UNIWERSYTET OPOLSKI WŁAŚCIWOŚCI WYBRANYCH OKTAKARBOKSYFTALOCYJANIN METALI JAKO POTENCJALNYCH FOTOUCZULACZY W TERAPII FOTODYNAMICZNEJ

Transkrypt

1 UNIWERSYTET OPOLSKI WYDZIAŁ CHEMII Zakład Chemii Fizycznej i Modelowania Molekularnego WŁAŚCIWOŚCI WYBRANYCH OKTAKARBOKSYFTALOCYJANIN METALI JAKO POTENCJALNYCH FOTOUCZULACZY W TERAPII FOTODYNAMICZNEJ AUTOREFERAT z wykazem dorobku naukowego Marta Kliber-Jasik Promotor: dr hab. Małgorzata A. Broda, prof. UO Promotor pomocniczy: dr Joanna Nackiewicz Opole 2019

2 Wstęp Ftalocyjaniny (Pc) są interesującą i ważną grupą związków organicznych, które nie występują w naturze i można je uzyskać jedynie na drodze syntezy chemicznej. Wykazują one duże strukturalne podobieństwo do występujących w przyrodzie porfiryn, dzięki czemu mogą być wykorzystywane jako modele związków biologicznie aktywnych [1]. Ftalocyjaniny, dzięki unikalnym właściwościom fizykochemicznym, mają zastosowanie w różnych obszarach nauki, przemysłu, technologii i medycyny [2]. W ostatnich latach ftalocyjaniny okazały się obiecującymi fotouczulaczami drugiej generacji w terapii fotodynamicznej, PDT (ang. Photodynamic Therapy), ponieważ cechują się szeregiem korzystnych pod tym kątem właściwości, m.in. fotochemicznych [3 8]. Ftalocyjaniny to makrocykliczne związki aromatyczne. Zbudowane są z czterech podjednostek izoindolowych, połączonych ze sobą poprzez atomy azotu, wchodzące w skład mostków azometinowych ( HC=N ), tworząc tzw. układ porfirazynowy (Rys. 1a, b) [9, 10]. pierścień izoindolowy a) b) Rys. 1. Struktura molekularna a) porfiny, b) ftalocyjaniny bez metalu (H 2Pc). mostek azometinowy Strukturę ftalocyjaniny można poddawać różnym modyfikacjom. Jednym ze sposobów modyfikacji jest przyłączenie przez ligand ftalocyjaniny o ładunku 2- (Pc 2- ) atomów lub jonów metali. Innym sposobem modyfikacji jest podstawienie atomów wodoru w pierścieniach benzenowych różnymi podstawnikami elektronoakceptorowymi np. grupami karboksylowymi, sulfonowymi, alkilowymi lub elektronodonorowymi, np. aminowymi, hydroksylowymi, alkoksylowymi, a także różnymi pochodnymi tych grup. Podstawniki zlokalizowane w pozycjach 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 i 25 nazywane są podstawnikami, natomiast te, które znajdują się w pozycjach 2, 3, 9, 10, 16, 17, 23 i 24 określane są

3 jako podstawniki (Rys. 2) [11, 12, 13]. Zmiany struktury ftalocyjaniny można także dokonać poprzez aksjalną koordynację różnego rodzaju ligandów do metalu centralnego ftalocyjaniny [14]. Zarówno charakter metalu centralnego, jak i jego aksjalne podstawienie, a także rodzaj, liczba i pozycja podstawników w pierścieniach benzenowych znacząco wpływa na właściwości fizykochemiczne Pc [1] pozycja pozycje pozycja Rys. 2. Struktura metaloftalocyjaniny z numeracją atomów wg IUPAC. Przedmiotem moich badań są oktakarboksyftalocyjaniny metali (MPcOC), czyli ftalocyjaniny, które są podstawione ośmioma grupami karboksylowymi w pozycjach β. Obecność grup karboksylowych sprawia, że związki te są rozpuszczalne w roztworach wodnych (np. w układach biologicznych), a także takich rozpuszczalnikach organicznych jak DMSO i DMF. Poprawa rozpuszczalności ftalocyjanin jest ważnym elementem, gdyż zwiększa możliwość ich różnorodnych zastosowań. W literaturze jest opisanych kilka metod syntezy oktakarboksyftalocyjanin metali, które w zależności od natury metalu znajdującego się w centrum pierścienia ftalocyjaninowego, różnią się reagentami i warunkami prowadzenia syntezy [11, 15 23]. Dobierając odpowiednią metodę syntezy należy mieć również na uwadze możliwość powstawania polimerów lub oligomerów (jako produktów ubocznych), możliwość zachodzenia niepełnej metalizacji makrocyklu ftalocyjaninowego lub całkowity jej brak oraz niecałkowitą hydrolizę do grup karboksylowych. Nie ma uniwersalnej metody, którą można by było zastosować do otrzymywania oktakarboksyftalocyjanin z różnymi metalami w centrum pierścienia. Metody syntezy w praktyce często wymagają zoptymalizowania warunków prowadzonych reakcji, m.in. poprzez zastosowanie odpowiedniej temperatury, czasu prowadzenia reakcji, jak również sposobu oczyszczania produktów.

4 Terapia fotodynamiczna jest to szybko rozwijająca się i powszechnie akceptowana metoda leczenia chorób nowotworowych, która posiada szereg korzystnych cech wyróżniających ją na tle konwencjonalnych technik leczenia takich jak leczenie operacyjne, radioterapia czy chemioterapia [24]. Terapia PDT charakteryzuje się selektywnym niszczeniem zmian nowotworowych i brakiem uszkodzeń tkanek zdrowych, dlatego też okazała się mało inwazyjną metodą leczenia w onkologii [25, 26]. Procedura obejmuje podawanie środka fotouczulającego, a następnie napromieniowanie w zakresie długości fali odpowiadającej pasmu absorbancji fotosensybilizatora. PDT składa się z trzech podstawowych komponentów fotouczulacza, światła i tlenu. [27]. Badania wykazały, że te trzy komponenty są całkowicie bezpieczne i nietoksyczne dla komórek kiedy działają osobno, natomiast ich połączenie inicjuje silną reakcję fotochemiczną, która generuje wysoce reaktywne formy tlenu, ROS (ang. reactive oxygen species) prowadzące do śmierci komórek nowotworowych na drodze apoptozy lub nekrozy [28]. Fotouczulacze są kluczowym składnikiem mającym wpływ na proces terapii fotodynamicznej. Istnieje wiele substancji fotouczulających, lecz tylko niektóre z nich spełniają określone warunki i mogą zostać zastosowane w terapii PDT [3, 29 36]. Przeprowadzone dotychczas badania udowodniły, że kompleksy ftalocyjanin z diamagnetycznymi jonami metali w centrum makropierścienia takimi jak: Zn 2+, Al 3+ czy Ga 3+ są szczególnie obiecujące w zakresie PDT, ponieważ wykazują wiele właściwości spełniających wymagania idealnego leku (fotouczulacza). Te cechy to m.in. wysoka efektywność generowania ROS po naświetleniu, wysoka stabilność chemiczna, fluorescencja i niska toksyczność przed naświetlaniem [3, 37 40]. Na przestrzeni lat, zbadano setki znanych, jak i nowo zsyntezowanych związków fotouczulających, pod kątem zastosowania w terapii fotodynamicznej, jednak nieustannie poszukuje się fotosensybilizatorów skuteczniejszych w leczeniu, bezpieczniejszych i mniej inwazyjnych [41, 42]. Jedną z podstawowych metod pozwalających na ocenę nowych fotouczulaczy jest spektroskopia UV-Vis. Analizując właściwości spektralne potencjalnych fotouczulaczy szczególną uwagę zwraca się przede wszystkim na intensywność pasma Q oraz jego położenie. Mianowicie, fotosensybilizatory stosowane w PDT, powinny mieć stosunkowo wysokie pasma absorpcyjne (ε > dm 3 mol -1 cm -1 ) w celu zminimalizowania dawki potrzebnej do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Ponadto pasma te powinny mieścić się w czerwonej części widma w zakresie absorpcji > 600 nm, natomiast < 1200 nm, czyli w tzw. oknie terapeutycznym [43]. Optymalne długości fali dla przenikania światła przez tkanki mieszczą się w zakresie pomiędzy 600 a 800 nm [31, 44].

5 Elektronowe widma absorpcyjne UV Vis ftalocyjanin charakteryzują się dwoma obszarami pochłaniania: obszarem B (zwanym także obszarem Soreta) występującym zwykle w zakresie długości fali nm, oraz obszarem Q znajdującym się w zakresie nm (Rys. 3). W badaniach ftalocyjanin od lat stosowana jest również spektroskopia fotoluminescencji. Dzięki analizie widm emisyjnych można uzyskać dodatkowe informacje dotyczące np. zjawiska asocjacji i uzupełnić dane otrzymane z widm absorpcyjnych UV-Vis. Rys. 3. Widma absorpcyjne UV-Vis dla MPcOC i H 2PcOC w roztworze wodnym (ph = 7.5) ze schematem głównych przejść elektronowych obserwowanych dla MPcOC. Badania eksperymentalne dotyczące ftalocyjanin są często wzbogacane i uzupełniane przez obliczenia z zastosowaniem metod modelowania molekularnego. Do tego celu obecnie najczęściej wykorzystuje się teorię funkcjonału gęstości, DFT (ang. Density Functional Theory), stanowiącą zestaw metod obliczeniowych chemii kwantowej, które opierają się na gęstości elektronowej stanu podstawowego badanego układu. Zazwyczaj obliczenia z zastosowaniem teorii funkcjonału gęstości dla ftalocyjanin przeprowadza się stosując najbardziej popularny funkcjonał hybrydowy B3LYP [45, 46]. Z przeglądu literatury dotyczącej obliczeń chemii kwantowej dla ftalocyjanin wynika, że hybrydowy funkcjonał korelacyjno-wymienny B3LYP przy bazie funkcyjnej 6-31G(d) jest preferowanym wyborem do obliczania struktury molekularnej i innych właściwości ftalocyjanin [47 51].

6 Cel badań Terapia fotodynamiczna, ze względu na szereg korzystnych cech w porównaniu do tradycyjnych technik, należy do najintensywniej rozwijających się i najbardziej obiecujących metod leczenia w onkologii. Rozwój PDT opiera się przede wszystkim na syntezie i badaniu nowych, coraz bardziej udoskonalonych fotouczulaczy, spełniających jak najwięcej cech idealnego leku. W różnych jednostkach badawczych na całym świecie prowadzone są badania, mające na celu poszukiwanie bardziej selektywnych fotosensybilizatorów, bezpieczniejszych dla pacjenta, o pożądanych właściwościach fotofizycznych. Aktualny stan wiedzy na temat terapii fotodynamicznej, oparty o przegląd literatury, potwierdza korzystne właściwości ftalocyjanin, a szczególnie ich kompleksów z diamagnetycznymi jonami metali w centrum pierścienia makrocyklu takimi jak: Zn 2+, Al 3+ czy Ga 3+. Pozytywne doniesienia naukowe dotyczące zastosowania ftalocyjanin jako fotouczulaczy były motywacją do zsyntezowania i scharakteryzowania trzech oktakarboksyftalocyjanin metali: ZnPcOC, Al(OH)PcOC oraz Ga(OH)PcOC. Celem naukowym niniejszej pracy jest zbadanie właściwości fizykochemicznych i biologicznych wybranych oktakarboksyftalocyjanin metali pod kątem ich potencjalnego zastosowania jako fotouczulaczy w terapii fotodynamicznej. Aby zrealizować założony cel, wykonałam szereg analiz w zakresie badań fizykochemicznych i biologicznych obejmujących: 1. Syntezę oraz pełną charakterystykę pozwalającą na stwierdzenie czystości i jednorodności otrzymanych kompleksów oktakarboksyftalocyjanin metali. 2. Porównanie właściwości spektroskopowych MPcOC. Zaplanowałam zbadanie właściwości absorpcyjnych i emisyjnych wybranych ftalocyjanin oraz wpływu różnych czynników m.in. ph, temperatury, stężenia na ich widma absorpcyjne UV-Vis i widma emisyjne. 3. Ocenę fotostabilności potencjalnych fotouczulaczy w różnych warunkach oświetlenia. 4. Zbadanie wpływu wybranych aminokwasów (L-cysteiny, glicyny, L-histydyny, L-seryny, L-tryptofanu) lub albuminy na widma absorpcyjne UV-Vis MPcOC oraz na ich fotostabilność. 5. Wyznaczenie kwantowej wydajności fluorescencji oktakarboksyftalocyjanin metali.

7 6. Modelowanie molekularne kompleksów MPcOC z aminokwasami pozwalające uzyskać informacje o oddziaływaniach występujących w tych układach. 7. Ocenę właściwości biologicznych potencjalnych fotosensybilizatorów z wykorzystaniem trzech ludzkich linii komórkowych, w tym dwóch prawidłowych (fibroblasty i keratynocyty) i jednej nowotworowej (czerniak). Zaplanowałam m.in. zbadanie kinetyki wnikania MPcOC do komórek, badanie cytotoksyczności, czy też zdolności generowania reaktywnych form tlenu przez potencjalne fotouczulacze. Wyniki W celu otrzymania oktakarboksyftalocyjaniny cynku (ZnPcOC, Rys. 4 a) przeprowadziłam dwie różne syntezy według metod zaproponowanych w pracach [21, 22], jednak w przypadku tego kompleksu skuteczniejsza okazała się metoda zaproponowana przez Kim i współpracowników [22], co potwierdziła analiza uzyskanych wyników (widma UV- Vis, IR, NMR, spektrometria mas, analiza elementarna). Z kolei do otrzymania Al(OH)PcOC (Rys. 4 b) oraz Ga(OH)PcOC (Rys. 4 c) najbardziej odpowiednia okazała się dwuetapowa synteza zaproponowana przez Sakamoto i Ohno [18], przy zastosowaniu w drugim etapie hydrolizy kwasowej i oczyszczaniu według procedury opisanej w pracy [19] a) b) c) Rys. 4. Struktura oktakarboksyftalocyjaniny a) cynku (ZnPcOC), b) glinu (Al(OH)PcOC, c) galu Ga(OH)PcOC Jak wskazują dane literaturowe, oktakarboksyftalocyjaniny takich metali jak cynk, glin, czy gal mogą stanowić potencjalnie dobre fotosensybilizatory w terapii fotodynamicznej. Jednak, aby takie związki zostały zakwalifikowane do praktycznego zastosowania muszą spełniać szereg wymagań idealnego fotouczulacza. Jednym z takich wymagań jest

8 występowanie ftalocyjaniny w trwałej, monomerycznej formie. W pierwszej kolejności zbadałam wpływ ph na widma absorpcyjne UV-Vis wodnych roztworów ZnPcOC, Al(OH)PcOC oraz Ga(H)PcOC, w celu sprawdzenia przy jakiej wartości ph związki te występują w postaci monomerycznej. Ma to duże znaczenie z punktu widzenia PDT, ponieważ tylko fotouczulacze występujące w formie monomerów mają zdolność wydajnego produkowania wysokoutleniających mediów cytotoksycznych. Zatem, od stopnia asocjacji zależy efektywność fotouczulaczy [52, 53]. Zarejestrowałam widma absorpcyjne UV-Vis dla MPcOC przy różnych wartościach ph (od ok. 2.0 do ok. 11.0), stosując bufor Brittona- Robinsona o odpowiednim składzie. Dla trzech kompleksów przedstawiłam krzywe zależności absorbancji (dla głównego pasma monomeru, przy λmax ok. 690 nm) od ph badanego roztworu (Rys. 5). Analiza uzyskanych zależności pozwala stwierdzić przy jakiej wartości ph w roztworze pojawia się postać monomeryczna odpowiedniej MPcOC i przy jakiej wartości ph jest to forma dominująca. Rys. 5. Zależność absorbancji głównego pasma Q od ph roztworu ZnPcOC, Al(OH)PcOC oraz Ga(OH)PcOC, C MPcOC = mol/dm 3, BRB. Dalsze badania przeprowadzałam w roztworach o ph = 8.0, gdzie formą badanych przeze mnie ftalocyjanin jest postać monomeryczna. Istotną cechą idealnego fotouczulacza, wpływającą na jego skuteczność terapeutyczną, jest również posiadanie absorpcji w zakresie długości fali od nm, czyli w tzw. oknie terapeutycznym [24, 54]. Wszystkie badane przez mnie kompleksy oktakarboksyftalocyjanin wykazują absorpcję w tym zakresie, zatem są potencjalnie dobrymi fotouczulaczami (Tabela 1). Ponadto ważne jest, aby najintensywniejsze pasmo Q fotouczulacza było jak najbardziej przesunięte batochromowo i charakteryzowało się wysokim molowym współczynnikiem absorpcji, dzięki czemu możliwe jest leczenie zmian

9 zlokalizowanych głębiej w organizmie. Porównując położenia maksimów absorpcji MPcOC dla głównego pasma Q oraz ich molowe współczynniki absorpcji można zauważyć, że wartości te różnią się i zależą od rodzaju skompleksowanego jonu metalu oraz roztworu, w którym zostały przygotowane (PBS o ph = 8.0 lub DMSO). Spośród badanych przeze mnie potencjalnych fotouczulaczy najkorzystniejsze właściwości wykazuje kompleks Ga(OH)PcOC. Mianowicie główne pasmo Q tego związku, zarówno w DMSO, jak również w buforze fosforanowym (ph = 8.0) jest najbardziej przesunięte w kierunku dłuższych fal. Jednocześnie pasmo to charakteryzuje najwyższa wartość molowego współczynnika absorpcji (Tabela 1). Tabela 1. Położenia maksimum absorpcji głównego pasma Q oraz wartości ԑ dla badanych MPcOC o stężęniu mol/dm 3. dm 3 ԑ Kompleks λ max [nm] mol cm DMSO PBS o ph = 8.0 DMSO PBS o ph = 8.0 ZnPcOC Al(OH)PcOC Ga(OH)PcOC Kolejnym ważnym aspektem wpływającym na skuteczność leku w terapii fotodynamicznej jest fotostabilność potencjalnego fotouczulacza, czyli określenie szybkości jego rozkładu pod wpływem światła. Większość stosowanych w PDT leków w pewnym stopniu ulega fotodegradacji. Potencjalny fotouczulacz powinien odznaczać się wysoką stabilnością w ciemności oraz podczas naświetlania. W celu sprawdzenia fotostabilności badanych przeze mnie kompleksów ftalocyjanin, zarejestrowałam ich widma absorpcyjne UV-Vis w równych odstępach czasowych i w różnych warunkach oświetlenia. Pomiary wykonywałam dla roztworów MPcOC w buforze fosforanowym o ph = 8.0 oraz w DMSO, znajdujących się w ciemności, poddanych działaniu światła dziennego oraz naświetlanych światłem czerwonym o długości fali 685 nm i gęstości mocy 6.4 mw/cm 2. Wszystkie zbadane roztwory MPcOC są stabilne w ciemności, jak również w obecności światła dziennego, z kolei światło czerwone w mniejszym lub większym stopniu powoduje ich fotodegradację. W odniesieniu do wprowadzenia oktakarboksyftalocyjanin metali do organizmu żywego celowe wydaje się także zbadanie oddziaływania tych molekuł ze składnikami obecnymi w komórce, np. aminokwasami czy białkiem. W tym celu zbadałam oddziaływania

10 kompleksów MPcOC z wybranymi aminokwasami (L-cysteina, glicyna, L-histydyna, L- seryna, L-tryptofan) lub białkiem (albumina) oraz zbadałam fotostabilność ftalocyjanin w obecności aminokwasów lub albuminy. Uzyskane wyniki pokazały, że badane aminokwasy lub albumina nie degradują MPcOC, a nawet zwiększają fotostabilność badanych kompleksów ftalocyjanin, co jest korzystne z punktu widzenia zastosowania tych związków jako potencjalnych fotouczulaczy w PDT (Rys. 6). Rys. 6. Absorbancja względna [%] głównego pasma Q dla MPcOC o stężeniu mol/dm 3 w PBS po 60 min. w ciemności lub po naświetlaniu światłem czerwonym (λ max. = 685 nm) i gęstości mocy 6.4 mw/cm 2. Widma emisyjne są również cennym źródłem wiedzy na temat ftalocyjanin, a uzyskane z analizy tych widm dane mogą stać się uzupełnieniem informacji otrzymanych z widm absorpcyjnych UV-Vis. Aby określić, czy badane oktakarboksyftalocyjaniny metali wykazują luminescencję w DMSO i w buforze fosforanowym o ph = 8.0, zarejestrowałam ich widma emisyjne. Przeprowadzone przeze mnie badania pokazują, że wszystkie trzy potencjalne fotouczulacze (ZnPcOC, Al(OH)PcOC i Ga(OH)PcOC) wykazują fluorescencję, zarówno w PBS o ph = 8.0, jak i w DMSO (Rys. 7).

11 Rys. 7. Widma emisyjne badanych MPcOC w DMSO, c = mol/dm 3. Charakterystyka właściwości emisyjnych potencjalnych fotouczulaczy obejmuje przeważnie ocenę jakościową, polegającą na analizie przebiegu widm fluorescencji, ale także ilościową, która obejmuje wyznaczenie wartości wydajności kwantowej fluorescencji, ФF. Potencjalny lek w terapii PDT powinien posiadać jak najniższą wartość ФF, co wiąże się ze zwiększeniem prawdopodobieństwa przejść interkombinacyjnych (ISC) co z kolei zwiększa wydajność kwantową stanu trypletowego. W kontekście PDT ważne jest, aby ten stan był efektywnie generowany, ponieważ z niego ma miejsce transfer energii do molekuł sąsiadujących z fotosensybilizatorem, które są odpowiedzialne za stres oksydacyjny komórek nowotworowych. Wszystkie trzy potencjalne fotouczulacze (ZnPcOC, Ga(OH)PcOC, Al(OH)PcOC) posiadają dość niskie wartości kwantowej wydajności fluorescencji, które mieszczą się w przedziale Uzyskane wyniki potwierdzają możliwość wykorzystania zbadanych związków w PDT i nie wykluczają wydajnego generowania reaktywnych form tlenu przez te związki. Jak wskazują dotychczasowe badania, oktakarboksyftalocyjaniny cynku, glinu lub galu, ze względu na szereg korzystnych właściwości, mogą stanowić dobre fotouczulacze w terapii fotodynamicznej. Przedstawione wyniki eksperymentalne pokazują, że fototostabilność wszystkich trzech kompleksów MPcOC wzrasta w obecności aminokwasów. Aby wyjaśnić sposób oddziaływania aminokwasów z badanymi ftalocyjaninami przeprowadziłam pełną optymalizację geometrii badanych kompleksów ftalocyjanin z wybranymi aminokwasami (glicyna, L-seryna, L-cysteina, L-histydyna), zarówno w próżni, jak i w wodzie przy użyciu metod DFT. Zoptymalizowane struktury różnych układów złożonych z ZnPcOC, Al(OH)PcOC lub Ga(OH)PcOC i aminokwasów, w środowiskach

12 o różnej polarności, otrzymałam stosując funkcjonał hybrydowy B3LYP z bazą funkcyjną 6-31G(d). Ponadto, w celu określenia wpływu oddziaływania z aminokwasami na właściwości optyczne ftalocyjanin, obliczyłam widma UV-Vis dla zoptymalizowanych układów przy użyciu metody TD-DFT/CAM-B3LYP/6-31G(d). Możliwe są dwa typy układów MPcOC aminokwas: kompleksy aksjalne lub ekwatorialne. Kompleksy aksjalne powstają na skutek oddziaływania pomiędzy jonem metalu centralnego ftalocyjaniny a wolną parą elektronową atomu tlenu grupy COO aminokwasu (Rys. 8). Natomiast kompleksy ekwatorialne są stabilizowane przez wiązanie wodorowe utworzone pomiędzy grupą karboksylową oktakarboksyftalocyjaniny metalu i grupą karboksylową COOH lub aminową NH2 pochodzącą od aminokwasu. Obliczenia pozwoliły na określenie wpływu aminokwasów na strukturę ftalocyjanin oraz na oszacowanie energii oddziaływania badanych fotouczulaczy z wybranymi aminokwasami. Rys. 8. Struktury dwóch typów aksjalnych kompleksów ZnPcOC L-histydyna otrzymane przy użyciu metody B3LYP/6-31G(d). Właściwości fizykochemiczne zbadanych oktakarboksyftalocyjanin okazały się na tyle ciekawe, że zostały one poddane badaniom biologicznym w układach in vitro, które przeprowadzono na modelowych ludzkich liniach komórkowych, w tym na prawidłowych fibroblastach (NHDF), immortalizowanych epidermalnych keratynocytach (HaCaT) oraz na nowotworowej linii czerniaka (Me45). Wybrane MPcOC okazały się dobrymi fotouczulaczami, selektywnymi wobec linii komórkowej czerniaka Me45 i obniżającymi jego przeżywalność (wykazując działanie cytostatyczne). Ponadto zgodnie z założeniami terapii fotodynamicznej, po naświetlaniu światłem czerwonym, aktywowały nadprodukcję reaktywnych form tlenu także w kontekście długoterminowym (do 24 h) (Rys. 9).

13 Rys. 9. Poziom ROS w komórkach HaCaT, NHDF i Me45, po 4h preinkubacji z Ga(OH)PcOC [6 µm] i wzbudzeniu promieniowaniem czerwonym w dawkach 2.5, 4.5, 7.5 J/cm 2, 24h po naświetlaniu. Wnioski Terapia fotodynamiczna jest metodą leczenia zmian nowotworowych, która budzi duże zainteresowanie z powodu swojej selektywności działania. PDT niszczy komórki zmienione nowotworowo poprzez połączenie działania trzech nietoksycznych czynników: fotouczulacza (fotosensybilizatora), światła oraz tlenu. Badania związane z poszukiwaniem idealnych substancji fotouczulających są kluczowe dla rozwoju PDT, ponieważ posiadanie leku o odpowiednich cechach warunkuje skuteczne leczenie. Wśród różnych związków badanych jako potencjalne leki w terapii fotodynamicznej, ftalocyjaniny okazały się wyjątkowo obiecujące ze względu na swoje szczególne właściwości. Zalicza się do nich przede wszystkim: niską toksyczność w ciemności, silną absorpcję w zakresie okna terapeutycznego ( nm) oraz wysoką wydajność kwantową stanu trypletowego. Jednak takie cechy jak silna tendencja ftalocyjanin do tworzenia asocjatów oraz niska rozpuszczalność w wodzie mogą ograniczać zastosowanie tych związków w PDT. W niniejszej pracy zsyntezowałam trzy, rozpuszczalne w wodzie, oktakarboksyftalocyjaniny: cynku, glinu i galu. Przy pomocy elektronowej spektroskopii absorpcyjnej zbadałam oraz porównałam ich tendencję do asocjacji w zależności od stężenia ftalocyjanin i kwasowości otoczenia. Z analizy uzyskanych widm UV-Vis wynika, że

14 w przypadku Ga(OH)PcOC postać monomeryczna występuje w ponad 90 % przy ph powyżej 5, a dla ZnPcOC i Al(OH)PcOC przy ph powyżej 6. W związku z tym dalsze badania prowadzone były w roztworach wodnych o ph = 8.0 i w DMSO, gdzie również badane ftalocyjaniny są w formie monomerów. Na podstawie liniowych zależności stężeniowych absorbancji w maksimum pasma Q badanych związków stwierdziłam, że w zakresie stężeń mol/dm 3 występują one wyłącznie w postaci monomerycznej oraz wyznaczyłam ich molowe współczynniki absorpcji w buforze wodnym oraz w DMSO. Istotne z punktu widzenia terapii fotodynamicznej, było zbadanie fotostabilności wybranych MPcOC. W celu określenia szybkości rozkładu fotouczulaczy, zarejestrowałam ich widma absorpcyjne UV- Vis w różnych warunkach oświetlenia: w ciemności, na świetle dziennym oraz naświetlanych światłem czerwonym o długości fali 685 nm i gęstości mocy 6.4 mw/cm 2. Przeprowadzone badania pokazują, że najbardziej podatne na fotodegradację są roztwory ZnPcOC, Al(OH)PcOC i Ga(OH)PcOC, które zostały naświetlane światłem czerwonym, natomiast w ciemności i na świetle dziennym rozwory badanych fotouczulaczy są stabilne. Tendencja ta jest widoczna zarówno w przypadku roztworów MPcOC znajdujących się w buforze fosforanowym o ph = 8.0, jak i w DMSO. Ponadto, spośród trzech badanych fotosensybilizatorów w PBS, najbardziej fotostabilny okazał się kompleks Al(OH)PcOC, natomiast w DMSO był to kompleks ZnPcOC. Dodatkowo zbadałam także wpływ aminokwasów i albuminy na widma absorpcyjne UV-Vis MPcOC i na fotostabilność badanych ftalocyjanin. Otrzymane wyniki pokazują, że dodanie wybranych aminokwasów lub albuminy do roztworu zawierającego badane fotouczulacze, zwiększa ich fotostabilność, co szczególnie jest widoczne w przypadku rozworów naświetlanych światłem czerwonym. Ponadto największy spadek efektywnych stałych szybkości reakcji dla wszystkich trzech zbadanych oktakarboksyftalocyjanin metali, zaobserwowano w przypadku dodania aminokwasów aromatycznych do roztworów MPcOC. W kolejnym etapie pracy, zarejestrowałam widma emisyjne dla MPOC, a uzyskane wyniki pokazują, że wszystkie trzy potencjalne fotosensybilizatory (ZnPcOC, Al(OH)PcOC i Ga(OH)PcOC) wykazują fluorescencję, zarówno w PBS o ph = 8.0, jak i w DMSO. Ponadto intensywność fluorescencji wzrasta wraz ze wzrostem ph roztworu, co wynika ze zwiększania stężenia postaci monomerycznej w roztworze, analogicznie do wyników otrzymanych z rejestracji widm absorpcyjnych. Oktakarbosyftalocyjaniną metalu, dla której maksymalna intensywność luminescencji pojawia się przy najniższej wartości ph (5.57) jest Ga(OH)PcOC. Fluorescencja nie jest wielkością stałą i zależy od stężenia ftalocyjanin, więc dla każdego roztworu MPcOC w DMSO wyznaczyłam wartości stężeń, którym odpowiada maksymalna

15 intensywność emisji, po których następuje stopniowe wygaszanie luminescencji. Dodatkowo wyznaczyłam kwantowe wydajności fluorescencji dla roztworów badanych ftalocyjanin. Wartość ФF potencjalnych fotouczulaczy powinna być umiarkowana, ponieważ zbyt wysoka emisja może powodować ograniczenie skuteczności terapeutycznej leku. Zbadane komplesksy (ZnPcOC, Al(OH)PcOC i Ga(OH)PcOC) posiadają dość niskie wartości ФF (w przedziele ), co jest korzystne z punktu widzenia zastosowania tych związków w PDT. Badania eksperymentalne zostały wzbogacone obliczeniami przy użyciu programu Gaussian 09 z zastosowaniem metod DFT. Aby określić sposób oddziaływania ftalocyjanin z aminokwasami, przeprowadziłam pełną optymalizację geometrii badanych kompleksów oktakarboksyftalocyjanin metali z wybranymi aminokwasami (glicyna, L-seryna, L-cysteina, L-histydyna). Dodatkowo, dla zoptymalizowanych układów, obliczyłam widma UV-Vis, w celu określenia wpływu oddziaływania z aminokwasami na właściwości optyczne oktakarboksyftalocyjanin metali. Wyniki obliczeń wskazują, że koordynacja aksjalna aminokwasu znacznie zmniejsza niepłaskość pierścienia ftalocyjaninowego, a tym samym zmienia strukturę elektronową. Z drugiej strony wiązania wodorowe utworzone pomiędzy grupami karboksylowymi ftalocyjaniny i aminokwasu w kompleksach ekwatorialnych nie zmieniają struktury wewnątrz centrum ftalocyjaniny i powodują tylko nieznaczny wzrost intensywności pasm UV-Vis, co doskonale zgadza się z danymi eksperymentalnymi. Uzyskanie interesujących wyników dotyczących właściwości fizykochemicznych oktakarboksyftalocyjanin metali pod kątem PDT, pozwoliło przeprowadzić badania biologiczne w układach in vitro na trzech modelowych ludzkich liniach komórkowych (NHDF, HaCaT i Me45). Uzyskane wyniki potwierdziły, że MPcOC mogą być dobrymi fotouczulaczami w terapii fotodynamicznej, ponieważ wykazały selektywność i działanie cytostatyczne wobec linii komórkowej czerniaka (Me45), przy czym najlepszym i najbardziej obiecującym fotosensybilizatorem okazała się Ga(OH)PcOC. Ponadto zbadane oktakarboksyftalocyjaniny aktywowały nadprodukcję reaktywnych form tlenu, co również jest zgodne z założeniami PDT. Badania przeprowadzone w ramach pracy wyjaśniły wiele kwestii dotyczących charakterystyki zaproponowanych fotouczulaczy. Jednocześnie poszerzyły dotychczasowy stan wiedzy w zakresie terapii fotodynamicznej i ujawniły nowe zagadnienia, które mogą być początkiem dalszych badań. Podsumowując, z wyników badań przedstawionych w niniejszej pracy, można wyciągnąć następujące wnioski:

16 1. Badane oktakarboksyftalocyjaniny metali (ZnPcOC, Al(OH)PcOC i Ga(OH)PcOC) wykazały silną absorpcję w tzw. oknie terapeutycznym. 2. W roztworach wodnych o ph = 8.0 oraz w DMSO, w badanym zakresie stężeń, oktakarboksyftalocyjanina cynku, glinu i galu występuje w pożądanej do PDT formie monomerycznej. 3. Potencjalne fotouczulacze są stabilne w ciemności i poddane działaniu światła dziennego, natomiast promieniowanie czerwone w mniejszym lub większym stopniu powoduje fotodegradację. 4. Obecność aminokwasów lub albuminy zwiększa fotostabilność badanych oktakarboksyftalocyjanin metali wystawionych na działanie światła czerwonego. 5. Wszystkie trzy zbadane MPcOC wykazują fluorescencję w buforze fosforanowym o ph = 8.0 oraz w DMSO. 6. Fotouczulacze (ZnPcOC, Al(OH)PcOC i Ga(OH)PcOC) charakteryzują się dość niskimi wartościami kwantowej wydajności fluorescencji ( ), co pozwala na skuteczne generowanie reaktywnych form tlenu. 7. Obliczenia przeprowadzone przy użyciu metod DFT i TD-DFT pozwoliły na określenie wpływu aminokwasów na strukturę ftalocyjanin oraz na oszacowanie energii oddziaływania w układach MPcOC aminokwas. 8. Oktakarboksyftalocyjaniny metali jako fotouczulacze wykazały działanie cytostatyczne wobec ludzkiej nowotworowej linii czerniaka (Me45), a także, zgodnie z założeniami terapii fotodynamicznej, aktywowały nadprodukcję reaktywnych form tlenu także w kontekście długoterminowym (do 24h). Dorobek naukowy Publikacje stanowiące podstawę rozprawy doktorskiej: 1. Nackiewicz J., Kliber-Jasik M., Skonieczna M. A novel pro-apoptotic role of zinc octacarboxyphthalocyanine in melanoma me45 cancer cell's photodynamic therapy (PDT). J. Photochem. Photobiol. B 2019, 190, (IF = 3.165). 2. Kliber-Jasik M., Broda M.A., Maroń A., Nackiewicz J. Interactions of amino acids with aluminum octacarboxyphthalocyanine hydroxide. Experimental and DFT studies. J. Mol. Model. 2017, 23, 51 (IF = 1.507). 3. Kliber M., Broda M.A., Nackiewicz J. Interactions of zinc octacarboxyphthalocyanine with selected amino acids and with albumin, Spectrochim. Acta A 2016, 155, (IF = 2.880).

17 4. Nackiewicz J., Kliber M. Synthesis and selected properties of metallo and metal-free 2,3,9,10,16,17,23,24 octacarboxyphthalocyanines. ARKIVOC 2015 (i) (IF = 1.048). 5. Nackiewicz J., Suchan A., Kliber M. Octacarboxyphthalocyanines compounds of interesting spectral, photochemical and catalytic properties. CHEMIK 2014, 68, Kliber M., Broda M.A., Nackiewicz J. Leki w terapii fotodynamicznej PDT. Lek w Polsce 2015, 25, Publikacja pokonferencyjna: Kliber-Jasik M., Nackiewicz J. The application of phthalocyanines in photodynamic therapy PDT, Materiały i Technologie XXI wieku / Godzierz Marcin [i in.] ( red. ), 2016, Rozdziały z książek: 1. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Oktakarboksyftalocyjaniny glinu i cynku jako potencjalne fotouczulacze w terapii fotodynamicznej PDT. Rozdział w książce: Na Pograniczu Chemii I Biologii, Tom XXXIII, red. Koroniak H., Barciszewski J., Wyd. Nauk. UAM, Poznań, 2014, Kliber-Jasik M., Nackiewicz J., Broda M.A. Ftalocyjaniny i ich rola w terapii fotodynamicznej. Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce Chemia, monografia, red. Nyćkowiak J., Leśny J. Wyd. Młodzi Naukowcy, Poznań, 2017, Kliber-Jasik M., Nackiewicz J., Broda M.A. Synteza i charakterystyka spektralna oktakarboksyftalocyjanin metali. Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce Chemia, monografia, red. Nyćkowiak J., Leśny J. Wyd. Młodzi Naukowcy, Poznań, 2017, Wystąpienia konferencyjne: 1. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Synteza oktakarboksyftalocyjaniny glinu jako potencjalnego fotouczulacza w terapii fotodynamicznej PDT. 56. Zjazd Polskiego Towarzystwa Chemicznego i Stowarzyszenia Inżynierów i Techników Przemysłu Chemicznego, Siedlce r. POSTER 2. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Synteza właściwości i zastosowanie oktakarboksyftalocyjanin metali. IX Targi Wiedzy Technologicznej w ramach projektu: Platforma Innowacji Technologicznej Regionu Opolszczyzny V, Opole r. POSTER 3. Nackiewicz J., Kliber M., Broda M.A. Synthesis and properties of aluminium octacarboxyphthalocyanine a potential photosensitizer for Photodynamic therapy. XVII Gliwice Scientific Meetings, Gliwice r. POSTER 4. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Octacarboxyphthalocyanines - promising compounds in photodynamic therapy PDT. Konferencja Użytkowników Komputerów Dużej Mocy, Zakopane r. WYSTĄPIENIE USTNE 5. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Oktakarboksyftalocyjaniny glinu i cynku jako potencjalne fotouczulacze w terapii fotodynamicznej PDT. XII Ogólnopolskie Seminarium

18 Doktorantów Na pograniczu chemii i biologii, Karpacz r. WYSTĄPIENIE USTNE 6. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Properties of aluminium- and zinc octacarboxyphthalocyanines from the theoretical and experimental point of view. Polish- Taiwanese Conference From Molecular Modeling to Nano- and Biotechnology, Opole- Groszowice r. POSTER 7. Kliber M., Nackiewicz J. Photodegradation of zinc octacarboxy-phthalocyanine in aqueous solutions. II Międzynarodowa Konferencja Naukowa OXYGENALIA 2014, Poznań r. POSTER 8. Kliber M., Nackiewicz J., Skonieczna M. Synthesis and properties of zinc octacarboxyphthalocyanine a potential photosensitizer for Photodynamic therapy. XVIII Gliwice Scientific Meetings, Gliwice r. POSTER 9. Kliber M., Nackiewicz J., Broda M.A. Octacarboxyphthalocyanines from the Experimental and Theoretical Viewpoint. Konferencja Użytkowników Komputerów Dużej Mocy, Zakopane r. WYSTĄPIENIE USTNE 10. Kliber M., Nackiewicz J. Synteza oktakarboksyftalocyjanin metali jako potencjalnych fotosensybilizatorów stosowanych w terapii fotodynamicznej PDT. X Ogólnopolskie Sympozjum Chemii Organicznej (OSCO X), Łódź r. POSTER 11. Kliber-Jasik M., Broda M.A., Nackiewicz J. Interactions of zinc octacarboxyphthalocyanine with selected amino acid-theoretical calculations". 2 nd Polish-Taiwanese Conference From Molecular Modeling to Nano- and Biotechnology, Opole-Groszowice r. POSTER 12. Nackiewicz J., Kliber-Jasik M., Skonieczna M. A novel pro-apoptotic role of Zincphthalocyanines in melanoma Me45 cancer cells PDT therapy. IX Gliwice Scientific Meetings, Gliwice r. POSTER 13. Nackiewicz J., Kliber-Jasik M., Skonieczna M. Novel aluminium phthalocyanines as potential pro-oxidative and pro-apoptotic drugs against melanoma Me45 cancer cells. IX Gliwice Scientific Meetings, Gliwice r. POSTER 14. Kliber-Jasik M., Nackiewicz J. The application of phthalocyanines in photodynamic therapy PDT. 18 th International student academic session Materials and Technologies of 21 st century, Katowice r. WYSTĄPIENIE USTNE 15. Kliber-Jasik M., Nackiewicz J. Badania właściwości spektralnych wybranych oktakarboksyftalocyjanin metali pod kątem ich potencjalnego wykorzystania w terapii fotodynamicznej PDT. Śląskie Spotkania Naukowe, Dzierżno r. WYSTĄPIENIE USTNE 16. Kliber-Jasik M., Broda M.A., Nackiewicz J. Interactions of amino acids with selected phthalocyanines. DFT study. Modeling and Design of Molecular Materials 2016, Trzebnica r. POSTER 17. Broda M.A., Kliber-Jasik M., Nackiewicz J. Influence of amino acids on the photostability of water-soluble octacarboxyphthalocyanines of Zn(II), Al(III) and Ga(III). 3 rd Polish-Taiwanese Conference From Molecular Modeling to Nano and Biotechnology, Taipei, Taiwan r. POSTER 18. Nackiewicz J., Kliber-Jasik M. Photodegradation of metallo-octacarboxyphthalocyanines in solutions. III Międzynarodowa Konferencja Naukowa OXYGENALIA 2016 Oblicza TLENU, Kraków r. POSTER 19. Skonieczna M., Kliber-Jasik M., Nackiewicz. Novel gallium phthalocyanine as potential proapoptotic drug against melanoma Me45 cancer cells. 20th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice r. POSTER

19 20. Kliber-Jasik M., Nackiewicz J., Broda M.A. Ftalocyjaniny i ich rola w terapii fotodynamicznej. IV Ogólnokrajowa Konferencja Młodzi Naukowcy w Polsce - Badania i Rozwój, Oleśnica r. POSTER 21. Nackiewicz J., Kliber-Jasik M., Skonieczna M. Oktakarboksyftalocyjanina galu jako potencjalny fotosensibilizator w terapii PDT. Śląskie Spotkania Naukowe, Ustroń marca 2017 r. WYSTĄPIENIE USTNE Nagroda i wyróżnienia: Wyróżnienie za najlepszą prezentację: Oktakarboksyftalocyjaniny glinu i cynku jako potencjalne fotouczulacze w terapii fotodynamicznej PDT, zaprezentowaną podczas XII Ogólnopolskiego Seminarium Doktorantów Na pograniczu chemii i biologii, Karpacz r. Działalność organizacyjna: 1. Aktywny udział w organizacji XI, XII, XIII i XIV Opolskiego Festiwalu Nauki 2. Członkostwo w Kole Naukowym Chemików Koronan 3. Członek komitetu organizacyjnego konferencji 3 rd Symposium on Weak Molecular Interactions (27 28 marca 2017 Opole), której organizatorem był Zakład Chemii Fizycznej i Modelowania Molekularnego, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski Staż naukowy: Trzymiesięczny staż naukowy (w dniach r.) w Laboratorium Genetyki Molekularnej i Inżynierii Genetycznej, Centrum Biotechnologii Politechniki Śląskiej w Gliwicach. Stypendia: 1. Stypendia doktoranckie - inwestycja w kadrę naukową województwa opolskiego projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego realizowany w latach 2012/2013 i 2013/ Stypendia doktoranckie - inwestycja w kadrę naukową województwa opolskiego II projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego realizowany w latach w latach 2014/ Stypendium Prezydenta Miasta Opola za wyróżniające osiągnięcia w grupie nauk ścisłych i inżynierskich w roku akademickim 2015/ Stypendium dla najlepszych doktorantów Uniwersytetu Opolskiego w roku akademickim 2016/ Zwiększenie stypendium doktoranckiego z dotacji podmiotowej na dofinansowanie zadań projakościowych w roku akademickim 2016/2017. Źródła finansowania pracy: 1. Środki statutowe służące rozwojowi młodych naukowców oraz uczestników studiów

20 doktoranckich w latach Obliczenia prowadzone były w Centrum Komputerowym CYFRONET AGH w Krakowie oraz we Wrocławskim Centrum Sieciowo Superkomputerowym (WCSS). Bibliografia [1] Leznoff C.C., Lever A.B.P. Phthalocyanines Properties and Applications, Wiley- VCH: New York (a) 1989, Vol.1, ; (b) 1993; Vol.3, [2] Karaoğlan G.K., Gümrükçü G., Koca A., Gül A., Avcıata U. Dyes Pigments, 2011, 90, [3] Allen C.M., Sharman W.M., Van Lier J.E. J. Porphyr. Phthalocya. 2001, 5, [4] Kɪrbaҫ E., Atmaca G.Y., Erdoğmuş A. J. Organomet. Chem. 2014, 752, [5] Dao K.L., Hanson R.N. Bioconjugate Chem. 2012, 23, [6] Ishii K., Shiine M., Shimizu Y., Hoshino S., Abe H., Sogawa K., Kobayashi N. J. Phys. Chem. B 2008, 112, [7] Ҫakɪr V., Ҫakɪr D., Pişkin M., Durmuş M., Bɪyɪkhlɪoğlu Z. J. Organomet. Chem. 2015, 783, [8] Ogbodu R.O., Nyokong T. Spectrochim. Acta A 2015, 151, [9] Knecht S., Dürr K., Schmid G., Subramanian L.R., Hanack M. J. Porphyr. Phthalocya. 1999, 3, [10] Yagi M., Fukiya H., Kaneko T., Aoki T., Oikawa E., Kaneko M. J. Electroanal. Chem 2000, 481, [11] Nemykin V.N., Lukyanets E.A. ARKIVOC 2010, (i) [12] [13] Lukyanets E.A., Nemykin V.N. J. Porphyr. Phthalocya. 2010, 14, Urbani M., Ragoussi M.E., Nazeeruddin M.K., Torres T. Coord. Chem. Rev. 2019, 381, [14] McKeown B.N. Cambridge University Press New York, [15] Shaposhnikov G.P., Maizlish V.E., Kulinich V.P. Russ. J. Gen. Chem. 2005, 75, [16] Boston D.R., Bailar J.C. Inorg. Chem. 1972, 11, [17] Inoue H., Kida Y., Imoto E. Bull. Chem. Soc. Jap. 1967, 40, [18] Sakamoto K., Ohno E. Prog. Org. Coat. 1997, 31, [19] Kuznetsova N.A., Gretsova N.S., Derkacheva V.M., Mikhalenko S.A., Solov eva L.I., Yuzhakova O.A., Kaliya O.L., Luk yanets E.A. Russ. J. Gen. Chem. 2002, 72, [20] US Patent , 1967, Chem. Abstr. 1967; 66, c. [21] Wöhrle D., Meyer G., Wahl B. Makromol. Chem. 1980, 181, [22] Kim S.J., Matsumoto M., Shigehara K. J. Porphyr. Phthalocya. 2000, 4, [23] Opris D.M., Nüesch F., Löwe C., Molberg M., Nagel M. Chem. Mater. 2008, 20, [24] Gośliński T., Konopka K., Piskorz J., Kryjewski M., Wierzchowski M., Sobiak S. Post. Mikrobiol. 2008, 47, [25] Kudinova N.V., Berezov T.T. Biochem. (Moscow) Supp. Ser. B: Biomed. Chem. 2010, 4, [26] Yano S., Hirohara S., Obata M., Hagiya Y., Ogura S., Ikeda A., Kataoka H., Tanaka M., Joh T. J. Photoch. Photobio.C 2011, 12, [27] Graczykowa A. Fotodynamiczna metoda rozpoznawania i leczenia nowotworów, Bellona, Warszawa 1999, [28] Schuitmaker J.J., Baas P., van Leengoed H.L.L.M., van der Meulen F.W., Star W.M., van Zandwijk N. J. Photoch. Photobio. B 1996, 34, [29] Plaetzer K. Krammer B. Berlanda J. Berr F. Kiesslich T. Lasers Med. Sci. 2009, 24,

21 [30] Josefsen L.B., Boyle R.W. Metal-Based Drugs 2008, 2008) [31] Kwiatkowski S., Knap B., Przystupski D., Saczko J., Kędzierska E., Knap-Czop K., Kotlińska J., Michel O., Kotowski K., Kulbacka J. Biomed. Pharmacother. 2018, 106, [32] [33] [34] [35] [36] [37] Allison R.R., Downie G.H., Cuenca R., Hu X.H, Childs C.J.H., Sibata C.H. Photodiagn. Photodyn. 2004, 1, Nyman E.S., Hynninen P.H. J. Photochem. Photobiol. B 2004, 73, Kalka K., Merk H., Mukhtar H. J. Am. Acad. Dermatol. 2000, 42, Detty M.R., Gibson S.L., Wagner S.J. J. Med. Chem. 2004, 47, Kliber M., Broda M.A., Nackiewicz J. Lek w Polsce 2015, 25, Jiang Z., Shao J., Yang T., Wang J., Jia L. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 87, [38] Ҫakɪr D., Göl C., Ҫakɪr V., Durmuş M., Bɪyɪkhlɪoğlu Z., Kantekin H. J. Lumin. 2015, 159, [39] Karaoğlan G.K., Gümrükçü G., Koca A., Gül A. Dyes Pigments 2011, 88, [40] Tedesco A.C., Rotta J.C.G., Lunardi C.N. Curr. Org. Chem. 2003, 7, [41] Hopper C. Lancet Oncol. 2000, 1, [42] Tatikolov A.S., Costa S.M.B. J. Photochem. Photobiol. A 2001, 140, [43] Castano A.P., Demidova T.N. Hamblin M.R. Photodiagn. Photodyn. 2004, 1, [44] Banerjee S.M., MacRobert A.J., Mosse C.A., Periera B., Bown S.G., Keshtgar M.R.S. The Breast 2017, 31, [45] Szalewicz K., Jeziorski B. Molecular Interactions, from van der Waals to Strongly Bound Complexes. [red.] S. Scheiner. Chichester: Wiley, [46] Jeziorski B., Szalewicz K. Intermolecular Interactions by Perturbation Theory in: Encyclopedia of Computational Chemistry. [red.] N.L. Allinger. brak miejsca: von Regue Schleyer. [47] Li D., Peng Z., Deng L., Shen Y., Zhou Y. Vib. Spectrosc. 2005, 39, [48] Zhang Y., Zhang X., Liu Z., Xu H., Jiang J. Vib. Spectrosc. 2006, 40, [49] Liu Z., Zhang X., Yuexing Zhang Y., Jiang J. Spectrochimica Acta Part A 2007, 67, [50] Basova T.V., Kiselev V.G., Schuster B.E, Peisert H., Chasse T. J. Raman Spectrosc. 2009, [51] Basova T.V., Kiselev V.G., Plyashkevich V.A., Cheblakov P.B., Latteyer F., Peisert H., Chasse T. Chem. Phys. 2011, 380, [52] Dube E., Oluwole D.O., Nwaji N., Nyokong T. Spectrochim. Acta A 2018, 203, [53] Oluwole D.O., Sari F.A., Prinsloo E., Dube E., Yuzer A., Nyokong T., Ince M. Spectrochim. Acta A 2018, 203, [54] Nyokong T. Pure Appl. Chem. 2011, 83,