Metody wykrywania czynników prognostycznych w ostrej białaczce limfoblastycznej u dzieci

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(4): Praca poglądowa Review Article Metody wykrywania czynników prognostycznych w ostrej białaczce limfoblastycznej u dzieci Methods of prognostic factors detection in childhood acute lymphoblastic leukemia Łukasz Sędek 1,2 1 Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej, 2 SK Nr 1, SUM Laboratorium Centralne, Pracownia Immunologii Streszczenie Ostre białaczki to heterogenna grupa chorób. Najczęściej występującym u dzieci podtypem białaczki jest ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów B. Rozwój ostrych białaczek jest poprzedzony wystąpieniem przynajmniej dwóch tzw. niekorzystnych zdarzeń. Pierwszym z nich jest uszkodzenie DNA, do którego w części przypadków dochodzi już podczas życia płodowego. Dlatego też, u większości pacjentów w momencie rozpoznania ostrej białaczki można wykryć w blastach białaczkowych określone aberracje genetyczne. Cytometria przepływowa jest obecnie szeroko rozpowszechnioną techniką stosowaną w laboratoriach zajmujących się diagnostyką chorób hematologicznych. Umożliwia ona ocenę składu antygenowego (fenotypu) komórek białaczkowych, również pod kątem antygenów, które mogą być związane z określonymi aberracjami genetycznymi (np. obecnością translokacji t(12;21) o korzystnym znaczeniu rokowniczym lub rearanżacji obejmujących gen MLL o rokowaniu niekorzystnym). Do oceny zawartości DNA, która również ma znaczenie rokownicze, może być użyta zarówno technika cytometrii przepływowej, jak również klasyczna cytogenetyka. Inne techniki, takie jak łańcuchowa reakcja polimerazowa z odwrotną transkryptazą oraz technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, również są powszechnie w laboratoriach diagnostycznych. Metody te umożliwiają wykrycie zmian na poziomie chromosomów i pojedynczych genów i są one najczęściej wycelowane w konkretne zaburzenia, zarówno o korzystnym jak i niekorzystnym znaczeniu prognostycznym. Istnieją również bardziej zaawansowane metody badań genetycznych, jak np. specyficzna dla miejsca ligacji multipleksowa amplifikacja PCR sond, porównawcza hybrydyzacja genomowa z użyciem mikromacierzy, sekwencjonowanie nowej generacji, które charakteryzują się dużą czułością, jednak mają one zastosowanie głównie w badaniach naukowych. Poszczególne metody mają swoje zalety, ale i ograniczenia, różnią się czasem potrzebnym do uzyskania wyniku, czułością i specyficznością, kosztem wykonania oznaczenia, a także dostępnością. Summary Acute leukemias constitute a heterogeneous group of diseases. The most common leukemia subtype in children is B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Development of acute leukemias is a consequence of at least so-called two unfavorable events. The first event results in DNA damage, which in part of the cases takes place during fetal development. Therefore, in majority of patients at diagnosis, it is possible to detect particular genetic abnormalities in leukemic blasts. Flow cytometry is currently broadly used technique in laboratories dealing with hematological disorders. It enables determination of the antigen repertoire (phenotype) of leukemic cells, including the antigens associated with certain genetic abnormalities (such as prognostically favorable t(12;21) translocation or MLL gene rearrangements being a marker of poor prognosis). DNA content, which is also a prognostic factor, can be evaluated both with flow cytometry and classical cytogenetics. Other techniques, such as reverse transriptase polymerase chain reaction, fluorescent in situ hybridization, are also commonly used in diagnostic laboratories. These techniques enable detection of changes at chromosomal or single-gene level and are most frequently targeted into particular aberration, both of favorable and unfavorable prognosis. There are also more advanced, highly sensitive genetic techniques (such as multiplex ligation-dependent probe amplification, array-comparative genomic hybridization, next generation sequencing), but their application is limited for research. Particular techniques have their advantages and limitations, differ with result production time, sensitivity and specificity, cost of the analysis as well as availability. Słowa kluczowe: Key words: ostra białaczka limfoblastyczna, czynnik prognostyczny, cytometria przepływowa, reakcja łańcuchowa polimerazy, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ. acute lymphoblastic leukemia, prognostic factor, flow cytometry, polymerase chain reaction, fluorescent in situ hybridization 297

2 Wprowadzenie Ostre białaczki (AL; Acute Leukemias) to heterogenna grupa chorób, u podstaw których leży nieprawidłowy rozrost niedojrzałych komórek prekursorowych (blastów białaczkowych) wywodzących się z różnych linii komórkowych. W przypadku rozrostu niedojrzałych komórek z linii limfoidalnej, mamy do czynienia z ostrymi białaczkami limfoblastycznymi (ALL; Acute Lymphoblastic Leukemia), natomiast rozrost komórek linii mieloidalnej, monoidalnej, erytroidalnej lub megakariocytarnej kategoryzowany jest ogólnie jako ostre białaczki szpikowe (AML; Acute Myeloid Leukemia). Wg danych literaturowych popartych prowadzonymi od 2007 roku badaniami własnymi 87,4% ostrych białaczek u dzieci stanowi ALL, przy czym 76,7% to ALL z komórek prekursorowych limfocytów B (BCP-ALL; B-Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia), 9,6% to ALL z linii limfocyta T (T-ALL; T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia), natomiast 1,1% stanowią AL bifenotypowe i biliniowe (ryc. 1) [1 3]. Według obecnie przyjętych teorii, ostre białaczki rozwijają się na skutek wystąpienia przynajmniej dwóch tzw. niekorzystnych zdarzeń. Pierwszym jest uszkodzenie DNA (w postaci rearanżacji chromosomalnych takich jak translokacje, delecje, duplikacje lub inwersje), do którego w części przypadków dochodzi już podczas życia płodowego. Drugim zdarzeniem jest prawdopodobnie zadziałanie pewnych czynników środowiskowych (takich jak promieniowanie jonizujące lub infekcje wirusowe często powodujące mutacje punktowe, zmieniające funkcje genów) [4, 5]. Dlatego też, u większości pacjentów w momencie rozpoznania ALL, można wykryć w blastach białaczkowych określone aberra- Tabela I. Wybrane aberracje genetyczne w ALL (na podstawie [7, 8]) Rodzaj aberracji Produkt genowy Podtyp ALL t(12;21)(p13;q22) ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) Częstość występowania Znaczenie prognostyczne BCP-ALL 15 25% + t(9;22)(q34;q11.1) BCR-ABL1 BCP-ALL 2 4% t(1;19)(q23;p13.3) hipodiploidia ( 44 chromosomów) hiperdiploidia (>50 chromosomów) rearanżacje genu CRLF2 rearanżacje genu IKZF1 tworzą podgrupę BCR- ABL1-like TCF3-PBX1 (E2A-PBX1) IGH@-CRLF2 P2RY8-CRLF2 (nadekspresja CRLF2) ; ulega poprawie w ostatnich latach BCP-ALL 5 6 % + BCP-ALL 1 2% BCP-ALL 20 30% + BCP-ALL pacjenci z zespołem Downa: 55% pozostali: 5 7% BCP-ALL 10% tylko dla BCP-ALL bez zespołu Downa (zwiększone ryzyko wznowy) Techniki diagnostyczne RT-PCR, FISH, FC, fosfo-fc FC, klasyczna cytogenetyka MLPA, fosfo-fc delecja ERG BCP-ALL 7% + rearanżacje MYC t(8;14)(q24;q32) t(2;8)(q12;q24) różne produkty BCP-ALL 2% + RT-PCR, FISH rearanżacje genu MLL t(4;11)(q21;q23) MLL-AFF1 (MLL-AF4) BCP-ALL T-ALL BCP-ALL 5 8% 5 10% niemowlęta: 70-80% starsze dzieci: ok. 2% tylko dla niemowląt z ALL RT-PCR, FISH, FC translokacje genów TCR z różnymi onkogenami: T-ALL 40 50% t(10;14)(q24;q11) nadekspresja TLX1 (HOX11) t(5;14)(q35;q32) nadekspresja TLX3 (HOX11L2) + RT-PCR, FISH (10;11)(p12;q14) PICALM-MLLT10 (CALM-AF10) T-ALL 10% BCP-ALL ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów B; FC cytometria przepływowa; FISH fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; MLPA specyficzna dla miejsca ligacji multipleksowa amplifikacja sond; RT-PCR łańcuchowa reakcja polimerazowa z odwrotną transkryptazą; T-ALL ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów T; + korzystne znaczenie rokownicze, niekorzystne znaczenie rokownicze; 298

3 Diagn Lab 2015; 51(4): cje genetyczne, a część z nich może być korzystnym lub niekorzystnym czynnikiem prognostycznym [6]. W ostatnich 30 latach zidentyfikowano wiele różnych aberracji genetycznych towarzyszących różnym podtypom ALL u dzieci, które zostały zestawione w tabeli I. Zaburzenia te wykrywane są podczas rutynowej diagnostyki różnymi metodami, takimi jak: cytometria przepływowa, klasyczna cytogenetyka, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, łańcuchowa reakcja polimerazowa z odwrotną transkryptazą. Inne, bardziej zaawansowane metody charakteryzują się dużą czułością jednak mają one zastosowanie głównie w badaniach naukowych (np. fosfo-cytometria przepływowa, specyficzna dla miejsca ligacji multipleksowa amplifikacja PCR sond, porównawcza Rycina 1. Częstość występowania poszczególnych podtypów białaczek i innych chorób hematologicznych u dzieci na podstawie badań własnych prowadzonych od 2007 roku na grupie 1750 hybrydyzacja genomowa z użyciem mikromacierzy, pacjentów (Pracownia Immunologii Laboratorium Szpitala Klinicznego Nr 1 im. Prof. Stanisława sekwencjonowanie nowej generacji). Metody cytogenetyczne, genetyczne, molekularne umożliwiają łaczka szpikowa, BCP-ALL ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów Szyszko w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach). Skróty: AML ostra bia- B, BF/BL-AL. ostra białaczka bifenotypowa/biliniowa, B-NHL chłoniak nieziarniczy z dojrzałych wykrycie tych zmian bezpośrednio na poziomie chromosomów i pojedynczych genów i są one najczęściej prekursorowych limfocytów T, T-NHL chłoniak nieziarniczy z dojrzałych limfocytów T. limfocytów B, MDS zespół mielodysplastyczny, T-ALL ostra białaczka limfoblastyczna z komórek wycelowane w konkretne zaburzenie. Z kolei inne metody, takie jak cytometria przepływowa, umożliwiają ocenę (np. guzów lub węzłów chłonnych) po uprzedniej homogenizacji. składu antygenowego (fenotypu) komórek białaczkowych, również pod kątem antygenów, które mogą być związane z określo- repertuaru antygenów obecnych zarówno na ich powierzchni, Technika FC umożliwia ocenę fenotypu komórek tj. określenie nymi aberracjami genetycznymi [7, 8]. jak i wewnątrz cytoplazmy. W przypadku oznaczeń obejmujących Podstawowe techniki diagnostyczne stosowane do wykrywania czynników prognostycznych w ALL Diagnostyka ALL (oprócz oceny mielogramu) oparta jest obecnie na szeroko rozpowszechnionej w laboratoriach diagnostycznych technice cytometrii przepływowej (FC; Flow Cytometry). Materiałem badanym w FC jest najczęściej szpik kostny lub krew obwodowa, ale możliwe jest również zastosowanie fragmentów tkanek zarówno antygeny powierzchniowe, jak i wewnątrzkomórkowe, w pierwszej kolejności oznacza się antygeny powierzchniowe, po czym próbkę poddaje się utrwaleniu, permeabilizacji i reakcji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom wewnątrzkomórkowym. Do określenia fenotypu (immunofenotypizacji) stosuje się przeciwciała monoklonalne, które wysoce swoiście rozpoznają antygeny docelowe. Przeciwciała monoklonalne sprzężone są ze znacznikiem fluorescencyjnym (fluorochromem), który pod Rycina 2. Przykładowy wynik immunofenotypizacji ALL techniką cytometrii przepływowej. Różnice w ekspresji poszczególnych antygenów pozwalają ustalić linię komórkową, z której wywodzi się białaczka. A BCP-ALL, B T-ALL. Skróty: cy marker cytoplazmatyczny, pow marker powierzchniowy, MPO mieloperoksydaza. 299

4 wpływem wzbudzenia światłem monochromatycznym o określonej długości fali emituje światło fluorescencyjne. Nowoczesna FC umożliwia ocenę wielu antygenów (tj. wielu rodzajów/kolorów fluorescencji) jednocześnie w powszechnym użyciu są cytometry 8-kolorowe, a w wyspecjalizowanych ośrodkach diagnostyczno- -badawczych 10-, 12-, a nawet 20-kolorowe. Warto nadmienić, że jednoczesne użycie większej liczby przeciwciał monoklonalnych w wieloparametrycznej FC umożliwia pełniejszą ocenę fenotypu badanych komórek i zwiększa specyficzność metody [5, 9-11]. Do celów diagnostycznych, dobiera się przeciwciała wykrywające pożądane antygeny, liniowo specyficzne dla określonego typu badanych komórek, w tym określonego rodzaju blastów białaczkowych (ryc. 2). Dzięki temu można rozpoznać linię komórek z której nastąpił rozrost oraz ocenić stopień dojrzałości blastów białaczkowych. Panele diagnostyczne, które muszą być również dopasowane pod względem rodzaju użytych fluorochromów do możliwości cytometru, powinny zawierać przeciwciała umożliwiające odpowiednią klasyfikację i określenie podtypu ALL (np. CD19, cytcd79a, CD22, CD10, CD20, CD22, CD34, TdT dla BCP-ALL oraz CD3, cytcd3, CD2, CD7, CD5, CD4, CD8, CD1a, CD99 dla T-ALL). Ważnym dopełnieniem w diagnostyce ALL jest również ocena ekspresji antygenów linii mieloidalnej (takich jak powierzchniowe CD13, CD14, CD15, CD33, CD64, CD66c, CD117 oraz cytoplazmatyczna mieloperoksydaza). Daje to możliwość wykrycia tzw. koekspresji antygenów mieloidalnych na blastach w ALL oraz immunofenotypów nietypowych. W zależności od liczby i rodzaju wykrytych antygenów innej linii komórkowej (zarówno limfoidalnej jak i mieloidalnej) możliwe jest wykrycie białaczek o mieszanym fenotypie (MPAL; mixed phenotype acute leukemia) oraz białaczek dwuliniowych (BAL; bilineage acute leukemia), w których wykrywalne są dwie populacje blastów pochodzących z różnych linii (zarówno limfoidalnych, jak i mieloidalnych). W panelu diagnostycznym warto również uwzględnić przeciwciała przeciwko antygenom, mającym potencjalne znaczenie prognostyczne o silnej korelacji zarówno z korzystnymi, jak i niekorzystnymi czynnikami rokowniczymi [10-12]. Przykładem aberracji o korzystnym znaczeniu prognostycznym, które może być badane techniką FC jest translokacja t(12;21), prowadząca do powstania genu fuzyjnego ETV6-RUNX1 (dawniej TEL-AML1). Stwierdzana jest u ok. 22% dzieci z BCP-ALL [6-8]. Wykrycie tego zaburzenia wymaga stosowania technik molekularnych (głównie RT-PCR lub FISH por. niżej), jednak wykazano, że powstanie genu fuzyjnego ETV6-RUNX1 jest silnie skorelowane z brakiem lub obniżoną ekspresją antygenu CD9 na blastach (wg danych literaturowych, czułość: 88-92%, specyficzność: 71-90%, dodatnia wartość predykcyjna: 47-75%) [13]. Natomiast zaburzeniem będącym niekorzystnym czynnikiem prognostycznym, możliwym do oceny techniką FC, są różne rearanżacje obejmujące gen MLL. Stwierdzane są w ok. 8% przypadków ALL u dzieci i obserwowane są w 70-80% przypadków niemowlęcej BCP-ALL, najczęściej o fenotypie CD10 (pro-b-all). Zidentyfikowanych zostało wiele genów-partnerów dla genu MLL, z którymi dochodzi do fuzji, jak np. najczęściej występująca i mająca szczególnie niekorzystne znaczenie prognostyczne translokacja t(4;11) (q21;q23), której efektem jest gen fuzyjny MLL-AFF1(AF4). Detekcja rearanżacji genu MLL jest silnie skorelowana ze stwierdzeniem na blastach białaczkowych ekspresji antygenu NG2 oraz często towarzyszących antygenów CD15 i CD65 [14, 15]. Na podstawie niepublikowanych wyników badań własnych, przeprowadzonych na grupie 654 dzieci z ALL, rearanżacje genu MLL zostały potwierdzone referencyjną techniką FISH (por. niżej) u 43 pacjentów (6,6%), podczas gdy ekspresja antygenu NG2 potwierdzona techniką FC była obserwowana u 39 pacjentów (6,0%). Czułość i specyficzność ekspresji antygenu NG2 z rearanżacją genu MLL wyniosła odpowiednio 73% i 98%, a dodatnia i ujemna wartość predykcyjna ekspresji antygenu NG2 wyniosła odpowiednio 82% i 98%. Natomiast ekspresja NG2 w połączeniu z brakiem antygenu CD10, zwiększa zarówno pozytywną, jak i negatywną wartość prognostyczną do niemal 100% [16]. Technika FC, oprócz oceny cech fenotypowych może być również użyta do oceny zawartości DNA (ploidii) w blastach białaczkowych, co również ma znaczenie rokownicze (ryc. 3). Do tego celu służy oznaczenie tzw. indeksu DNA (DI), czyli stosunku zawartości DNA w blastach białaczkowych w fazie G 0 /G 1 cyklu komórkowego do zawartości DNA w prawidłowych komórkach diploidalnych (również w fazie G 0 /G 1 ). Do oznaczenia DI używa się barwników (takich jak np. jodek propidyny), które stechiometrycznie wiążą się z DNA, dzięki czemu możliwa jest ilościowa ocena reakcji [9, 12]. Hipodiploidia stwierdzana jest, gdy wyznaczona wartość DI jest mniejsza niż 0,9, dotyczy ok. 1% przypadków ALL u dzieci i związana jest z niekorzystnym rokowaniem. W odróżnieniu od niej, hiperdiploidia skojarzona jest z dobrym rokowaniem, zwłaszcza gdy DI jest wyższy niż 1,20. Stwierdzana jest u ok. 25% dzieci z ALL [7, 8]. Proponowanych jest wiele mechanizmów tłumaczących różnice w odpowiedzi na leczenie pomiędzy pacjentami z hipo i hiperdiploidią (np. zwiększona wrażliwość na sygnały proapoptotyczne spowodowana stresem komórkowym związanym z hiperdiploidią, wyższa ekspresja białek będących receptorami czynników proapoptotycznych lub zaangażowanych w dokomórkowy transport różnych cząsteczek, w tym leków) [17, 18]. Wykazano, że z hiperdiploidią skorelowana jest ekspresja antygenu CD123 na blastach (czułość: 81,5%, specyficzność: 91,5%, dodatnia wartość predykcyjna 78,6%) [19]. Ploidia może być również oceniana techniką klasycznej cytogenetyki oceny kariotypu. Polega ona na liczeniu chromosomów pod mikroskopem, w preparatach blastów poddanych wcześniej hodowli w zoptymalizowanych warunkach, z dodatkiem mitogenów (np. pochodzących ze szkarłatki amerykańskiej), przez co zwiększa się częstotliwość wejścia komórek w fazę mitozy. W metafazie mitozy, wyodrębnione w jądrach chromosomy układają się w centralnej części komórki, tworząc tzw. płytkę metafazową. Dodanie do hodowli kolcemidu zapewnia zatrzymanie cyklu komórkowego w tej fazie, po czym preparaty komórek poddaje się utrwaleniu i wybarwieniu. Stwierdzenie liczby chromosomów 45 lub 47 określa się odpowiednio jako hipodiploidia lub hiperdiploidia. Klasyczna cytogenetyka umożliwia również stwierdzenie obecności charakterystycznego chromosomu Filadelfia, będącego produktem wymiany części dłuższych ramion pomiędzy chromosomami 9 i 22. Doprowadza to do powstania fuzji genów BCR-ABL1, która jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym 300

5 Diagn Lab 2015; 51(4): Rycina 3. Ocena indeksu DNA (DI) w ALL. A kontrola z prawidłowej krwi obwodowej, B ALL bez zmian w zawartości DNA (DI = 1), C ALL z hiperdiploidią (DI = 1,22) strzałką zaznaczono pik hiperdiploidalny, D wysoka ekspresja antygenu CD123 towarzysząca BCP-ALL z hiperdiploidią. w BCP-ALL [20, 21]. Wadą klasycznej cytogenetyki jest to, że uzyskanie płytek metafazowych z komórek białaczkowych nie jest możliwe u wszystkich pacjentów. Wykrywanie zaburzeń leżących u podstaw dziecięcej ALL rutynowo wykonuje się również innymi technikami. Do wykrywania aberracji genetycznych takich jak np. translokacje chromosomalne szeroko stosowana jest technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH; Fluorescent In Situ Hybridization) [20-22]. Zaletą tego badania jest to, że można je wykonać na rozmazach szpiku kostnego pobranych przy rozpoznaniu choroby tak więc jest dostępne praktycznie dla wszystkich pacjentów. Do badań tą techniką można również zastosować komórki z hodowli przygotowanej do klasycznej cytogenetyki. Następnie preparaty komórek poddaje się reakcji (hybrydyzacji) z sondami tj. krótkimi odcinkami polinukleotydowymi wyznakowanymi znacznikiem fluorescencyjnym (najczęściej o kolorze zielonym i czerwonym), komplementarnymi do określonych sekwencji DNA. W wariancie FISH z sygnałem fuzyjnym, sondy dobiera się tak, by hybrydyzowały z różnymi genami, na różnych chromosomach, na podstawie znajomości często występujących rodzajów pęknięć chromosomów w ALL. W przypadku gdy nie ma żadnych zaburzeń, w obrazie mikroskopu fluorescencyjnego, sondy widoczne są jako osobne sygnały (czerwony i zielony), natomiast wystąpienie translokacji powoduje, że również sondy przemieszczają się w pobliże siebie, przez co pod mikroskopem widoczny jest jeden sygnał fuzyjny (żółty) pochodzący od nałożonych na siebie sond (ryc. 4). Z kolei w wariancie FISH z rozszczepieniem sygnału, sondy dobiera się tak, by hybrydyzowały w obrębie jednego określonego genu, po przeciwstawnych stronach znanego miejsca pęknięcia, do którego dochodzi w ALL. Umieszczone blisko siebie sondy wyznakowane są różnymi znacznikami fluorescencyjnymi. W sytuacji prawidłowej (brak translokacji), ze względu na bliskie sąsiedztwo sond, pod mikroskopem widoczny jest jeden sygnał fluorescencyjny (żółty). Dopiero zajście translokacji powoduje rozszczepienie sygnału od obydwu sond i w różnych miejscach preparatu mikroskopowego uwidaczniają się sygnały (czerwone i zielone) pochodzące od pojedynczych sond zhybrydyzowanych z przemieszczonymi różnymi fragmentami tego samego genu (ryc. 4). Wariant z rozszczepieniem sygnału jest niezależny od partnera genowego, z którym dochodzi do fuzji i umożliwia identyfikację nowych rodzajów translokacji genów [20, 22]. Technika FISH umożliwia wykrywanie w BCP-ALL np. translokacji chromosomalnych t(9;22) prowadzącej do powstania genu fuzyjnego BCR-ABL1, translokacji obejmującej gen MLL (markery rokowania niekorzystnego), jak również translokacji t(12;21) prowadzącej do powstania genu fuzyjnego ETV6-RUNX1, translokacji t(1;19), prowadzącej do powstania genu fuzyjnego TCF3-PBX1 (korzystne czynniki prognostyczne). Natomiast w T-ALL, możliwe jest wykrycie translokacji genów TCR z różnymi onkogenami m.in. t(10;14) prowadzącej do powstania genu fuzyjnego TCR-TLX1 (niekorzystny czynnik prognostyczny) oraz t(5;14) prowadzącej do powstania genu fuzyjnego TCR-TLX3 (marker rokowania korzystnego) (tab. I). 301

6 produktu. Często stosuje się modyfikację metody umożliwiającą śledzenie postępu reakcji w czasie rzeczywistym tzw. real time PCR (RQ-PCR), w której konieczne jest zastosowanie oprócz starterów sondy wyznakowanej znacznikiem fluorescencyjnym. Inną modyfikacją reakcji RT-PCR jest jednoczesne użycie wielu starterów rozpoznających różne miejsca złączeń genów fuzyjnych, czyli multipleksowanie (ang. multiplex PCR), co znacząco wpływa na wydajność metody [21-25]. Inne techniki o potencjalnym zastosowaniu w detekcji czynników prognostycznych w ALL Oprócz stosowanych rutynowo technik wykrywania znanych czynników prognostycznych, istnieją inne techniki, umożliwiające bardzo dokładną analizę genomu, eksomu i zmian w ich obrębie, które mogą służyć wykryciu nowych rodzajów zmian genetycznych, będących potencjalnie nowymi czynnikami prognostycznymi w ALL. Jedną z tych technik jest odmiana techniki FC, tzw. fosfocytometria przepływowa (fosfo- -FC; phospho-flow). Przy zastosowaniu odpowiednio zmodyfikowanego protokołu przygotowania materiału do FC, możliwe jest wykrywane ufosforylowanych form białek-cząsteczek przekaźnikowych lub ocena indukcji fosforylacji pod wpływem określonego stymulatora (np. różnych cytokin i interleukin) [26]. Przykładem pierwszego z wymienionych zastosowań jest oznaczenie ufosforylowanej formy białka CrkL, którego obecność silnie koreluje ze wspomnianą wcześniej translokacją genetyczną o niekorzystnym znaczeniu rokowniczym t(9;22) (tzw. chromosom Filadelfia) oraz genu fuzyjnego BCR-ABL1 [7, 8]. Wykorzystanie fosfo-fc Rycina 4. Zasada metody FISH. A z sygnałem fuzyjnym, B z rozszczepieniem sygnału (opis daje przewagę w wykrywaniu ALL z fuzją genów BCRw tekście ). Zaadaptowano z [20]. -ABL1 nad tradycyjną FC, gdyż nie wykazano dotychczas dostatecznie silnej asocjacji tego zaburzenia z ekspresją określonych antygenów powierzchniowych. W ostatnich Równie powszechnie, do detekcji aberracji genetycznych w ALL stosowana jest technika łańcuchowej reakcji polimerazowej z odwrotną transkryptazą (RT-PCR; reverse transriptase polymerase tzw. BCR-ABL-like ALL, o niekorzystnym znaczeniu prognostycz- latach wyodrębniono dodatkową podgrupę w obrębie BCP-ALL, chain reaction). Materiałem wyjściowym jest wyizolowane z blastów RNA, które następnie poddawane jest transkrypcji do cdna pacjentów z BCP-ALL, jest charakterystyczny profil ekspresji genów, nym. Podstawą wyróżnienia tej podgrupy, która stanowi 5-10% w reakcji z odwrotną transkryptazą. W następnym etapie stosuje podobny do profilu ALL z fuzją genów BCR-ABL1. Cechą wspólną się startery (krótkie sekwencje DNA) komplementarne do znanych miejsc złączeń genów fuzyjnych wspomnianych wcześniej gen JAK, wpływający na przekaźnictwo sygnału komórkowego obydwu tych podgrup jest występowanie mutacji aktywujących (tab. I), będących matrycą dla nowopowstającej nici DNA. Reakcje szlakiem JAK-STAT. Mutacjom tym może towarzyszyć nadekspresja przebiegają sekwencyjnie w odpowiednio zaprogramowanym białka będącego receptorem dla cytokin (CRLF2; Cytokine Receptortermocyklerze. Cykl reakcji obejmuje denaturację cdna w 95 C, -Like Factor-2) poprzez fuzję genu CRLF2 m.in. z genem P2RY8 lub następnie przyłączenie startera w temperaturze C oraz właściwą reakcję polimeryzacji (elongacji) w temperaturze około 72 C, (IGH@) i/lub aberracje (delecje, mutacje punktowe, inne rearanża- z lokus rodziny genów ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego przebiegającą w kilkunastu-kilkudziesięciu cyklach. W każdym cje) w obrębie genu IKZF1, zaangażowanego w prawidłowe dojrzewanie limfocytów B. Ponadto, w podgrupie BCR-ABL1-like stwierdza cyklu powstają nowe, komplementarne do badanej sekwencji odcinki DNA, które również służą jako matryce w kolejnych cyklach się nadmierną fosforylację białka przekaźnikowego Stat5, co może amplifikacji, dzięki czemu przyrost produktu jest wykładniczy. Do być wykryte właśnie techniką fosfo-fc [27, 28]. mieszaniny reakcyjnej konieczne jest dostarczenie (oprócz enzymów) substratu, którym jest mieszanina nukleotydów (trifosforanów deoksyrybonukleozydów). Produkt reakcji poddawany jest elektroforezie, która daje możliwość identyfikacji otrzymanego Metoda specyficznej dla miejsca ligacji multipleksowej amplifikacji PCR sond (MLPA; Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) jest techniką opartą na multipleks-pcr umożliwiającą wykrywanie zmienionej liczby kopii genów. W odróżnieniu od typowej reakcji multipleks-pcr, w MLPA amplifikacji ulegają sondy (a nie sekwencje badanego DNA, do których one hybrydyzowały). Technika ta umożliwia jednoczesną amplifikację wielu sond zhybrydyzowanych do różnych sekwencji DNA, przy użyciu poje- 302

7 Diagn Lab 2015; 51(4): dynczego startera, gdyż każda sonda zawiera komplementarną do niego sekwencję. Uzyskane produkty reakcji amplifikacji są analizowane poprzez elektroforezę kapilarną, a wyniki (wzorce pików) porównywane z wynikami uzyskanymi dla określonych próbek referencyjnych. Analiza wyników reakcji MLPA umożliwia identyfikację, które z badanych sekwencji DNA mają zmienioną liczbę kopii. Możliwa jest również analiza nawet całych chromosomów. Ponadto, w połączeniu z techniką długodystansowego (długoodcinkowego) PCR (ang. long range PCR), możliwe jest wykrywanie znanych rodzajów mikrodelecji lub mikroduplikacji obejmujących krótkie sekwencje (kilkadziesiąt nukleotydów) w obrębie jednego genu, co daje znaczną przewagę nad techniką FISH, która nie jest wystarczająco czuła, by wykryć zmiany obejmujące tak małe fragmenty DNA [22, 23, 29]. Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej z użyciem mikromacierzy, acgh (Array-Comparative Genomic Hybridization) lub mikromacierzy SNP o wysokiej gęstości (HD-SNP; high-density SNP array), umożliwia przeszukiwanie (skrining) całego genomu (lub określonych chromosomów) pod kątem wykrycia aneuploidii, duplikacji, delecji, z rozdzielczością limitowaną wyłącznie liczbą oraz wielkością sond użytych do konstrukcji mikromacierzy. Macierze używane w technice acgh zawierają sondy odpowiadające poszczególnym fragmentom każdego z chromosomów, ciasno upakowane na powierzchni mikromacierzy, na które nanosi się badane DNA. Odpowiednie fragmenty badanego DNA hybrydyzują do sondy genetycznej na zasadzie komplementarności, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja delecji i duplikacji o wielkości nawet kilkudziesięciu par zasad. Badanie techniką acgh dostarcza ogromnych ilości danych, wymaga zastosowania specjalistycznego sprzętu, wysoko wykwalifikowanego personelu (bioinformatyk), w związku z czym, koszty są wysokie. Podobnie, technika sekwencjonowania nowej generacji (NGS; Next Generation Sequencing), która umożliwia badanie wybranych paneli genów, całego eksomu lub genomu. Rzadko jednak jest konieczne badanie całego genomu, zwykle badania są celowane, przez co koszty analiz można znacznie obniżyć. Analiza NGS pozwala na wychwycenie zmian na poziomie pojedynczych par zasad, co ma zastosowanie w wykrywaniu rzadkich form polimorficznych alleli genów, w tym zaangażowanych w przekaźnictwo sygnału komórkowego i różnicowanie komórek różnych linii komórkowych, z których mogą wywodzić się białaczki [22, 23]. Podsumowanie Jak pokazują wyniki wielu badań, ALL jest chorobą bardzo heterogenną, zarówno genetycznie, immunofenotypowo jak i klinicznie, a do oceny tej różnorodności można stosować różne techniki diagnostyczne. Sytuacją idealną byłoby przeprowadzenie dla wszystkich pacjentów z rozpoznaną ALL wszelkich niezbędnych badań, by skutecznie zaklasyfikować pacjentów do różnych grup prognostycznych (stratyfikacja) na podstawie wszystkich wykrytych czynników rokowniczych. Diagnostyka ALL przy użyciu wieloparametrycznej FC umożliwia identyfikację wielu markerów o potencjalnym znaczeniu prognostycznym. Niewątpliwą zaletą oznaczeń metodą FC jest jej szybkość wyniki mogą być dostępne w ciągu czasu rzędu godzin od pobrania materiału do badań. Technika FC, oprócz znacznie krótszego czasu potrzebnego do identyfikacji nieprawidłowości genetycznych, charakteryzuje się o wiele niższym kosztem w porównaniu do technik molekularnych takich jak FISH, RT-PCR czy MLPA, które ponadto nie są dostępne we wszystkich ośrodkach hematologicznych, wymagają specjalistycznych laboratoriów, centralizacji badań i transportu próbek. Technika FC staje się obecnie coraz bardziej powszechna i wymaga jedynie standardowego laboratorium wyposażonego w cytometr przepływowy. Wadą techniki FC jest brak stuprocentowej czułości i specyficzności (oraz dodatniej i ujemnej wartości predykcyjnej), dlatego zasadne jest zróżnicowanie metodyki w zakresie wykrywania poszczególnych czynników rokowniczych. W kontekście zarysowanej różnorodności ALL, dokładna charakterystyka biologii ALL daje perspektywy na możliwość zastosowania zindywidualizowanej terapii w przyszłości po to, by osiągnąć jak najlepsze wyniki leczenia tej choroby. Ma to już miejsce np. u pacjentów ze stwierdzoną fuzją genów BCR-ABL1 (głównie techniką FISH lub RT-PCR), których rokowanie, pierwotnie niekorzystne, uległo znaczącej poprawie w związku z zastosowaniem leków inhibitorów kinazy tyrozynowej [30]. Upowszechnienie technik fosfo-fc oraz MLPA może przyczynić się do właściwej identyfikacji podgrupy BCR-ABL1-like, których rokowanie jest również niekorzystne, jednak wstępne wyniki badań wskazują, że poprawę wyników leczenia może przynieść zastosowanie nowych leków o działaniu inhibitorów kinazy tyrozynowej, albo inhibitorów JAK2 [27]. Dalszy postęp może przynieść synteza wyników uzyskanych różnymi technikami przy użyciu metod bioinformatycznych. Dla przykładu, identyfikacja różnych grup prognostycznych, oprócz tego, że charakteryzują się one ekspresją typowego pojedynczego parametru (np. cytometryczna ocena ekspresji antygenu CD123 w hiperdiploidii) w połączeniu z innymi parametrami, określonymi innymi technikami może skutkować wyższą czułością, specyficznością i dodatnią wartością predykcyjną w porównaniu do oceny tylko pojedynczych parametrów. Utworzenie bazy danych dla pacjentów z ALL zawierającej taką kompleksową informację i wzajemne korelacje pomiędzy poszczególnymi wynikami mogłoby stanowić odniesienie dla nowo rozpoznawanych przypadków, a niewykluczone, że również przyczynić się do identyfikacji nowych czynników prognostycznych. Piśmiennictwo 1. Sędek Ł, Bulsa J, Sonsala A i wsp. The immunophenotypes of blast cells in B- -cell acute lymphoblastic leukemia: how different are they from their normal counterparts? Cytometry B Clin Cytom 2014; 86B: Onciu M. Acute lymphoblastic leukemia. Hematol Oncol Clin N Am 2009; 23: Pui CH, Robison LL, Look AT. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 2008; 371: Greaves M. Infection, immune responses and the aetiology of childhood leukaemia. Nat Rev Cancer 2006; 6: Inaba H, Greaves M, Mullighan CG. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 2013; 381: Belson M, Kingsley B, Holmes A. Risk factors for acute leukemia in children: a review. Environ Health Perspect 2007; 115:

8 7. Szczepański T, Harrison CJ, van Dongen JJM. Genetic aberrations in paediatric acute leukaemias and implications for management of patients. Lancet Oncol 2010; 11: Mullighan CG. Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 2012; 122: Sędek Ł, Sonsala A, Szczepański T, Mazur B. Techniczne aspekty cytometrii przepływowej. Diagn Lab 2010; 46(4): Sędek Ł, Flores-Montero J, Bulsa J, et al. Flow cytometric immunophenotyping as diagnostic tool of hematopoietic malignancies. W: Witt M, Dawidowska M, Szczepański T [red.] Molecular aspects of hematologic malignancies. Diagnostic tools and clinical applications. Springer Verlag, Berlin 2012, s Maecker H, Trotter J. Wybór odczynników do wielokolorowej cytometrii przepływowej. Post Bioch 2009; 55(4): Sędek Ł, Mazur B. Cytometria przepływowa. W: Solnica B, Sztefko K [red.] Medyczne laboratorium diagnostyczne. Metodyka i aparatura. PZWL, Warszawa 2015, s Gandemer V, Aubry M, Roussel M, et al. CD9 expression can be used to predict childhood TEL/AML1-positive acute lymphoblastic leukemia: proposal for an accelerated diagnostic flowchart. Leuk Res 2010; 34: Emerenciano M, Renaud G, Santana M, et al. Challenges in the use of NG2 antigen as a marker to predict MLL rearrangements in multi-center studies. Leuk Res 2011; 35: Meyer C, Hofmann J, Burmeister T, et al. The MLL recombinome of acute luekemias in Leukemia 2013; 27: Bulsa J. Charakterystyka kliniczna, biologiczna i immunofenotypowa ostrej białaczki limfoblastycznej z rearanżacją genu MLL u dzieci rozprawa na stopień doktora nauk medycznych. Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Carroll WL. Safety in numbers: hyperdiploidy and prognosis. Blood 2013; 121(13): Dastugue N, Suciu S, Plat G, et al. Hyperdiploidy with chromosomes in childhood B-acute lymphoblastic leukemia is highly curable: CLG-EORTC results. Blood 2013; 121(13): Djokic M, Björklund E, E. Blennow, Mazur J, et al. Overexpression of CD123 correlates with the hyperdiploid genotype in acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2009; 94: Van der Burg M, Poulsen TS, Hunger SP, et al. Split-signal FISH for detection of chromosome aberrations in acute lymphoblastic. Leukemia 2004; 18: Marin C, Martinez-Delgado B, Melendez B, et al. Multiplex-polymerase chain reaction assay for the detection of prognostically significant translocations in acute lymphoblastic leukemia. Hematologica 2001; 86: Sanak M. Metody biologii i genetyki molekularnej. W: Solnica B, Sztefko K [red.] Medyczne laboratorium diagnostyczne. Metodyka i aparatura. PZWL, Warszawa 2015, s Demkow U. Nowoczesne metody badania genomu. Diagnosta Laboratoryjny 2015; 3(39): Fueller E, Schaefer D, Fischer U, et al. Genomic Inverse PCR for Exploration of Ligated Breakpoints (GIPFEL), a new method to detect translocations in leukemia. PLoS ONE 2014; 9(8): e doi: /journal.pone Hang QY, Garner K, Viswanatha DS. Rapid detection of leukemia-associated translocation fusion genes using a novel combined RT-PCR and flow cytometric metod. Leukemia 2002; 16: Krutzik PO, Iris JM, Nolan G, Perez OD. Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications. Clin Immunol 2004; 110: Roberts KG, Pei D, Campana D, et al. Outcomes of children with BCR-ABL1 like acute lymphoblastic leukemia treated with risk-directed therapy based on the levels of minimal residual disease. J Clin Oncol 2014; 32: Roberts KG, Li Y, Payne-Turner D, et al. Targetable kinase-activating lesions in Ph-like acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 2014; 371: Ł 29. Łaczmańska I, Łaczmański Ł. Metoda MLPA oraz jej zastosowanie w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie. Post Biol Kom 2009; 36(4): Schultz KR, Bowman WP, Aledo A, et al. Improved early event-free survival with Imatinib in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia: A Children s Oncology Group Study. J Clin Oncol 2009, 27: Adres do korespondencji: dr Łukasz Sędek Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej Zabrze, ul. 3 Maja tel lsedek@sum.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: