Biotechnologia molekularna

Transkrypt

1 Biotechnologia molekularna Plan wykładów JC Wykłady 1-3: struktury RNA RNAi, rybozymy, ryboprzełączniki zastosowania, sposoby dostarczenia do komórki Wykład 4: podstawy funkcjonowania układu immunologicznego, przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, humanizowane... Wykład 5: prezentacja peptydów i przeciwciał na powierzchni bakteriofagów Nagroda Nobla z chemii 2018 Wykład 6: techniki immunologiczne i ich zastosowania II Połówka egzaminu

2 Materiały do nauki: Publikacje cytowane w prezentacjach Notatki z wykładów Prezentacje Własne poszukiwania źródeł

3 Biotechnologia molekularna Wykład JC1. RNA struktury i funkcje regulacyjne dr hab. Joanna Cieśla, prof. PW Katedra Biotechnologii Środków Leczniczych i Kosmetyków Gmach Technologii Chemicznej, III p., pok. 305 tel , jciesla@ch.pw.edu.pl

4 Większość naszego genomu jest transkrybowana do cząsteczek RNA, ale funkcje większości z nich są nieznane Poznanie komponentów IIIrzędowej struktury RNA może pomóc w przewidywaniu struktury III-rzędowej na podstawie sekwencji i w rezultacie poznanie biologicznej funkcji RNA Po co badać III-rzędową strukturę RNA? Wiedza na temat struktury RNA pozwoli na opracowanie nowych supramolekularnych struktur, które mogłyby być użyte jako nanomechaniczne komponenty nowych materiałów Wiele patogenów wirusowych ma genom zbudowany z RNA. Znajomość struktury RNA ułatwi opracowywanie nowych leków

5 Sekwencja nukleotydów w RNA Unikatowa struktura 3-D Funkcja

6 RNA najczęściej: Mają wysoce skomplikowaną strukturę Są zaangażowane we wszystkie aspekty procesu ekspresji genów Biosensory (ryboprzełącznik) Fabryka syntezy białek (rybosom) Kataliza (samowycinający się intron grupy II) Anna Marie Pyle (Yale U./HHMI) Part 1: RNA Structure

7 Co odróżnia RNA od DNA i jakie są tego skutki? 5 Uracyl zamiast tyminy Obecność grupy 2 -OH Tymina 3 DNA

8 Możliwość wielu interakcji

9 Cukier w RNA i DNA nie jest płaski C3 -endo (najczęstsze w RNA) Inna odległość między dwiema grupami fosforanowymi (OP) C2 -endo (najczęstsze w DNA) Konformacja cukru nadaje RNA i DNA odmienne kształty

10 RNA występuje w formie A Cząsteczki wody są bardzo istotne w tworzeniu struktury RNA

11 Drugorzędowa struktura RNA Interakcje między zasadami azotowymi w obrębie jednej nici lub między dwiema nićmi

12

13 Struktura typowego ludzkiego mrna kodującego białko Drugorzędowa struktura rejonu 3'-UTR mrna kodującego kofilinę

14 Regiony sparowane i pętle Głównie pary Watsona-Cricka, ale także tzw. wobble pairs : G-U, A-C +, G-A (zazwyczaj na końcu dupleksu)

15 Ważny przykład Para G-U: ryboza ryboza Porównaj parę G-U z normalną parą A-U: Inny kierunek wiązań, w G-U zaangażowany jest O2, a nie O4 jak w A-U, ale kształt pary pozostaje taki sam ryboza ryboza

16 Takie pętle powodują zginanie struktury RNA Zasady azotowe w środowisku wodnym nie wystają na zewnątrz, lecz chowają się we wnętrzu struktury i oddziałują ze sobą hydrofobowo PDB ID 255D

17 Końcowe pętle w strukturach spinki do włosów mają zwykle konserwowane sekwencje, takie jak np. UUCG lub GAAA

18 Trzeciorzędowa struktura RNA

19 W obecności jonów RNA tworzy drugoi trzeciorzędowe struktury

20 Powstawanie struktury trzeciorzędowej Kształt cząsteczki jest determinowany przez współosiowe układanie się pni (coaxial stacking of stems)

21 Motyw: pseudowęzeł (pseudoknot) Parowanie zasad pomiędzy pętlą i sąsiadującą sekwencją Aptamer wiążący biotynę Udział Mg 2+ i unieruchomionych cząsteczek H 2 O Nix J et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:

22 Motyw: czterozasadowa pętla receptor (tetraloop-receptor motif) Cate & Doudna (1996) Science 273: 1678 Przykład: domena P456 rybozymu z Tetrahymena

23 Trzeciorzędowe interakcje RNA: całujące się pętle (kissing loops) Kształt RNA zgiętego pod kątem ~ 90

24 Trzeciorzędowe interakcje RNA : rybozowe zamki błyskawiczne (ribose zippers) Grupa 2 -OH jest zarówno donorem jak i akceptorem wiązań wodorowych Gdy nici RNA są blisko siebie, reszty ryboz reagują ze sobą poprzez grupy 2 -OH. Zasady azotowe też są czasami zaangażowane w te oddziaływania Cate & Doudna (1996) Science 273: 1678

25 Trzeciorzędowe interakcje RNA: interakcje wielozasadowe (multi-base interactions) Tworzą się struktury trzy- a często i czteroniciowe Triplet zasad U:A:U Kwadruplet

26 Katalityczne RNA Zrozumienie budowy RNA pozwala zrozumieć funkcje, które RNA może spełniać Ryboprzełączniki Rybosom trna

27 Struktury RNA - zagadnienia: 1. Wzory strukturalne pięciu nukleotydów i łańcucha RNA 2. Porównanie struktury RNA i DNA 3. Pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowa budowa RNA (motywy, interakcje) 4. W jaki sposób powstaje III-rzędowa struktura RNA? 5. Jakie funkcje mogą spełniać RNA dzięki ich III-rzędowej strukturze? Piśmiennictwo: 1. Butcher SE, Pyle AM (2011) The molecular interactions that stabilize RNA tertiary structure: RNA motifs, patterns, and networks. Acc Chem Res. 44:

28 Interferencja RNA (RNAi)

29 Ekspresja genów DNA Transportujące RNA (trna) Rybosomowe RNA (rrna) Małe jądrowe RNA (snrna) Małe jąderkowe RNA (snorna) Informacyjne RNA (mrna) Micro RNA (mirna) Small interfering RNA (sirna) Piwi-interacting RNAs (pirnas) trans-activating sirnas (tasirnas) small scan RNAs (scnrnas) long noncoding RNAs (lncrnas) Białka jądra ssaków rośliny, robaki Tetrahymena Genom Transkryptom Proteom

30 Niekodujące RNA: śmieci czy niezbędne regulatory? Bakterie Drożdże Robaki Ludzie Regiony nietranskrybowane Regiony transkrybowane niekodujące Regiony kodujące białka

31 Interferencja RNA (RNAi) Silny, naturalnie występujący biologiczny mechanizm wyciszania genów, sterowany przez małe cząsteczki RNA. Wyciszenie może być potranskrypcyjne (post-transcriptional gene silencing, PTGS) osiągane na drodze degradacji bądź zahamowania translacji docelowego mrna lub transkrypcyjne (TGS) poprzez metylację DNA i/lub histonów

32 Historia odkrycia zjawiska RNAi 1990 Napoli i współpracownicy syntaza chalkonowa (CHS) główny enzym w szlaku syntezy antocyjaniny. nadekspresja genu CHS w petunii efekt białe lub pasiaste kwiaty, zamiast oczekiwanych fioletowych Wynik: poziom endogennej CHS był 50 razy niższy niż w dzikich petuniach Wniosek: wprowadzony gen CHS powodował ko-supresję endogennego genu CHS

33 1992 Romano i Macino Podobne zjawisko u Neurospora crassa wprowadzenie homologicznej sekwencji RNA wyciszało endogenny gen Guo and Kemphues Wprowadzenie antysensownej do mrna par-1 powodowało degradację nici mrna par-1 u C. elegans. Kontrola: wprowadzenie sensownej nici. Wynik: degradacja mrna par Fire i Mello Nagroda Nobla w 2006 r Wprowadzenie dsrna do C. elegans i uzyskanie razy silniejsze wyciszenie ekspresji genu unc-22 Wniosek: nić antysensowna jest skuteczna tylko wtedy, gdy wprowadzi się obie nici. Mello CC & Conte D Jr (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature 431:

34 1999 Hamilton i Baulcomb Istnieją stabilne intermediaty dsrna, które muszą się rozwinąć, aby nić antysensowna mogła zadziałać Poszukiwanie krótszych antysensownych RNA i znalezienie ok. 25-nt 2000/2001 identyfikacja nukleotydowych sekwencji RNA związanych z RNAi. Sugestia, że dsrna jest przekształcany do krótszych intermediatów, małych interferujących (small interfering) RNA sirna. sirna są komplementarne do sekwencji docelowych w mrna i powodują jego przecięcie w środku sekwencji sirna przez enzym Bernstein i wsp. Badania na ekstraktach z Drosophila Czy enzym przekształcający dsrna do sirna jest tożsamy z enzymem tnącym docelowy mrna? Odpowiedź: są to różne białka (ultrawirowanie) RISC (RNA-induced silencing complex) odpowiedzialny za cięcie mrna Dwie fazy RNAi: inicjatorowa (konwersja dsrna do sirna) i efektorowa (cięcie mrna przez RISC)

35 2001 Hannon i wsp. Odkrycie endonukleazy Dicer, niezbędnej na inicjatorowym etapie RNAi 2002 Tuschl i wsp. Oczyszczenie RISC dołączyli do sirna biotynę immunoprecypitacja białek związanych z sirna Identyfikacja białek AGO1 i AGO Joshua-Tor i wsp., Hannon i wsp. Czy białko/a AGO mają aktywność Slicer? Badania obejmujące krystalizację, modelowanie, immunoprecypitację, mutacje punktowe, myszy AGO2 null 2003 Paddison i wsp., Sui i wsp., Paul i wsp. Short hairpin RNA (shrnas) indukują specyficzne w stosunku do sekwencji wyciszenie ekspresji genów w komórkach ssaczych 2003 zastosowanie RNAi w terapii żółtaczki u myszy 2004 FDA zezwoliła na pierwszą kliniczną próbę z użyciem RNAi

36 W jaki sposób sirna wchodzi do kompleksu RISC? 2005 Gregory i wsp., Matranga i wsp. Białko AGO2 jest odpowiedzialne za degradację nici-pasażera i wstawienie do RISC drugiej nici Dicer odgrywa rolę również w dalszych etapach RNAi (Pham i wsp, 2004; Chendrimada i wsp., 2005) identyfikacja 500 kda minimalnego kompleksu identyfikacja białek, które współoczyszczają się z Dicer: AGO2, TRBP (the HIV Transactivating response RNA-Binding Protein) 2004 Bartel i wsp. mirna stanowią dużą klasę małych regulatorowych RNA u różnych gatunków roślin i zwierząt 5% ludzkiego genomu koduje ok mirna, które regulują co najmniej 30% naszych genów

37 NCBI PubMed. Hasło: RNAi or sirna or mirna

38 shrna mir genes mirna sirna RNAi Inne pochodzenie i funkcja sirna i mirna Podobne etapy: Cięcie przez Dicer (w kompleksie z innymi białkami) Rozplecenie dupleksu - enzym podobny do helikazy Powstanie kompleksu RISC i degradacja nici pasażera Wiązanie komplementarnych sekwencji w regionie 5 UTR, 3 - UTR lub w ORF, wyciszenie ekspresji genów mirna: nie 100% komplementarność, wiele sekwencji docelowych, hamowanie translacji sirna: 100% komplementarność, cięcie i degradacja mrna

39 Różne bazy danych, ciekawe projekty badawcze: Geny kodujące mikrorna (mir) 4000 znanych genów, 1000 u ludzi 70% genów mir jest zlokalizowanych w obrębie intronów lub eksonów 30% genów mir jest zlokalizowanych w regionach międzygenowych Tworzą niezależne jednostki transkrypcyjne Transkrypcja przez polimerazę II Często zlokalizowane w krytycznych rejonach chromosomów Często ich brak lub są zmutowane w komórkach nowotworowych Mysie i ludzkie geny mir są zakonserwowane

40 Struktura mirna shrna short hairpin RNA. Takie struktury powstają w komórce lub można je dostarczyć w celu terapeutycznym. Są substratami nukleazy Dicer, która je tnie powstają mirna podobne do sirna

41 Struktura sirna nt duplex 2 nt 3 overhangs

42 Możliwe mechanizmy represji translacji przez mirisc Translacja mrna Konkurencja o wiązanie czapeczki (cap) Promocja degradacji mrna Konkurencja o wiązanie ef6/60s Zablokowanie cyrkularyzacji Carthew RW & Sontheimer EJ (2009) Cell 136: Odpadanie rybosomów

43 Wyciszanie genów przez sirna na poziomie transkrypcji (TGS) W S. pombe i prawdopodobnie u zwierząt DMT DNA methyltransferase HMT histone methyltransferase RITS U roślin RITS RNA-induced transcriptional silencing complex. Zawiera AGO1. Działanie RITS owocuje metylacją histonów lub DNA i zwiększeniem upakowania chromatyny. TGS Transcriptional Gene Silencing

44 Interferencja RNA: główne rodzaje RNA i funkcje Małe interferujące RNA (sirna) obrona integralności genomu (wirusy, transpozony, transgeny) - egzogenne i endogenne sirna Wiążą się z AGO Mikro RNA (mirna) regulatory endogennej ekspresji genów Wiążą się z AGO Piwi RNA (pirna) udział w wyciszeniu transpozonów, znajdowane u zwierząt w liniach komórek rozrodczych. Prekursory pirna są prawdopodobnie jednoniciowe Wiążą się z Piwi Działanie tych małych RNA zależy od tych samych dwóch rodzin białek: Dicer wycięcie z większych prekursorów AGO udział w funkcji efektorowej (wyciszenie genu)

45 Dicer: I etap procesu interferencji RNA ATPase/Helicase DUF PAZ RIII RIII dsrbd Drosophila Dicer-1 Drosophila Dicer-2 C. elegans Dicer human Dicer Arabidopsis DCL1 Arabidopsis DCL2 Arabidopsis DCL3 superrodzina helikaz DEAD-podobnych C-końcowa domena superrodziny helikaz Domena wiążąca dsrna DUF283 domena PAZ rodzina RNazy III DEAD box zawiera aktywności ATPazy i helikazy Domena PAZ wiąże końce RNA, szczególnie dwuniciowe, zawierające 2-nukleotydowe nawisy Domeny RNAzy III każda tnie jedną lub obie nici w dsrna Rola w RNAi/miRNA: obróbka dsrna złożenie kompleksu RISC

46 Białka Argonauta są egzekutorami RNAi po doprowadzeniu ich przez krótkie jednoniciowe RNA do docelowych mrna Cephalopod Argonauta argo Carthew RW & Sontheimer EJ (2009) Cell 136: A. thaliana AGO1 mutant

47 Porównanie mirna i sirna 1. Wspólne etapy: Dicer, Ago (RISC), zależne od sekwencji wyciszenie genu 2. Różnice: Biogeneza mirna są produktami genomu własnego organizmu, celowa ekspresja sirna zasadniczo są pochodzenia zewnętrznego: pochodzą od wirusów, transpozonów, itp. Komplementarność z sekwencją docelową i funkcja sirna - 100% komplementarności, specyficzny cel; degradacja docelowego mrna rola: obrona przed obcym materiałem genetycznym mirna nieidealna komplementarność, rozpoznaje wiele sekwencji docelowych rola: regulacja ekspresji genów (proliferacja, różnicowanie, apoptoza),

48 Animacja : RNA interference (RNAi)

49 RNAi - zagadnienia: Naturalnie występujące zjawisko RNAi rodzaje i funkcje Różnice w pochodzeniu i działaniu między sirna i mirna Budowa sirna Mechanizmy wyciszania genów przez mirna i sirna Piśmiennictwo: 1. Sen GL and Blau HM. (2006) A brief history of RNAi: the silence of the genes. The FASEB Journal 20: Carthew RW and Sontheimer EJ (2009) Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell 136: Piotrowska A. i in. (2009) Interferencja RNA mechanizm i możliwości terapeutycznego wykorzystania. Pol. Ann. Med. 6: Dla zainteresowanych i wnikliwych: 1. Wilson RC & Doudna JA (2013) Molecular Mechanisms of RNA Interference. Annu Rev Biophys 42: Zheng et al. (2014) RNA activation: Promise as a new weapon against cancer. Cancer Letters 355: 18-24

50 Ryboprzełączniki

51 Ryboprzełączniki Regulatorowe segmenty mrna (najczęściej w regionie 5 -UTR), mające zdolność do wiązania małych cząsteczek i kontrolujących w ten sposób ekspresję swojego transkryptu

52 Odkrycie ryboprzełączników Tiamina, ryboflawina i kobalamina hamowały geny kodujące białka biorące udział w biosyntezie odpowiednio witaminy B 1, B 2, i B 12 (Nou and Kadner, 1998; Miranda-Rioss et al., 2001) poszukiwano białkowych represorów. Nie znaleziono. Wniosek: regulatorową rolę odgrywają konserwowane sekwencje mrna ( boxes ) czy mrna bezpośrednio wyczuwa metabolity? Znaleziono in vivo alternatywne konformacje mrna cob w zależności od obecności AdoCbl u Salmonella typhimurium. Udowodniono, że pochodne witamin TPP, FMN i AdoCbl bezpośrednio oddziałują z mrna kodującymi enzymy syntezy B 1, B 2 i B 12 i kontrolują te operony (Mironov et al., 2002; Winkler et al., 2002; Nahvi et al., 2002) Bezpośrednie wiązanie metabolitów do mrna powoduje ryboprzełączanie ( riboswitching ) pomiędzy alternatywnymi konformacjami mrna, co zmienia ekspresję genu (Nahvi et al., 2002)

53 Organizacja ryboprzełącznika zmienna konserwowana Sekwencja przełączająca 5 UTR mrna Domena aptameru wiąże ligand Sekwencja przełączająca może parować się z domeną aptameru lub platformą ekspresyjną tworząc alternatywne struktury: strukturę terminatora lub antyterminatora RNAP polimeraza RNA Platforma ekspresyjna może wpływać na transkrypcję lub translację Garst et al., (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol. doi: /cshperspect.a003533

54 Podstawowe sposoby działania ryboprzełącznika SD RBS Rybosome Binding Site Kim NJ, Braeker RR.(2008) Biol. Cell 100: 1-11 Regulacja poprzez terminację transkrypcji (A) lub zahamowanie inicjacji translacji (B) genów kodujących białka transportujące metabolit lub biorące udział w jego syntezie

55 Działanie ryboprzełącznika można opisać jako proces, w którym rozpoznanie ligandu przez aptamer dyktuje sposób zwinięcia się transkrybowanego mrna. Powstająca struktura determinuje interakcje z maszynerią transkrypcyjną lub translacyjną

56 Przykłady ligandów wiązanych przez ryboprzełączniki Mononukleotyd flawinowy (FMN) Adenozynokobalamina (AdoCbl) Pirofosforan tiaminy (TPP) Jony Puryny Aminokwasy Aminocukry

57 Przykłady ligandów wiązanych przez ryboprzełączniki cd. Kofaktor molibdenowy (Moco) Kofaktor wolframowy (Wco)

58 Jak ryboprzełączniki wybierają odpowiednie ligandy? W jaki sposób sygnał, że metabolit jest związany, jest przekazywany do maszynerii ekspresji genów? Jakie jest pochodzenie ryboprzełączników? Jak ryboprzełączniki można wykorzystać do celów terapeutycznych?

59 Ryboprzełącznik Regulowane procesy Ligand RFN-element Biosynteza i transport ryboflawiny FMN (mononukleotyd flawinowy) THI-element B 12 -element Biosynteza tiaminy, transport tiaminy i pokrewnych cząsteczek Biosynteza kobalaminy, transport kobalaminy i powiązanych cząsteczek, transport kobaltu, zależne od kobalaminy izozymy enzymów TPP (pirofosforan tiaminy) Coenzyme B12 (adenozylokobalamina) THF riboswitch Regulacja syntezy i transportu THF tetrahydrofolian G-box or XptR regulon PreQ1 I and II Cyclic-di-GMP riboswitches I and II glms Purine metabolism and transport Regulacja syntezy prekursora of queuosine Kontrola różnych genów kontrolowanych przez ten wtórny przekaźnik, implikowany w różnicowaniu komórek, tworzeniu biofilmu, ruchliwości i wirulencji Rybozym, który trawi sam siebie przy wystarczających stężeniach glukozamino- 6-fosforanu. Oszacowanie ogólnego stanu metabolicznego. Purines Pre-queuosine Cyclic-di-GMP Glukozamino-6-fpsforan, szereg pokrewnych związków chemicznych

60 Ryboprzełącznik Regulowane procesy Ligand Gly riboswitches Biosynteza i katabolizm glicyny Glicyna Gln riboswitches: Gln RNA motif Downstream peptide motif L-box or LYS-element SAH SAM SAM-SAH Biosynteza glutaminy, metabolizm azotu, krótkie peptydy o nieznanej funkcji Biposynteza, transport i katabolizm lizyny. Regulacja recyklingu SAHRegulation of recycling of SAH Biosynteza i transort metioniny, metabolizm SAM. Regulacja biosyntezy adenylotransferazy metioninowej. Wiązanie SAH jest prawdopodobnie nieistotne fizjologicznie. Glutamina Lizyna SAH (S-adenozylohomocysteina) SAM (S-adenozylometionina) SAM i SAH

61 Riboprzełącznik Regulowane procesy Ligand Moco RNA motif??? Prawdopodobnie regulacja transportu molibdenu Kofaktor molibdenowy Aniony (F - ), metale (Mg 2+ ) yybp Detekcja ph Protonacja i deprotonacja zasad azotowych zakłócenie parowania zasad w DNA Orphan riboswitches Inne, jeszcze nieodkryte

62 Struktury aptamerów 8 klas ryboprzełączników a) purynowy, b) TPP, c) SAM I, d) SAM II, e) SAM III, f) Lys, g) GlcN6P, h) Mg 2+ Roth A, Braker RR (2009) The Structural and Functional Diversity of Metabolite-Binding Riboswitches. Annu. Rev. Biochem. 78:305 34

63 Kluczowe interakcje molekularne w kieszeniach apatmerów pokazanych na poprzednim slajdzie Wiązania wodorowe Kontakty wewnętrznej powierzchni z Mg 2+ Elektrostatyczne interakcje z S Jonowe interakcje z K + Roth A, Braker RR (2009) The Structural and Functional Diversity of Metabolite-Binding Riboswitches. Annu. Rev. Biochem. 78:305 34

64 Rozpoznawanie metabolitu Ryboprzełącznik TPP Apy reszty aminopirymidynowe, Thi tiazol, PP- pirofosforan Ciasna kieszeń z idealną komplementarnością do części wiązanego ligandu. Indukowane dopasowanie Wiązania wodorowe, oddziałaywania elektrostatyczne, interakcje grup leżących w jednej płaszczyźnie (stacking interactions). Serganov A & Nudler E (2013) Cell 152:

65 Czynniki ważne dla zrozumienia działania ryboprzełączników: Szybkość transkrypcji Zatrzymania transkrypcji Kinetyka tworzenia struktur RNA Termodynamika tworzenia struktur RNA

66 Pochodzenie ryboprzełączników Ryboprzełącznik TPP jest obecny we wszystkich królestwach organizmów żywych, inne są szeroko rozpowszechnione w organizmach odległych ewolucyjnie Konserwowane domeny aptamerów Aktywność katalityczna niektórych ryboprzełączników Wiązanie starych ewolucyjnie ligandów (FMN, puryny) Pozostałości Świata RNA?

67 Ryboprzełączniki - zagadnienia: Definicja czym są ryboprzełączniki Budowa i organizacja funkcjonalna ryboprzełączników Podstawowe sposoby działania ryboprzełączników (na poziomie transkrypcji i translacji) Przykłady ligandów wiązanych przez ryboprzełączniki i regulowane procesy biochemiczne Piśmiennictwo: 1. Serganov A & Nudler E (2013) A decade of riboswitches. Cell 152: Breaker RR (2011) Prospects for Riboswitch Discovery and Analysis. Molecular Cell 43: Garst AD, Edwards AL, Batey RT (2010) Riboswitches: structures and mechanisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a Bugała K i wsp. (2005) Przełączniki RNA. Postępy Biochemii 51: Olszak K. (2011) Ryboprzełączniki - czy elementy struktury RNA mogą być przyszłością nauki i medycyny? Siła Wiedzy -

68 Rybozymy

69 Odkrycie katalitycznych właściwości RNA W latach 70./80. XX w. badał splicing RNA u jednokomórkowego organizmu, pierwotniaka Tetrahymena thermophila. Wykazał, że wycinanie intronu zachodzi bez udziału białka. Thomas Robert Cech Badał trna u E. coli. Scharakteryzował cząsteczkę prekursorową trna i zidentyfikował enzym, RNazę P, który bierze udział w dojrzewaniu trna. Odkrył obecność RNA w cząsteczce enzymu, oraz że to RNA (M1 RNA) katalizuje reakcję odcinania 5 -końca w prekursorze trna Nagroda Nobla w dziedzinie chemii Sidney Altman

70 Thomas Cech opowiada o odkryciu samowycinającego się intronu

71 Rybozymy RNA mające zdolność do katalizowania pewnych reakcji enzymatycznych

72 Pojedyncza nić Podwójna nić Wybrzuszenia jedno i 3-nukleotydowe Spinka do włosów Symetryczne i asymetryczne wewnętrzne pętle Połączenia 2, 3 lub 4 pni Tworzenie odpowiednich kieszeni i wiązanie metali umożliwia katalizę II i III-rzędowe struktury RNA Pseudowęzeł The RNA World and the Origins of Life. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; Całujące się spinki do włosów Kontakt pętli i wybrzuszenia

73 Biochemiczne reakcje, które mogą być katalizowane przez rybozymy The RNA World and the Origins of Life. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

74 Selekcja in vitro aktywności enzymatycznych RNA (SELEX) Materiał wyeluowany z kolumny jest przekształcany do DNA (odwrotna duża pula dsdna o przypadkowych sekwencjach Transkrypcja przez Pol RNA i fałdowanie RNA transkryptaza), powielany w reakcji PCR, transkrybowany do RNA i poddawany ponownie selekcji Duża pula ssrna o przypadkowych sekwencjach Dodanie pochodnej γs-atp RNA bez S są wymywane złoże w kolumnie silnie wiąże S Elucja związanych cząsteczek RNA Tylko RNA zdolne do autofosforylacji włączają S Rzadkie cząsteczki RNA o aktywności kinazowej Na podstawie: The RNA World and the Origins of Life. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

75 Podział rybozymów Duże kilkaset >3000 nt Małe nt Produkty zawierają wolną grupę 3 -OH i 5 -fosforanową Produkty zawierają 2-3 cykliczny fosforan i 5 -OH Samowycinające się introny grupy I i II Składnik RNA RNazy P Hammerhead Hairpin Rybozymy Hepatitis delta (HDV) Varkud satellite RNA (VS)

76 Reakcje katalizowane przez rybozymy a. Mechanizm reakcji dużych katalitycznych RNA. Nukleofilem (BOH) jest grupa 3 -OH nukleotydu (kofaktora guanozynowego, lub reszta adenylanowa intronu splicing intronów odpowiednio grupy I i II), lub cząsteczka wody (RNaza P) b. Mechanizm reakcji małych katalitycznych RNA. Reakcja jest najprawdopodobniej inicjowana przez aktywację grupy 2 -OH (udział jonu metalu?) Liczba wiązań netto w obu mechanizmach jest zachowana podczas reakcji Tanner NK (1999) Microbiology Reviews 23:

77 Ogólne właściwości rybozymów 1. Ulegają modyfikacji podczas reakcji (wyjątek: RNaza P modyfikująca 5 -koniec prekursorów trna) 2. Zwiększają szybkość reakcji do krotnie, k cat /K m do 10 8 M -1 min Miejsce katalityczne rybozymu ulega szybko wysyceniu ze względu na powolne uwalnianie produktu 4. W naturze katalizują wewnątrzcząsteczkowe reakcje o pojedynczym obrocie (single-turnover reactions) 5. Wszystkie rybozymy wymagają kationów dwuwartościowych (głównie Mg 2+ ) do katalizy

78 Metody badania rybozymów, ich struktury, zmian konformacyjnych, mechanizmu reakcji Krystalografia NMR Mutageneza Modelowanie molekularne FRET (Förster Resonance Energy Transfer)

79 Deoksyrybozymy (DNAzymy) Nie występują w naturze Sztuczne DNAzymy są jednoniciowe Są podobnie kompetentne katalitycznie jak rybozymy, mimo braku grupy 2 -OH Parametry kinetyczne dla deoksyrybozymu (reakcja cięcia RNA): k cat = 10 min -1 (porównywalne z rybozymem) k cat /K m = 10 9 M -1 min -1 (porównywalne z białkiem RNazą) Niektóre używają kofaktorów (kwas askorbinowy, histydyna) Metody selekcji podobne jak dla rybozymów, ale bez etapu odwrotnej transkrypcji

80 Sztuczne rybozymy (i deoksyrybozymy ) selekcja in vitro katalizowana reakcja przyłączenie katalityczne w celu umożliwienia selekcji region wiążący region katalityczny (enzym) region wiążący dwa substraty X i Y wiązane przez rybozym (oligonukleotydy lub mogą być małe cząsteczki) Przypadkowe sekwencje regionu katalitycznego. N 70 = , N kombinacji. Ograniczenia techniczne (np. objętość mieszaniny PCR) znacznie mniejsza liczba możliwych sekwencji regionu katalitycznego. Silverman SK (2008) Wiley Encyclopedia of Chemical Biology doi: / wecb406

81 Deoksyrybozymy i 8-17 Uzyskane przez Santoro i Joyce w 1997 r techniką SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) Pętla katalityczna 15 lub 13 nukleotydów, dwa ramiona wiążące substrat, o różnej długości i sekwencji aktywniejszy Zmodyfikowany 10-23: oporność na nukleazy i zwiększona aktywność Łatwość syntezy, większa stabilność Grimpe B. (2011) Deoxyribozymes: new therapeutics to treat central nervous system disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience 4, article 25

82 Reakcje katalizowane przez deoksyrybozymy Silverman SK (2008) Wiley Encyclopedia of Chemical Biology doi: / wecb406

83 Mechanizm działania deoksyrybozymu (A) Katalizowana reakcja atak grupy 2 -OH na wiązanie fosfodiestrowe w substracie (B) Parowanie zasad między deoksyrybozymem a substratem RNA Silverman SK (2016) Trends Biochem Sci July ; 41(7):

84 Silverman SK (2016) Trends Biochem Sci July ; 41(7): Inne reakcje z udziałem substratów oligonukleotydowych, katalizowane przez deoksyrybozymy

85 Reakcje deoksyrybozymów z nieoligonukleotydowymi substratami Silverman SK (2016) Trends Biochem Sci July ; 41(7):

86 Reakcje katalizowane przez reprezentatywne rybozymy i deoksyrybozymy oraz ich możliwe struktury II-rzędowe Ligacja (rybozym klasy I) Cięcie RNA (deoksyrybozym 10-23) Reakcja Dielsa-Aldera (rybozym Dielsa-Aldera) Utlenienie alkoholu (rybozym ribox02) Silverman SK (2008) Wiley Encyclopedia of Chemical Biology doi: / wecb406

87 Rybozymy/deoksyrybozymy - zagadnienia: 1. Definicja rybozymu, ogólny podział i właściwości 2. Naturalne i sztuczne rybozymy 3. Deoksyrybozymy sposób otrzymywania 4. Sposób selekcji in vitro aktywności rybozymu (ogólne założenia metody) 5. Przykłady reakcji chemicznych katalizowanych przez rybozymy i deoksyrybozymy Piśmiennictwo: 1. Kazula A. (2018) Rybozymy i DNAzymy budowa molekularna, mechanizm działania i zastosowanie w terapii genowej. Biochemia farmaceutyczna 74: Silverman SK (2008) Nucleic Acid Enzymes (Ribozymes and Deoxyribozymes): In Vitro Selection and Application. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology doi: / wecb Silverman SK (2016) Catalytic DNA: Scope, Applications, and Biochemistry of Deoxyribozymes. Trends Biochem Sci July ; 41(7): doi: /j.tibs Nawrot B. (2002) Katalityczne DNA deoksyrybozymy. Post. Biochem. 48: