(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2009/07 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. C07K14/705 A61K38/00 A61K49/00 G01N33/68 ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Zastosowanie rozpuszczalnej kadheryny T do leczenia zaburzeń metabolicznych (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/38 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 07/2009 (73) Uprawniony z patentu: WHITEHEAD INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH, Cambridge, US PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: HUG Christopher, Brookline, US LODISH Harvey F., Brookline, US (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Hawrylak Jolanta Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy zastosowania polipeptydów kadheryny T do leczenia zaburzenia metabolicznego. [0002] Zaburzenia metaboliczne, które można leczyć przy użyciu modulatora według wynalazku obejmują np. otyłość, cukrzycę typu II, oporność na insulinę, hipercholesterolemię, hiperlipidemię, dyslipidemię, zespół X, anoreksję i kacheksję. Stan techniki 1. Kadheryna T [0003] Kadheryny, obejmują dużą rodzinę powierzchniowych białek komórkowych, zaangażowanych w oddziaływania komórka-komórka i przekazywanie sygnałów odbywających się za pośrednictwem wapnia. Kadheryny wykazują specyficzność ekspresji wobec typu komórki i rozwoju oraz podlegają nieprawidłowej regulacji w wielu ludzkich nowotworach (patrz, np., Conacci-Sorrell i wsp., 2002). [0004] Kadheryna T, znana także jako kadheryna H lub kadheryna -13, jest połączona z błoną kotwicą GPI na końcu C (Tanihara i wsp., 1994). W porównaniu z innymi przedstawicielami rodziny kadheryn, kadheryna T nie posiada domeny transbłonowej i jest uwalniana z powierzchni komórki po potraktowaniu komórek fosfolipazą fosfatydyloinozytolową C. Początkowo kadherynę T opisano w układzie nerwowym, lecz jej dystrybucja tkankowa jest znacznie szersza, z najwyższą ekspresją w układzie sercowo-naczyniowym i najniższymi poziomami w mięśniach. W układzie naczyniowym jest zlokalizowana w błonie wewnętrznej naczynia i warstwie środkowej ściany naczynia oraz ulega ekspresji na komórkach śródbłonka i mięśni gładkich (Ivanov i wsp., 2001). [0005] Na powierzchni komórkowej znajdują się dwie formy kadheryny T. Jedna z nich, 135 kda polipeptyd, jest trawiona blisko końca N tworząc drugą formę o 105 kda (Tkachuk i wsp., 1998). Obie formy białka znajdują się na powierzchni komórki, gdzie są zdolne do wiązania cząsteczek LDL, dzięki łączeniu kotwicy GPI z lipoproteinami (Niermann i wsp., 2000). [0006] Chociaż nie są znane drogi przekazywania sygnałów, w które zaangażowana jest kadheryna T, sugerowano, że kadheryna T może brać udział w przekazywaniu sygnału przez wiązanie z innymi białkami błonowymi i włączanie do specyficznych domen lipidowych błony komórkowej (Doyle i wsp., 1998). Pokazano, że kadheryna T może regulować wzrost komórek układu nerwowego (Takeuchi i wsp., 2000). Ponadto, kadheryna T hamuje wzrost astrocytów i jest zredukowana w linii komórek glejaka (Huang i wsp., 2003). Sugerowano także, że kadheryna T może być zaangażowana w kontrolę prawidłowej budowy naczyniowej i przebudowę podczas powstawania miażdżycy (Ivanov i wsp., 2001). [0007] Publikacja US ujawnia ogromną liczbę krótkich pochodnych peptydowych z ponad 20 różnych kadheryn. Odnosi się on jedynie niejasno do leczenia cukrzycy i otyłości, wynikających z za- 1

3 burzeń metabolicznych, za pomocą czynników modulujących obejmujących oktapeptyd reprezentujący sekwencję aminokwasową rozpoznawania adhezji komórkowej. [0008] W publikacji WO99/19477 wskazano, że peptydy, które są odcinane z Pro-kadheryn podczas przetwarzania w odpowiednie kadheryny, reprezentują tak zwane regiony kadherynowego czynnika wzrostu (CGFR) i, że aktywności tych CGFR mogą być wykorzystywane terapeutycznie. W takim kontekście, ujawnia on CGFR pochodzący z kadheryny T do leczenia zaburzenia metabolicznego. CGFR taki składa się z aminokwasów z SEKW. NR ID.: 1. [0009] W publikacji WO2004/ ujawnione są rozpuszczalne formy kadheryny T, które są polipeptydami składającymi się z fragmentów do 118 aminokwasów polipeptydu składającego się z aminokwasów 23 do 692 z SEKW. NR ID: 1. Ujawnia on także medyczne zastosowania tych rozpuszczalnych form w zaburzeniach metabolicznych. 2. Otyłość Objawy [0010] Otyłość polega na akumulacji nadmiaru tłuszczu w ciele. Stopień otyłości ustala się na podstawie pomiaru wysokości i masy. Często, pomiary te są przekształcane w Indeks Masy Ciała (BMI): masa w kilogramach dzielona przez wysokość w metrach kwadratowych. Wartość 25 do 29,9 wskazuje na nadwagę lub średnią otyłość, a wartość 30 lub powyżej wskazuje na otyłość i wymaga leczenia. W Stanach Zjednoczonych, nadwaga i otyłość dotyczy obecnie ponad 50% dorosłych, co odzwierciedla szybki wzrost dotkniętych nią osobników w tej populacji. [0011] Otyłość wynika z konsumpcji większej ilości kalorii niż wykorzystuje organizm. Czynniki genetyczne i środowiskowe wpływają na masę ciała, chociaż stale pozostaje niejasne jak dokładnie wzajemnie wpływają na określenie masy osobnika. Ostatnie badania sugerują, że średnio, wpływ genetyki dotyczy do około 33 procent masy ciała. Wzrost wielkości lub liczby komórek tłuszczowych lub oba te czynniki składają się na ilość tłuszczu odłożonego w ciele. Ludzie otyli, w szczególności ci, którzy stali się otyli w dzieciństwie, mogą posiadać do pięciu razy więcej komórek tłuszczowych niż ludzie o prawidłowej masie. Ponieważ liczby komórek nie można zredukować, masę można stracić jedynie przez zmniejszenie ilości tłuszczu w każdej komórce. [0012] Gromadzenie nadmiaru tłuszczu poniżej przepony i ściany klatki piersiowej może powodować ucisk na płuca, wywołując trudność w oddychaniu i spłycenie oddechu, nawet przy minimalnym wysiłku. Trudność w oddychaniu może poważnie przeszkadzać w śnie, powodując chwilowe ustanie oddychania (bezdech periodyczny we śnie zwany też bezdechem sennym), co prowadzi do dziennej ospałości i innych komplikacji. Otyłość może także powodować różne problemy ortopedyczne, zaburzenia skórne oraz puchnięcie stóp i kostek. Poważne komplikacje związane z otyłością obejmują o wiele wyższe ryzyko zaburzeń tętnicy wieńcowej oraz jej główne czynniki ryzyka cukrzycę typu II, hiperlipidemię i nadciśnienie. Większość stanów chorobowych związanych z otyłością jest powiązana z cukrzycą typu II, ponieważ słabo kontrolowana cukrzyca i otyłość prowadzą do ukształtowania objawów, które razem są znane jako zespół X lub zespół metaboliczny (patrz, np., Roth i wsp., 2002). 2

4 2. 2. Leczenie [0013] Większość programów zarządzania wagą opiera się na zmianie zachowania. Dieta jest zazwyczaj uważana za mniej istotną niż wprowadzenie stałych zmian w nawykach jedzenia i ćwiczeń. W celu redukcji wagi, lekarze przepisują coraz częściej leki takie jak orlistat lub sibutramina. Leki takie mogą redukować wagę o około 10 procent w ciągu 6 miesięcy i utrzymywać tę utratę tak długo jak podawany jest lek. Niemniej jednak, kiedy ich podawanie zostanie przerwane, waga jest szybko przywracana i długotrwałe efekty takiego leczenia otyłości są rozczarowujące. Chociaż nastąpił znaczący progres w pomocy ludziom w utracie wagi, zazwyczaj w ciągu 3 lat odzyskują ją. Wiele poważnych komplikacji wynikających z otyłości sprawia, że leczenie jest ważne, a w przypadku poważnej nadwagi coraz bardziej powszechne staje się leczenie zabiegiem chirurgicznym. 3. Cukrzyca Objawy [0014] Cukrzyca jest zaburzeniem, w którym poziomy glukozy we krwi są nieprawidłowo wysokie, ponieważ organizm odpowiednio nie uwalnia lub nie wykorzystuje insuliny. Cukrzyca powstaje, kiedy organizm nie wytwarza ilości insuliny wystarczającej do utrzymania prawidłowych poziomów cukru we krwi lub kiedy komórki nie odpowiadają odpowiednio na insulinę. [0015] Ludzie z cukrzycą typu I (cukrzycy zależni od insuliny) wytwarzają niewiele insuliny lub wcale jej nie produkują. Chociaż 6 procent populacji zamieszkującej Stany Zjednoczone posiada dowolną formę cukrzycy, tylko 10 procent wszystkich cukrzyków posiada zaburzenie typu I. Większość ludzi z cukrzycą typu I rozwija zaburzenie przed 30 rokiem życia. W cukrzycy typu I ponad 90 procent komórek trzustki wytwarzających insulinę (komórki beta) jest stale uszkodzonych. Wynikający z tego niedobór insuliny jest poważny i w celu przeżycia osoba z cukrzycą typu I musi regularnie przyjmować iniekcje insuliny. [0016] W cukrzycy typu II (cukrzyca niezależna od insuliny), trzustka wytwarza insulinę, czasami nawet na wyższych poziomach niż normalne. Niemniej jednak, organizm rozwija oporność na jej działania, co powoduje relatywny niedobór insuliny. Cukrzyca typu II może pojawić się u dzieci i osób w wieku młodzieńczym, lecz zazwyczaj zaczyna się po 30 roku życia i staje się stopniowo bardziej powszechna z wiekiem: około 15 procent osób powyżej 70 roku życia posiada cukrzycę typu II. Otyłość stanowi czynnik ryzyka dla cukrzycy typu II, i 80 do 90 procent osobników z tym zaburzeniem jest otyłych. [0017] Inne, mniej powszechne przyczyny cukrzycy, to nieprawidłowo wysokie poziomy kortykosteroidów, ciąża (cukrzyca ciążowa), leki i trucizny, które oddziałują z wytwarzaniem lub skutkami działania insuliny, czego wynikiem są wysokie poziomy cukru we krwi. [0018] Ludzie z cukrzycą typu II mogą nie wykazywać objawów przez całe lata lub dekady. Objawy mogą się rozwinąć wraz z postępowaniem niedoboru insuliny. Wzrost oddawania moczu i pragnienie 3

5 są początkowo łagodne i stopniowo pogarszają się w ciągu tygodni lub miesięcy. Kiedy poziom cukru we krwi staje się bardzo wysoki (często przekraczający 1000 mg/dl), u osobnika może nastąpić silne odwodnienie, które może prowadzić do dezorientacji umysłowej, senności, ataków padaczki i hiperglikemiczno-hiperosmolarnej śpiączki bez kwasicy ketonowej. [0019] Z czasem, podniesione poziomy cukru we krwi niszczą naczynia krwionośne, nerwy i inne struktury wewnętrzne. Gromadzące się w ścianach drobnych naczyń krwionośnych złożone substancje zbudowane na bazie cukru powodują ich grubienie i przeciekanie. Wraz z grubieniem dostarczają one coraz mniej i mniej krwi, w szczególności do skóry i układu nerwowego. Słabo kontrolowane poziomy cukru we krwi przyczyniają się do podniesienia poziomów substancji tłuszczowych we krwi, co prowadzi do przyspieszenia miażdżycy tętnic (gromadzenie płytek w naczyniach krwionośnych). Miażdżyca tętnic jest od dwóch do sześciu razy powszechniejsza u cukrzyków niż u osób bez cukrzycy i pojawia się zarówno u mężczyzn jak u kobiet. Słabe krążenie w dużych i drobnych naczyniach krwionośnych może uszkadzać serce, mózg, nogi, oczy, nerki, nerwy, skórę i powoduje powolne gojenie ran. [0020] Z wszystkich tych powodów, ludzie z cukrzycą mogą doświadczać poważnych długoterminowych komplikacji. Do najczęstszych należą zawały serca i udary. Uszkodzenie naczyń krwionośnych oka może powodować utratę wzroku (retynopatia cukrzycowa). Wadliwie mogą pracować nerki, co prowadzi do niewydolności nerek wymagającej dializy. Uszkodzenie układu nerwowego manifestuje się na wiele sposobów. W przypadku wadliwej pracy pojedynczego nerwu (mononeuropatia) nagle może stać się słabe ramię lub noga. Kiedy dochodzi do uszkodzenia nerwów rąk, nóg i stóp (polineuropatia cukrzycowa) może pojawić się nieprawidłowe czucie i mrowienie lub ból piekący oraz może wystąpić osłabienie ramion i nóg. Uszkodzenie nerwów skóry powoduje powtarzające się uszkodzenia z uwagi na to, że osobnik nie odczuwa zmian w nacisku lub temperaturze. Słabe dostarczanie krwi do skóry może także prowadzić do owrzodzenia i powolnego gojenia wszelkich ran. Wrzody stopy mogą stać się tak głębokie i zakażone oraz goić się tak powoli, że konieczna staje się amputacja nogi Leczenie [0021] Głównym celem leczenia cukrzycy jest utrzymanie w prawidłowym zakresie, jak tylko to możliwe, poziomów cukru we krwi. Całkowicie prawidłowe poziomy są trudne do podtrzymania, lecz im bardziej mogą być zbliżone do prawidłowego zakresu, tym mniej prawdopodobne, że pojawią się czasowe lub długotrwałe komplikacje. Głównym problemem przy próbach ścisłego kontrolowania poziomów cukru we krwi jest wzrost możliwości przedawkowania, co prowadzi do niskich poziomów cukru we krwi (hipoglikemia). [0022] Leczenie cukrzycy wymaga zwrócenia uwagi na kontrolowanie masy ciała, ćwiczenia i dietę. Wielu ludzi otyłych z cukrzycą typu II nie wymaga przyjmowania leków, jeśli straci masę ciała i będzie regularnie ćwiczyć. Chociaż, jak dyskutowano powyżej, zmniejszenie masy ciała jest trudne. Dlatego często potrzebna jest zastępcza terapia insulinowa lub podawanie doustne leków hipoglikemicznych. [0023] Doustne leki hipoglikemiczne, takie jak glipizyd, gliburyd, tolbutamid i chlorpropamid mogą obniżać poziomy cukru we krwi odpowiednio u ludzi z cukrzycą typu II przez stymulowanie trzustki do 4

6 uwalniania insuliny i przez zwiększenie jej efektywności. Inny typ doustnego leku, metformina, zwiększa odpowiedź organizmu na jego własną insulinę. Jeszcze inny lek, akarboza, działa przez opóźnienie wchłaniania glukozy w jelicie. Jeśli te leki hipoglikemiczne nie są w stanie kontrolować wystarczająco dobrze cukru we krwi, potrzebna jest zastępcza terapia insulinowa. [0024] Zastępczą terapię insulinową można osiągnąć jedynie przez codzienne wstrzyknięcia insuliny, co czyni tę terapię ciężką. Testowane są nowe formy insuliny, takie jak spray donosowy. Do tej pory te nowe formy nie działają dość dobrze, ponieważ zmienność w poziomie adsorpcji prowadzi do problemów z ustaleniem dawki. 4. Acrp30 [0025] Tkanka tłuszczowa, podczas gdy dobrze znana jako zdolna do gromadzenia tłuszczu, odgrywa ważną rolę jako źródło wielu hormonów i mediatorów trzustkowych, w tym rezystyny, adypsyny, leptyny i TNF-α. Wspólnie cząsteczki te są nazywane adipokinami, od ang. adipose - tłuszczowy, dla podkreślenia ich roli jako hormonu i miejsca syntezy. Jedną z takich adipokin jest, wytwarzane wyłącznie przez tkankę tłuszczową, Acrp30 nazywane także, adiponektyną lub ApM-1. [0026] Jako pierwsze, w 1995, zidentyfikowano mysie Acrp30 (Scherer i wsp., 1995) i wykazano, że jego wytwarzanie jest zwiększone ponad 100 razy podczas różnicowania adipocytu. Homolog ludzki zidentyfikowano w 1996 (Maeda i wsp., 1996). Acrp30 zawiera na końcu aminowym sekwencję sygnałową, za nią region centralny, obejmujący powtórzenia kolagenowe i na końcu karboksylowym domenę homologiczną do globularnego czynnika dopełniacza C1q. W użytym tu znaczeniu, termin Acrp30 odnosi się zarówno do białek ludzkich jak i mysich oraz ich homologów u innych gatunków Rola Acrp30 w otyłości i cukrzycy typu II [0027] Wiele badań wykazało, że Acrp30 jest powiązane z otyłością i cukrzycą typu II. Dane genetyczne wykazały u kohorty pacjentów japońskich sprzężenie pomiędzy cukrzycą typu II i niekodującymi polimorfizmami pojedynczych nukleotydów (SNP) położonymi w genie Acrp30 (Hara i wsp., 2002). Następnie wykazano, że mutacje typu missens, zaburzające globularną głowę korelują z poziomami surowiczymi Acrp30 (Kondo i wsp., 2002). [0028] Ponadto, poziomy surowicze Acrp30 są obniżone w wielu modelach otyłości, w tym u myszy z niedoborem leptyny, u myszy z niedoborem receptora leptyny i w modelach małpich (patrz, np., Hu i wsp., 1996; Yamauchi i wsp., 2001). W badaniach u ludzi, poziomy Acrp30 odwrotnie korelują zarówno z cukrzycą jak otyłością a ponadto są zredukowane u pacjentów z chorobą wieńcową (Arita i wsp., 1999). Dalsze dowody przyczynowych powiązań pomiędzy zredukowanymi poziomami Acrp30 i rozwojem oporności na insulinę oraz cukrzycy typu II otrzymali Lindsay i wsp. (2002), którzy pokazali, że osobnicy z populacji Indian Pima charakteryzujący się niższymi poziomami surowiczymi Acrp30 z większym prawdopodobieństwem rozwijali cukrzycę typu II niż ci z poziomami wyższymi. [0029] Doświadczenia z uszkodzeniem genu dostarczyły dowodów potwierdzających zaangażowanie Acrp30 w otyłość i cukrzycę typu II. Maeda i wsp. (2002) odkryli, że homozygotyczne myszy z niedo- 5

7 borem Acrp30 nie miały hiperglikemii, kiedy były utrzymywane na normalnej diecie, chociaż wykazywały zredukowany klirens wolnych kwasów tłuszczowych z surowicy. Przestawione na wysokotłuszczową dietę, z wysokim cukrem prezentowały silną oporność na insulinę i wykazywały zwiększony przyrost masy ciała w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. [0030] Wykazano, że oprócz kluczowej roli w otyłości i cukrzycy, Acrp30 odgrywa rolę w innych zaburzeniach, takich jak zespół zespół policystycznych jajników (Panidis i wsp., 2003), rak śluzówki macicy (Petridou i wsp., 2003), stan przedrzucawkowy (Ramsay i wsp., 2003), stłuszczenie wątroby (Xu i wsp., 2003) i zespół nerczycowy (Zoccali i wsp., 2003). Pokazano także, że Acrp30 wykazuje właściwości przeciwzapalne (Yokota i wsp., 2000). [0031] Biorąc pod uwagę powyższe badania, egzogenne Acrp30 jest obiecującym terapeutykiem do leczenia różnych zaburzeń, w tym zaburzeń metabolicznych, takich jak otyłość i cukrzyca typu II, zaburzeń ginekologicznych, zaburzeń wątroby oraz przewlekłych zaburzeń zapalnych Różne rodzaje Acrp30 [0032] Acrp30 jest obecne w surowicy w wysokim stężeniu (5-10 µg/ml) i występuje w postaci wieloskładnikowych pul o różnej pozornej masie cząsteczkowej (Scherer i wsp., 1995). [0033] Struktura tych rodzajów cząsteczek o różnej pozornej masie cząsteczkowej została zbadana przez Tsao i wsp. (2002, 2003). Po wytworzeniu w bakteriach w postaci fuzji białkowej o pełnej długości i rozdzieleniu za pomocą chromatografii filtracji w żelu, zidentyfikowano trzy rodzaje Acrp30: heksamery i dwa rodzaje trimerów. Badania nad ekspresją w komórce eukariotycznej wykazały trzy rodzaje Acrp30: rodzaje o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), nie obserwowane dla białek wytwarzanych przez bakterie i rodzaje odpowiadające heksamerom oraz jeden rodzaj odpowiadający trimerom. [0034] Wiele badań skupiło się na polipeptydach obejmujących globularną głowę Acrp30, oznaczonych dalej jako gacrp30. Istnieją różnice w aktywnościach Acrp30 i gacrp30 in vivo, chociaż polipeptydy te mają wiele podobnych cech. Po długoterminowym traktowaniu białkiem zrekombinowanym, istnieje większa redukcja masy ciała przy wstrzykiwaniu gacrp30 w porównaniu z Acrp30, pomimo braku różnicy w przyjmowanym pożywieniu (Fruebis i wsp., 2001). Z drugiej strony, Acrp30 redukowało wytwarzanie glukozy synergistycznie z insuliną, podczas gdy gacrp30 nie posiadało aktywności w tym teście (Berg i wsp., 2001). [0035] W celu określenia potencjalnej aktywności tych różnych rodzajów, zbadano szereg elementów odpowiedzi transkrypcyjnej, kierujących ekspresją reporterowego genu lucyferazy w monocytach C2C12, komórkach znanych z odpowiedzi na Acrp30 (Tsao i wsp., 2003). Promotor selektyny E, odpowiadający na NF-κB, wykazywał zwiększoną aktywność w odpowiedzi na dodanie Acrp30. Aktywne były tylko rozdzielony heksamer i rodzaje HMW, podczas gdy zarówno gacrp30 i trimer były nieaktywne w tym teście. IL-6, której ekspresja wzrasta dzięki NF-κB w miotubulach C2C12, jest wytwarzana na wysokich poziomach przez mięsień szkieletowy podczas ćwiczeń i uważa się, że wyzwala produkcję kwasu tłuszczowego i glukozy z tkanki tłuszczowej i wątroby, doprowadzając do wzrostu krążącego paliwa do wykorzystania przez mięsień (Febbraio i wsp., 2002; Kosmidou i wsp., 2002). Zatem 6

8 heksameryczne i HMW rodzaje Acpr30 mogą pośrednio stymulować lipolizę tkanki tłuszczowej dzięki NF-κB indukującemu uwalnianie IL-6 z mięśnia szkieletowego (Tsao i wsp., 2003). [0036] Ze względu na to, że Acrp30 jest zaangażowane w otyłość i cukrzycę typu II, modulacja białek ze szlaku przekazywania sygnału Acrp30 stwarza możliwość terapii zaburzeń metabolicznych, takich jak otyłość, cukrzyca typu II, oporność na insulinę, hipercholesterolemia, hiperlipidemia, dyslipidemia, zespół X, anoreksja i kacheksja. Jednakże, izolacja receptorów Acrp30 okazała się nieosiągalna. Opisano wiązanie Acrp30 do kolagenów i ludzkich aortalnych komórek śródbłonka (HAEC) in vitro (Okamoto i wsp., 2000). Ostatnio, opisano dwa receptory o nieznanej funkcji dla Acrp30globularnego i o pełnej długości, nazwane AdipoRl i AdipoR2 (Yamauchi i wsp., 2003). Z przewidywań wynika, że te dwa receptory Acrp30 zawierają siedem domen transbłonowych, lecz są strukturalnie i funkcjonalnie inne od receptorów sprzężonych z białkiem G. Jednakże, w literaturze naukowej receptory nie zostały opisane dla heksametrycznych i HMW rodzajów Acrp30. Krótkie streszczenie wynalazku [0037] Niniejszy wynalazek wywodzi się z odkrycia nowego receptora Acrp30. Konkretnie, w ramach niniejszego wynalazku pokazano, że kadheryna T jest receptorem dla heksametrycznych i o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) rodzajów Acrp30. [0038] Zatem, pierwszy aspekt opisu dotyczy użycia polipeptydu kadheryny T jako miejsca docelowego do poszukiwania kandydatów modulatorów jako leków kandydatów do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z zaburzenia metabolicznego, zaburzenia ginekologicznego, przewlekłego stanu zapalnego i zaburzenia wątroby lub nerek, przy czym lekiem kandydatem jest modulator kadheryny T. [0039] Drugi aspekt dotyczy zastosowania modulatora polipeptydu kadheryny T do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z zaburzenia metabolicznego, zaburzenia ginekologicznego, przewlekłego stanu zapalnego i zaburzenia wątroby lub nerek. [0040] Trzeci aspekt dotyczy zastosowania polipeptydu kadheryny T jako celu do poszukiwania naturalnych partnerów wiążących, gdzie omawiany naturalny wiążący partner jest lekiem kandydatem do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z zaburzenia metabolicznego, zaburzenia ginekologicznego, przewlekłego zaburzenia zapalnego i zaburzenia wątroby lub nerek. [0041] Czwarty aspekt dotyczy użycia rozpuszczalnej formy kadheryny T jako leku. [0042] W piątym aspekcie, który reprezentuje niniejszy wynalazek, dotyczy zastosowania rozpuszczalnej formy kadheryny T do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia metabolicznego. [0043] Szósty aspekt dotyczy sposobu oszacowania wydajności modulatora polipeptydu kadheryny T do leczenia otyłości, przy czym sposób ten obejmuje podawanie modulatora zwierzęcemu modelowi otyłości, gdzie ustalenie, że modulator łagodzi reprezentatywne cechy otyłości w modelu zwierzęcym wskazuje, że modulator jest lekiem do leczenia otyłości. [0044] Siódmy aspekt dotyczy sposobu oszacowania wydajności modulatora polipeptydu kadheryny T do leczenia cukrzycy typu II, obejmującego podawanie modulatora zwierzęcemu modelowi cukrzycy typu II, gdzie ustalenie, że modulator łagodzi reprezentatywne cechy cukrzycy typu II w modelu zwie- 7

9 rzęcym wskazuje, że modulator jest lekiem do leczenia cukrzycy typu II. Krótki opis rysunków [0045] Figura 1 przedstawia wynik testów wiązania sortowanych fluorescencyjnie wzbudzonych komórek (FACS) dla komórek C2C12, CHO i Ba/F3, jak wyjaśniono w Przykładzie 2. Figura 2 przedstawia wynik testów wiązania sortowanych fluorescencyjnie wzbudzonych komórek (FACS) dla komórek kontrolnych Ba/F3 i komórek Ba/F3 wyrażających kadherynę T, jak wyjaśniono w Przykładzie 4.2. Figura 3A przedstawia analizę ELISA wiązania różnych rodzajów Acrp30 z komórkami CHO-GFP, jak wyjaśniono w Przykładzie 4.3. Figura 3B przedstawia analizę ELISA wiązania różnych rodzajów Acrp30 z komórkami CHO wyrażającymi kadherynę T, jak wyjaśniono w Przykładzie 4.3. Figura 4 przedstawia aktywację NF-κB w komórkach C2C12, jak wyjaśniono w Przykładzie 5. Krótki opis sekwencji [0046] SEKW. NR ID.: 1 odpowiada prekursorowi ludzkiej kadheryny T o pełnej długości. SEKW. NR ID.: 2 odpowiada prekursorowi ludzkiego Acrp30 o pełnej długości. SEKW. NR ID.: 3 odpowiada prekursorowi mysiego Acrp30 o pełnej długości. SEKW. NR ID.: 4 odpowiada prekursorowi mysie kadheryny T o pełnej długości. SEKW. NR ID.: 5-18 odpowiadają sekwencjom starterów. Szczegółowe ujawnienie wynalazku [0047] Niniejszy wynalazek oparty jest na znalezieniu nowego receptora Acrp30. Konkretnie, w ramach niniejszego wynalazku pokazano, że kadheryna T jest receptorem dla heksametrycznych i o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) rodzajów Acrp30. Ponadto, dostarczano wyniki pokazujące, że nadekspresja kadheryny T powoduje supresję transkrypcji indukowanej przez Acrp30, w której pośredniczy NF-κB. Zgodnie z powyższym, niniejszy opis wskazuje sposoby identyfikacji związków przydatnych w leczeniu zaburzeń metabolicznych takich jak, np. otyłość, cukrzyca typu II, oporność na insulinę, hipercholesterolemia, hiperlipidemia, dyslipidemia, zespół X, anoreksja i kacheksja. Konkretnie, opis dotyczy zastosowania polipeptydów kadheryny T jako miejsc docelowych do poszukiwania ich modulatorów. Kolejnym aspektem niniejszego opisu jest zastosowanie omawianych modulatorów do leczenia zaburzeń metabolicznych. [0048] Pierwszym aspektem niniejszego opisu jest bezpośrednie użycie polipeptydu kadheryny T 8

10 jako miejsca docelowego do poszukiwania modulatorów kandydatów jako leków kandydatów do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z zaburzenia metabolicznego, zaburzenia ginekologicznego, przewlekłego stanu zapalnego i zaburzenia wątroby lub nerek, przy czym lekiem kandydatem jest modulator kadheryny T. [0049] Termin polipeptyd kadheryny T, stosowany w całym niniejszym opisie, odnosi się zarówno do białek kadheryny T o pełnej długości jak do jej biologicznie aktywnych fragmentów. Polipeptydy kadheryny T mogą być pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Korzystnie, polipeptydy kadheryny T są pochodzenia ludzkiego. [0050] Najkorzystniej, ludzki polipeptyd kadheryny T jest wybrany z grupy składającej się z: a) polipeptydu obejmującego SEKW. NR ID.: 1; b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 23 do 713 SEKW. NR ID.: 1; c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 23 do 693 SEKW. NR ID.: 1; d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 140 do 713 SEKW. NR ID.: 1; e) polipeptydu obejmującego aminokwasy 140 do 693 SEKW. NR ID.: 1; f) muteiny dowolnego z (a) do (e), gdzie sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji w (a) do (e); g) muteiny dowolnego z (a) do (e), która jest kodowana przez kwas nukleinowy hybrydyzujący z komplementarną sekwencją DNA kodującą dowolny z (a) do (e) w bardzo ostrych warunkach; oraz h) muteiny dowolnego z (a) do (e), w której dowolne zmiany w sekwencji aminokwasowej są konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi w sekwencji aminokwasowej w (a) do (e). [0051] Termin polipeptyd kadheryny T obejmuje polipeptydy naturalnie występujące, zrekombinowane, chimeryczne, syntetyczne i zsyntetyzowane chemicznie. Termin polipeptyd kadheryny T obejmuje ponadto fragmenty kadheryny T o co najmniej 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 lub 650 aminokwasach. Termin polipeptyd kadheryny T obejmuje ponadto muteiny kadheryny T. W użytym tu znaczeniu termin muteiny odnosi się do analogów kadheryny T, w których jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych naturalnej kadheryny T została zamieniona przez inne reszty aminokwasowe lub została wydeletowana lub jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych naturalnej kadheryny T została dodana do naturalnej sekwencji kadheryny T bez znaczącego obniżenia aktywności uzyskanych produktów w porównaniu z kadheryną T dzikiego typu. Muteiny są wytwarzane za pomocą znanej syntezy i/lub technikami ukierunkowanej mutagenezy lub dowolną dostępna dogodną do tego techniką. [0052] Muteiny kadheryny T, które można zastosować zgodnie z niniejszym opisem, obejmują określony zestaw zasadniczo odpowiadających sobie sekwencji jak peptydy lub polinukleotydy z podstawieniami, które mogą być rutynowo uzyskane przez specjalistów w dziedzinie, bez nadmiernego eksperymentowania, na podstawie prezentowanych tu i znanych w dziedzinie wskazań i poradników. [0053] Zgodnie z niniejszym opisem polipeptydy kadheryny T obejmują białka kodowane przez kwasy nukleinowe, takie jak DNA lub RNA, które hybrydyzują z DNA lub RNA, kodującymi kadherynę T, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, w warunkach umiarkowanych lub bardzo ostrych. Termin ostre 9

11 warunki odnosi się do warunków hybrydyzacji a następnie płukania, które specjaliści w dziedzinie standardowo określają jako ostre (patrz, np., Sambrook i wsp., 1989). [0054] Nie ograniczając się do, przykłady ostrych warunków obejmują warunki płukania C poniżej obliczonej Tm badanej hybrydy, np., 2 x SSC i 0,5% SDS przez 5 min., 2 x SSC i 0,1% SDS przez 15 min., 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 37 C przez min., a następnie 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 68 C przez min. Specjaliści w dziedzinie rozumieją, że ostrość warunków zależy także od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (takich jak zasad) lub mieszanych sond oligonukleotydowych. W przypadku stosowania sond mieszanych korzystne jest użycie chlorku tetrametyloamonowego (TMAC) zamiast SSC. [0055] Polipeptydy kadheryny T, które można stosować według niniejszego opisu obejmują muteiny o sekwencji aminokwasowej w co najmniej 50% identycznej, korzystniej w co najmniej 60% identycznej i jeszcze korzystniej w 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identycznej z kadheryną T z SEKW. NR ID.: 1 lub SEKW. NR ID.: 4 lub jej fragmentem. Jako polipeptyd o sekwencji aminokwasowej w co najmniej, przykładowo, 95% identycznej z przykładową sekwencją aminokwasową według niniejszego wynalazku. Wskazane jest aby sekwencja aminokwasowa polipeptydu była identyczna z przykładową sekwencją z wyjątkiem tego, że sekwencja polipeptydu może zawierać do pięciu zmian aminokwasowych na 100 aminokwasów przykładowej sekwencji aminokwasowej. Innymi słowy, w celu uzyskania polipeptydu o sekwencji aminokwasowej w co najmniej 95% identycznej z konkretną przykładową sekwencją aminokwasową, w omawianej sekwencji może być wstawionych lub podstawionych innym aminokwasem do 5% (5 z 100) reszt aminokwasowych. [0056] Dla sekwencji, dla których nie istnieje dokładny odpowiednik, można obliczyć % identyczności. Zasadniczo, dwie porównywane sekwencje są tak przyrównywane, aby uzyskać maksymalną korelację pomiędzy tymi sekwencjami. Przyrównanie może obejmować wstawienie przerw w jednej lub obu sekwencjach, w celu zwiększenia stopnia przyrównania. % identyczności można określić na całej długości każdej z porównywanych sekwencji (tak zwane przyrównanie całkowite), co jest szczególnie odpowiednie dla sekwencji o tej samej lub bardzo podobnej długości, lub na krótszych, określonych długościach (tak zwane przyrównanie miejscowe), co jest bardziej odpowiednie dla sekwencji o nierównej długości. [0057] Korzystne zmiany w muteinach, które można stosować zgodnie z niniejszym opisem są znane jako podstawienia konserwatywne. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe polipeptydów kadheryny T mogą obejmować aminokwasy synonimiczne z grupy, która posiada wystarczająco podobne własności fizykochemiczne, tak, że podstawienie pomiędzy przedstawicielami grupy pozwoli na zachowanie biologicznej funkcji cząsteczki (Grantham, 1974). Oczywiste jest, że w zdefiniowanych powyżej sekwencjach można także wprowadzić insercje lub delecje aminokwasów bez zmiany ich funkcji, w szczególności, jeśli insercje lub delecje obejmują tylko niewiele aminokwasów, np. poniżej trzydziestu, a korzystnie poniżej dziesięciu i nie usuwają one lub nie wymieniają aminokwasów, które są krytyczne dla wytworzenia funkcjonalnej konformacji, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny wytworzone za pomocą takich delecji i/lub insercji wchodzą w zakres niniejszego opisu. [0058] Korzystnie, grupami aminokwasów synonimicznych są te zdefiniowane w Tabeli I. Korzystniej, grupami aminokwasów synonimicznych są te zdefiniowane w Tabeli II; i najkorzystniej grupami ami- 10

12 nokwasów synonimicznych są te zdefiniowane w Tabeli III. Tabela I Korzystne grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Trp Tabela II Korzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, Ile Gly Gly Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr 11

13 Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Tabela III Najkorzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Trp [0059] Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasowych w białkach, które mogą być stosowane dla uzyskania mutein kadheryny T, polipeptydów do zastosowania według niniejszego wynalazku, obejmują dowolne etapy znanych metod, takich jak przedstawione w patentach USA , i według Mark i wsp.; według Koths i wsp., według Namen i wsp.; według Chong i wsp. i według Lee i wsp. oraz białka z podstawieniami lizy- 12

14 nowymi przedstawione w patencie USA nr (Shaw i wsp.). [0060] Korzystnie, muteiny według niniejszego opisu wykazują zasadniczo taką samą aktywność biologiczną jak polipeptyd kadheryny T, któremu odpowiadają. Najkorzystniej, muteiny według niniejszego wynalazku wykazują większą aktywność biologiczną niż polipeptyd kadheryny T, któremu odpowiadają. [0061] W użytym tu znaczeniu, termin modulator odnosi się do związku, który zwiększa lub obniża aktywność polipeptydu kadheryny T. W użytym tu znaczeniu, modulator kadheryny T odnosi się do związku, który zwiększa lub obniża aktywność polipeptydu kadheryny T i/lub związku, który zwiększa lub obniża poziom transkrypcji mrna kadheryny T. Termin modulator obejmuje zarówno agonistów i antagonistów. [0062] W użytym tu znaczeniu agonista kadheryny T odnosi się do związku, który ma tak samo ukierunkowany wpływ na aktywność kadheryny T jak Acrp30. Związek, posiadający tak samo ukierunkowany wpływ na aktywność kadheryny T jak Acrp30 odnosi się do związku, który (i) kiedy jest badany w teście, w którym Acrp30 zwiększa aktywność kadheryny T, zwiększa aktywność kadheryny T; i/lub (i) kiedy jest badany w teście, w którym Acrp30 zmniejsza aktywność kadheryny T, zmniejsza aktywność kadheryny. Terminy agonista i aktywator uważane są za synonimy i mogą być w niniejszym ujawnieniu stosowane zamiennie. [0063] W użytym tu znaczeniu, antagonista kadheryny T odnosi się do związku, który ma przeciwny wpływ na aktywność kadheryny T w porównaniu z Acrp30. Związek posiadający przeciwny wpływ na aktywność kadheryny T w porównaniu z Acrp30 odnosi się do związku, który (i) kiedy jest badany w teście, w którym Acrp30 zwiększa aktywność kadheryny T, zmniejsza aktywność kadheryny T; i/lub (i) kiedy jest badany w teście, w którym Acrp30 zmniejsza aktywność kadheryny T, zwiększa aktywność kadheryny. Terminy antagonista i inhibitor uważane są za synonimy i mogą być w niniejszym ujawnieniu stosowane zamiennie. [0064] Sposoby określania czy modulator ma wpływ tak samo ukierunkowany na aktywność kadheryny T jak Acrp30 czy przeciwny zostały przedstawione szczegółowo poniżej. [0065] Sposoby, które można stosować do badania modulatorów pod kątem ich zdolności do podnoszenia lub obniżania aktywności polipeptydu kadheryny T lub do podnoszenia lub obniżania ekspresji mrna kadheryny T są dobrze znane w dziedzinie i zostały wyszczególnione poniżej. Testy te można przeprowadzać in vitro lub in vivo. [0066] Modulatory kandydaci według niniejszego opisu obejmują związki występujące naturalnie i syntetyczne. Związki takie obejmują, np. naturalne ligandy, małe cząsteczki, aptamery, cząsteczki antysensownego mrna, małe cząsteczki interferującego RNA, rozpuszczalne formy kadheryny T i przeciwciała. Związki takie są w niniejszej specyfikacji określone jako związki kandydaci lub jako modulatory kandydaci Korzystni agoniści kandydaci obejmują naturalne ligandy, małe cząsteczki i aptamery. Korzystni kandydaci antagoniści obejmują naturalne ligandy, małe cząsteczki, aptamery, cząsteczki antysensownego mrna, małe cząsteczki interferującego RNA, rozpuszczalne formy kadheryny T i przeciwciała. Najkorzystniejszymi kandydatami antagonistami są rozpuszczalne formy kadheryny T. [0067] W użytym tu znaczeniu, termin naturalny ligand odnosi się do dowolnej cząsteczki sygnało- 13

15 wej, która wiąże kadherynę T in vivo i obejmuje cząsteczki takie jak np. nukleotydy, polinukleotydy, aminokwasy, peptydy, polipeptydy, białka, węglowodany i cząsteczki nieorganiczne. [0068] W użytym tu znaczeniu, termin mała cząsteczka odnosi się do cząsteczek organicznych o stosunkowo niskiej masie cząsteczkowej. Korzystnie, mała cząsteczka obejmuje mniej niż 200 atomów. Najkorzystniej, mała cząsteczka obejmuje pomiędzy około 50 atomów a 80 atomów. [0069] W użytym tu znaczeniu, termin przeciwciało odnosi się do białka wytwarzanego przez komórki układu odpornościowego lub jego fragmentu, który wiąże się z antygenem. Przeciwciała według opisu mogą być poliklonalne lub monoklonalne, chimeryczne, humanizowane lub nawet w pełni ludzkie. Zrekombinowane przeciwciała i ich fragmenty charakteryzują się wysokim powinowactwem wiązania z polipeptydami kadheryny T in vivo i niską toksycznością. Przeciwciała, które można stosować według opisu charakteryzują się zdolnością do leczenia pacjentów przez okres wystarczający do bardzo dobrego lub znakomitego cofnięcia się lub złagodzenia stanu patogennego lub dowolnego objawu lub grupy objawów związanych ze stanem patogennym i niską toksycznością. Przeciwciała neutralizujące są z łatwością wywoływane w zwierzętach, takich jak króliki, koza lub myszy przez immunizację polipeptydami kadheryny T. Szczególnie przydatne są immunizowane myszy, które dostarczają komórki B do produkcji hybrydom, które z kolei są hodowane do produkcji dużych ilości przeciwciał monoklonalnych przeciwko kadherynie T. Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin charakteryzującymi się dwoma lub większą liczbą segmentów lub części pochodzących od różnych gatunków zwierząt. Zazwyczaj, region zmienny przeciwciała chimerycznego pochodzi z przeciwciała ssaka innego niż człowiek, takiego jak mysie przeciwciało monoklonalne, a region stały immunoglobuliny pochodzi z cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, zarówno regiony jak i ich kombinacja posiadają niską immunogenność w rutynowych oznaczeniach (Elliott i wsp., 1994). Przeciwciała humanizowane są cząsteczkami immunoglobulin stworzonymi za pomocą technik inżynierii genetycznej, w których mysie regiony stałe są zamienione przez ludzkie odpowiedniki, przy zachowaniu mysich regionów wiążących antygen. Uzyskane chimeryczne przeciwciała mysz-człowiek korzystnie posiadają zredukowaną immunogenność i ulepszoną farmakokinetykę u ludzi (Knight i wsp., 1993). Przeciwciała mogą być w pełni ludzkie. Technologię wytwarzania przeciwciał ludzkich opisano szczegółowo np. w WO 00/76310, WO 99/53049, US i AU Jeden ze sposobów przygotowania w pełni ludzkich przeciwciał składa się z humanizowania mysiego humoralnego układu odpornościowego, np. wytworzenie mysich szczepów zdolnych do wytwarzania ludzkiego Ig (Ksenomysz), przez wprowadzenie loci ludzkiej immunoglobuliny (Ig) do myszy, u której inaktywowano geny endogennych Ig. Loci Ig są złożone zarówno w znaczeniu struktury fizycznej i rearanżacji genów jak i procesów ekspresji wymaganych do ostatecznej produkcji rozległej odpowiedzi odpornościowej. Różnorodność przeciwciał jest przede wszystkim wytwarzana dzięki kombinatorycznym rearanżacjom pomiędzy różnymi genami V, D i J obecnymi w loci Ig. Loci te zawierają także rozsiane elementy regulacyjne, które kontrolują ekspresję przeciwciał, wykluczanie alleli, przełączanie klas i dojrzewanie powinowactwa. Wprowadzenie nie przerearanżowanych transgenów ludzkich Ig do myszy pokazało, że maszyneria rekombinacyjna u myszy jest kompatybilna z genami ludzkimi. Ponadto, przy pomocy immunizacji Ksenomyszy antygenem można uzyskać hybrydomy wydzielające różne izotypy hu-mabs specyficzne wobec antygenu. Przeciwciała w pełni ludzkie i sposoby ich wytwarzania są znane w dziedzinie (patrz, 14

16 np., WO 98/24893). [0070] W użytym tu znaczeniu, termin antysensowny mrna odnosi się do cząsteczki RNA komplementarnej do nici normalnie przetwarzanej w mrna i podlegającej translacji lub do cząsteczki RNA komplementarnej do jej regionów. [0071] W użytym tu znaczeniu, termin aptamer odnosi się do sztucznego liganda z kwasu nukleinowego (patrz, np., Ellington i Szostak, 1990). [0072] W użytym tu znaczeniu, termin mały interferujący RNA odnosi się do dwuniciowego RNA indukującego specyficzne wobec sekwencji potranskrypcyjne wyciszanie genu (patrz, np., Elbashir i wsp., 2001). [0073] W użytym tu znaczeniu, termin rozpuszczalna forma kadheryny T odnosi się do polipeptydu kadheryny T, który nie jest związany z błoną. Polipeptydy kadheryny T, które nie są związane z błoną mogą być prosto wytworzone przez specjalistów w dziedzinie za pomocą mutowania miejsce kotwiczenia GPI w polipeptydzie kadheryny T. Przykładowo, glicynę w pozycji 693 z SEKW. NR ID.: 1 można zmienić na inny aminokwas. Alternatywnie, rozpuszczalną formą może być fragment kadheryny T bez miejsca kotwiczenia GPI. Rozpuszczalna forma kadheryny T, według niniejszego wynalazku, jest wybrana z grupy składającej się z: a) polipeptydu składającego się z aminokwasów 23 do 692 z SEKW. NR ID.: 1; b) polipeptydu składającego się z fragmentu o co najmniej 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 lub 650 aminokwasach z (a); c) muteiny z dowolnego z (a) lub (b), której sekwencja aminokwasowa posiada co najmniej 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności z przynajmniej jedną z sekwencji z (a) lub (b); d) muteiny z dowolnego z (a) lub (b), która jest kodowana przez kwas nukleinowy hybrydyzujący z sekwencją komplementarnego DNA, kodującego dowolny z (a) lub (b), w bardzo ostrych warunkach; oraz e) muteiny z dowolnego z (a) lub (b), w której dowolne zmiany w sekwencji aminokwasowej są podstawieniami konserwatywnych aminokwasów w sekwencji aminokwasowej z (a) lub (b). Korzystnie, rozpuszczalna forma kadheryny T wiąże Acrp30. Korzystnie, rozpuszczalna forma kadheryny T wiąże heksameryczne i/lub HMW rodzaje Acrp30. [0074] W użytym tu znaczeniu termin HMW rodzaje Acrp30 odnosi się do kompleksu polipeptydów Acrp30 obejmującego ponad sześć polipeptydów Acrp30. Pozorna masa cząsteczkowa mysich rodzajów HMW Acrp30 wynosi około 630 kda. W użytym tu znaczeniu, termin heksameryczne rodzaje Acrp30 odnosi się do kompleksu sześciu polipeptydów Acrp30. Pozorna masa cząsteczkowa mysich heksamerycznych rodzajów wynosi około 410 kda. Takie multimeryczne lub heksameryczne kompleksy można oczyszczać i/lub rozdzielać za pomocą, np. filtracji w żelu jak opisano w Tsao i wsp. (2002). [0075] Rozpuszczalne formy kadheryny T według niniejszego opisu ponadto obejmują chimeryczny polipeptyd kadheryny T obejmujący kadherynę T lub jej fragmenty w fuzji z polipeptydem heterologicznym. [0076] Omawiana rozpuszczalna forma kadheryny T, według niniejszego opisu, obejmuje kadherynę 15

17 T lub jej fragment w fuzji z całą lub częścią immunoglobuliny. Sposoby wytwarzania immunoglobulinowych fuzji białkowych są dobrze znane w dziedzinie, jak, przykładowo, te opisane w WO 01/ Specjalista w dziedzinie będzie rozumiał, że uzyskana fuzja białkowa według wynalazku zachowuje aktywność biologiczną kadheryny T, w szczególności wiązanie z heksamerycznymi i/lub HMW rodzajami Acrp30. Fuzja może być bezpośrednia lub z krótkim łącznikiem peptydowym, o długości 1 do 3 reszt aminokwasowych lub dłuższym, przykładowo, o długości 13 reszt aminokwasowych. Omawiany łącznik może być, przykładowo, peptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub 13-aminokwasową sekwencją łącznika obejmującą Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met wprowadzoną pomiędzy sekwencję kadheryny T i sekwencję immunoglobuliny. Uzyskana fuzja białkowa posiada ulepszone własności, takie jak wydłużony czas obecności w płynach ustrojowych (czas półtrwania), zwiększona aktywność specyficzna, zwiększony poziom ekspresji lub ułatwione jest oczyszczanie fuzji białkowej. Korzystnie, kadheryna T lub jej fragment jest w fuzji z regionem stałym cząsteczki Ig. Korzystnie, jest w fuzji z regionami łańcucha ciężkiego, jak przykładowo, domeny CH2 i CH3 ludzkiej IgGl. Inne izoformy cząsteczek Ig także są odpowiednie do wytwarzania fuzji białkowych według niniejszego opisu, takich jak, przykładowo, izoformy IgG2 lub IgG4 lub inne klasy Ig, jak IgM lub IgA. Fuzje białkowe mogą być monomeryczne lub multimeryczne, hetero- lub homomultimeryczne. [0077] Rozpuszczalna forma kadheryny T może być cząsteczką chimeryczną łączącą rozpuszczalny region kadheryny T i całe lub część Acrp30. Chimerę taką opisano dla IL-6 i jej receptora IL-6R (Chebath i wsp., 1997, WO 99/02552 i WO 97/32891). Chimera IL-6R/IL-6 wiąże się ze swoim receptorem komórkowym in vitro z wyższym powinowactwem niż mieszanina IL-6 z rozpuszczalnym IL-6R (Kollet i wsp., 1999). Kadheryna T może, przykładowo, być w fuzji z Acrp30 o pełnej długości. Alternatywnie, kadheryna T może być w fuzji z centralnym regionem Acrp30, który obejmuje powtórzenia kolagenowe. Oczekuje się, że chimery takie będą tworzyły rozpuszczalne chimeryczne cząsteczki, heksameryczne i HMW. [0078] Leki kandydaci mogą zostać otrzymani przy użyciu dowolnego z wielu podejść w metodach z bibliotekami kombinatorycznymi znanymi w dziedzinie, w tym, np. bibliotekami biologicznymi, bibliotekami równolegle adresowanymi przestrzennie w fazie stałej lub w fazie roztworu i metodach syntetycznych bibliotek przy użyciu selekcji z chromatografią powinowactwa. Podejście z biblioteką biologiczną jest zazwyczaj stosowane z bibliotekami peptydowymi, podczas gdy pozostałe cztery podejścia mają zastosowanie w bibliotekach związków peptydowych, oligomerowych nie będących peptydami, aptamerowych i małych cząsteczek. [0079] Przykładem sposobu, który można zastosować do poszukiwania związków kandydatów na modulator jest sposób obejmujący etapy: a) kontaktowania polipeptydu kadheryny T ze związkiem kandydatem; i b) testowania aktywności omawianego polipeptydu kadheryny T w obecności omawianego związku kandydata; w którym różnica lub zmiana w aktywności polipeptydu kadheryny T w obecności tego związku wskazuje na to, że związek jest modulatorem polipeptydu kadheryny T. Korzystnie, sposób taki dodatkowo 16

18 obejmuje etap porównania aktywności polipeptydu kadheryny T w obecności takiego związku z aktywnością polipeptydu kadheryny T przy braku związku kandydata. Korzystnie jest także, jeśli taki sposób obejmuje etap testowania aktywności polipeptydu kadheryny T przy braku związku będącego kandydatem. [0080] Alternatywnie, test może być oparty na teście komórkowym obejmującym etapy: a) kontaktowania komórki wyrażającej polipeptyd kadheryny T ze związkiem kandydatem; i b) testowania aktywności polipeptydu kadheryny T w obecności związku kandydata; w którym różnica lub zmiana w aktywności polipeptydu kadheryny T w obecności związku kandydata wskazuje na to, że związek ten jest modulatorem polipeptydu kadheryny T. Korzystnie, sposób taki dodatkowo obejmuje etap porównania aktywności polipeptydu kadheryny T w obecności tego związku z aktywnością polipeptydu kadheryny T przy braku tego związku. Korzystnie także, jeśli taki sposób obejmuje także etap testowania aktywności polipeptydu kadheryny T przy braku związku kandydata. [0081] Modulator może być inhibitorem lub aktywatorem. Inhibitor może zmniejszać aktywność kadheryny T o np. 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 100% w porównaniu z aktywnością kadheryny T przy braku inhibitora. Aktywator może zwiększać aktywność kadheryny T o np. 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 100% w porównaniu z aktywnością kadheryny T przy braku aktywatora. [0082] Modulator może modulować dowolną aktywność polipeptydu kadheryny T. Modulator może przykładowo modulować ekspresję mrna kadheryny T w komórce, modulować wiązanie polipeptydu kadheryny T z naturalnym partnerem wiążącym, takim jak np. Acrp30 lub modulować wzrost komórki. [0083] Aktywność polipeptydu kadheryny T można badać przez pomiar wiązania polipeptydu kadheryny T z Acrp30. Testy pomiaru wiązania polipeptydu kadheryny T z Acrp30 są znane specjalistom w dziedzinie. Przykładowo, można stosować test FACS opisany w Przykładzie 4.2. lub test ELISA opisany w Przykładzie 4.3. niniejszego opisu. Test taki, przykładowo, obejmuje etapy: a) kontaktowania komórki wyrażającej polipeptyd kadheryny T z związkiem kandydatem i z Acrp30; i b) testowania wiązania polipeptydu kadheryny T z Acrp30 w obecności związku kandydata; w którym różnica lub zmiana w wiązaniu polipeptydu kadheryny T z Acrp30 w obecności tego związku wskazuje na to, że związek kandydat jest modulatorem polipeptydu kadheryny T. Korzystnie, sposób taki dodatkowo obejmuje etap porównania wiązania o polipeptydu kadheryny T z Acrp30 w obecności tego związku z wiązaniem polipeptydu kadheryny T z Acrp30 przy braku tego związku. Korzystne jest również, jeśli taki sposób obejmuje etapy: c) kontaktowania komórki wyrażającej polipeptyd kadheryny T z Acrp30; i d) testowania wiązania polipeptydu kadheryny T z Acrp30 przy braku związku kandydata. [0084] Acrp30 może być heksamerycznym rodzajem Acrp30. Alternatywnie, Acrp30 może być rodzajem HMW Acrp30. 17

19 [0085] Aktywność polipeptydu kadheryny T można badać przez pomiar poziomów mrna kadheryny T w komórce. Aktywność można mierzyć za pomocą techniki Northern blot, RT-PCR, ilościowego RT- PCR ze starterami i sondami specyficznymi do cząsteczek mrna kadheryny T. Alternatywnie, ekspresja mrna kadheryny T jest mierzona na poziomie polipeptydu, przy użyciu znakowanych przeciwciał, które specyficznie wiążą polipeptyd kadheryny T w testach enzymo-immunologicznych takich jak testy ELISA lub testy RIA, technice Western blot lub testach immunohistochemicznych. [0086] Ewentualnie aktywność polipeptydu kadheryny T można badać przez pomiar regulacji wzrostu komórki. Korzystnymi komórkami są komórki z układu nerwowego, takie jak astrocyty. Innymi korzystnymi komórkami są miotubule C2C12. Testy takie można przykładowo prowadzić tak jak opisano w Takeuchi i wsp. (2000) lub w Huang i wsp. (2003). [0087] Użyty w całym niniejszym opisie, termin zaburzenie metaboliczne obejmuje otyłość, cukrzycę typu II, oporność na insulinę, hipercholesterolemię, hiperlipidemię, dyslipidemię, zespół X, miażdżycę tętnic, anoreksję i kacheksję. Terminy otyłość cukrzyca typu II, oporność na insulinę, hipercholesterolemia, hiperlipidemia, dyslipidemia i miażdżyca tętnic odnoszą się do stanów zdefiniowanych w The Merck Manual-- Second Home Edition (Publisher: Merck & Co). Termin zespół X odnosi się do wspólnego występowania czynników ryzyka miażdżycy tętnic, w tym oporności na insulinę, hiperinsulinemii, dyslipidemii, nadciśnienia i otyłości (patrz, np., Roth i wsp., 2002). Termin kacheksja odnosi się do stanu charakteryzującego się utratą tłuszczu. W użytym tu znaczeniu, termin kacheksja obejmuje wyniszczenie związane z AIDS i rakiem. Termin anoreksja odnosi się do stanu charakteryzującego się fałszywym wizerunkiem własnego ciała, lękiem przed otyłością i niezdolnością utrzymania minimalnej, prawidłowej masy ciała. [0088] Użyty w całym niniejszym opisie, termin zaburzenie ginekologiczne odnosi się do zaburzeń, które dotyczą kobiecego układu rozrodczego i/lub zaburzeń powiązanych z ciążą. Zaburzenia takie obejmują np. zespół jajników policystycznych, raka śluzówki macicy, raka sutka, stan przedrzucawkowy i rzucawkę. Użyty w całym niniejszym opisie, termin zaburzenie wątroby lub nerek obejmuje np. stłuszczenie wątroby, zespół nerczycowy i przewlekły zespół nerkowy. Użyty w całym niniejszym opisie, termin przewlekły stan zapalny odnosi się do zapalenia przewlekłego patologicznego. Przewlekłe choroby zapalne obejmują np. łuszczycę, artropatię łuszczycową, reumatoidalne zapalenie stawów, astmę, zapalenie jelita i stwardnienie rozsiane. Wszystkie wspomniane powyżej zaburzenia odnoszą się do zaburzeń zdefiniowanych w The Merck Manual--Second Home Edition (Publisher: Merck & Co). Inne zaburzenia, które można leczyć przy użyciu modulatorów i rozpuszczalnych form kadheryny T według niniejszego opisu obejmują dowolne raki związane z otyłością i/lub opornością na insulinę, takie jak np. rak śluzówki macicy. [0089] Zaburzenie, według niniejszego wynalazku, jest zaburzeniem metabolicznym. [0090] W dalszym korzystnym wykonaniu, zaburzenie jest zaburzeniem metabolicznym wybranym z grupy składającej się z otyłości, cukrzycy typu II, oporności na insulinę, hipercholesterolemii, hiperlipidemii, dyslipidemii i zespołu X. Polipeptyd kadheryny T można zastosować jako miejsce docelowe do poszukiwania kandydatów modulatorów jako leków kandydatów do leczenia otyłości, przy czym lekiem kandydatem jest modulator kadheryny T. Alternatywnie, polipeptyd kadheryny T można zastosować jako miejsce docelowe do poszukiwania kandydatów modulatorów jako leków kandydatów do leczenia 18

20 cukrzycy typu II, przy czym lekiem kandydatem jest modulator kadheryny T. Ponadto, polipeptyd kadheryny T można zastosować jako miejsce docelowe do poszukiwania modulatorów kandydatów jako leków kandydatów do leczenia zespołu X, przy czym lekiem kandydatem jest modulator kadheryny T. [0091] Korzystnymi lekami kandydatami do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z: otyłości, cukrzycy typu II, oporności na insulinę, hipercholesterolemii, hiperlipidemii, dyslipidemii i zespołu X są agoniści kadheryny T. Zatem, polipeptyd kadheryny T można zastosować jako miejsce docelowe do poszukiwania związków kandydatów jako leków kandydatów do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z: otyłości, cukrzycy typu II, oporności na insulinę, hipercholesterolemii, hiperlipidemii, dyslipidemii i zespołu X, przy czym lekiem kandydatem jest agonista kadheryny T. Korzystnie, związki kandydaci są wybrani z grupy składającej się z: naturalnych ligandów, małych cząsteczek i aptamerów. [0092] Ustalenie czy modulator kadheryny T jest agonistą kadheryny T czy antagonistą kadheryny T można przykładowo przeprowadzić przy użyciu testu opisanego w Przykładzie 5. Test taki może przykładowo obejmować etapy: a) kontaktowania komórki wyrażającej polipeptyd kadheryny T z modulatorem; i b) testowania transkrypcji, w której pośredniczy NF-κB, w obecności tego modulatora; w którym ustalenie, że modulator posiada taki sam wpływ na transkrypcję, w której pośredniczy NFκB, jak Acrp30 wskazuje na to, że związek jest agonistą polipeptydu kadheryny T, oraz w którym ustalenie, że modulator posiada przeciwny wpływ na transkrypcję, w której pośredniczy NF-κB, w porównaniu z Acrp30 wskazuje na to, że związek jest antagonistą polipeptydu kadheryny T. Korzystnie sposób taki dodatkowo obejmuje etapy: c) kontaktowania komórki wyrażającej polipeptyd kadheryny T z Acrp30; i d) testowania transkrypcji, w której pośredniczy NF-κB, w obecności Acrp30 i przy braku modulatora. [0093] W teście takim, Acrp30 jest korzystnie Acrp30 rodzaju heksamerycznego lub rodzaju HMW. W teście takim, komórka wyrażająca polipeptyd kadheryny T może być np. linią komórek C2C12 lub komórek C2C12 z nadprodukcją kadheryny T. Test taki można także przeprowadzić z związkami kandydatami w celu poszukiwania agonistów kadheryny T lub antagonistów kadheryny T. [0094] IL-6, która jest wytwarzana na wysokich poziomach przez mięsień szkieletowy podczas ćwiczeń fizycznych, wyzwala podwyższoną produkcję kwasów tłuszczowych i glukozy z tkanki tłuszczowej. Uważa się, że w uwalnianiu IL-6 z mięśnia szkieletowego odgrywa rolę Acrp30 przez aktywację NF-κB (patrz, np. Tsao i wsp., 2003). Zatem, ustalenie czy modulator kadheryny T jest agonistą kadheryny T czy antagonistą kadheryny T można przeprowadzić przez pomiar ekspresji genu IL-6 i/lub uwalniania IL-6 z komórek mięśnia szkieletowego. Test taki może przykładowo obejmować etapy: a) kontaktowania komórki wyrażającej polipeptyd kadheryny T z modulatorem; i b) testowania ekspresji genu IL-6 i/lub uwalniania IL-6 z komórek mięśnia szkieletowego w obecności tego modulatora; 19