierny wzrost stężenia NO prowadzi do wytłumienia sygnalizacji wapniowej i w efekcie zwrotnego zmniejszenia aktywności zależnej od Ca 2+ syntazy NO, co jest ważnym, z punktu widzenia funkcjonowania śródbłonka, a także naczynia krwionośnego, mechanizmem sprzężenia zwrotnego [16]. Synergistycznie z tlenkiem azotu działa PGI 2. Lipid ten powstaje na drodze enzymatycznej cyklizacji kwasu arachidonowego zachodzącej z udziałem syntazy cyklicznego nadtlenku prostaglandynowego, nazywanej także cyklooksygenazą. Pierwszym etapem wytwarzania PGI 2 jest uwalnianie kwasu arachidonowego z fosfolipidów błonowych katalizowane przez fosfolipazę A 2 (PLA 2 ). Reakcja ta jest etapem ograniczającym szybkość syntezy prostacykliny. Aktywność fosfolipazy A 2, podobnie jak syntazy tlenku azotu, wzrasta wraz ze zwiększającym się stężeniem Ca 2+ w cytoplazmie [1]. A zatem, wapń łączy procesy syntezy i wydzielania NO i PGI 2 przez śródbłonek. Interesującym jednak jest fakt, że kinetyka uwalniania tych dwóch czynników jest inna, głównie z powodu niejednakowej wrażliwości na wapń syntazy tlenku azotu i fosfolipazy A 2. Po zainicjowaniu sygnału wapniowego, NO jest wydzielane w sposób ciągły, natomiast PGI 2 krótkotrwale [17]. Dzieje się tak, ponieważ PLA 2 wymaga do aktywacji stosunkowo dużego wzrostu stężenia Ca 2+ w cytoplazmie, który pojawia się w pierwszych minutach po aktywacji komórki, jako następstwo opróżnienia wewnątrzkomórkowych magazynów wapniowych. Natomiast syntaza tlenku azotu jest również aktywowana przy niższych stężeniach jonów wapnia, które utrzymują się dłużej i są efektem aktywacji napływu Ca 2+ ze środowiska pozakomórkowego. Tlenek azotu i PGI 2 nie są jedynymi czynnikami stymulującymi relaksację mięśni gładkich i rozkurcz naczyń krwionośnych. Wykazano bowiem, że nawet w warunkach zahamowania wytwarzania obu tych substancji w komórkach śródbłonka, komórki mięśniowe naczynia nadal ulegały rozkurczowi. Obserwacje te skłoniły do konkluzji, że istnieje dodatkowy czynnik wytwarzany w komórkach śródbłonka, powodujący hiperpolaryzację błony plazmatycznej komórek mięśniowych i w efekcie ich rozkurcz. Czynnik ten nazwano śródbłonkowym czynnikiem hiperpolaryzującym (EDHF, ang. endothelium derived hyperpolarisation factor) [18]. Potencjalnymi czynnikami wywołującymi zależną od śródbłonka hiperpolaryzację komórek mięśni naczynia są, jak się sądzi, jony K +, kwasy epoksyeikozatrienowe, nadtlenek wodoru. Ponadto, w mechanizmie przekazywania sygnału od komórek śródbłonka do komórek mięśniowych ważną funkcję pełnią także połączenia szczelinowe (ang. gap junction) umożliwiające bezpośredni kontakt między komórkami. Chociaż nie istnieje jeden uniwersalny czynnik hiperpolaryzujący pochodzenia śródbłonkowego odpowie

4 rianodynowych w siateczce śródplazmatycznej, są jednak wrażliwe na zahamowanie fosfolipazy C (PLC). Wskazuje to na wiodącą rolę receptorów inozytolotrisfosforanowych (IP 3 R) w uwalnianiu wapnia z ER i powstawaniu fal wapniowych [22]. Badania dowodzą, że za utrzymanie hiperpolaryzacji błony plazmatycznej komórek mięśniowych odpowiada napływ Ca 2+ z zewnątrz przez błonę komórkową [23]. W stanach patologicznych, w których dochodzi do dysfunkcji śródbłonka, wytwarzanie NO jest znacznie zmniejszone. Sugeruje się, że hiperpolaryzacja miocytów przebiegająca z udziałem kanałów potasowych aktywowanych wapniem stanowi mechanizm kompensujący niedobory NO [24]. Ponadto uwalnianie NO i PGI 2, ale nie EDHF okazało się wrażliwe na stres oksydacyjny [25]. Zaburzenia w procesie zależnej od śródbłonka hiperpolaryzacji komórek mięśni gładkich są jednym z objawów towarzyszących wielu stanom patologicznym przebiegającym z dysfunkcją śródbłonka. UTRZYMANIE BARIERY KREW NARZĄDY Rycina 3. Śródbłonkowe czynniki powodujące hiperpolaryzację błony plazmatycznej miocytów. Głównymi czynnikami hiperpolaryzującymi są NO i PGI 2. Klasyczna droga wymaga aktywacji kanałów potasowych zależnych od Ca 2+ na błonie plazmatycznej komórek śródbłonka. COX cyklooksygenaza; camp i cgmp cykliczne nukleotydy; Gap połączenia szczelinowe. dzialny za relaksację mięśni gładkich naczynia [19], wydaje się, że jony wapnia są uniwersalnym przekaźnikiem sygnału uczestniczącym w tym procesie. W niniejszej pracy dokładny przebieg procesu zależnej od śródbłonka hiperpolaryzacji miocytów będzie omówiony na przykładzie sytuacji, w której rolę czynnika hiperpolaryzującego odgrywają jony potasu (Ryc. 3). Niekiedy ten szlak nazywany jest klasyczną drogą hiperpolaryzacji zależną od śródbłonka [20]. Natomiast w pracy Ozkor i Quyyumi można znaleźć szczegółowy opis szlaków prowadzących do hiperpolaryzacji i relaksacji mięśni gładkich naczynia z udziałem innych potencjalnych EDHF [21]. Działanie bodźców chemicznych na komórki śródbłonka, takich jak agoniści receptorów, w tym acetylocholina czy bradykinina oraz bodźców mechanicznych, czyli napięcia ścinającego przepływającej krwi, powoduje wzrost cytoplazmatycznego stężenia jonów wapnia. Dochodzi do aktywacji kanałów potasowych zależnych od Ca 2+. Wypływ jonów potasu z komórek śródbłonka powoduje lokalny wzrost stężenia tego jonu w przestrzeni pomiędzy warstwą śródbłonka a warstwą miocytów. Dochodzi do otwarcia kanałów potasowych rektyfikujących (prostowniczych) oraz aktywacji pompy sodowo-potasowej (Na + /K + ) w błonie komórki mięśniowej, co prowadzi do hiperpolaryzacji komórek mięśniowych, zamknięcia zależnych od napięcia kanałów wapniowych i w efekcie rozkurczu miocytów. Początkowe zmiany stężenia jonów wapnia w cytoplazmie komórek śródbłonka występują pod postacią asynchronicznych fal przesuwających się wzdłuż komórki. Zmiany te występują także po zablokowaniu receptorów Śródbłonek tworzy półprzepuszczalną barierę pomiędzy krwią płynącą w świetle naczynia a komórkami znajdującymi się w głębiej położonych warstwach. Do jego zadań należy zatem kontrola przepływu gazów, elektrolitów oraz związków drobno- i wielkocząsteczkowych pomiędzy tymi dwoma środowiskami. W stanach patologicznych, śródbłonek nie wypełniając właściwie tej roli, może doprowadzić do poważnych zaburzeń w funkcjonowaniu narządów. Stopień przepuszczalności śródbłonka zależy bezpośrednio od jego lokalizacji w organizmie. W mózgu śródbłonek naczyniowy współtworzy barierę krew-mózg, która pełni krytyczną rolę w utrzymaniu homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Komórki w tej warstwie są ze sobą połączone poprzez połączenia międzykomórkowe i połączenia ścisłe [26]. Śródbłonek bariery krew-mózg różni się od śródbłonka naczyń w innych narządach brakiem szczelin i okienek [27] pomiędzy sąsiadującymi komórkami. W wielu stanach chorobowych, takich jak choroba Alzheimera, cukrzyca, udar, stany zapalne, integralność bariery krew-mózg ulega zaburzeniu. Wykazano, że ważną rolę w utrzymaniu połączeń między komórkami w tej warstwie mogą pełnić jony wapnia. W przypadku połączeń międzykomórkowych zmniejszenie stężenia jonów wapnia w przestrzeni zewnątrzkomórkowej powoduje rozłączenie (zanik oddziaływań) pozakomórkowych domen kadheryny E komórek sąsiadujących [28]. Kadheryny połączone są pośrednio z aktyną przez białka zwane kateninami. Następujące zmiany konformacyjne wewnątrz komórki śródbłonka powodują zaburzenia w połączeniach międzykomórkowych. Połączenia ścisłe, w których biorą udział białka z grupy klaudyn, okludyn i białka ZO-1,-2,- 3, również są wrażliwe na stężenie zewnątrzkomórkowego wapnia [29]. Dokładny mechanizm tej zależności nie jest poznany, choć już wiadomo, że wapń jest konieczny do prawidłowego działania okludyny i ZO-1. Dodatkowo, powszechnie akceptowany jest pogląd wskazujący na podwyższone stężenie wewnątrzkomórko- Postępy Biochemii 58 (4)

5 wego wapnia jako główny czynnik w dysfunkcji komórek śródbłonka bariery krew mózg [30]. Podczas udaru następuje pozbawienie komórek kontaktu z tlenem i substancjami odżywczymi. Niedotlenienie powoduje wzrost stężenia jonów wapnia w wielu typach komórek, także w śródbłonku tworzącym barierę krew mózg. W efekcie dochodzi do uszkodzenia komórek i zaburzeń funkcjonalnych, a przede wszystkim do wzrostu przepuszczalności warstwy śródbłonka. Dokładny mechanizm tych zmian również nie został poznany, choć wiadomo, że po zablokowaniu napływu wapnia do wnętrza komórek można zapobiec powstającym uszkodzeniom bariery [31]. Badania przeprowadzone ostatnio dowodzą, że śródbłonkowa bariera krew mózg traci swoją integralność również w wyniku stresu mechanicznego, imitującego urazowe uszkodzenia mózgu i związanego z nim wzrostu cytoplazmatycznego stężenia wapnia. Okazało się, że dwa kanały z rodziny TRP (ang. transient receptor potential): TRPC1 i TRPC2 są odpowiedzialne za ten proces [32]. Ponadto, inne izoformy kanałów TRPC oraz kanały TRP typu V są wskazywane jako miejsca napływu Ca 2+ związanego ze wzrostem przepuszczalności komórek tej specyficznej warstwy śródbłonka [33]. Wapń pełni również istotną rolę w barierze śródbłonkowej w innych narządach, na co kolejnym dobrym przykładem są naczynia włosowate okalające pęcherzyki płucne. W płucach rezultatem zwiększenia przepuszczalności warstwy śródbłonka jest wysięk płynu, obrzęk, a w rezultacie uszkodzenie płuc. Zaobserwowano, że selektywny napływ wapnia (Isoc, ang. calcium selective current) powoduje pojawienie się przerw pomiędzy sąsiadującymi komórkami śródbłonka naczyń otaczających pęcherzyki płucne. Kanały TRPC1 i TRPC4 biorą udział w tym procesie, jednak wciąż nie wiadomo czy są to jedyne białka odpowiedzialne za napływ jonów wapnia [34]. Sugeruje się, że zablokowanie tego procesu może być celem dla interwencji farmakologicznej. Dokładny szlak przemian, rozpoczynający się zaburzeniem homeostazy wapniowej komórek śródbłonka i prowadzący ostatecznie do utraty ciągłości i spójności w warstwie śródbłonka naczyń płucnych, również nie jest do końca jasny. Przypuszcza się, że prawdopodobnym miejscem działania tego jonu może być cyklaza adenylanowa typu 6. Jest to enzym przekształcający ATP w cykliczny AMP, mający właściwości ochronne w stosunku do bariery śródbłonkowej. Wzrost cytoplazmatycznego stężenia Ca 2+ hamuje cyklazę adenylanową. Wzrost stężenia Ca 2+ może także aktywować proteazy zależne od tego jonu, katalizujące hydrolizę białek wiążących aktynę, na przykład gesolinę, co pociąga za sobą reorganizację cytoszkieletu aktynowego. Co ciekawe, stwierdzono, że mechanizmy regulujące napływ jonów wapnia do komórki śródbłonka dużych i małych naczyń płucnych nie są jednakowe. Zaobserwowano między innymi intensywniejszy wzrost stężenia wapnia w cytoplazmie po napływie pojemnościowym w komórkach śródbłonka tętnicy płucnej w porównaniu do komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego [35]. Warto także wspomnieć, że podczas procesów zapalnych, warstwa śródbłonka staje się przepuszczalna dla komórek układu odpornościowego. Leukocyty przenikają poprzez przestrzenie pomiędzy komórkami śródbłonka, które tworzą się za sprawą fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny. Enzym odpowiedzialny za tą fosforylację - kinaza lekkich łańcuchów miozyny (MLCK, ang. myosin light-chain kinase) również działa w sposób zależny od wapnia i kalmoduliny [36]. Będzie to dokładniej opisane w dalszej części tej pracy. POWSTAWANIE NOWYCH NACZYŃ KRWIONOŚNYCH Angiogeneza oznacza rozrost układu naczyniowego, podczas którego dochodzi do tworzenia się nowych naczyń w oparciu o już istniejące. Proces ten jest szeroko opisywany jako fizjologiczna funkcja śródbłonka. Towarzyszy również stanom patologicznym, na przykład podczas tworzenia się guza litego w chorobie nowotworowej. Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają pierwszoplanową rolę w procesie angiogenezy, ulegając aktywacji poprzez sygnały wysyłane przez środowisko w postaci czynników wzrostowych, między innymi naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostowego (VEGF, ang. vascular endothelial growth factor) [37]. Aktywowane komórki śródbłonka zaczynają się dzielić, zmieniać swoje właściwości adhezyjne, migrować i w rezultacie różnicować w nowe naczynia. Także w tym przypadku, jednym z kluczowych czynników regulacyjnych są jony wapnia, co przedstawiono na rycinie 4. Wiąże się to ze znaną rolą regulacyjną Ca 2+ w cyklu komórkowym [38]. VEGF aktywuje między innymi kaskadę sygnalizacyjną zależną od kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK, ang. mitogen-activated protein kinase), w tym kinazy ERK (ang. extra cellular signal-regulated kinases), która jest markerem proliferacji komórek śródbłonka. Jedna z dróg aktywacji tej kinazy jest zależna od jonów wapnia. Poprzez przyłączenie VEGF do odpowiedniego receptora, aktywowana zostaje fosfolipaza C, a produkt jej działania, inozytolotrifosforan (IP 3 ), powoduje uwalnianie wapnia z siateczki śródplazmatycznej. W komórkach HUVEC obserwowano dwufazowy wzrost cytoplazmatycznego stężenia Ca 2+ w odpowiedzi na VEGF, co oznacza, że po opróżnieniu wewnątrzkomórkowych magazynów, aktywacji uległ Rycina 4. Rola wapnia w szlaku sygnalizacyjnym prowadzącym od naczyniowo- -śródbłonkowego czynnika wzrostowego do procesu angiogenezy. Akt kinaza białkowa Akt; CAI karboksyamido-triazol; IP 3 inozytolotrifosforan; VEGF naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostowy; VEGFR receptor VEGF

6 także pojemnościowy napływ jonów wapnia z przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Kinaza białkowa C, której aktywność zależy od Ca 2+, aktywuje kinazy MAP. Jednak aktywacja MAPK, mimo tego, że wymagana, nie jest czynnikiem wystarczającym. Drugim elementem koniecznym do aktywowania proliferacji komórek śródbłonka są jony wapnia [39]. VEGF aktywuje także kinazę białkową B (Akt), która stymuluje produkcję NO. Tlenek azotu to czynnik prożyciowy, proproliferacyjny, który bardzo mocno wzmacnia mitogenną aktywność naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostowego. Aktywność śródbłonkowej syntazy NO, jak wspomniano powyżej, zależy od obecności wapnia. Ta zależność może wyjaśniać obowiązkową obecność tego jonu w procesie angiogenezy [40]. Ponad 30 lat temu zaobserwowano, że rozrost guza nowotworowego zależy od zachodzącego w nim procesu angiogenezy. Powstała wtedy koncepcja, by hamowanie tego procesu wykorzystywać w terapii przeciwnowotworowej [41]. Karboksyamido-triazol (CAI) jest postrzegany jako potencjalna substancja hamująca angiogenezę w guzach nowotworowych, ponieważ blokuje napływ wapnia poprzez kanały niezależne od napięcia, czyli w istocie blokuje SOCE [42]. Do endogennych substancji antyangiogennych zalicza się także angiostatynę i endostatynę, które hamują migrację i proliferację komórek śródbłonka oraz aktywują programowaną śmierć komórki (apoptozę). Badania dowodzą, że także te dwie substancje wpływają na sygnalizację wapniową w komórkach śródbłonka [43]. GOJENIE RANY JAKO PROCES AKTYWACJI PODZIAŁÓW KOMÓRKOWYCH Niezwykle złożonym procesem biologicznym jest gojenie powstałej rany. Sygnał uruchamiający naprawę jest przekazywany tylko do miejsc znajdujących się w najbliższym sąsiedztwie uszkodzenia. Bezpośrednio po uszkodzeniu warstwy śródbłonka obserwuje się tam wzrost stężenia Ca 2+ w komórce. Istnieją dowody na to, że prawidłowy przebieg gojenia wymaga obecności tych jonów zarówno w środowisku pozakomórkowym, jak też w wewnątrzkomórkowych magazynach wapnia. Prawdopodobnie aktywowane są kanały SOC, co potwierdza wykorzystanie BTP-2 (N-(4-[3,5- -bis(trifluoromethyl)-1h-pyrazol-1-yl]phenyl)-4-methyl- -1,2,3-thiadiazole-5-carboxamide), selektywnego inhibitora napływu pojemnościowego, w badaniach dotyczących uszkodzenia śródbłonka in situ. Jony wapnia aktywują ekspresję wielu genów zaangażowanych w przemieszczanie się komórek po zranieniu. Dodatkowo, jak już wspominano wcześniej, Ca 2+ przyczynia się do wzrostu produkcji NO, który następnie aktywuje proliferację komórek śródbłonka naczyniowego, niezwykle istotną podczas naprawy uszkodzonej tkanki. Zauważono, że uruchomienie szlaku naprawy uszkodzonego miejsca jest procesem zależnym od ATP [44]. Wykazano również, że białka zaangażowane w aktywację pojemnościowego napływu mają bezpośredni wpływ na proliferację komórek śródbłonka. Stwierdzono, że wyciszenie genów kodujących białka STIM1 i Orai1 znacząco ogranicza podziały komórkowe, ponieważ prowadzi to do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie S i G2/M [45]. Białko STIM 1 (ang. stromal Interaction molecule 1) zostało zidentyfikowane jako czujnik stężenia jonów wapnia w magazynach wewnątrzkomórkowych, a jego obecność stwierdzono w błonach siateczki śródplazmatycznej, jak również w błonie plazmatycznej. Natomiast wykazano, że białko Orai1 stanowi element kanału aktywowanego STIM 1, czego skutkiem jest pojemnościowy napływ wapnia [46]. ROZWÓJ DYSFUNKCJI ŚRÓDBŁONKA NACZYNIOWEGO ODPOWIEDŹ NA DZIAŁANIE CZYNNIKÓW PROZAPALNYCH Stan zapalny to reakcja tkanek na zranienie lub antygen, która może obejmować ból, obrzęk, swędzenie, zaczerwienienie czy utratę funkcji. W pierwszej kolejności dochodzi do zwiększenia ukrwienia tkanki na skutek rozszerzenia naczyń krwionośnych, a także do wzrostu ich przepuszczalności. W komórkach śródbłonka, w odpowiedzi na działanie cytokin prozapalnych, w tym czynnika martwicy nowotworu (TNFα, ang. tumor necrosis factor alpha), obserwuje się zaburzenia regulacji stabilności mrna dla enos. Skutkiem tego jest zmniejszenie ekspresji genu kodującego ten enzym oraz zmniejszenie syntezy NO. Jednakże, wtórnym efektem towarzyszącym stanowi zapalnemu jest zwiększenie aktywności indukowanej izoformy NOS (inos, ang. inducible nitric oxide synthase), która sprzyja zależnemu od IP 3 uwolnieniu Ca 2+ z siateczki śródplazmatycznej. Dochodzi do aktywacji MLCK, co, jak wspomniano powyżej, powoduje zwiększenie przepuszczalności bariery śródbłonkowej dla leukocytów [47]. Markerami rozwoju zmian zapalnych są pojawiające się we krwi obwodowej (forma rozpuszczalna) lub na powierzchni komórek śródbłonka (forma związana) cząsteczki adhezyjne: międzykomórkowe cząsteczki adhezyjne (ICAM-1), cząsteczki adhezji komórek naczyniowych (VCAM-1), cząsteczki adhezji płytek krwi (PE- CAM-1) oraz śródbłonkowej selektyny E. Szlaki sygnałowe związane ze stanem zapalnym aktywowane są na drodze zależnej od pojemnościowego napływu jonów wapnia. Dotyczy to między innymi czynnika transkrypcyjnego NF-κB (jądrowy czynnik κb), jądrowego czynnika aktywowanych komórek T (NF-AT), śródbłonkowej syntazy tlenku azotu oraz leukotrienów. NF-κB i NF-AT odgrywają istotną rolę w aktywacji układu odpornościowego, proliferacji komórek i aktywacji genów przez cytokiny prozapalne. Co ważne, szczególnie w kontekście niniejszej pracy, oba te czynniki są aktywowane na drodze zależnej od Ca 2+ [48]. Aktywność NF-AT jest ściśle regulowana przez kalcyneurynę, fosfatazę serynową zależną od wapnia i kalmoduliny [49]. Wykazano, że kanały związane z SOCE odgrywają znaczącą rolę w krótkotrwałej i długotrwałej regulacji procesów zapalnych. Ich udział wiąże się z chorobami związanymi z przewlekłym stanem zapalnym, takimi jak: przewlekłe zapalenia stawów, miażdżyca naczyń krwionośnych czy astma. Postuluje się, że napływ jonów wapnia przez kanały SOC opisywany niekiedy jako CRAC (ang. calcium release activated current), może stanowić cel terapeutyczny w leczeniu tych chorób [50]. W komórkach śródbłonka naczyniowego obserwowano podwyższenie wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia na skutek działania szeregu czynników prozapalnych. Wzrost stężenia Ca 2+ poprzedzał uruchomienie kaskady zdarzeń prowadzących do zmian przepuszczalności w obrębie małych naczyń krwionośnych, przy czym wydaje się, że aktywacja kinazy białkowej C nie jest Postępy Biochemii 58 (4)

7 tutaj konieczna [51]. Jednocześnie, w komórkach HUVEC, rosnących w środowisku ubogim w jony wapnia, obserwowano zwiększenie poziomu białka zwanego cząsteczką adhezyjną ICAM-1, która odpowiada za oddziaływanie komórek śródbłonka z leukocytami i płytkami krwi [52]. Czynniki pośredniczące w rozwoju stanu zapalnego wpływają na kształt oraz przepuszczalność komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w płucach, jak wspomniano w podrozdziale dotyczącym bariery krew-narządy. Wydaje się, że jest to związane ze specyficzną aktywacją kanałów SOC, która przyczynia się pośrednio do zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia cyklicznego AMP. Wiadomo, że o ile podwyższony poziom wapnia w komórce zwiększa barierę przepuszczalności śródbłonka, o tyle podniesiony poziom cyklicznego AMP wykazuje przeciwne działanie [7]. STRES OKSYDACYJNY Stres oksydacyjny, czyli stan zaburzonej równowagi między ilością wytwarzanych reaktywnych form tlenu, a zdolnością do ich usuwania, stanowi podłoże do rozwoju chorób układu sercowo-naczyniowego. W wyniku zwiększonego stresu oksydacyjnego dochodzi do uszkodzenia tkanek. Odgrywa to niezwykle istotną rolę w przebiegu wielu procesów fizjologicznych i patologicznych, między innymi w starzeniu, rozwoju choroby nowotworowej, chorobach neurodegeneracyjnych, cukrzycy, miażdżycy, jak również towarzyszy ischemii i reperfuzji oraz chorobom autoimmunologicznym. RFT mogą być wytwarzane w kilku miejscach w komórce. Za główne ich źródło uważa się mitochondrialny łańcuch oddechowy, ale istotną rolę odgrywają również oksydaza ksantynowa, oksydaza NAD(P)H czy śródbłonkowa syntaza tlenku azotu. Wspomniana oksydaza NAD(P)H katalizuje powstanie anionorodnika ponadtlenkowego na drodze jednoelektronowej redukcji tlenu z użyciem NADPH lub NADH. Enzym ten może wytwarzać znaczne ilości wolnych rodników tlenowych. Jego aktywatorami są między innymi angiotensyna II, trombina, TNF-α, ale także stres mechaniczny. Wzmożona produkcja RFT w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym może wynikać z jego częściowego zahamowania i wzrostu stopnia redukcji dinukleotydów nikotynoamidoadeninowych w macierzy mitochondrialnej. Wykazano, że nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) powoduje wzrost stężenia wolnych jonów wapnia we wnętrzu komórki, co z kolei skutkuje zwiększeniem ilości Ca 2+ akumulowanego w mitochondriach. Wykazano także, że w warunkach stresu oksydacyjnego modulowane jest funkcjonowanie kanałów TRP (Ryc. 5) na skutek uszkodzenia tratw lipidowych bogatych w kaweolinę-1. Dodatkowo, TRPC w komórkach śródbłonka działają jak czujniki NO, bowiem tlenek azotu może aktywować TRPC1, TRPC4, TRPC5, TRPV1, TRPV3 i TRPV4. Wymienione receptory odgrywają, jak wspomniano, istotną rolę w relaksacji naczyń zależnej od śródbłonka. Są one zapewne białkami współtworzącymi lub aktywującymi kanały wapniowe, a skutkiem ich aktywacji jest napływ jonów wapnia do wnętrza komórki [53]. Poza enzymami wytwarzającymi RFT, w prawidłowej komórce istnieją mechanizmy obronne, enzymatyczne i Rycina 5. Aktywacja napływu wapnia wpływa na funkcjonowanie śródbłonka. Stres oksydacyjny, naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostowy (VEGF), jak również napięcia związane z przepływem krwi modulują aktywność wielu kanałów wapniowych (w tym z rodziny TRP). Napływający Ca 2+ reguluje liczne procesy charakterystyczne dla śródbłonka. AA kwas arachidonowy; Orai1 białko wchodzące w skład kanału wapniowego, który uczestniczy w napływie pojemnościowym. nieenzymatyczne, które pozwalają na utrzymanie prawidłowego potencjału oksydoredukcyjnego, a ponadto biorą udział w naprawianiu uszkodzeń oksydacyjnych powodowanych przez RFT. Do enzymów usuwających RFT, a przez to wykazujących działanie przeciwutleniające należą między innymi: dysmutazy ponadtlenkowe, peroksydaza glutationowa czy katalazy [54]. Nadmierna produkcja reaktywnych form tlenu może powodować upośledzenie czynności pompy Na + /K +, ATPazy wapniowej w siateczce śródplazmatycznej oraz wymiennika Na + /Ca 2+, co powoduje rozchwianie homeostazy wapniowej komórki. [55]. Wykazano, że stężenie markerów stresu oksydacyjnego jest zwiększone u pacjentów z niewydolnością serca, jak również dobrze koreluje ze stopniem dysfunkcji lewej komory oraz zaawansowaniem niewydolności serca [56,57]. Dowodzi się, że w układzie sercowo-naczyniowym wolne rodniki regulują funkcje wielu białek, w tym białek kanałów jonowych i pomp wapniowych, między innymi SERCA (ang. sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase). Zauważono również, że w hiperglikemii i cukrzycy, stres oksydacyjny jest jednym z głównych czynników przyczyniających się do rozwoju chorób sercowo-naczyniowych. Stwierdzono w tym wypadku, że w mikronaczyniach produkcja RFT jest skutkiem wzrostu stężenia glukozy w komórkach śródbłonka, zaś w dużych naczyniach krwionośnych, jak również w sercu, stanowi prawdopodobnie konsekwencję wzrostu utleniania kwasów tłuszczowych [58]. Wykazano również, że produkcja RFT w mitochondriach wzrasta w wyniku zwiększenia stężenia jonów wapnia w tych organellach. Dochodzi do tego po aktywacji receptorów sprzężonych z białkami G, których aktywatorem jest między innymi trombina. Mobilizacja Ca 2+ następuje w wyniku współdziałania z receptorem IP 3. Jest to jedna z dróg umożliwiających adhezję leukocytów do komórek śródbłonka w przypadku zapalenia indukowanego trombiną [59]. Związek między zmianami wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia a produkcją RFT zauważono także w przypadku sty

8 mulacji komórek przez ATP. Nie do końca wiadomo jednak jakie jest w tym przypadku główne źródło reaktywnych form tlenu. Podanie inhibitorów mitochondrialnego łańcucha oddechowego, rotenonu i antymycyny A, nie dało jednoznacznych odpowiedzi. Nasunęło jednak przypuszczenia co do aktywacji, innych niż mitochondria, mechanizmów zwiększających produkcję RFT [60]. W celu uzyskania bezpośrednich dowodów wpływu stresu oksydacyjnego na homeostazę wapniową w komórkach śródbłonka, prowadzono doświadczenia, w których uprzepuszczalniano błonę plazmatyczną, a następnie traktowano komórki nadtlenkiem wodoru. Zauważono zwiększenie stężenia wapnia w mitochondriach, do którego prawdopodobnie dochodzi na skutek inaktywacji wymiennika Na + /Ca 2+ w tych organellach. Postuluje się, że taki sposób rozregulowania sygnałów wapniowych w komórce może być istotny w stanach patologicznych układu sercowo-naczyniowego [12]. Zahamowanie napływu jonów wapnia przez czynniki oksydacyjne poprzedza zahamowanie stymulowanego agonistą uwolnienia jonów wapnia z ER. Przypuszcza się, że stres oksydacyjny przyczynia się do utlenienia przekaźnika sygnału i/lub miejsca jego wiązania w błonie plazmatycznej. Może to dotyczyć miejsca wiązania cząsteczki przekaźnika, poru kanału, czy też mechanizmu bramkowania kanału. Ponadto, stres oksydacyjny może wpływać na białka transportujące błony plazmatycznej, co wpływa na gradient jonowy i wtórnie hamuje napływ Ca 2+. Poza zahamowaniem aktywności transportu jonów, postulowana jest indukowana stresem oksydacyjnym aktywacja nieselektywnych kanałów kationowych, kanałów potasowych zależnych od Ca 2+ i pomp sodowych w błonie plazmatycznej. Zmiana w sygnalizacji wapniowej i transporcie przez błony stanowi podstawę do dalszych zaburzeń w funkcjonowaniu komórek śródbłonka naczyniowego, włączając modyfikacje w przekazywaniu sygnału do komórek mięśni gładkich i innych komórek towarzyszących. W przypadku długotrwałego stresu oksydacyjnego stwierdzono wzrost spoczynkowego stężenia jonów wapnia w komórkach śródbłonka. Przypuszcza się, że jest to spowodowane zahamowaniem pomp wapniowych w błonie plazmatycznej [61]. W warunkach nadmiernego stresu oksydacyjnego obserwuje się zwiększenie śmiertelności komórek śródbłonka naczyniowego. Dochodzi do indukcji genów związanych z apoptozą, któremu towarzyszy aktywacja zależnych od Ca 2+ kinaz i/lub fosfataz. Dodatkowo, wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia sprzyja aktywacji proteaz i/ lub endonukleaz, które powodują uszkodzenia DNA, charakterystyczne dla programowanej śmierci komórki [62]. CZYNNIKI RYZYKA CHORÓB SERCOWO-NACZYNIOWYCH NADCIŚNIENIE TĘTNICZE JAKO SKUTEK I PRZYCZYNA STRESU OKSYDACYJNEGO Nadciśnienie tętnicze jest jednym z czynników, którego skutkiem może być dysfunkcja śródbłonka. Mimo wieloletnich badań, mechanizmy prowadzące do rozwoju tej choroby nie są ostatecznie wyjaśnione. We wczesnych etapach kluczową wydaje się rola stresu oksydacyjnego w komórkach śródbłonka naczyniowego. Z drugiej jednak strony, wytwarzanie RFT w komórkach śródbłonka może być dalszym skutkiem nadciśnienia tętniczego. Powstaje zatem pętla dodatniego sprzężenia, utrudniająca rozpoznanie skutku i przyczyny. Stres oksydacyjny prowadzi do wzrostu oporu naczyniowego na skutek obniżonej biodostępności NO, peroksydacji lipidów błonowych i upośledzenia rozkurczu oraz poprzez zwiększenie proliferacji mięśni gładkich ściany naczynia [54]. Do skurczu mięśni gładkich, jak opisywano w rozdziale dotyczącym regulacji napięcia naczyń, dochodzi w wyniku wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia. Powstaje kompleks Ca 2+ /kalmodulina, który aktywuje MLCK. Następuje fosforylacja lekkich łańcuchów miozyny prowadząca w konsekwencji do aktywacji miozyny tworzącej kompleks z aktyną. Dochodzi do skurczu mięśni gładkich. Proces ten wymaga hydrolizy ATP. Aktywacja cyklazy guanylanowej przez NO i w efekcie wzrost stężenie cyklicznego GMP powoduje aktywację fosfatazy, która katalizuje defosforylację miozyny, a zatem jej inaktywację, co prowadzi ostatecznie do rozkurczu mięśni. Proces ten powoduje zmniejszenie wrażliwości mięśni gładkich na jony wapniowe. Wzrasta aktywność zależnych od wapnia kanałów potasowych, czego skutkiem jest opisywana powyżej hiperpolaryzacja błony komórkowej i zmniejszenie aktywności zależnych od napięcia kanałów wapniowych [63]. W badaniach komórek śródbłonka izolowanych ze szczurów, u których spontanicznie rozwijało się nadciśnienie, obserwowano przeładowanie jonami wapnia, któremu towarzyszyło zwiększenie produkcji RFT [9,47] Jednym ze szczególnie poważnych przypadków choroby nadciśnieniowej jest nadciśnienie ciężarnych i towarzyszący mu stan przedrzucawkowy. Są to jedne z najbardziej niebezpiecznych powikłań ciąży, które wiążą się ze zwiększonym ryzykiem śmiertelności okołoporodowej. Patologiom tym towarzyszy wzrost poziomu endoteliny-1 (ET-1), który następuje w odpowiedzi na wzrost stężenia jonów wapnia uwalnianego z magazynów wewnątrzkomórkowych. Interesujące z diagnostycznego punktu widzenia jest to, że stężenie ET-1 może być wykorzystywane u ciężarnych w ocenie zaawansowania nadciśnienia indukowanego ciążą [8]. Zarówno w nadciśnieniu tętniczym, jak i w nadciśnieniu ciężarnych, obserwuje się obniżenie dostępności NO, co jest przecież niezwykle istotne dla zachowania prawidłowych funkcji śródbłonka naczyniowego. Wykazano, że w czasie ciąży, mechanizmy adaptacyjne kompensujące niedobory NO, aktywowane są na drodze zależnej od współdziałania receptorów IP 3 i TRPC na poziomie błony plazmatycznej [64]. U kobiet w stanie przedrzucawkowym stwierdzono znacznie mniejsze pobieranie jonów wapnia, w porównaniu ze zdrowymi ciężarnymi kobietami. Wykazano, że ryzyko wynikające z indukowanego ciążą nadciśnienia i stanu przedrzucawkowego, zdecydowanie obniżało się u ciężarnych przyjmujących suplementy diety zawierające wapń. Prawdopodobnie jest to skutkiem wpływu Ca 2+ na syntezę tlenku azotu w komórkach śródbłonka. W badaniach in vitro wykazano, że zmiany stężenia wapnia w środowisku zewnątrzkomórkowym mają istotny wpływ na poziom syntezy enos, a zatem bezpośrednio wpływają na ilość wydzielanego NO [52]. CUKRZYCA JAKO WYSOKI CZYNNIK RYZYKA POWIKŁAŃ SERCOWO-NACZYNIOWYCH Cukrzyca typu 2 jest obecnie najpowszechniejszym schorzeniem metabolicznym na świecie, a liczba chorych rośnie Postępy Biochemii 58 (4)

9 w szybkim tempie. Komplikacje ze strony układu sercowo- -naczyniowego są głównym powodem pogorszenia stanu zdrowia i śmierci wśród tych pacjentów. Ekspozycja komórek śródbłonka na, charakterystyczne dla cukrzycy, wysokie stężenia glukozy znacznie przekraczające prawidłowy poziom fizjologiczny, przyczynia się do ich poważnych uszkodzeń. Zaobserwowano także, że w warunkach hiperglikemii zaburzeniom podlega homeostaza wapniowa komórek śródbłonka. Przeprowadzone badania na różnego typu modelach doświadczalnych śródbłonka naczyniowego wskazują na wewnątrzkomórkowy wzrost stężenia wolnych jonów wapnia w warunkach hiperglikemii (Ryc. 6). Opisano to między innymi dla pierwotnych komórkach HUVEC oraz wyprowadzonej z nich linii unieśmiertelnionej EA.hy926. Nie do końca jest jasne, czy zwiększenie stężenia Ca 2+ w cytoplazmie tych komórek po inkubacji w warunkach hiperglikemicznych następuje na skutek wzmożonego opróżniania wewnątrzkomórkowych magazynów czy poprzez aktywację napływu z przestrzeni pozakomórkowej [65,66]. Czterodniowe traktowanie komórek HUVEC glukozą o stężeniu 30 mm, prowadzi na przykład do zwiększenia pojemnościowego napływu wapnia. Aktywacja tych komórek histaminą dała podobne rezultaty. Ponadto, zauważono również, że hiperglikemia powoduje apoptozę na drodze zależnej od kalcyneuryny i SOCE. Ca 2+ jest aktywatorem tego enzymu, zaś sama kalcyneyruna odgrywa istotną rolę w procesach związanych z programowaną śmiercią komórek. Sugeruje się, że proces ten jest aktywowany w wyniku zwiększonej produkcji nadtlenku wodoru [67]. Inne badania pokazują, że w warunkach hiperglikemicznych w śródbłonku dochodzi do zmian aktywności białek uczestniczących w utrzymaniu homeostazy wapniowej takich jak SERCA oraz wymiennika Na + /Ca 2+ (NCX) [68]. Komórki śródbłonka naczyniowego, główny cel uszkodzeń hiperglikemicznych u cukrzyków, mimo znacznego wzrostu stężenia glukozy, nie wykazują istotnych zmian w szybkości transportu tego cukru. Zaobserwowano, że w cukrzycy dochodzi do zaburzenia homeostazy wapniowej w kardiomiocytach na drodze zależnej od acetylacji O-GlcNAc (ang. O- -linked-n-acetylglucosamine). O-GlcNAc zmniejsza ilość mrna i syntezę białka ATPazy wapniowej drugiej (SERCA2) w siateczce sarkoplazmatycznej, jak również obniża aktywność promotora dla tego genu. Zaburza to pojemnościowy napływ wapnia, głównie napływ jonów Ca 2+ przez kanały w błonie plazmatycznej aktywowane opróżnieniem magazynów wapniowych w siateczce śróplazmatycznej i sarkoplazmatycznej [58]. Ca 2+ jest skutecznym aktywatorem syntazy tlenku azotu, jak też odgrywa kluczową rolę w regulowaniu aktywności tego enzymu, co było omawiane powyżej. enos jest wrażliwa na wszelkie zmiany wewnątrzkomórkowej zawartości wolnych jonów wapnia [69]. W cytoplazmie komórek śródbłonka naczyniowego eksponowanych na wysokie stężenia glukozy obserwowano znaczące obniżenie spoczynkowego stężenia wapnia. Może to zatem prowadzić do obniżenia aktywności NOS, a co za tym idzie zmniejszenia ilości powstającego tlenku azotu [70]. W komórkach HUVEC, uwolnienie jonów wapnia z siateczki śródplazmatycznej jest wystarczające do aktywacji kinazy zależnej od AMP. Enzym ten odgrywa w komórkach śródbłonka istotną rolę w procesach związanych z regulacją metabolizmu i angiogenezą. Jego aktywacja chroni komórki przed różnego rodzaju stresem, między innymi wysokimi stężeniami glukozy (hiperglikemia) czy kwasów tłuszczowych (hiperlipidemia). AMPK reguluje metabolizm kwasów tłuszczowych i reguluje pobieranie glukozy, przez co jest związana z metabolizmem energetycznym komórek. Enzym ten fosforyluje enos i tym samym ją aktywuje, co prowadzi do wzrostu produkcji NO. Dodatkowo zwiększa wrażliwość na insulinę i chroni komórki śródbłonka przed apoptozą indukowaną w warunkach hiperglikemii [71]. PODSUMOWANIE Rycina 6. Hiperglikemia sprzyja rozwojowi dysfunkcji śródbłonka. Glukoza w wysokim stężeniu zaburza sygnalizację wapniową, przyczynia się do zwiększonej produkcji RFT, prowadzi do zmniejszenia biodostępności NO, obniża wydzielanie PGI 2 oraz indukuje odpowiedź zapalną komórek śródbłonka. PKC kinaza białkowa C; NADPH Ox oksydaza NAD(P)H; ICAM1 i VCAM1 cząsteczki adhezyjne; ET-1 endotelina 1. Nie ulega wątpliwości, że jon wapniowy jest jednym z najważniejszych przekaźników sygnału we wszystkich rodzajach komórek. Jego stężenie jest precyzyjnie regulowane dzięki obecności pomp, wymienników, kanałów, magazynów i buforów wapniowych. Liczne białka wrażliwe na zmiany stężenia Ca 2+ dekodują sygnał wapniowy i umożliwiają prawidłową reakcję komórki. Mechanizmy te są w swojej istocie podobne we wszystkich typach komórek, natomiast koordynacja ich działania z innymi, komórkowo specyficznymi procesami sprawia, że działanie jonów wapnia jest jednocześnie uniwersalne i wszechstronne. W komórkach śródbłonka wapń uczestniczy w procesach charakterystycznych dla tego organu, reguluje napięcie ścian naczyń krwionośnych, bierze udział w utrzymaniu bariery krew-tkanki czy narządy, ale również uczestniczy w powstawaniu nowych naczyń krwionośnych czy gojeniu ran. Poza znaczeniem wapnia dla fizjologicznych funkcji śródbłonka, jon ten reguluje odpowiedź komórek na stres. W wielu stanach patologicznych dochodzi do zaburzenia przekazywania sygnału między warstwą śródbłonka a mięśniówką okalającą naczynia. Podejmowano już próby hamowania rozwoju nowotworów zależnego od angiogenezy poprzez ingerencję w mechanizmy regulujące napływ wapnia. Wydaje się, że dokładne poznanie mechanizmów regulujących zmiany stężenia jonów wapnia w komórkach śródbłonka, może mieć istotne 426