BADANIA PRZEGLĄDOWE ZAKAŻEŃ wirusem zapalenia wątroby typu C

Transkrypt

1 Nr 2 (20) Listopad 2009 ISSN BADANIA PRZEGLĄDOWE ZAKAŻEŃ wirusem zapalenia wątroby typu C NGAL jako nowy marker w diagnostyce chorób nerek Walidacja metody badawczej w laboratorium medycznym część 1

2 ARCHITECT Urine NGAL Lipokalina neutofilowa związana z żelatynazą Fizjologia/Patofizjologia NGAL jest białkiem z rodziny lipokalin. Początkowo wykryte w aktywowanych neutrofilach, występuje również w niektórych nabłonkach, takich jak nabłonki kanalików nerkowych. Jego ekspresja w tych częściach nefronu ulega znacznemu nasileniu w wyniku ich niedokrwiennego lub toksycznego uszkodzenia. Zastosowanie kliniczne Dotychczasowa diagnostyka ostrego uszkodzenia nerek (AKI) opiera się na ocenie wzrostu stężenia kreatyniny w surowicy; jednakże kreatynina nie jest przydatna we wczesnym rozpoznaniu AKI. Oznaczanie NGAL może być przydatne do wczesnego wykrycia AKI w następujących przypadkach: Operacje z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego u dzieci i dorosłych Przezskórne interwencje wieńcowe (PCI) Pacjenci w stanie ciężkim hospitalizowani w oddziałach medycyny ratunkowej i intensywnej opieki medycznej (niewydolność serca, sepsa, niewydolność wielonarządowa) Transplantacja nerki Pacjenci z przewlekłymi chorobami nerek ARCHITECT Urine NGAL Jest testem immunochemicznym, służącym do ilościowego oznaczania NGAL w moczu Wniosek z publikacji Analiza wieloczynnikowa wykazała, że stężenie NGAL w moczu 2 godziny po zastosowaniu krążenia pozaustrojowego było najsilniejszym niezależnym czynnikiem ryzyka ostrego uszkodzenia nerek. J. Mishra et al., Lancet 2005, 365: Komitet Naukowy Dagna Bobilewicz Warszawa Jan Kulpa Kraków Redakcja Mirosława Nowacka Abbott Laboratories Poland Abbott Laboratories Poland Sp. z o.o. ul. Postępu 21 B, Warszawa tel.: , faks: (19)

3 BADANIA PRZEGLĄDOWE ZAKAŻEŃ WIRUSEM ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C Screening fests for infection with hepatitis C virus Kazimierz Madaliński Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny w Warszawie Streszczenie: Sytuacja epidemiologiczna wskazuje na to, że wirus zapalenia wątroby C (hepatitis C virus; HCV) jest ważnym patogenem człowieka, gdyż zakażonych jest 170 osób na świecie. Diagnostyka laboratoryjna zakażeń HCV jest 4-etapowa, tj. obejmuje testy serologiczne: anty- HCV i test potwierdzenia RIBA oraz testy molekularne: oznaczenie HCV-RNA i genotypu wirusa. Wprowadzenie testu ilościowego anty-hcv (wartości sample/cut-off ; S/CO) pozwala bardziej zróżnicować reaktywność (odpowiedź pozytywną) gospodarza i przewidzieć reaktywność w dalszych testach. Test potwierdzenia RIBA ciągle jest używany, lecz badacze zdają sobie sprawę, że znacznie pewniejszy wynik (lecz także nie w 100 %) daje badanie na obecność HCV-RNA w surowicy. Badanie ilościowe HCV-RNA winno wykazywać czułość 32 IU/ml w testach klinicznych; jednak najwyższą czułość wykazuje amplifikacja mediowana przez transkrypcję (TMA: 2-5 IU/ml) oraz PCR w czasie rzeczywistym, 10 IU/ml. Summary: Epidemiological situation indicates that infection with hepatitis C virus (HCV) is important human pathogen, since it concerns 170 mln people worldwide. Laboratory diagnostics of HCV infection is 4-stage, i.e. it contains serological tests: anti-hcv and RIBA confirmation test; then molecular examination for HC-RNA and determination of the viral genotype. Introduction of quantitative anti-hcv test (sample/cut-off value; S/CO) allows the differentiation of the positive host reactivity and also prediction reactivity in the next determinations. RIBA confirmation test is still used in diagnostics, but more certain result which confirms or excludes the presence of virus in the circulation is determination of HCV-RNA. Quantitative HCV-RNA test should have the sensitivity of 32 IU/ml in clinical material; but the most sensitive methods are: transcription mediated amplification (TMA; 2-5 IU/ml) and real time PCR (10 IU/ml). Słowa kluczowe: Wirusowe zapalenie wątroby C, diagnostyka, testy serologiczne anty-hcv i test potwierdzenia; badania molekularne czułość; algorytm badań Key words: Viral hepatitis C, diagnostics, serology anti-hcv and RIBA test; molecular assays sensitivity; algorithm Wstęp Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV; wzw C) stanowi globalny problem zdrowotny, który istniał na długo przedtem, zanim wykryto wirusa. (1) Wg przybliżonych szacunków, ok. 170 mln osób na świecie jest zakażonych wirusem HCV, z czego większość nie jest świadoma tego stanu. Najbardziej narażeni na zakażenie wzw C są obywatele rozwijających się krajów Afryki (np. Egiptu), Azji płd.-wschodniej i Ameryki Łacińskiej, gdzie znacznie ponad 2 % populacji jest zakażona wirusem. Skuteczność terapii, jak i jej dostępność w skali globalnej są ograniczone, co przyczynia się do rozprzestrzeniania wirusa; ponadto, nadal nie udało się wytworzyć skutecznej szczepionki przeciwko wzw C. Przenoszenie wirusa odbywa się drogą parenteralną, najczęściej podczas zabiegów medycznych i niemedycznych, związanych z naruszeniem ciągłości tkanek oraz podczas wstrzykiwania środków odurzających. Do grup ryzyka zakażenia wzw C należą: Narkomani, stosujący środki odurzające drogą dożylną lub donosową, Osoby często/przewlekle hospitalizowane; po zabiegach chirurgicznych, pacjenci hemodializowani i po transplantacji narządów*, Osoby mające b.liczne kontakty heteroseksualne lub homoseksualne, Osoby mające długotrwały kontakt z zakażonym wzw C domownikiem, Osoby po zabiegach stomatologicznych, a także 3

4 kosmetycznych z naruszeniem ciągłości tkanek, np. po tatuażach, Noworodki urodzone przez matki HCV-dodatnie. * Do początku naszego wieku w grupie ryzyka były także osoby, którym wykonano transfuzje krwi, lub przetaczano preparaty krwiopochodne; jednak wprowadzenie po 2000 r. obowiązkowego sprawdzania każdej próbki krwi od dawcy metodami biologii molekularnej niezwykle zminimalizowało przeniesienie wirusa HCV tą drogą. Istnieje ryzyko zawodowe zakażenia wzw C: do grup zawodowych należą pracownicy służby zdrowia, studenci medycyny i stomatologii; policjanci, strażacy, ratownicy i funkcjonariusze służby więziennej; oraz pracownicy stykający się z materiałem biologicznym ludzi. W Polsce mamy ok zakażonych osób (dane Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie). Długotrwałe bez- lub skąpo-objawowe zakażenie może prowadzić do poważnych skutków zdrowotnych, od przewlekłego zapalenia wątroby, poprzez marskość, do raka pierwotnego wątroby. Mogą także powstawać schorzenia pozawątrobowe, jak kłębkowe zapalenie nerek, zapalenie naczyń z krioglobulinemią, pierwotny zespól Sjögrena (reumatoidalny) oraz neuropatie. Wczesne rozpoznanie oraz podjęcie leczenia znacznie zwiększają szanse na skuteczne wyeliminowanie wirusa. Diagnostyka wzw C Diagnostyka opiera się na badaniach pomocniczych, serologicznych badaniach przesiewowych i testach potwierdzenia, oraz badaniach biologii molekularnej. Badania pomocnicze stanowią szeroko stosowane testy biochemiczne, mierzące w podejrzeniach chorób wątroby aktywność enzymów wątrobowych oraz poziom bilirubiny. Do badanych enzymów należą: transaminaza alaninowa (ALT; górna granica wartości referencyjnych 40 U/L), transaminaza asparaginianowa (AST; górna granica 40 U/L), gamma-glutamyl transpeptydaza (GGTP; górna granica: kobiety 60 U/L, mężczyźni 90 U/L), zasadowa fosfataza (ALP; górna granica 126 U/L), dehydrogenaza mleczanowa (LDH; górna granica 230 U/L). Górna granica wartości referencyjnej bilirubiny wynosi 1.0 mg/dl (17 µmol/l). Podwyższona aktywność enzymów wątrobowych świadczy o ich uwalnianiu z uszkodzonych hepatocytów (komórek wątroby), co jest zwykle skutkiem zapalenia wątroby. Diagnostyka serologiczna (przesiewowa) polega na stosowaniu testów immunoenzymatycznych. Testy te opierają się na wykrywaniu przeciwciał anty-hcv skierowanych przeciwko kilku epitopom wirusa. Testy te wykazują wysoką czułość i swoistość, rzędu 98 %. Należy jednak pamiętać, że przeciwciała anty-hcv pojawiają się nie wcześniej niż po 7 8 tyg. od zakażenia, a u pacjentów z pierwotnymi/ wtórnymi niedoborami odporności, czy poddanych immunosupresji, mogą być w ogóle niewykrywalne (patrz: opis algorytmu). Ponadto, u części osób zakażonych zachodzi zjawisko serorewersji, to znaczy iż poziom przeciwciał spada poniżej progu wykrywalności. Natomiast, obecność przeciwciał anty-hcv świadczy o zakażeniu aktualnym lub przeszłym, gdyż przeciwciała mogą się utrzymywać w organizmie przez wiele lat, także wtedy, gdy zakażenie zostało już wyeliminowane. Oszacowanie wyniku ilościowego anty-hcv, wyrażonego jako proporcja sample/cut-off [S/CO] daje dodatkowe, bardzo istotne informacje. (2) S/CO oznacza proporcję wartości OD badanej próbki do wartości OD cut-off, charakterystycznej dla danego testu. Dla przykładu, cut-off testu MEIA (Abbott) wynosi 1.0. Oznacza to, że wszystkie próbki dające wynik < 1.0 są ujemne, natomiast próbki dające wynik > 1.0 są dodatnie. Stosując obliczenie proporcji S/CO, możemy te ostatnie wyniki zróżnicować. I tak, wyniki o proporcji S/CO > 1.0 < 8.0 są nisko dodatnie, natomiast te o proporcji S/CO > 8.0 są wysoko dodatnie (procedura MEIA na aparacie AXSYM). Wartość wysoko dodatnia dla procedury CMIA na aparacie ARCHITECT wynosi > 5.0. Wszystkie wyniki wysoko dodatnie znajdują potwierdzenie w teście Recombinant immunoblot assay ; Western blot (RIBA). Testem potwierdzenia dla oznaczenia przeciwciał anty-hcv jest właśnie reakcja RIBA z 6 antygenami wirusa: C1, C2, E2, NS3, NS4 oraz NS5. W teście RIBA firmy Immunogenetics wynik dodatni, to reakcja (+/-, lub wyższa) z 2 antygenami, w tym NS3, natomiast wynik nieokreślony to reakcja z 1 antygenem (+), lub z NS3 (co najmniej +/ ). Kombinacja różnych wyników ilościowych anty-hcv oraz wyników reakcji RIBA daje możliwości interpretacji, przedstawione na schemacie (algorytm). Przeważa pogląd, że wynik RIBA nieokreślony tak naprawdę należy traktować jako dodatni, gdyż wykazano kontakt z wirusem. Z kolei, część badaczy jest zdania, że test RIBA traci na znaczeniu, gdyż znacznie pewniejszy wynik, który potwierdza lub wyklucza (ale nie w 100 %) zakażenie danej osoby, daje badanie na obecność materiału genetycznego wirusa (HCV RNA). Nie bez znaczenia jest fakt, że to ostatnie badanie można obecnie wykonać znacznie taniej niż jeszcze parę lat temu. Wirus HCV rozprzestrzenia się w organizmie za pośrednictwem kompleksów immunologicznych/krioglobulin i jest znajdowany w wielu lokalizacjach, m.in. w komórkach mózgu, w tym w komórkach glejowych; w płynie mózgowo-rdzeniowym, w komórkach krwi obwodowej makrofagach, limfocytach T i B, oraz komórkach szpiku 4 2(20)

5 kostnego. Oznaczenie HCV-RNA można więc zastosować do komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, które mogą być miejscem replikacji wirusa i czulszym niż surowica markerem ukrytego zakażenia (3). Objaśnienie algorytmu badań przesiewowych Kolejność badań przesiewowych w kierunku HCV przedstawia się następująco. Podstawowym testem jest badanie na obecność przeciwciał anty-hcv. Na terenie Unii Europejskiej testy te mają określoną swoistość zdefiniowaną przez dokument Komisji Europejskiej z maja 2002 r. (4) Wynik: jeśli test wyszedł ujemnie, to wyciągamy wniosek, że osoba nie jest zakażona. Jednak, wniosek ten ma pewne ograniczenia, o których wspomniano wyżej; wymieniono je również w opisie algorytmu. Test dodatni anty-hcv dzielimy na 2 strefy. Przy niskim S/CO (między 1.0 a 8.0 dla aparatów IMx lub AXSYM; między 1.0 a 5.0 dla aparatu Architect),) należy wykonać test RIBA; przy wysokim S/CO (> 8.0; odpowiednio > 5.0 dla aparatu Architect) mamy pewność, że test RIBA będzie dodatni i od razu przystępujemy do wykonania badań molekularnych PCR. Test RIBA: jeśli wynik ujemny wyciągamy wniosek, że pacjent nie jest zakażony. Test RIBA: jeśli wynik dodatni lub nieokreślony wyciągamy wniosek, że pacjent miał kontakt z wirusem HCV. Następny krok: badania molekularne (PCR w kierunku HCV; wymagana czułość 32 IU/ml), jeśli test jest dodatni należy oznaczyć genotyp wirusa. Wniosek: pacjent ma czynne wzw C; określenie genotypu determinuje sposób leczenia. Jeśli test PCR jest ujemny, a wynik RIBA był dodatni lub nieokreślony wyciągamy wniosek, że pacjent jest dodatni tylko na przeciwciała anty-hcv. Oznacza to, że badana osoba miała kontakt z wirusem HCV i zareagowała wytworzeniem przeciwciał. Uwaga: W stosunku do poprzednich ustaleń producentów testu RIBA, należy przyjąć następującą zmianę: wynik nieokreślony jest równoznaczny z wynikiem (+); oznacza on zetknięcie się z wirusem i obecność przeciwciał. Przy wysokim wyniku S/CO anty-hcv wykonujemy reakcję PCR; jeśli wynik jest dodatni należy oznaczyć genotyp. Wniosek: pacjent ma czynne wzw C; określenie genotypu determinuje sposób leczenia. Jeśli reakcja PCR dała wynik ujemny należy wykonać test RIBA; gdy otrzymamy wynik dodatni lub nieokreślony, wyciągamy wniosek, że pacjent jest dodatni na przeciwciała anty-hcv. Jest to dawne, lub obecne zakażenie; po 6 mies. należy powtórzyć reakcję PCR. Wynik ujemny testu RIBA oznacza, że pacjent nie jest zakażony. Badania molekularne Badania molekularne w celu wykrycia HCV-RNA są wykonywane za pomocą jednej z 4 metod: a) polimerazowa reakcja łańcuchowa odwrotnej transkrypcji (RT-PCR), b) reakcja rozgałęzionego DNA, c) polimerazowa reakcja łańcuchowa w czasie rzeczywistym, oraz d) amplifikacja mediowana przez transkrypcję (TMA). Najczęściej używaną metodą jest RT-PCR, ale najwyższą czułość zapewniają metody TMA (2-5 IU/ml) oraz PCR w czasie rzeczywistym (10 IU/ml). Testy PCR w wersji jakościowej zapewniają najprostszą odpowiedź na pytanie co do obecności wirusa HCV w badanej próbce: wynik może być (+), tj. pozytywny; albo ( ), tj. negatywny. Należy wspomnieć, iż testy ilościowe mają nieco wyższą czułość wykrywania HCV-RNA, niż testy ilościowe. Oto jak wygląda skrócony algorytm z uwzględnieniem wyników badań serologicznych i biologii molekularnej. Anty-HCV HCV RNA Interpretacja ( ) ( ) pacjent nie jest zakażony ( ) (+) a) wczesne zakażenie okienko serologiczne b) przewlekłe zakażenie u osoby z niedoborem odporności (+) ( ) a) przewlekłe zakażenie z niską lub przerywaną wiremią b) biernie przeniesione przeciwciała c) wyeliminowane zakażenie d) test anty-hcv fałszywie dodatni (+) (+) przewlekłe lub ostre zakażenie aktywna infekcja wzw C (wg firmy Diagnostyka, zmodyf.) Przedziały wartości testu ilościowego HCV-RNA: 32 IU/ml granica wykrywalności w testach klinicznych do 3.8x10 8 IU/ml b.wysoki poziom Ważne wartości oznaczeń ilościowych HCV RNA są następujące: 1. wartość 4x10 5 IU/ml: poziom wiremii prognozujący możliwość samoistnego wyleczenia; (5) 2. wartość 8x10 5 IU/ml: granica, od której istnieją różne strategie terapii ostrego wzw C; 3. wartość 1x10 6 IU/ml: poziom wiremii, od którego jest duże prawdopodobieństwo przechodzenia HCV przez łożysko u matek HCV-dodatnich. Testy ilościowe odgrywają największą rolę przy kwalifikacji pacjenta do leczenia przeciwwirusowego i przy ocenie odpowiedzi na zastosowane leczenie. Powszechnie uznanym i przyjętym sposobem leczenia przewlekłych zapaleń wątroby C jest terapia skojarzona interferonem-α i ribawiryną. 5

6 Uwaga: Z powodu skąpoobjawowego lub zupełnie bezobjawowego przebiegu wzw C diagnostyka serologiczna i badania molekularne, o których tu mowa, nabierają szczególnego znaczenia. Należy przytoczyć fakt, że w każdym roku polska służba krwi identyfikuje wśród kandydatów na dawców krwi kilkanaście do kilkudziesięciu osób zakażonych wzw C. Osoby te są całkowicie nieświadome swego zakażenia. Innym źródłem wykrywania zakażonych osób są prowadzone raz do roku badania przesiewowe, w ramach tzw. żółtego tygodnia. Przewlekłe vs ostre zapalenie wątroby C Należy pamiętać że > 85 % zakażeń wzw C przebiega jako postać przewlekła, a tylko 15 % ma charakter zakażenia ostrego. Biopsję wątroby wykonujemy tylko w przypadkach przewlekłego zapalenia wątroby w celu potwierdzenia rozpoznania, określenia aktywności zapalnej oraz nasilenia włóknienia. Aktywność zapalna (G, grading) jest mierzona w skali 0 do 18, natomiast nasilenie włóknienia (S, staging) w skali 0 do 4. Okres inkubacji zakażenia ostrego można było prześledzić najbardziej precyzyjnie, śledząc potransfuzyjne zapalenie wątroby typu C. Okres ten wynosił 6 12 tygodni; jednak przebieg wzw C, w porównaniu do dobrze przedtem poznanego wzw B był wyraźnie łagodniejszy. Wyraża się to skąpo-objawowym, często bezżółtaczkowym przebiegiem oraz niższą aktywnością transaminaz (np. AST średnio 470 U/L w wzw C wobec 703 U/L w wzw B, wg Mayera). Tylko wyjątkowo występują objawy zwiastunowe; obecność żółtaczki i powiększenia wątroby występuje tylko w 33 % przypadków tak więc, diagnostyka laboratoryjna odgrywa tu dużą rolę. Przy bardzo sprawnym układzie odpornościowym osoby zakażonej, kiedy reakcja obronna jest szeroka i nastąpi b. szybko w niewielkim odsetku przypadków zakażenie udaje się wyeliminować samoistnie. Najbardziej typowe jednak jest przejście zakażenia ostrego w postać przewlekłą, której przebieg charakteryzuje się następującymi po sobie epizodami wzrostu, a okresami stabilnego poziomu ALT i AST. W wypadku utrzymywania się objawów i innych wykładników zakażenia ostre wzw C należy leczyć interferonem, co określa stanowisko Polskiej Grupy Ekspertów HCV oraz Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych. Podsumowanie Charakterystyczną cechą wzw C jest skrytość zakażenia i skąpość lub zupełny brak objawów chorobowych. Istnieją dobrze zdefiniowane grupy ryzyka zakażenia w populacji. Diagnostyka zakażenia wzw C jest trójstopniowa: testy serologiczne, test RIBA oraz metody biologii molekularnej. Te ostatnie metody nabierają wzrastającego znaczenia. Ciągle brak jest skutecznej szczepionki przeciwko wzw C, co wymusza wzmożoną profilaktykę zakażeń. Należy podkreślić, że już zastosowano bardziej nowoczesne procedury sterylizacji w szpitalach, co pozwoli ograniczyć szerzenie się zakażeń drogą zabiegów medycznych. Piśmiennictwo 1. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M: Science, 1989; 244: Alter MJ, Kunert WL, Finelli L: Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Morbidity Mortality Weekly Reports, Recommendations and reports, 2003; 25: Radkowski M, Gallegos-Orozco JF, Jablonska J, Colby TV, Walewska-Zielecka B, Kubicka J, Wilkinson J, Adair D, Rakela J, Laskus T: Persistence of hepatitis C virus in patients successfully treated for chronic hepatitis C.Hepatology 2005; 41: European Commission decision on common technical specifications for in-vitro medical devices ; 7 th May 2002; znowelizowana Zeuzem S, Fried MF, Torriani F, Zehnter E, Berg T, Lin A i wsp.: EASL 42nd Meeting of the European Association for the Study of Liver Diseases, Barcelona, April 2007; abstr. 350: 321A 6 2(20)

7 BADANIE PRZESIEWOWE W KIERUNKU HCV (ALGORYTM) Test na przeciwciała anty-hcv Ujemny ( ) (S/C0 < 1.0) Osoba nie jest zakażona * niskie S/CO (> 1.0 < 8.0) niskie S/CO (> 1.0 < 5.0) (+) Dodatni wysokie S/CO, > 8.0 dla AXSYM, tmx (Abbott) wysokie S/CO, < 5.0 dla ARCHITECT (Abbott) S/CO dla IMx lub AXSYM (Abbott) S/CO dla ARCHITECT (Abbott) Następny krok: RIBA Następny krok: PCR ujemny dodatni lub nieokreślony ( ) (+) zrób RIBA określ genotyp Pacjent nie jest zakażony zrób PCR Pacjent ma czynne wzw C ( ) RIBA dodatni lub (+) ( ) (+) RIBA nieokreślony lub nieokreślony genotyp pacjent nie jest zakażony Genotyp determinuje rodzaj leczenia Pacjent dodatni na przeciwciała anty HCV pacjent ma czynne wzw C Pacjent dodatni na przeciwciała anty-hcv = jest to dawne lub obecne zakażenie. Powtórzyć PCR! Pacjent miał kontakt z wirusem = dawne lub obecne zakażenie genotyp determinuje rodzaj leczenia * Ograniczenia: Okienko serologiczne wczesny okres zakażenia Dziecko lub osoba dorosła z niedoborem odporności Dziecko lub osoba dorosła na immunosupresji lub z wtórnym niedoborem odporności przy podejrzeniu zakażenia HCV należy zrobić PCR Genotypy 1 (1a i 1b) i HCV wymagają dłuższego leczenia niż pozostałe genotypy 7

8 NGAL jako nowy marker w diagnostyce chorób nerek NGAL as a new marker in diagnostics of renal diseases Magdalena Kuligowska-Prusińska, Grażyna Odrowąż-Sypniewska Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: prof. dr hab. Grażyna Odrowąż-Sypniewska Streszczenie: Ze względu na niewystarczającą czułość dotychczas stosowanych, do oceny czynności nerek, parametrów diagnostycznych poszukuje się nowych markerów uszkodzenia nerek, które umożliwiałyby wczesne rozpoznanie choroby i włączenie odpowiedniego leczenia. Lipokalina związana z żelatynazą neutrofili (NGAL) to nowoodkryty wczesny biomarker uszkodzenia nerek, który, obok tradycyjnych wskaźników, może znaleźć zastosowanie w diagnostyce ostrej i przewlekłej niewydolności nerek. Jej oznaczanie w moczu, który jest materiałem biologicznym stosowanym rutynowo w diagnostyce laboratoryjnej może okazać się przydatne w praktyce klinicznej. Summary: With regard to insufficient sensitivity of diagnostic markers used so far for evaluation of renal function, the search for new markers of renal failure is needed, which may enable the early recognition of renal disease and commencing the proper therapy. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) is a newly discovered biomarker of renal failure, which besides of traditional indices seems to be useful in the diagnosis of acute and chronic renal failure. Determination of lipocalin in the urine, a biological material routinely used in laboratory diagnostics may be useful in the clinical practice. Słowa kluczowe: obojętnochłonna lipokalina związana z żelatynazą (NGAL), choroby nerek Key words: neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), renal diseases Dotychczasowa diagnostyka dysfunkcji nerek uwzględniająca stężenie kreatyniny, a także wyniki badań obrazowych i histologicznych nerek często jest niewystarczająca z powodu zbyt małej dokładności lub dużej inwazyjności. Do tej pory stosowane oznaczanie stężenia kreatyniny w surowicy nie jest czułym wskaźnikiem upośledzenia czynności nerek, zależy bowiem od takich czynników jak: masa mięśniowa, płeć, wiek, dieta. Biorąc również pod uwagę ograniczoną wartość diagnostyczną oznaczania stężenia kreatyniny we wczesnych stadiach ostrej niewydolności nerek, a także trudności w prawidłowym przeprowadzeniu zbiórki dobowej moczu w celu oceny klirensu kreatyniny, istnieje konieczność poszukiwania nowych markerów uszkodzenia nerek, których stężenie we krwi lub moczu ulega zmianie już w przedklinicznym stadium choroby, co umożliwiałoby wczesne rozpoznanie i włączenie odpowiedniego leczenia. Do markerów, które charakteryzują się wyższą czułością i swoistością należą: lipokalina związana z żelatynazą neutrofili (z ang. neutrophil gelatinase-associated lipocalin), czyli NGAL, a ponadto interleukina 18 (IL-18), cząsteczka-1 uszkodzenia nerek (z ang. kidney injury molecule-1), czyli KIM-1, a także cystatyna C (1,2,3). Lipokalina związana z żelatynazą neutrofili NGAL Lipokalina związana z żelatynazą neutrofili (z ang. neutrophil gelatinase-associated lipocalin) czyli NGAL występująca w literaturze również pod nazwą ludzka obojętnochłonna lipokalina (HNL) jest białkiem sekrecyjnym należącym do rodziny lipokalin obecnym w ziarnistościach granulocytów obojętnochłonnych (1,4). Ponadto glikopro- 8 2(20)

9 teina ta znana jest u myszy jako lipokalina 2, onkogen 24p33 lub uterokalina, a u szczurów jako białko 25 kda związane z α2-mikroglobuliną (4). Wykazano, że ludzka forma NGAL składa się z pojedynczych disiarczkowych mostków łańcucha polipeptydowego zawierającego 178 reszt aminokwasowych o masie cząsteczkowej 22 kda, która w wyniku glikozylacji białka wzrasta do 25 kda. Punkt izoelektryczny białka to ph = 8,4 (1). Ryc. 1. Budowa strukturalna NGAL. Aktywacja neutrofili prowadzi do uwalniania z ziarnistości NGALu, która może być wydzielana jako monomer, a w niewielkim stężeniu również jako dimer lub może występować w kompleksie z kolagenazą typu IV, zwaną żelatynazą B lub metaloproteinazą-9 tworząc heterodimer o masie 125 kda (Ryc.1) (4). Podobnie, jak inne lipokaliny, NGAL ma strukturę β-beczułki z hydrofobowym wnętrzem. Wspólną cechą rodziny tych białek, wynikającą z jej struktury, jest zdolność do wiązania i transportu małych lipofilowych cząsteczek, tj. wolnych kwasów tłuszczowych, retinoidów, kwasu arachidonowego i sterydów (5). Wykazano, że wiele lipokalin posiada specyficzne powierzchniowe receptory, jednakże receptora dla NGAL do tej pory nie zidentyfikowano (4). Natomiast ligand NGAL został odkryty przez Goetza i wsp. (6). Wykazano, że głównym ligandem dla NGALu są syderomakrofagi komórki zawierające hemosyderynę, które syntetyzowane są przez bakterie (5,7). Funkcja NGAL Pomimo że NGAL została zidentyfikowana ponad dekadę temu, to fizjologiczna funkcja tego białka jest nadal słabo poznana. Ludzka NGAL została pierwotnie wyizolowana z supernatantu aktywowanych neutrofili. Początkowo była uważana za marker zakażenia, ponieważ podwyższone stężenie tego białka obserwowano w stanach zapalnych i ostrych infekcjach bakteryjnych. Wykazano, że NGAL wywiera efekt bakteriostatyczny poprzez niszczenie syderomakrofagów, dlatego też może być zaangażowana w procesy zapalne w komórkach (5). Ponadto niezależnie od procesu infekcyjnego wzrost stężenia NGAL stwierdza się w astmie, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc, a także gruczolakach i gruczalorakach sutka (4,8,9). Poza tym białko to występuje w tchawicy, żołądku, okrężnicy, a także w kanalikach proksymalnych nerek (9). Jednakże ekspresję NGAL wykazano w licznych ludzkich tkankach tylko na bardzo niskim poziomie, natomiast znacznemu nasileniu ulega ona w uszkodzonych komórkach nabłonkowych, m.in. nerek, wpływając za pośrednictwem czynników transkrypcyjnych, tj. NF-kB na przeżycie i proliferację komórek (2,5). NGAL aktywuje tworzenie nefronów na wczesnym etapie rozwoju nerek, przez co wykazuje działanie ochronne (10). Ze względu na niewielką masę cząsteczkową i odporność na degradację NGAL może być łatwo wydzielana przez komórki grubego odcinka ramienia wstępującego pętli Henlego i cewki zbiorcze oraz wydalana z moczem, zarówno w postaci wolnej, jak i skompleksowanej z MMP-9. Stężenie tego białka w moczu koreluje również ze stężeniem w surowicy krwi, stąd też NGAL może okazać się przydatnym markerem w diagnostyce chorób nerek (1). NGAL we wczesnej diagnostyce ostrego uszkodzenia nerek Ostre uszkodzenie nerek (z ang. acute kidney injury AKI) nowe określenie występujące w literaturze zastępujące termin ostra niewydolność nerek (z ang. acute renal failure) jest częstym powikłaniem po zabiegach kardiochirurgicznych, przeszczepie nerki, wstrząsie kardiogennym i septycznym, po podaniu kontrastu rentgenowskiego lub chemioterapeutyków m.in. niektórych antybiotyków czy niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Badania dowodzą, że AKI rozwija się u ok. 7 % hospitalizowanych pacjentów i aż u % chorych po operacji serca (11). Wśród 5,7 % chorych wymagających dializoterapii wskaźnik śmiertelności wynosi aż %, co dowodzi, że ostre uszkodzenie nerek jest niezależnym czynnikiem ryzyka zgonu (11,12). Pomimo udokumentowanego znaczenia zmodyfikowanej dla AKI klasyfikacji RIFLE obejmującej m.in. zmiany stężenia kreatyniny w surowicy wciąż poszukuje się markerów o wyższej czułości, które byłyby pomocne we wczesnej diagnostyce ostrego uszkodzenia nerek (2). W badaniach przedklinicznych wykazano, że NGAL jest białkiem łatwo wykrywalnym we krwi i moczu po zadziałaniu czynnika nefrotoksycznego, dlatego zaproponowano jego użycie jako nieinwazyjnego markera w diagnostyce AKI (5,11,13). Badania Bennetta i wsp. (14) dowodzą, że NGAL oznaczana w moczu jest wczesnym wskaźnikiem ostrego uszkodzenia nerek u chorych po zabiegach kardiochirurgicznych. U 51 % spośród 196 dzieci, u których rozwinęła się ostra niewydolność nerek po operacji serca zaobserwowano po 2 godz. od zabiegu 15-krotny wzrost stężenia NGAL w moczu i aż 9

10 25-krotny po 4 i 6 godzinach (14). Dla porównania stężenie kreatyniny w surowicy podwyższyło się dopiero po 2-3 dniach od zastosowania krążenia pozaustrojowego (14). Potwierdzają to również badania Mishry i wsp. (15). Również inne badania prospektywne przeprowadzone u dzieci po operacji serca wskazały na znaczny wzrost stężenia NGAL w moczu a także w osoczu po 2-6 godz. od zabiegu, podczas gdy podwyższenie stężenia kreatyniny w surowicy zaobserwowano dopiero po kilku dniach (16), co sugeruje, że NGAL oznaczana w moczu może służyć jako wczesny marker niedokrwiennego uszkodzenia nerek u dzieci po operacji serca (4). Również u dorosłych pacjentów, u których rozwinęła się ostra niewydolność nerek po operacji serca, definiowana jako zwiększenie stężenia kreatyniny w surowicy, obserwuje się wzrost poziomu NGAL w moczu już po 1-3 godzinach od zabiegu (16). Ponadto liczne dane literaturowe wskazują na zależność pomiędzy wczesnym pooperacyjnym stężeniem NGAL oznaczanym w moczu lub osoczu a ciężkością ostrej niewydolności nerek, hospitalizacją pacjenta, koniecznością dializoterapii i zwiększoną umieralnością (16). Stąd też stężenie NGAL w moczu po 2 godz. koreluje z nasileniem i czasem trwania ostrej niewydolności nerek (14,15). NGAL uważana jest za niezależny czynnik rozwoju ostrej niewydolności nerek (16). Wykazano, że stężenie NGAL ściśle koreluje ze stanem ostrym, dlatego też obserwuje się istotny wzrost jej stężenia u chorych z niedokrwiennym uszkodzeniem nerek prowadzącym często do ostrej niewydolności nerek, martwicy cewek lub cewkowo-śródmiąższowej nefropatii (4). Podkreśla się, że pacjenci z chorobą niedokrwienną serca często wykazują różny stopień dysfunkcji nerek na skutek towarzyszących chorób, tj. cukrzycy, nadciśnienia i zastoinowej niewydolności serca, pomimo prawidłowego stężenia kreatyniny w surowicy (17). Ze względu na wzrost stężenia NGAL jeszcze przed obserwowanym podwyższeniem stężenia kreatyniny w surowicy możliwość jej oznaczenia w moczu na powszechnie dostępnym analizatorze immuno-biochemicznym wydaje się być pomocna we wczesnej diagnostyce pacjentów z ostrym uszkodzeniem nerek (16). Ponadto stężenie NGAL wzrasta także u chorych po zabiegu angiografii tętnic wieńcowych (17). Wykazano wzrost stężenia NGAL w surowicy po 2-4 godzinach od zabiegu koronarografii, a w moczu po 4-8 godz. Zaobserwowano także istotną korelację pomiędzy NGAL a innymi markerami funkcji nerek: cystatyną C, GFR i stężeniem kreatyniny w surowicy, co sugeruje, że NGAL może stać się także użytecznym markerem ostrej niewydolności nerek u chorych po zabiegu angiografii tętnic wieńcowych (17). Podobną korelację między czasem po operacji a stężeniem NGAL zaobserwował Mishra i wsp. (15). Badania Devarajana (11) wykazały ponadto, że stężenie kreatyniny w surowicy istotnie koreluje z NGAL oznaczaną w surowicy lub moczu. Interesujące jest jednak, że wzrost stężenia NGAL w surowicy obserwuje się już po 2 godz. od zabiegu koronarografii, natomiast NGAL w moczu wzrasta po 4 godz. i utrzymuje się do 8 godzin po przeprowadzonym zabiegu (17). Badania Mishry i wsp. (15) wskazują na podobną zależność, co dowodzi, że NGAL jest uwalniana do krążenia ponownie przez neutrofile w wyniku aktywacji czynników zapalnych zapoczątkowanej podczas zabiegu koronarograficznego (17). Ponadto obecność NGAL stwierdza się w blaszkach miażdżycowych, co sugeruje, że jest wydzielana do krążenia (17). Podkreśla się, że wiele innych zaburzeń funkcji nerek jest również związanych ze wzrostem stężenia NGAL stwierdzonym w osoczu lub moczu (4) Sugeruje się, że NGAL może być także wczesnym biomarkerem rozwoju nefropatii kontrastowej (z ang. contrast induced nephropathy CIN), na którą kilkakrotnie częściej narażeni są chorzy ze współistniejącą przewlekłą chorobą nerek, cukrzycą, nieprawidłową glikemią na czczo lub niewydolnością serca (18). Ponadto wzrost stężenia kreatyniny, jako objaw CIN, obserwuje się u chorych po godz., a niekiedy dopiero w ciągu 3-5 dni, co znacznie utrudnia wczesne rozpoznanie uszkodzenia nerek (18). W grupie dzieci, którym w badaniu radiologicznym podawano kontrast już po 2-4 godz. zaobserwowano istotny wzrost stężenia NGAL w moczu, jak i osoczu (19), co wskazuje, że NGAL może być czynnikiem predykcyjnym nefropatii indukowanej kontrastem radiologicznym i markerem potencjalnie przydatnym w praktyce (16). Ponadto wzrost stężenia NGAL w surowicy i moczu obserwuje się także u chorych po transplantacji nerki. Wieloośrodkowe badania przeprowadzone u dorosłych i dzieci po przeszczepie nerki wskazują na wzrost stężenia NGAL w moczu i osoczu po 1 dniu od przeszczepu u tych, u których została utracona funkcja nerki (16). Tab. 1. NGAL jako marker ostrego uszkodzenia nerek [wg 5]. Znaczenie NGAL specyficzny marker dla ostrego uszkodzenia nerek (AKI) pozwala na różnicowanie typów AKI (pochodzenia przednerkowego i wywołanego ostrą martwicą cewek nerkowych) czuły marker we wczesnym i ustalonym rozpoznaniu wzrasta proporcjonalnie do uszkodzenia lub utraty funkcji nerek wykrywany przed rozwinięciem pełnoobjawowej niewydolności nerek dostępna zautomatyzowana metoda jego oznaczania 10 2(20)

11 Tab. 2. Porównanie oznaczania NGAL w moczu i osoczu we wczesnym wykrywaniu ostrego uszkodzenia nerek [wg 11]. NGAL w moczu NGAL w osoczu zabiegi kardiochirurgiczne 2 godz. po zabiegu 2 godz. po zabiegu nefropatia kontrastowa 2-4 godz. po zastosowaniu kontrastu 2 godz. po zastosowaniu kontrastu transplantacja nerki godz. po przeszczepie metoda oznaczania zutomatyzowana na analizatorze ARCHITECT zestawy point-of-care (Triage NGAL) dla porównania stężenie kreatyniny w surowicy 2-3 dni po zabiegu kardiologicznym; 1-3 dni po zastosowaniu kontrastu rentgenowskiego NGAL w przewlekłej niewydolności nerek Przewlekła choroba nerek (PChN) stanowi poważne ryzyko występowania powikłań sercowo-naczyniowych i zgonów. Szacuje się, że zachorowalność na PChN w USA wynosi aż 16 %, natomiast w Polsce częstość występowania PChN w ogólnej populacji określa się na ponad 10 % (3). Wykazano, że oznaczanie NGAL w moczu może być nie tylko markerem ostrego uszkodzenia nerek (AKI), ale również wskaźnikiem przewlekłej choroby nerek (PChN) (2). Bolignano i wsp. (20) proponują wykorzystanie NGAL w praktyce klinicznej jako czynnika predykcyjnego pogarszającej się funkcji nerek u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek. U chorych na PChN zaobserwowano kilkunastokrotnie wyższe stężenie NGAL oznaczanej w moczu, które korelowało ze stężeniem kreatyniny w surowicy, GFR i białkomoczem (11). Ponadto Mitsnefes i wsp. (21) zaobserwowali istotną zależność pomiędzy NGAL oznaczaną w surowicy a cystatyną C (r=0,74). Ze względu na to, że NGAL jest czułym markerem uszkodzenia nerek (22) jej oznaczanie w przewlekłej chorobie nerek przebiegającej z białkomoczem pozwala na określenie stopnia uszkodzenia nerek (23), dzięki temu istnieje możliwość zastosowania oznaczenia tego białka do wczesnej identyfikacji i monitorowania pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Ponadto wykazano, że nawet pojedyncze oznaczanie NGAL w moczu, a nie kreatyniny w surowicy, może być pomocne w różnicowaniu pacjentów z ostrą niewydolnością nerek i przewlekłą chorobą nerek (24). Badania dowodzą, że NGAL jest również zaangażowana w patologiczny proces prowadzący do torbielowatości nerek czy zapalenia kłębuszków nerkowych. Wydaje się, że NGAL może być także wczesnym markerem predykcyjnym aktywności choroby u pacjentów z toczniowym zapaleniem nerek (3,25). W badaniach Suzuki i wsp. (25) zaobserwowano znaczący wzrost NGAL w osoczu i moczu dzieci z SLE w porównaniu do młodzieńczego idiopatycznego zapalenia stawów i grupy zdrowych dzieci. Także Rubinstein i wsp. (26) wskazują na istotną zależność pomiędzy stężeniem NGAL w moczu a aktywnością choroby w przebiegu toczniowego zapalenia nerek. Ze względu na niewystarczającą czułość dotychczas stosowanych, do oceny czynności nerek, parametrów diagnostycznych poszukiwania nowych markerów uszkodzenia nerek są obecnie przedmiotem licznych badań. Lipokalina związana z żelatynazą neutrofili (NGAL) to nowoodkryty wczesny biomarker uszkodzenia nerek, który, obok tradycyjnych wskaźników, może znaleźć zastosowanie w diagnostyce ostrej i przewlekłej niewydolności nerek. Jej oznaczanie w moczu, który jest materiałem biologicznym stosowanym rutynowo w diagnostyce może okazać się przydatne w praktyce klinicznej. 11

12 Piśmiennictwo 1. Marchewka Z. Niskocząsteczkowe wskaźniki biochemiczne w diagnostyce neurotoksyczności. Adv Clin Exp Med. 2006, 15, 6, Czekalski S. Postępy w diagnostyce i terapii ostrego uszkodzenia nerek i przewlekłej choroby nerek. Przew Lek, 2009, 1, Hyla-Klekot L., Kokot F. Biomarkery uszkodzenia nerek. Post N Med., 2009, 22, 1, Uttenthal L.O. et. al. NGAL: marker molecule for the distressed kidney? www. cli-online.com 5. Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin an emerging troponin for kidney injury. Nephrol Dial Transplant, 2008, Goetz GH, Holmes MA, Borregaard N et al. The neutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition. Mol Cell, 2002, 10, Schmidt-Ott K. M., Mori K., Li J. Y. et al. Dual Action of Neutrophil Gelatinase- Associated Lipocalin. J Am Soc Nephrol. 2007, 18, Xu S, Venge P. Lipocalins as biochemical markers of disease. Biochim Biophys Acta. 2000, 18, 1482, Mishra J., Ma Q, Prada A. et al. Identification of Neutrohpil Gelatinase-associated Lipocalin as a Novel Early Urinary Biomarker for Ischemic Renal Injury. J Am Soc Nephrol, 2003, 14, Mori K, Nakao K. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as the real-time indicator of active kidney damage. Kidney Int. 2007, 71, 10, Devarajan P. NGAL in Acute Kidney Injury: From Serendipity to Utility. Am J Kidney Dis. 2008, 52, 3, Dent C L, Ma Q, Dastrala S et al. Plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin predicts acute kidney injury, mortidity and mortality after pediatric cardiac surgery: a prospective uncontrolled cohort study. content/11/6/r Ronco C. N-Gal: diagnosing AKI as soon as possibile. Crit Care, 2007, 11, 6, Bennett M, Dent CL, Ma Q et al. Urine NGAL predicts severity of acute kidney injury after cardiac surgery: a prospective study. Clin J Am Soc Nephrol. 2008, 3, Mishra J, Dent C, Tarabishi R et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery. Lancet 2005, 2-8, 365, Devarajan P. Neutrophil gelatinase-assotiated lipocalin (NGAL): A New marker of kidney disease. Scan J Clin Lab Invest. 2008, 68, Bachorzewska-Gajewska H., Malyszko J., Sitkiewska E. i wsp. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) correlations with cystatin C, serum creatinine and egfr in patients with normal serum creatinine undergoing coronary angiography. Nephrol Dial Transplant, 2007, 22, Bachórzewska-Gajewska H., Dubicki A., Dobrzycki S. Powikłania po zabiegach rewaskularyzacyjnych u pacjentów z cukrzycą. Prz Kardiol, 2007, 2, 4, Hirsch R, Dent C, Pfriem H et al. NGAL is an early predictive biomarker of contrast-induced nephropathy in children. Pediatr Nephrol. 2007, 22, 12, Bolignano D., Coppolino G., Lacquaniti A et al. Pathological and prognostic value of urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin in macroproteinuric patients with worsening renal function. Kidney Blood Press Res. 2008, 31, 4, Mitsnefes MM, Kathman TS, Mishra J et al. Serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a marker of renal function in children with chronic kidney disease. Pediatr Nephrol 2007, 22, 1, Malyszko J., Bachorzewska-Gajewska H., Sitkiewska E. i wsp. Serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a marker of renal function in non-diabetic patients with stage 2-4 chronic kidney disease. Ren Fail. 2008, 30, 6, Bolignano D., Donato V., Coppolino G. et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a marker of kidney damage. 24. Nickolas TL, O Rourke MJ, Yang J et al. Sensitivity and specificity of a single emergency department measurement of urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin for diagnosing acute kidney injury. Ann Intern Med. 2008, 3, 148 (11), Suzuki M, Wiers KM, Klein-Gitelman MS et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker of disease activity in pediatric lupus nephritis. Pediatr Nephrol, 2008, 23, 3, Rubinstein T, Pitashny M, Putterman C. The novel role of neutrophil gelatinase- B associated lipocalin (NGAL)/Lipocalin-2 as a biomarker for lupus nephritis. Autoimmun Rev. 2008, 7, 3, (20)

13 Walidacja metody badawczej w laboratorium medycznym część 1 Testing method validation in medical laboratory part 1 Urszula Wendt Laboratoria Medyczne BRUSS Grupa ALAB Sp. z o.o. Streszczenie Przeprowadzenie walidacji metody badawczej w laboratorium jest wymaganiem zawartym zarówno w normie ISO/IEC jak i ISO Laboratorium medyczne, które wdraża system zarządzania zgodny z wymaganiami jednego z tych dokumentów jest zobligowane do przeprowadzenia walidacji wszystkich procedur badawczych, które zamierza poddać ocenie w procesie akredytacji. Jednak obowiązek walidacji metod badawczych został także zawarty w obowiązujących przepisach dotyczących laboratoriów medycznych. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 marca 2006 r. w sprawie standardów jakości w medycznych laboratoriach diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz.U , Załącznik Nr 1 pkt6.1.b oraz Załącznik Nr 2 pkt6.1.e) z późniejszymi zmianami z 2009 roku, zobowiązuje laboratoria do przeprowadzenia i udokumentowania walidacji stosowanych metod badawczych. Czym więc jest walidacja i jak ją przeprowadzić? To pytania, które z całą pewnością zadaje obecnie wiele laboratoriów. Niniejsze opracowanie ma na celu przybliżenie tego zagadnienia w odniesieniu do metod ilościowych stosowanych w medycznych laboratoriach diagnostycznych. Summary Conducting of testing method validation in laboratory is a requirement contained both in ISO/IEC and ISO Medical laboratory, which implements management system consistent with the requirements of one of these documents is obliged to carry out validation all test procedures, which intends to be evaluated in the process of accreditation. However, the obligation to testing method validation was also included in the existing legislation on medical laboratories. Ordinance of the Minister of health of 23 March 2006 on quality standards in diagnostic and microbiological medical laboratories (Dz.U , annex No. 1 point 6 1. (b) and annex 2 point 6 1. e) with changes from 2009, instructs laboratories to perform and document testing methods validation. What therefore is validation and how it performed? This questions that certainly raises many laboratories. This develop aims to approximate the subject in regard to quantitative methods used in medical diagnostic laboratories. Słowa kluczowe: walidacja, metoda badawcza, cechy charakterystyki metody, akredytacja. Key words: validation, testing method, method characteristics, accreditation. Co to jest walidacja metody badawczej? Zgodnie z definicją podaną w normie ISO/IEC pkt , walidacja jest potwierdzeniem, przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczególne wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania. Oznacza to, że celem walidacji metody badawczej jest potwierdzenie, iż stosowana w laboratorium metoda jest odpowiednia do celów w jakich się ją wykorzystuje, np. metoda oznaczania albuminy z użyciem zieleni bromokrezolowej jest właściwa do oznaczania stężenia albuminy w surowicy krwi. Jednak gdyby poprzez walidację zbadać, czy metoda ta jest odpowiednia do oznaczania albuminy w moczu lub płynie mózgowo-rdzeniowym, to z pewnością nie uzyskalibyśmy potwierdzenia, że jest to właściwa metoda do oznaczania stężenia albuminy w tych materiałach biologicznych. Generalnie, walidacja jest procesem, którego przeprowadzenie obejmuje następujące etapy: 1. specyfikację wymagań, 2. określenie cech charakterystycznych metody, 3. sprawdzenie czy wyspecyfikowane wymagania mogą zostać spełnione przez daną metodę, 4. stwierdzenie o przydatności walidowanej metody do zamierzonego zastosowania.

14 W normie ISO/IEC (pkt ) wymieniono techniki, których stosowanie zalecane jest podczas walidacji, są to: wzorcowanie (kalibracja) przy wykorzystaniu wzorców odniesienia lub materiałów odniesienia, porównanie otrzymanych wyników z wynikami uzyskanymi innymi metodami, porównania międzylaboratoryjne (Interlaboratory Comparision, ILC), co w przypadku laboratoriów medycznych oznacza udział w programach zewnątrz laboratoryjnej oceny jakości (External Quality Assessment System, EQAS), systematyczna, okresowa ocena czynników wpływających na wynik, ocena niepewności wyników oparta na teoretycznych podstawach metody i praktycznym doświadczeniu. Norma nie określa częstotliwości z jaką należy przeprowadzać walidację metody. Zawiera jednak zalecenie, aby walidację wykonywać w miarę rozwoju metody oraz wtedy, gdy w już zwalidowanej metodzie dokonujemy zmian i uznamy, że ponowna walidacja jest niezbędna. Co więcej, laboratorium po rozważeniu możliwości technicznych metody, samodzielnie podejmuje decyzje dotyczące zakresu i sposobu walidacji danej metody. Koncepcję walidacji zawiera opracowany przez europejską organizację EURACHEM przewodnik zatytułowany Przydatność metod analitycznych do określonych celów. Przewodnik walidacji metod w laboratorium i zagadnienia związane. Dokument ten, jest na tyle uniwersalny, że ze wskazówek w nim zawartych można skorzystać planując i wykonując walidację metod badawczych stosowanych w laboratoriach medycznych. Zgodnie z zaleceniami zawartymi w przewodniku, metodę należy walidować gdy: opracowuje się nową metodę, zmienia się ustaloną metodę poprzez wprowadzenie udoskonaleń lub rozszerzenie jej stosowania (np. w innym zakresie pomiarowym, innym materiale biologicznym itp.) celem rozwiązywania nowego problemu, kontrola jakości wykazuje, że ustalona metoda badawcza zmienia się w czasie, ustaloną metodę wykorzystuje się np. przy użyciu nowych (zmienionych) przyrządów pomiarowych. Metody już ustalone, tj. opracowane w laboratorium lub przez firmy wytwarzające odczynniki, użytkownik powinien walidować w celu ustalenia parametrów działania metody w warunkach przez niego stosowanych, tj. w swoim laboratorium. Podobnie jak w normie ISO/IEC 17025, przewodnik EU- RACHEM zaleca aby, laboratorium samodzielnie określało, które parametry robocze metody należy charakteryzować w celu zwalidowania metody, z uwzględnieniem wymagań klientów oraz posiadanego doświadczenia w stosowaniu danej metody. Zakres walidacji metody badawczej Zgodnie z ISO/IEC 17025, walidacja powinna być na tyle obszerna, na ile jest to konieczne przy określonym zastosowaniu metody. Zakres walidacji, a także dokładność uzyskiwanych wartości odpowiadających zamierzonemu zastosowaniu metody powinny odpowiadać potrzebom użytkowników wyników badań. W przypadku laboratoriów medycznych odbiorcami wyników badań są lekarze, na których spoczywa odpowiedzialność za opiekę nad pacjentem. Przykładowe cechy metody jakie należy określić podczas walidacji (ISO/IEC 17025, pkt ) to między innymi granica wykrywalności, selektywność, liniowość, granica powtarzalności i odtwarzalności, odporność na czynniki zewnętrzne, wrażliwość na zakłócenia pochodzące z matrycy próbki badanej, niepewność wyników. Zgodnie z zaleceniami przewodnika EURACHEM, parametry charakterystyki metody podlegające walidacji mogą obejmować: identyczność ustalenie, czy sygnał otrzymany podczas pomiaru lub inna mierzona właściwość przypisywana analitowi, pochodzi rzeczywiście od analitu; selektywność (selectivity) i specyficzność (specificity) to miary służące ocenie wiarygodności pomiaru w obecności zakłóceń. W celu określenia selektywności/specyficzności metody należy sprawdzić możliwość interferencji występujących w próbce podczas oznaczania danego analitu; granica wykrywalności (limit of detection, limit of determination) określa najmniejsze stężenie analitu w próbce, które można wykryć daną metodą, ale niekoniecznie określić ilościowo w ustalonych warunkach badania; granica oznaczenia ilościowego/granica oznaczalności (limit of quantitation) to najmniejsze stężenie analitu, jakie można oznaczyć daną metodą z określoną dokładnością 1 i precyzją w ustalonych warunkach badania; liniowość (linearity) to zakres liniowy krzywej kalibracji, w którym sygnał jest liniowo zależny od stężeń wzorców; dokładność (accuracy) to zgodność wyniku pomiaru z wartością odniesienia. Dokładność po- 1 Przewodnik EURACHEM został opublikowany w 1998 roku i stosuje dane określenia. Obecnie zamiast terminu dokładność używamy terminu poprawność. 14 2(20)

15 winna być sprawdzana przy użyciu odpowiednich materiałów referencyjnych, badań międzylaboratoryjnych jeśli są dostępne, lub za pomocą metody referencyjnej. Badanie dokładności obejmuje poprawność i precyzję; poprawność (trueness) to stopień zgodności między wartością średnią otrzymaną z dużego zbioru wyników pomiarów i przyjętą wartością odniesienia. Miarą poprawności jest całkowity błąd systematyczny (bias, obciążenie) czyli różnica pomiędzy wynikiem badania a wartością odniesienia; precyzja (precision) określa zgodność wyników serii pomiarów w danej próbce przy użyciu danej metody. Precyzję wyraża się jako odchylenie standardowe dla wyników uzyskanych w serii pomiarów. Miarami precyzji są powtarzalność i odtwarzalność; powtarzalność (repetability) to zgodność wyników pomiarów uzyskanych w danej próbce, w tych samych warunkach pomiarowych, tj. w tym samym laboratorium, tą samą metodą, przez jednego analityka, w krótkim czasie (tzw. seria jednoczesna); odtwarzalność (reproducibility) to precyzja wyników w danej próbce w warunkach odtwarzalności, tj. w różnych laboratoriach, tą samą metodą, przez różnych analityków, w długim okresie czasu (tzw. seria niejednoczesna); niepewność pomiaru (uncertainty of measurement) parametr związany z wynikiem pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości, które można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej, VIM, def. 3.9; czułość (sensitivity) to gradient krzywej odpowiedzi, czyli zmiana odpowiedzi przyrządu pomiarowego odpowiadająca zmianie stężenia analitu. Można ją wyznawczyć jako nachylenie krzywej kalibracji lub obliczyć z wartości sygnałów dla dwóch próbek o różnym stężeniu oznaczanego analitu; odporność (robustness, ruggedness) określa wpływ zmiany warunków wykonywania pomiarów, np. w procedurze badawczej, na stabilność uzyskiwanych wyników. Określenie odporności umożliwia wskazanie krytycznych etapów badanej metody oraz etapów, gdzie dopuszczalne są pewne zmiany pozostające jednak bez wpływu na parametry analityczne metody. odzysk (recovery) część analitu dodanego przed analizą do badanej próbki (próbka wzbogacona lub domieszkowa), określona na podstawie pomiaru analitu w próbce wzbogaconej i nie wzbogaconej. Odzysk pozwala ocenić tzw sprawność metody w wykrywaniu całej zawartości analitu w próbce. Wszystkie dane pierwotne uzyskane podczas walidacji metody podlegają obróbce statystycznej w celu wyliczenia i określenia cech charakterystyki metody, które następnie należy porównać z przyjętymi założeniami na etapie specyfikacji wymagań dla danej metody. W niektórych przypadkach podczas procesu walidacji laboratorium uzyskuje dodatkowe informacje dotyczące metody. Przykładowo, jeśli badano odporność na zmiany, wtedy na podstawie uzyskanych wyników można określić czy laboratorium może w metodzie dokonywać modyfikacji, jeśli tak, to jakich oraz jaki będą one miały wpływ na wiarygodność wyników badań laboratoryjnych. Po zakończeniu walidacji metody należy skompletować całą dokumentację źródłową wraz z wyliczeniami cech charakterystyki metody i na ich podstawie pisemnie sformułować tzw. stwierdzenie walidacyjne o przydatności metody do założonego zastosowania. Dopiero zwalidowaną i zatwierdzoną metodę badawczą można stosować do wykonywania badań rutynowych. Piśmiennictwo EURACHEM, Przydatność metod analitycznych do określonych celów. Przewodnik walidacji metod w laboratorium i zagadnienia związane, POLLAB, Biul. Inf. 2 (30), Warszawa 2000 Międzynarodowy Słownik Podstawowych i Ogólnych Terminów Metrologii (VIM), Główny Urząd Miar, Warszawa 1996 PN-EN ISO/IEC 17025:2005 Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących, PKN, Warszawa 2005 PN-EN ISO 15189:2008 Laboratoria medyczne. Szczególne wymagania dotyczące jakości i kompetencji, PKN, Warszawa 2008 Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 marca 2006 r. w sprawie standardów jakości dla laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz.U ) Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz.U ) Wendt U., Rogulski J.: Walidacja metod badawczych jako element systemu zapewnienia jakości w laboratorium diagnostyki medycznej, Diagn. Lab. 2003: 39 (1), s Wendt U., Parzybut A., Nowacka M., Pacanis A., Rogulski J.: Procedura walidacji metody badawczej na przykładzie oznaczania stężenia białka całkowitego w surowicy krwi, Diagn. Lab. 2003: 39 (4), s

16 Nowe testy na analizator ARCHITECT 1P testów ARCHITECT Urine NGAL Reagent Kit 1P testów ARCHITECT Urine NGAL Reagent Kit 1P x 4 ml ARCHITECT Urine NGAL Calibrators 1P x 8 ml ARCHITECT Urine NGAL Controls 2P testów ARCHITECT HE4 Reagent Kit 2P x 4 ml ARCHITECT HE4 Calibrators 2P x 8 ml ARCHITECT HE4 Controls 8L testów ARCHITECT MPO Reagent Kit 8L testów ARCHITECT MPO Reagent Kit 8L x 4 ml ARCHITECT MPO Calibrators 8L x 8 ml ARCHITECT MPO Controls 1P testów ARCHITECT ProGRP Reagent Kit 1P x 4 ml ARCHITECT ProGRP Calibrators 1P x 8 ml ARCHITECT ProGRP Controls 1P testów ARCHITECT Anti CCP Reagent Kit 1P x 4.3 ml ARCHITECT Anti CCP Calibrators 1P x 7 ml ARCHITECT Anti CCP Controls 6L testów ARCHITECT HCV Ag Reagent Kit 6L x 4 ml ARCHITECT HCV Ag Calibrators 6L x 8 ml ARCHITECT HCV Ag Controls 1P testów ARCHITECT HBsAg Qualitative Assay 1P x 500 testów ARCHITECT HBsAg Qualitative Assay 1P testów ARCHITECT HBsAg Qualitative Assay 1P x 4 ml ARCHITECT HBsAg Qualitative Calibrators 1P x 8 ml ARCHITECT HBsAg Qualitative Controls 1P testów ARCHITECT HBsAg Qualitative Confirmatory 1L testów ARCHITECT Cyclosporine Reagent Kit 1L x 9.0 ml (A) 5 x 4.5 ml (B-F) ARCHITECT Cyclosporine Calibrators 1P x 12 ml Immunosuppressant MCC Controls 16 2(20)

17 17

18

19 Zintegrowana platforma immunochemiczna ARCHITECT ci4100 PROSTA OBSŁUGA ZAAWANSOWANA TECHNOLOGIA Integracja bez kompromisów Abbott Diagnostics stworzył unikalne rozwiązanie techniczne umożliwiające wykonywanie badań biochemicznych i immunochemicznych na jednej zintegrowanej platformie analitycznej która zapewni: Optymalizację organizacji pracy dzieki wykonywaniu tych badań z jednej próbki Jeden operator może obsługiwać zintegrowaną platformę immunochemiczną Natychmiastowe pobieranie próbek pilnych dzięki podajnikowi RSH Zabezpieczenie przed kontaminacją dzięki inteligentnemu systemowi mycia SmartWash (nieistotny klinicznie współczynnik pzenoszenia 0,1 ppm)

20 Austria Abbott Ges.m.b.H. Diagnostics Tel. (+43) Fax (+43) Germany Abbott GmbH & Co. KG Tel. (+49) Fax (+49) Poland Abbott Laboratories Poland Sp. z o.o. Tel. (+48) Fax (+48) Sweden Abbott Scandinavia AB Tel. (+46) Fax (+46) Belgium/Luxembourg Abbott S.A./N.V. Tel. (+32) Fax (+32) Greece Abbott Laboratories (Hellas) S.A. Tel. (+30) Fax (+30) Portugal Abbott Laboratòrios Lda. Diagnòsticos Tel. (+351) Fax (+351) Switzerland Abbott AG Diagnostics Tel. (+41) Fax (+41) Croatia Abbott Representative Office Tel. (+385) Fax (+385) Hungary Abbott Kft. Tel. (+36) Fax (+36) Romania Abbott Laboratories Representative Office Romania Tel. (+4021) Fax (+4021) Turkey Abbott Laboratuarlari Tel. (+90) Fax (+90) Czech Republic Abbott Laboratories s r.o. Tel. (+420) Fax (+420) Ireland Abbott Diagnostics Tel. (+353) Fax (+353) Russian Federation Abbott Laboratories S.A. Tel. (+7) Fax (+7) United Arab Emirates Abbott Laboratories S.A. Tel. (+971) Fax (+971) Denmark Abbott Laboratories A/S Diagnostics Tel. (+45) Fax (+45) Italy Abbott S.p.A. Abbott Diagnostici Tel. (+39) Fax (+39) Saudi Arabia Mediserv Tel. (+966) Fax (+966) United Kingdom Abbott Laboratories Ltd. Diagnostics Tel. (+44) Fax (+44) Egypt (MEN) ADD Egypt Tel. (+20) Fax (+20) Latvia Abbott Laboratories S.A. Latvian Representative Office Tel. (+371) Fax (+371) Slovak Republic Abbott Laboratories Slovakia s r.o. Tel. (+421) Fax (+421) Finland Abbott Oy/Diagnostics Tel. (+358) Fax (+358) Netherlands Abbott B.V. Tel. (+31) Fax (+31) South Africa Abbott Laboratories (Pty) Ltd. Tel. (+27) Fax (+27) France Abbott France S.A.S. Tel. (+33) Fax (+33) Norway Abbott Norge AS Tel. (+47) Fax (+47) Spain AbbottCientífica S.A. Tel. (+34) Fax (+34)