Elżbieta Starzycka-Korbas

Transkrypt

1 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Państwowy Instytut Badawczy Elżbieta Starzycka-Korbas Charakterystyka wybranych populacji Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary i ocena odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego (Brassica napus L.) na tego patogena Characterisation of selected Sclerotina sclerotiorum (Lib.) de Bary populations and evaluation of different winter rapeseed (Brassica napus L.) cultivars types of resistance to this pathogen Rozprawa doktorska wykonana w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Państwowego Instytutu Badawczego w Poznaniu Promotor: prof. dr hab. Zbigniew Weber Promotor pomocniczy: dr Marcin Matuszczak Poznań 2018

2 Szanownemu Panu Profesorowi dr hab. Zbigniewowi Weberowi Serdeczne podziękowania za podjęcie się obowiązków promotora, wiele cennych wskazówek podczas realizacji i redagowania pracy oraz za poświęcony czas i wyrozumiałość

3 Serdecznie dziękuję Panu dr Marcinowi Matuszczakowi Za podjęcie roli promotora pomocniczego oraz za pomoc w opracowaniu wyników z zakresu badań molekularnych Pani inż. Irenie Tokarczuk za pomoc przy prowadzeniu prac w doświadczeniach polowych i laboratoryjnych Panu dr Grzegorzowi Budzianowskiemu za możliwość przeprowadzenia doświadczenia polowego w Małyszynie oraz za pomoc i cenne wskazówki w obliczeniach statystycznych Panu dr hab. Janowi Bocianowskiemu za pomoc przy obliczeniach statystycznych Pani prof. dr hab. Iwonie Bartkowiak-Brodzie Za umożliwienie realizacji pracy w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych IHAR-PIB w Poznaniu Rodzicom oraz Mężowi za wsparcie, cierpliwość i wyrozumiałość

4 Spis treści 1. Wstęp Rzepak (Brassica napus L.) Systematyka i pochodzenie Historia uprawy i znaczenie gospodarcze rzepaku w Polsce Kierunki hodowli rzepaku Odporność rzepaku na S. sclerotiorum Zgnilizna twardzikowa (Sclerotinia sclerotiorum /Lib./ de Bary) Występowanie i szkodliwość Objawy Etiologia Epidemiologia Rola kwasu szczawiowego wytwarzanego przez S. sclerotiorum w zakażaniu roślin Polimorfizm DNA S. sclerotiorum przy wykorzystaniu technik RAPD i SSR Ochrona roślin przed zgnilizną twardzikową Cel pracy Materiały i metody Materiały Kolekcja izolatów S. sclerotiorum z lat Pochodzenie i charakterystyka izolatów S. sclerotiorum wykorzystywanych do oceny stopnia odporności wybranych odmian rzepaku ozimego Odmiany rzepaku ozimego oceniane pod względem stopnia odporności na S. sclerotiorum Metody Charakterystyka wybranych populacji S. sclerotiorum Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum z lat

5 Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez siedem izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Zależność między wielkością kolonii izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego Analizy molekularne wybranych izolatów S. sclerotiorum Analizy z wykorzystaniem markerów RAPD Analizy z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych SSR Charakterystyka odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w trzech kolejnych latach Porównanie zdolności wybranych izolatów S.sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec dziesięciu odmian rzepaku ozimego Obliczenia statystyczne Współczynnik korelacji Jednoczynnikowa i dwuczynnikowa analiza wariancji oraz test Duncana Analiza skupień na podstawie podobieństwa Nei & Li Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) Dane meteorologiczne Wyniki Charakterystyka wybranych populacji S. sclerotiorum Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum z lat Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez siedem izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Zależność między wielkością kolonii izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego

6 Analizy molekularne wybranych izolatów S. sclerotiorum Analiza podobieństw na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w latach Analiza podobieństw na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD siedmiu izolatów S. sclerotiorum używanych do inokulacji rzepaku ozimego Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w latach Analiza podobieństw na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji przy użyciu markerów mikrosatelitarnych izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w 2014 roku i siedmiu izolatów wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Charakterystyka odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w trzech kolejnych latach ( ) Porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec dziesięciu odmian rzepaku ozimego Dyskusja Podsumowanie i wnioski Streszczenie/Summary Literatura Załącznik Załącznik Załącznik

7 1. Wstęp 1.1. Rzepak (Brassica napus L.) Systematyka i pochodzenie Rzepak (Brassica napus L.) należy do rodziny kapustowatych (Brassicaceae), dawniej krzyżowych (Cruciferae), plemienia kapustne (Brassiceae), rodzaju kapusta (Brassica). Rodzina Brassicaceae obejmuje ponad 3000 gatunków z ponad 300 rodzajów. Należą do nich zarówno rośliny rolnicze, warzywne, jak i ozdobne (Warwick i in. 2006). Największe znaczenie mają rodzaje: kapusta (Brassica), gorczyca (Sinapis), rzodkiew (Raphanus) oraz lnianka (Camelina). Rodzaj Brassica oprócz rzepaku obejmuje około stu innych gatunków w skład, których wchodzą rośliny: oleiste, warzywne, przyprawowe, ozdobne, a także chwasty. Rośliny oleiste to przede wszystkim rzepak zarówno ozimy, jak i jary, rzepik (ozimy i jary) oraz gorczyce będące formami jarymi: sarepska (Brassica juncea), abisyńska (Brassica carinata) i czarna (Brassica nigra L.) (Bartkowiak-Broda i in. 2005). Rzepak jest naturalnym amfidiploidem (gatunkiem o genomie allotetraploidalnym), który powstał na skutek spontanicznego przekrzyżowania diploidalnych gatunków podstawowych: Brassica rapa (rzepik) n = 10 oraz Brassica oleracea (kapusta) n = 9 (Ryc. 1) (Song i Osborn, 1992). B. napus (AACC, n = 19) posiada genom A od rzepiku i genom C od kapusty (Bartkowiak-Broda i in. 2005). Ryc. 1. Trójkąt Nagaharu U gatunki podstawowe i amfidiploidalne oraz związki w obrębie rodzaju Brassica (Źródło: (U, 1935). 4

8 Historia uprawy i znaczenie gospodarcze rzepaku w Polsce W Polsce nasiona roślin oleistych z rodzaju Brassica odnajdywano w osadach pochodzących z X wieku (Krzymański 1997). Jednak dokumenty świadczące o uprawie i badaniach nad rzepakiem pochodzą z XIX wieku. W tym czasie roślina ta była uprawiana w wielu gospodarstwach w ówczesnych rejonach Kaliskiem, Warszawskiem, na Kujawach, w Sandomierskiem, Poznańskiem, Płockiem, Lubelskiem, Siedleckiem, Łomżyńskiem, Bydgoskiem i Krakowskiem (Pietruszyński 1949). Plony uzyskiwano na poziomie od 5 do 11 dt/ha, a powierzchnia uprawy była niewielka i wynosiła 20 tys. ha (Bartkowiak-Broda 2002, Arseniuk i Oleksiak 2012). W drugiej połowie XIX wieku nastąpił spadek uprawy roślin oleistych w Europie, w tym również w Polsce, ze względu na import tanich olejów roślinnych z Dalekiego Wschodu, a także olejów mineralnych i gazu. W okresie międzywojennym na terenie Polski uprawa rzepaku stopniowo wzrastała dzięki podejmowanej hodowli i pod koniec lat 30 XX wieku powierzchnia uprawy wyniosła ponad 60 tys. ha (Bartkowiak-Broda 2009, Arseniuk i Oleksiak 2012). Po II wojnie światowej ze względu na malejącą podaż olejów na Dalekim Wschodzie w Europie zainteresowanie uprawą roślin oleistych znacznie wzrosło. W Polsce dzięki poprawie zimotrwałości B. napus i wprowadzeniu środków chemicznych zwalczających głównego szkodnika słodyszka rzepakowca powierzchnia uprawy roślin oleistych w 1950 r. wyniosła 130 tys. ha w tym 100 tys. ha stanowił rzepak i rzepik. Do końca lat 50. XX w. udział rzepaku w powierzchni zasiewów był mniejszy niż 1% (Dembiński 1955, Bartkowiak-Broda 2009, Arseniuk i Oleksiak 2012) co w kolejnych latach uległo zmianie. W 1989 r. powierzchnia uprawy wyniosła 570 tys. ha (co stanowiło 4% w strukturze zasiewów), a uzyskiwane plony na poziomie tys. ton odpowiadały potrzebom przemysłu tłuszczowego. Ostatnia dekada XX w. charakteryzowała się wahaniami w powierzchni uprawy rzepaku. Istotny wzrost znaczenia rzepaku, jako rośliny oleistej w świecie był wynikiem prac badawczych i hodowlanych. Do zwiększenia uprawy rzepaku przyczyniło się najpierw wyhodowanie odmian rzepaku bez kwasu erukowego, a następnie bez glukozynolanów (Krzymański 1968; Krzymański 1970). Pierwszą odmianę podwójnie ulepszoną (syn. dwuzerową typ canola) Jantar zarejestrowano w 1985 roku. Natomiast od początku lat 90 dwudziestego wieku w Polsce i innych krajach europejskich, a także w Kanadzie uprawiane są wyłącznie odmiany rzepaku podwójnie ulepszone. Do Krajowego Rejestru wpisywane są tylko te odmiany, które nie zawierają więcej niż 1% kwasu erukowego w oleju z nasion 5

9 oraz glukozynolanów 15µM/g w suchej masie nasion (Bartkowiak-Broda 2009). Podwójnie ulepszone odmiany pozbawione związków antyżywieniowych stały się źródłem pełnowartościowego, zdrowego oleju, a także cenną paszą dla zwierząt, zawierającą około 40% białka w suchej masie (Muśnicki 1997). Olej rzepakowy uznawany jest za najzdrowszy w żywieniu człowieka (Scarth i McVetty 1999; Clifton 1999; Pedersen i in. 2000). W swoim składzie zawiera średnio 62% jednonienasyconego kwasu oleinowego wpływającego na obniżenie szkodliwej formy cholesterolu LDL, a także około 30% kwasów wielonienasyconych w zrównoważonej proporcji: 20% kwasu linolowego (kwasy tłuszczowe omega-6) i 10% kwasu linolenowego (kwasy tłuszczowe omega-3). Ponadto w oleju rzepakowym występują takie związki, jak: tokoferole, fitosterole, a także beta-karoten i polifenole, które pełnią funkcję przeciwutleniającą (Bartkowiak-Broda 2009). Następne kamienie milowe, które przyczyniły się do zwiększenia zainteresowania uprawą rzepaku to: odkrycie i opracowanie systemów kontrolujących zapylanie krzyżowe dających możliwość hodowli wysokoplennych odmian mieszańcowych (Bartkowiak-Broda 1991; Liersch i in. 2000) oraz odkrycie zjawiska androgenezy u rzepaku, co pozwala na uzyskanie linii podwojonych haploidów (Cegielska-Taras i Szała 1997; Cegielska-Taras i in. 1997), które włączone do programów hodowlanych przyczyniają się do skrócenia cyklu selekcji. Bardzo ważne stało się również opracowanie markerów molekularnych niektórych cech, zwiększając efektywność selekcji, a także wykrycie źródeł odporności na niektóre choroby, co pozwala na ochronę plonu. Zbiory rzepaku w Polsce w XXI wieku systematycznie wzrastały osiągając w latach średnio 2,9 mln ton. Zauważalny wzrost produkcji rzepaku w naszym kraju nastąpił po akcesji Polski do Unii Europejskiej w wyniku promocji wykorzystania oleju do produkcji biopaliw i konieczności wdrożenia dyrektywy UE. Prognozuje się, że zużycie oleju rzepakowego, zarówno na cele spożywcze, jak i biopaliwa do roku 2020 wzrośnie, co wiąże się ze wzrostem rocznego zapotrzebowania krajowego rynku na rzepak do około 4 mln ton. Następnym czynnikiem, który będzie stymulował uprawę rzepaku w Polsce, podobnie jak w innych krajach Unii Europejskiej jest deficyt pasz wysokobiałkowych. Śruta rzepakowa jest drugim po soi źródłem białka paszowego nie modyfikowanego genetycznie. Hodowla i uprawa rzepaku ciągle się rozwija ze względu na duże wartości dietetyczne oleju rzepakowego oraz jego przydatność w różnych technologiach, na 6

10 przykład do produkcji biopaliw, a także możliwości wykorzystania poekstrakcyjnej śruty rzepakowej, jako paszy wysokobiałkowej dla zwierząt gospodarskich Kierunki hodowli rzepaku Rzepak znajduje szereg zastosowań, w przemyśle: spożywczym, paszowym, energetycznym, czy chemicznym. Z tego też względu istnieje potrzeba otrzymywania odmian o różnych cechach jakościowych. Olej, który stanowi główny produkt otrzymywany z nasion rzepaku, jest stosowany na cele spożywcze oraz jest wykorzystywany w różnych gałęziach przemysłu, a także odpowiada na zapotrzebowanie na odnawialne paliwa napędowe (estry kwasów tłuszczowych oleju rzepakowego) (Krzymański 2005). Dlatego zawartość tłuszczu oraz skład kwasów tłuszczowych jest jednym z celów selekcyjnych w programach hodowlanych rzepaku. Zawartość tłuszczu w suchej masie nasion rzepaku mieści się w granicach 43-48% (Rybacki 2005, Bartkowiak-Broda 2009) i zależy od czynników dziedzicznych (Delourme i in. 2006), a także jest modyfikowana przez warunki środowiskowe. Istotny jest także fakt, że wraz ze wzrostem zawartości tłuszczu maleje zawartość białka drugiego bardzo ważnego składnika nasion rzepaku, wykorzystywanego do produkcji pasz. Od momentu wyhodowania odmian rzepaku bez kwasu erukowego i z ograniczoną zawartością glukozynolanów, prace nad zmianą proporcji kwasów tłuszczowych i dostosowaniem oleju do różnych potrzeb trwają do dziś. Obecne badania prowadzone są w kierunku podwyższenia zawartości kwasu oleinowego (powyżej 80% - tzw. typ HO) oraz obniżenia zawartości kwasu linolowego i linolenowego (do około 7%). Olej o takim składzie jest ważny w diecie człowieka przyczynia się do obniżenia ilości szkodliwego cholesterolu we krwi (LDL), a także posiada stosunek kwasów omega-6 (kwas linolowy) do omega-3 (kwas linolenowy) równy 1:1, czyli właściwy dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Dużym osiągnięciem polskiej hodowli jest wyhodowanie odmiany typu HO (Polka) (Spasibionek i in. 2016; Bartkowiak-Broda 2016). Innym kierunkiem hodowli jest uzyskanie odmian z podwyższoną zawartością kwasu oleinowego do około 80% i z obniżoną zawartością kwasu linolenowego do ok. 3% (typ HOLL). Tego rodzaju tłuszcz nadaje się zarówno do głębokiego smażenia, jak i do produkcji biopaliw, ze względu na wysoką termostabilność oraz wolny proces utleniania (Bartkowiak-Broda 2016). Do zastosowań w przemyśle istnieje 7

11 zapotrzebowanie na odmiany rzepaku o bardzo wysokim poziomie zawartości kwasu erukowego w nasionach (90%) (Bartkowiak-Broda 2005). Olej rzepakowy wykorzystywany jest także do produkcji olejów, smarów, środków powierzchniowo czynnych, czy do produkcji lakierów, farb olejnych i drukarskich (Krzymański, 2005). Taki olej nadaje się do produkcji między innymi środków antyspieniających (Krzymański, 2005). Stosunkowo duża zawartość białka w nasionach rzepaku, która kształtuje się na poziomie około 24%, a śruty poekstrakcyjnej średnio 35%, klasyfikuje to źródło białka paszowego na drugim miejscu po śrucie sojowej. Jednak duża zawartość włókna pokarmowego (obniżająca wartość energetyczną paszy), związków antyżywieniowych: glukozynolanów, synapiny, kwasu fitynowego, związków polifenolowych, taniny, znacznie ogranicza wykorzystanie śruty rzepakowej, jako paszy dla zwierząt (Bartkowiak-Broda 2016). Dlatego ważnym kierunkiem hodowli jest podwyższenie zawartości białka w nasionach i wyeliminowanie związków antyżywieniowych. Poprzez hodowlę odmian rzepaku żółtonasiennego istnieje również możliwość obniżenia zawartości włókna (Bartkowiak-Broda 2016). Wykorzystanie surowców pochodzących z nasion rzepaku w wieloraki sposób powoduje, że zapotrzebowanie na nie cały czas wzrasta. W związku z tym prace hodowlane mające na celu wzrost plonowania rzepaku są niezmiernie ważne. Istotnym efektem pracy hodowców było wytworzenie odmian mieszańcowych rzepaku. W plonie tych odmian obserwuje się wysoki efekt heterozji. Osiągany plon odmian mieszańcowych jest o około 10% wyższy niż dla odmian populacyjnych (Krzymański i in. 1999; Nowakowska i in. 2005; Wolko 2012). W związku z dyrektywą UE, która nakazuje od 2014 r. wprowadzenie zasad integrowanej ochrony, ważnym kierunkiem hodowli rzepaku są prace nad otrzymaniem odmian odpornych przede wszystkim na patogeny grzybowe (Leptosphaeria spp., Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria spp.) i grzybopodobne (Plasmodiophora brassicae). Ze względu na dużą powierzchnię oraz ułatwiony transport między państwami, patogeny w szybki sposób rozprzestrzeniają się. Dodatkowo częstym zjawiskiem jest przełamywanie odporności przez patogeny, dlatego proces hodowli odpornościowej jest długi i ciągły (Bartkowiak-Broda 2016). 8

12 Odporność rzepaku na S. sclerotiorum Obecnie uprawiane odmiany rzepaku ozimego wykazują częściową odporność na patogena S. sclerotiorum. Szkody oraz ponoszone koszty na ochronę roślin są znaczne (del Río i in. 2007), dlatego hodowla odmian rzepaku o wysokim stopniu odporności stanowi ekonomiczną i ekologiczną alternatywę dla zwalczania S. sclerotiorum. Uprawa odmian odpornych lub tolerancyjnych na patogeny ogranicza wykorzystanie środków ochrony roślin jednocześnie obniżając koszty produkcji. Podjęto wiele wysiłków w celu poznania mechanizmu odporności rzepaku poprzez mapowanie QTL (Zhao i Meng 2003a, Zhao i in. 2006) oraz analizę mikromacierzy (Yang i in ; Zhao i in ). Według Zhao i Menga (2003a) zarówno pojedynczy QTL, jak i interakcje epistatyczne odgrywają ważną rolę w determinacji odporności rzepaku na porażenie powodowane przez S. sclerotiorum. U rzepaku jeden z dziewięciu loci związanych z zawartością glukozynolanów alifatycznych ma wpływ na odporność na S. sclerotiorum (Zhao i Meng 2003b). Wykazano również, że dziedziczenie odporności rzepaku na tego patogena mają wpływ cztery geny recesywne (Fu i in. 1990). Wzrost odporności rzepaku na S. sclerotiorum próbuje się uzyskać zarówno poprzez hodowlę rekombinacyjną (Wang i in. 2004; Yu i in. 2010), jak i biotechnologicznymi technikami, takimi jak krzyżowanie międzygatunkowe (Ding i in. 2013; Chen i in. 2007; Garg i in. 2010; Wei i in. 2010; Mei i in. 2013b; Uloth i in. 2013, 2014), hodowla podwojonych haploidów (Liu i in. 2005), czy resynteza B. napus z gatunków podstawowych (Ding i in. 2013) Zgnilizna twardzikowa (Sclerotinia sclerotiorum /Lib./ de Bary) Występowanie i szkodliwość S. sclerotiorum występuje na całym świecie. Szkody wyrządza najczęściej u roślin dwuliściennych w Europie, Azji, Ameryce Południowej i Północnej, a także w Afryce. Grzyb ten poraża 408 gatunków z 75 rodzin roślin dwuliściennych. Tylko kilka gatunków roślin należących do jednoliściennych ulega infekcji przez tego patogena głównie. Avena sp., Secale cereale, Triticum aestivum, Sorghum vulgare, Setaria viridis, Penisetum americanum, Zea sp. (Boland i Hall 1994). Straty plonów spowodowane przez S. sclerotiorum w uprawach podatnych odmian są zróżnicowane się i mogą wynosić nawet 100 procent (Purdy 1979). U warzyw 9

13 straty wynikają z gnicia roślin na polu przed zbiorami, a także po ich zbiorach podczas przechowywania (Walker 1969; Willetts i Wong 1980). W uprawach nasiennych plony są redukowane przez zmniejszenie wielkości nasion ze względu na przedwczesne zamieranie zainfekowanych roślin (Krüger 1973, 1975b, Morrall i in. 1976) oraz utratę nasion podczas zbioru. W uprawach rzepaku czy słonecznika z roślin porażonych uzyskuje się nasiona małe, słabo wykształcone, tzw. pośladowe (Krüger 1973, 1980, Morrall i in. 1976). Na niechronionych plantacjach rzepaku w latach sprzyjających rozwojowi S. sclerotiorum straty plonu mogą sięgać do 70% (Korbas i in. 2015) Objawy Objawy zgnilizny twardzikowej na rzepaku wywoływane przez S. sclerotiorum mogą występować na wszystkich częściach roślin, jednak najczęściej obserwuje się je na liściach i łodygach. Na początku białoszare plamy widoczne są na liściach, dopiero w późniejszym czasie białe lub białoszare, współśrodkowo strefowane przebarwienia zauważalne są na łodygach, które rozrastając się obejmują cały obwód łodygi. Silnie porażone rośliny przedwcześnie zamierają. W zainfekowanych łodygach roślin rzepaku rozrasta się biała, puszysta grzybnia, która przy dużej wilgotności powietrza może występować także na ich powierzchni. W kolejnym etapie ze skupień grzybni formują się czarne formy przetrwalnikowe, tzw. sklerocja wielkości od 0,3 30 mm (Kryczyński i Weber 2011) Etiologia Główne źródło infekcji roślin rzepaku stanowią wydłużone zarodniki workowe tzw. askospory, wielkości 9-12 x 4,5-6,6 µm, z których wyrastają strzępki grzybniowe wrastające do nadziemnych części roślin (Kryczyński i Weber 2011). Askospory powstają w owocnikach (apotecjach) wyrastających z zimujących sklerocjów. Szacuje się, że z dojrzałych apotecjów w sprzyjających warunkach uwalnianych jest około 2,32 x 10 6 askospor przez okres tygodnia (Schwartz i Steadman 1978). Zarodniki workowe mogą być przenoszone przez wiatr na odległość kilku kilometrów (Abawi i Grogan 1979, Walker 1969, Williams i Stelfox 1979). Badania z użyciem pułapek zarodników wykazały również, że askospory mogą pojawić się na wysokości 150 cm powyżej powierzchni ziemi (Williams i Stelfox 1979), a więc zarodniki mogą być 10

14 transportowane przez wiatr na duży dystans. Bardzo ważną rolę w rozwoju patogena odgrywają sklerocja (Czyżewski 1975). Z jednego sklerocjum może wyrosnąć do 100 apotecjów (Schwartz i Steadman 1978 ). Źródłem zakażenia rzepaku mogą być również strzępki grzybniowe wyrastające ze sklerocjów znajdujących się w ziemi i wrastające do podziemnych części roślin Epidemiologia Sklerocja, które zimują w powierzchniowej warstwie gleby, przy niskiej wilgotności mogą przetrwać do 5 lat (Bardin i Haung 2001). Wyrastaniu apotecjów ze sklerocjów sprzyja duża wilgotność gleby oraz zakres temperatur 5 15 C. Największe stężenie askospor w atmosferze zwykle występuje w okresie kwitnienia rzepaku i przypada na maj i czerwiec (Kryczyński i Weber 2011). Askospory osiadające na płatkach kwiatowych stanowią naturalne inokulum. Opadające zakażone płatki często zatrzymują się w rozgałęzieniach rośliny, gdzie panują odpowiednie warunki do zainfekowaniatych części roślin przez strzępki grzybniowe (Brun i in. 1983; Starzycka i Starzycki 2008). Proces infekcji najszybciej przebiega w temperaturach C, choć zainicjowany może być już przy temperaturze 8 C (Koch i in. 2007a) Rola kwasu szczawiowego wytwarzanego przez S. sclerotiorum w zakażaniu roślin Kwas szczawiowy wytwarzany jest przez różne patogeny grzybowe w tym przez S. sclerotiorum. Substancja ta wpływa na patogeniczność, konkurencję między gatunkami, a także kontroluje poziom składników odżywczych i toksyn (Dutton i Evans 1996). We wczesnych fazach infekcji kwas szczawiowy gromadzi się w zainfekowanych tkankach zmniejszając pozakomórkowe ph do około 4-5. Obecność kwaśnego odczynu w roślinie, na skutek wytwarzania tej substancji przez S. sclerotiorum została udowodniona w badaniach Starzyckiej i Starzyckiego (2011). Obniżone ph przyczynia się do zwiększenia aktywności enzymów degradujących ścianę komórkową (Bateman i Beer 1965; Marciano i in. 1983; Magro i in. 1984; Maxwell i Lumsden 1970). Wytwarzaniu kwasu szczawiowego towarzyszy chelatacja jonów wapnia Ca 2+ i związków pektynowych zawartych w ścianie komórkowej (Smith i in. 1986). Badania 11

15 wykazały, że sama poligalakturonaza nie jest zdolna do hydrolizy pektyn i konieczne jest współdziałanie z kwasem szczawiowym. Kwas szczawiowy chelatuje jony wapnia ściany komórkowej, a poligalakturonaza umożliwia hydrolizę pektyn przyczyniając się do zaburzenia integralności ściany komórkowej rośliny (Bateman i Beer 1965; Kurian i Stelzig 1979). Wykazano również, że kwas szczawianowy hamuje wybuch oksydacyjny, który jest wczesną reakcją obronną roślin (Cessna i in. 2000), a także indukuje otwieranie aparatów szparkowych i hamuje ich zamykanie, doprowadzając porażoną roślinę do więdnięcia (Guimarães i Stotz 2004). Zmniejszające się ph otoczenia pod wpływem wytwarzanego kwasu szczawiowego może wpływać na regulację transkrypcyjną genów regulowanych przez ph niezbędnych do przeprowadzenia patogenezy oraz rozwoju S. sclerotiorum. Przypuszczalny czynnik transkrypcyjny S. sclerotiorum pac1, homologi innych znanych czynników transkrypcyjnych odczytywanych przez grzyby i czynnik wirulencji S. sclerotiorum, są autoregulowane i odpowiednie transkrypty gromadzą się równolegle ze wzrostem ph otoczenia (Rollins i Dickman 2001; Rollins 2003). Podobnie ekspresja genów Smk1, MAPK niezbędnych do rozwoju sklerocjów, występujeprzy niskim ph powstałym w wyniku akumulacji kwasu szczawiowego (Chen i in. 2004). Kwas szczawiowy może być pośrednio toksyczny dla rośliny (Noyes i Hancock 1981) ponieważ jego wytwarzanie i aktywność endopoligalakturonazy S. sclerotiorum reguluje się przez ph (Rollins i Dickman 2001). Niskie ph środowiska może osłabić rośliny i uczynić je bardziej podatnymi na późniejszy wzrost grzybów. Na podstawie badań in vitro na pożywkach stwierdzono, że odczyn środowiska wpływa znacząco na produkcję kwasu szczawiowego (Maxwell i Lumsden 1970, Rollins i Dickman 2001). Środowisko alkaliczne sprzyja biosyntezie kwasu szczawiowego. Natomiast nagromadzenie się kwasu i znaczne obniżenie ph przyczynia się do ograniczenia wytwarzania kwasu szczawiowego przez S. sclerotiorum (Rollins i Dickman 2001). Na rolę jaką odgrywa kwas szczawiowy w patogenezie wskazuje fakt, że uzyskane mutanty S. sclerotiorum pozbawiane zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego przy pełnej aktywności enzymów degradujących ścianę komórkową nie są patogeniczne. Dopiero po odzyskaniu zdolności do wytwarzania tej substancji stają się ponownie patogeniczne (Godoy i in. 1990). 12

16 Polimorfizm DNA S. sclerotiorum oceniany przy wykorzystaniu technik RAPD i SSR Bardzo ważnym aspektem badań nad patogenami jest ich dokładna charakterystyka. Oprócz tradycyjnych metod, polegających na ocenie objawów choroby na roślinach oraz hodowli patogenów w laboratorium, wykorzystuje się analizy molekularne dzięki którym można wykryć polimorfizm między badanymi izolatami na poziomie DNA lub RNA. Metody te są znacznie dokładniejsze, szybsze, a także charakteryzuje je wysoka specyficzność i możliwość wykazania zmienności w obrębie gatunku patogena (Parker i in. 1998; Lucas 2004). W diagnostyce patogenów markery molekularne wykorzystywane są do rozpoznania ich odporności, jak również do badań struktury populacji dzięki czemu istnieje możliwość kontrolowania występowania choroby oraz zastosowania właściwych zabiegów ochrony roślin (Rouxel i in. 2003; Sosnowski i in. 2001; Palmer i Skinner 2002). O polimorfizmie mówi się, gdy w obrębie populacji występują dwa lub więcej alleli w danym locus. Zakłada się, że częstotliwość zmian w sekwencji nukleotydów powyżej 1% jest rezultatem polimorfizmu (Słomski i in. 2004). Obecnie istnieje wiele technik molekularnych badających zróżnicowanie genetyczne w obrębie analizowanych populacji. W przypadku patogena S. sclerotiorum najczęściej stosowanymi metodami jest: polimorfizm losowo amplifikowanych fragmentów DNA (RAPD ang. Random Amplified Polymorphic DNA) oraz mikrosatelitarny polimorfizm DNA (SSR ang. Simple Sequence Repeats). Analiza metodą RAPD, w której wykorzystuje się 10-nukleotydowe pojedyncze startery jest stosunkowo łatwa i szybka. Jako wynik, dla poszczególnego startera otrzymuje się unikatowe zestawy prążków (amplikonów), dzięki którym istnieje możliwość stwierdzenia różnic między obiektami (Matuszczak 2013). Stosowanie markerów RAPD w badaniach nad S. sclerotiorum pozwala na wykazanie różnic między izolatami w badanych populacjach grzyba, lecz nie zawsze związane są one z cechami świadczącymi o patogeniczności S. sclerotiorum. Mikrosatelitarne DNA, czyli krótkie tandemowe powtórzenia, występują niemal u wszystkich organizmów bezjądrowych (Prokaryota) i jądrowych (Eukaryota). Stwierdzono, że w przypadku grzybów najczęściej powtarzanym motywem jest adenina i tymina (AT) (Tóth i in. 2000). Ponadto uważa się, że 0,08 0,67% części genomu grzybów stanowią krótkie powtórzenia DNA (Karaoglu i in. 2004). Przy projektowaniu 13

17 starterów mikrosatelitarnych trudność stanowi odkrycie lokalizacji tandemowych powtórzeń w badanym obiekcie (Matuszczak 2013). Dla S. sclerotiorum markery mikrosatelitarne zostały zaprojektowane przez Sirjusingh i Kohn (2001) oraz Mert-Türk i in. (2007). Wykorzystywanie starterów mikrosatelitarnych przy badaniu polimorfizmu S. sclerotiorum pozwala wyodrębnić wiele grup haplotypów, natomiast nie zawsze udaje się odnaleźć ich związek z cechami fenotypowymi grzyba Ochrona roślin przed zgnilizną twardzikową Najczęstszym sposobem ochrony rzepaku przed zgnilizną twardzikową jest stosowanie fungicydów w okresie od początku jego kwitnienia do momentu opadania pierwszych płatków kwiatowych. Skuteczne są między innymi te fungicydy, które zawierają azoksystrobinę, cyprokonazol, czy difenokonazol (Korbas i in. 2015). W niektórych krajach istnieją modele prognozujące występowanie S. sclerotiorum, które wyznaczają optymalny termin chemicznej ochrony, ograniczając jednocześnie użycie fungicydów. Między innymi taki program opracowano w Niemczech o nazwie ScleroPro (Koch i in. 2007a, 2007b). Ograniczenie występowania choroby można uzyskać także poprzez stosowanie kwalifikowanego materiału siewnego pozbawionego sklerocjów S. sclerotiorum. Bardzo ważne jest również przestrzeganie zmianowania i zwalczanie chwastów, które często są porażane przez tego patogena. Zaobserwowano, że występowanie sklerocjów i tworzących się na nich apotecjów jest mniejsze na polach gdzie w zmianowaniu uwzględnia się kukurydzę, czy pszenicę ozimą (Gracia-Garza i in. 2002). Uprawa w kolejnych latach roślin żywicielskich (na przykład rzepaku) przyczynia się do zwiększania liczby sklerocjów w glebie (Williams i Stelfox 1980). Innym sposobem ograniczania występowania zgnilizny twardzikowej jest głęboka orka, która zmniejsza liczbę sklerocjów w wierzchniej warstwie gleby, z których później wyrastają apotecja (Abawi i Grogan 1975; Williams i Stelfox 1980). Niestety biorąc pod uwagę długość życia sklerocjów w ziemi oraz fakt, że między innymi pozostają one żywe na głębokości 17,5 cm (Abawi i Grogan 1975), w kolejnych latach z głęboką uprawą mogą z powrotem znaleźć się na powierzchni lub tuż pod powierzchnią gleby, a tym samym zwiększyć ilość inokulum porażającego rośliny (Partyka i Mai 1962). W związku z ograniczaniem używania chemicznych środków ochrony roślin poszukuje się naturalnych antagonistów sprawcy zgnilizny twardzikowej. Istnieje kilka 14

18 antagonistycznych mikroorganizmów (grzyby, bakterie, drożdże, glony) obniżających patogeniczną aktywność S. sclerotiorum. Hamowanie rozwoju patogena przez naturalnych wrogów może zachodzić na różne sposoby, tj. pasożytnictwo, drapieżnictwo, konkurencję o składniki odżywcze i przestrzeń, oraz wytwarzanie toksycznych i hamujących jego rozwój metabolitów. Uważa się, że wyizolowany z gleby grzyb Coniothyrium minitans jest najskuteczniejszym antagonistą tego patogena (Chen i in. 2007; Zeng i in. 2014). Zmniejszenie objawów choroby występuje na skutek nadpasożytnictwa przede wszystkim wobec sklerocjów patogena. Stwierdzono również, że C. minitans przyczynia się do detoksykacji kwasu szczawiowego wytwarzanego prze S. sclerotiorum (Zeng i in. 2014). Innym skutecznym naturalnym wrogiem S. sclerotiorum jest bakteria Pseudomonas chloraphis, a dokładnie jej szczep PA23. Bakteria ta wytwarza organiczne lotne substancje (nonal, benzothiozol, 2-etyl-1-hexanol) oraz antybiotyki: phenazin, pyrrolnitrin, które posiadają zdolność do hamowania wzrostu grzybni i wytwarzania zarodników workowych sprawcy zgnilizny twardzikowej (Fernando i in. 2007). Istotną rolę w ograniczaniu porażania roślin rzepaku przez S. sclerotiorum odgrywa uprawa odmian o znacznym stopniu odporności. Niestety do tej pory nie udało się wyhodować odmiany rzepaku całkowicie odpornego na tego patogena, ale badania zmierzające do osiągnięcia tego celu są cały czas podejmowane w różnych ośrodkach badawczych (Chen i in. 2007; Starzycka i in. 2009; Delourme i in. 2011; Ding i in. 2013; Uloth i in. 2013; Mei i in. 2013; Uloth i in. 2014; Taylor i in. 2015). 15

19 2. Cel pracy Rzepak jest ważną rośliną uprawną w Polsce zajmuje około 900 tysięcy hektarów. Coroczne występowanie zgnilizny twardzikowej (S. sclerotiorum) ma negatywne znaczenie ekonomiczne, przyczyniając się do znacznych strat w plonie na plantacjach rzepaku ozimego. Dlatego istotne jest podjęcie badań nad tym patogenem oraz poszukiwanie genotypów wysoce tolerancyjnych lub odpornych na S. sclerotiorum. Celem pracy była charakterystyka populacji S. sclerotiorum występujących na terenie Polski, na przykładzie trzech miejscowości o zróżnicowanych warunkach agroklimatycznych, to jest w Borowie (52.12N, 16.79E) w województwie wielkopolskim, Małyszynie (52.74N, 15.17E) w województwie lubuskim i Bąkowie (50.96N, 18.31E) w województwie opolskim oraz ocena odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego na tego patogena. Populację S. sclerotiorum scharakteryzowano na poziomie fenotypowym oceniając ilość wytwarzanego kwasu szczawiowego przez badane izolaty patogena oraz na poziomie molekularnym badając zmienność genetyczną wybranych izolatów metodami RAPD i SSR. 16

20 3. Materiały i metody 3.1. Materiały Obiektami badań były populacje patogenicznego grzyba S. sclerotiorum zebrane w latach , w trzech miejscowościach: Małyszynie (województwo lubuskie), Borowie (województwo wielkopolskie) i Bąkowie (województwo opolskie) oraz wybrane odmiany rzepaku ozimego badane w doświadczeniu polowym prowadzonym w Małyszynie (Ryc. 2). Poza charakteryzowaniem izolatów S. sclerotiorum do oceny odporności wybranych odmian rzepaku ozimego na S. sclerotiorum użyto siedem izolatów tego patogena (sześć z 2009 roku i jeden z 1998 roku (Starzycka i in., 1998). Ryc. 2. Lokalizacja pól doświadczanych rzepaku ozimego Kolekcja izolatów S. sclerotiorum z lat Każdego roku w okresie przedżniwnym pobierano z pól doświadczalnych i produkcyjnych Małyszyna, Borowa i Bąkowa łodygi rzepaku ozimego z objawami zgnilizny twardzikowej. Ze sklerocjów znajdujących się w zainfekowanych łodygach roślin izolowano kultury S. sclerotiorum. Najwięcej izolatów (94) zebrano w Małyszynie, a najmniej (59) w Borowie (Tab. 1.). 17

21 Tab.1. Pochodzenie i liczebność zebranych izolatów S. sclerotiorum Rok Lokalizacja Symbol Liczba izolatów Małyszyn MAL/ Borowo BOR/ Bąków BAK/ Małyszyn MAL/13 21 Borowo BOR/ Bąków BAK/ Małyszyn MAL/14 37 Borowo BOR/ Bąków BAK/14 32 Małyszyn MAL 94 Razem Borowo BOR Bąków BAK Pochodzenie i charakterystyka izolatów S. sclerotiorum wykorzystywanych do oceny stopnia odporności wybranych odmian rzepaku ozimego Zgromadzona w 2009 populacja S. sclerotiorum roku została wstępnie scharakteryzowana pod kątem wytwarzania kwasu szczawiowego. Następnie wytypowano sześć patogenicznych izolatów grzyba (po jednym izolacie o słabej i jednym izolacie o silnej patogeniczności z każdej z trzech miejscowości): 01MAL/09 i 31MAL/09 (z Małyszyna), 04BOR/09 i 24BOR/09 (z Borowa), 05BAK/09 i 24BAK/09 (z Bąkowa), które poddano analizie sekwencjonowania w celu potwierdzenia przynależności gatunkowej (zał. 1). Do wymienionych sześciu izolatów dołączono izolat S.s.-3 S. sclerotiorum, pochodzący z Poznania, wykorzystywany od 1998 roku do testów odpornościowych linii i odmian rzepaku ozimego, o oznaczonym wcześniej poziomie wytwarzania kwasu szczawiowego i zsekwencjonowanym fragmencie ITS. Ogółem siedem izolatów patogena wykorzystano do oceny stopnia odporności wybranych odmian rzepaku ozimego (Tab. 2). 18

22 Tab. 2. Charakterystyka izolatów S. sclerotiorum użytych do oceny stopnia odporności wybranych odmian rzepaku ozimego L.p. Izolat Średnia średnica przebarwień powstających pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego [mm] Procentowa zgodność DNA izolatu do wzorca z Banku Genów na podstawie sekwencjonowania ITS1 i ITS2 1 01MAL/09 15, MAL/09 45, BOR/09 46, BOR/09 16, BAK/09 49, BAK/09 23, S.s.-3 31, Odmiany rzepaku ozimego oceniane pod względem stopnia odporności na S. sclerotiorum Stopień odporności na S. sclerotiorum oceniano na dziesięciu odmianach rzepaku ozimego o dużym zasięgu uprawy w okresie prowadzonych badań (Tab. 3). Wybrano pięć odmian populacyjnych: Bogart, Californium, Bojan, Adriana i Cabriolet, cztery odmiany heterozyjne F1: Poznaniak, DK Example, Gladius i Vectra oraz jedną odmianę otrzymaną z linii podwojonych haploidów (DH) Monolit. Wszystkie odmiany według autorów i badań Centralnego Ośrodka Badań Odmian Roślin Uprawnych (COBORU) odznaczają się średnim stopniem odporności na tego patogena. Tab.3. Charakterystyka odmian rzepaku ozimego wybranych do badań Typy odmian populacyjna Odmiany rzepaku ozimego Firma Rok wpisu do Rejestru Odmian Stopień odporności na S. sclerotiorum wg COBORU Adriana Limagrain Europe % Bogart HR Strzelce % Bojan HR Strzelce % Cabriolet Monsanto % Californium Monsanto % DK Example Monsanto % Heterozyjna F1 Gladius Syngenta % Poznaniak HR Strzelce % Vectra Bayer Crop Science % linia DH Monolit HR Strzelce % 19

23 3.2 Metody Charakterystyka wybranych populacji S. sclerotiorum W latach w warunkach aseptycznych, w laboratorium przenoszono sklerocja z wnętrza łodyg zainfekowanych roślin na płytki Petriego o średnicy 90 mm z pożywką PDA (Potato Dextrose Agar) Fluka. Inkubację kolonii wyrastających ze sklerocjów patogena prowadzono w klimatyzowanym pomieszczeniu o temperaturze 18ºC. Z kolonii patogena wolnych od zanieczyszczeń, w warunkach aseptycznych przenoszono fragmenty grzybni na świeżą pożywkę PDA. Dziesięciodniowe kultury poszczególnych izolatów patogena znajdujące się na płytkach Petriego (szczelnie zamknięte przy pomocy folii Parafilm) utrzymywano w chłodziarce o temperaturze 4ºC Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum z lat W poszczególnych latach po wyizolowaniu czystych kultur S. sclerotiorum oceniano ich zdolność do wytwarzania kwasu szczawiowego. Na przygotowane wcześniej płytki Petriego o średnicy 90 mm z pożywką PDA z dodatkiem indykatora kwasowości (zieleni bromokrezolowej w ilości 100 mg/1 litr pożywki) w warunkach aseptycznych przenoszono fragment pożywki o średnicy około 5 mm z grzybnią dziesięciodniowej kolonii patogena. Inkubację kultur prowadzono w klimatyzowanym pomieszczeniu przy temperaturze 18ºC z dostępem światła. Po 48 godzinach od założenia doświadczenia w czterech powtórzeniach mierzono średnicę przebarwień powstałych w wyniku wytwarzania kwasu szczawiowego przez rozrastające się strzępki grzyba S. sclerotiorum. Otrzymane wyniki opracowano i uszeregowano za pomocą testu Duncana Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez siedem izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego W latach corocznie po wykonaniu oceny odporności odmian rzepaku na siedem izolatów S. sclerotiorum wykonywano ich izolacje z miejsca na pograniczu zdrowej i porażonej uprzednio zainokulowanej łodygi rzepaku. Po kilkukrotnym pasażowaniu fragment pożywki o średnicy około 5 mm z grzybnią dziesięciodniowej kolonii poszczególnych izolatów patogena przenoszono na pożywkę PDA z dodatkiem 20

24 zieleni bromokrezolowej. Inkubację kultur prowadzono w klimatyzowanym pomieszczeniu przy temperaturze 18ºC z dostępem światła. Po 48 godzinach od założenia doświadczenia w sześciu powtórzeniach mierzono średnicę przebarwień powstałych w wyniku wytwarzania kwasu szczawiowego przez rozrastające się strzępki grzyba S. sclerotiorum. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie przy pomocy jednoczynnikowej analizy wariancji Zależność między wielkością kolonii izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego Izolaty S. sclerotiorum uzyskane w 2014 roku posłużyły do badań zależności między wielkością kolonii izolatów patogena i powstającymi przebarwieniami pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego na pożywce z indykatorem kwasowości. Po 48 godzinach prowadzenia hodowli izolatów na pożywce PDA z zielenią bromokrezolową, mierzono średnice kolonii S. sclerotiorum oraz średnice powstałych przebarwień. Otrzymane wartości posłużyły do oceny korelacji między tymi cechami przy użyciu programu STATISTICA Analizy molekularne wybranych izolatów S. sclerotiorum Do oceny zmienności genetycznej izolatów S. sclerotiorum wykorzystano analizę RAPD (ang.: Random Amplified Polymorphic DNA) (Welsh J. i McClelland M. 1990; Williams i in. 1990) oraz analizę z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych SSR (ang.: Simple Sequence Repeat) (Litty i Luty 1989; Akkaya i in. 1992; Atallah i in. 2004). Badania polimorfizmu obejmowały: izolację genomowego DNA izolatów S. sclerotiorum, przeprowadzenie PCR (ang.: Polimerase Chain Reaction) ze starterami RAPD i rozdział produktów przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym, a także PCR ze starterami SSR i rozdział produktów za pomocą sekwenatora. DNA S. sclerotiorum izolowano przy pomocy Dneasy Plant Mini Kit (firmy Qiagen). Z grzybni kultur poszczególnych izolatów patogena rosnących w temperaturze pokojowej na płytkach Petriego o średnicy 60 mm z płynną pożywką glukozowoziemniaczaną (PD: wywar z 200 g bulw ziemniaka i 20 g glukozy / 1l wody destylowanej). Z siedmiodniowych kultur pożywkę odsączano na bibule i około 25 mg 21

25 grzybni przenoszono do probówek typu Eppendorf (1,5 ml), które następnie zamrażano w temperaturze -22 C. W celu rozdrobnienia zamrożonej grzybni dodawano 150 mg sterylnych szklanych kuleczek i 450 µl buforu AP1 z zestawu Dneasy Plant Mini Kit. Po dokładnym roztarciu ścian i błon komórkowych dodawano 4 µl RNazy A, natychmiast mieszano i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 65 C wykorzystując termomikser (Eppendorf). W kolejnym etapie dodawano buforu AP2, mieszano i umieszczano na lodzie tak, aby doszło do wytrącenia białek, polisacharydów i detergentów. Po 5 minutach inkubacji na lodzie wirowano mieszaninę przez 2 minuty w wirówce z prędkością x g. Po wirowaniu na kolumienkę QIAshredder Mini Spin Column, przenoszono 580 µl supernatantu. Kolumienki te służyły do usunięcia resztek wytrąconych zanieczyszczeń. Ponownie wirowano przez 2 minuty z prędkością x g. Następnie 450 µl frakcji płynnej spod kolumienki przenoszono do probówki Eppendorf (1,5 ml), a w dalszej kolejności dodawano 675 µl buforu AP3, mieszano i wirowano przez kilka sekund. W dalszym etapie wykorzystywano kolumienki DNeasy Mini Spin Column z membraną wiążącą selektywne DNA. Część powstałego lizatu (600 µl) przenoszono na kolumienki i wirowano przez 1 minutę z prędkością 4400 x g. Przefiltrowaną frakcję płynną spod kolumienek zlewano do pojemnika z wodą, a kolumienki wykorzystywano powtórnie, przenosząc resztę lizatu i wirując z zastosowaniem tych samych parametrów. Następnie kolumienki przenoszono na probówki o pojemności 2 ml znajdujące się w zestawie mini kitu. Do kolumienek dodawano 450 µl buforu AW i wirowano 4 minuty z prędkością x g, zlewano frakcję płynną spod kolumienki i powtarzano czynność dodając tą samą ilość buforu AW i wirując z zastosowaniem tych samych parametrów. Kolumienki przenoszono do wcześniej przygotowanych probówek Eppendorf (1,5 ml) z odciętymi wieczkami i na membranę nanoszono 60 µl buforu AE. W dalszym etapie po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej wirowano próby z prędkością 1100 x g. Ponownie do kolumienek dodawano 60 µl buforu AE podgrzanego do 65 C i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie probówki wirowano 1 minutę z prędkością 1100 x g oraz 1 minutę z prędkością 4400 x g. Powstały eluat zawierający DNA izolatów S. sclerotiorum przenoszono spod kolumienki do probówek o pojemności 0,5 ml i przechowywano w temperaturze 4 C. Wyizolowane DNA posłużyło do analiz, zarówno RAPD, jak i z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych. 22

26 Analizy z wykorzystaniem markerów RAPD Do analizy RAPD wykorzystano 12 starterów firmy Operon (Tab.4). Tab. 4. Startery użyte do reakcji RAPD L.p. Nazwa startera Sekwencja startera OPR-01 TGCGGGTCCT 2 OPR-02 CACAGCTGCC 3 OPR-03 ACACAGAGGG 4 OPR-04 CCCGTAGCAC 5 OPS-01 CTACTGCGCT 6 OPO-02 ACGTAGCGTC 7 OPO-04 AAGTCCGCTC 8 OPO-05 CCCAGTCACT 9 OPP-01 GTAGCACTCC 10 OPP-02 TCGGCACGCA 11 OPP-03 CTGATACGCC 12 OPP-04 GTGTCTCAGG Mieszanina reakcyjna, której całkowita objętość wynosiła 12,5 µl zawierała: H2O (6,9625 µl) bufor (Thermo Scientific) (1,25 µl), MgCl2 (Thermo Scientific) (0,95 µl; końcowe stężenie: 1,9mM), dntp (Thermo Scientific) (0,1875 µl; końcowe stężenie każdego z deoksynukleotydów: 150 µm), starter (Operon) (0,25 µl; końcowe stężenie: 0,2 µm), Taq polimeraza (Thermo Scientific) (0,4 µl; końcowe stężenie: 0,4 jednostek na reakcję), DNA (2,5 µl). PCR przeprowadzano w termocyklerze firmy Eppendorf. Reakcję rozpoczynano wstępną denaturacją (30 sek., 95 C), a w dalszej kolejności prowadzono 45 cykli, które obejmowały: denaturację 30 sek., 95 C; hybrydyzację 1 min., 35 C; polimeryzację 2,5 min., 72 C. Reakcję zakończono dodatkowym etapem polimeryzacji trwającym 5 min. w temperaturze 72 C. Powstałe produkty rozdzielano przy pomocy elektroforezy w 1,8% 23

27 żelu agarozowym. Elektroforezę wykonano w buforze TBE (Tris-kwas borowy-edta) zawierającym 10,8 g/l TrisHCl, 5,5 g/l kwasu borowego i 40 µl 0,5 mm EDTA ph 8,0. Do ich wybarwiania wykorzystano bromek etydyny. Jako wzorzec wielkości zastosowano DNA faga Lambda (Lambda DNA/EcoRI+HindIII, Thermo Scientific). Obrazy rozdzielonych produktów obserwowano i fotografowano w świetle UV za pomocą zestawu do dokumentacji żeli elektroforetycznych Quantum ST (Vilber Lurmat) (Załącznik 2, ryciny 12-23). Otrzymane dane dotyczące polimorfizmu produktów amplifikacji za pomocą metody RAPD posłużyły do analiz statystycznych: podobieństw izolatów S. sclerotiorum zgromadzonych w latach i siedmiu izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego; wariancji molekularnej izolatów S. sclerotiorum zgromadzonych w latach z trzech miejscowości Analizy z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych SSR Do analizy z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych wykorzystano 8 par starterów (Applied Biosystem) połączonych w dwa multipleksy (Atallah i in., 2004). Startery przednie (ang.: forward, F) znakowano odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi: 6FAM (niebieski), VIC (zielony), NED (żółty) i PET (czerwony), natomiast startery wsteczne (ang. reverse, R) nie były znakowane (Tab. 5). Analizie tej poddano izolaty S. sclerotiorum z 2014 roku i izolaty wybrane do oceny stopnia odporności odmian rzepaku ozimego. 24

28 Tab. 5. Pary starterów mikrosatelitarnych wykorzystanych do charakterystyki wybranych populacji S. sclerotiorum Multipleks Sekwencje starterów F i R (5 3 ) Powtarzający się motyw Liczba par zasad 1 F: 6FAM-TCATAGTGAGTGCATGATGCC R: CAGGGATGACTTTGGAATGG F: VIC-GCTCCTGTATACCATGTCTTG R: GGACTTTCGGACATGATGAT F: NED-TCGCCTCAGAAGAATGTGC R: AGCGGGTTACAAGGAGATGG F: PET-TGCATCTCGATGCTTGAATC R: CCTGCAGGGAGAAACATCAC 2 F: 6FAM-GTAACACCGAAATGACGGC R: GATCACATGTTTATCCCTGGC F: VIC-TTTGCGTATTATGGTGGGC R: ATGGCGCAACTCTCAATAGG F: NED-CCTGATATCGTTGAGGTCG R: ATTTCCCCTCACTTGCTCC F: PET-TCTACCCAAGCTTCAGTATTCC R: GAACTGGTTAATTGTCTCGG (TTA) (AGAT) 14(AAGC) (CT) (CATA) (GT) (GA) (GT) (GTGGT) PCR z wymienionymi w tabeli 5 starterami przeprowadzono wykorzystując Typeit Microsatellite PCR KIT firmy Qiagen. Znajdujący się w zestawie Type-it Multiplex PCR Master Mix zawierał: polimerazę Taq, MgCl2, dntp oraz bufor. Każda próba reakcyjna (6 μl) składała się z: 3 μl Type-it Multiplex PCR Master Mix; 0,48 μl mieszaniny 0,2 μm starterów (po 0,06 μl każdego startera F i R z danego multipleksu); 1,52 μl wody; 1 μl DNA S. sclerotiorum. Termocykler (Applied Biosystems, model 2720) zaprogramowano następująco: Wstępna denaturacja 5 min., 95ºC 30 cykli, które obejmowały: o denaturację 30 sek., 95 ºC o hybrydyzację 1 min. 30 sek., 50 ºC o polimeryzację 30 sek., 72 ºC Kończąca polimeryzacja 30 min., 65 ºC Amplifikowane fragmenty PCR z loci mikrosatelitów rozcieńczano dwudziestosześciokrotnie, a następnie rozdzielano metodą elektroforezy kapilarnej wykorzystując sekwenator - Applied Biosystems, Genetic Analyser 3130xl z kapilarami o długości 36 cm i ze standardem wielkości Gene Scan 600 LIZ. 25

29 W celu odczytywania i opracowania wyników korzystano z programu Peak Skanner Software v1.0 firmy Applied Biosystems. Uzyskane dane posłużyły do : analizy podobieństwa izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i izolatów wybranych do oceny stopnia odporności odmian rzepaku ozimego; wariancji molekularnej na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji przy użyciu markerów mikrosatelitarnych izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i izolatów wybranych do oceny stopnia odporności odmian rzepaku ozimego. Badania molekularne z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych przeprowadzono na Wydziale Biologii (Wydziałowa Pracownia Technik Biologii Molekularnej) Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu Charakterystyka odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Doświadczenia polowe z wybranymi typami odmian rzepaku ozimego zakładano w kolejnych trzech sezonach wegetacyjnych począwszy od sezonu 2011/2012, na polach uprawnych należących do Spółki Hodowli Roślin Strzelce Grupa IHAR Oddziału w Małyszynie. Odmiany rzepaku wysiewano w czterech powtórzeniach na poletkach doświadczalnych o powierzchni 1,2 m Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w trzech kolejnych latach W celu zbadania poziomu odporności wybranych typów odmian rzepaku ozimego zakażano rośliny wcześniej przygotowanym inokulum, które stanowiły wysterylizowane w autoklawie ziarniaki żyta umieszczone na płytkach Petriego, a następnie zaszczepione fragmentami grzybni wybranego do inokulacji izolatu S. sclerotiorum. W fazie opadania pierwszych płatków kwiatowych rzepaku zakażano odpowiednim izolatem S. sclerotiorum po 10 roślin (powtórzeń) każdej z 10 odmian. Przerośnięty grzybnią ziarniak żyta umieszczano w połowie wysokości łodyg roślin i owijano je w tym miejscu folią aluminiową. Inokulację w 2012 roku przeprowadzono 10 maja, w 2013 roku 16 maja, a w 2014 roku 6 maja. Po trzech tygodniach od inokulacji oceniano stopień porażenia zakażonych roślin rzepaku w trójstopniowej skali: 0 brak porażenia (Fot. 1); 1 średnie porażenie (plama 26

30 infekcyjna nie obejmuje całego obwodu łodygi) Fot. 2; 2 silne porażenie (rozległa plama infekcyjna obejmująca cały obwód łodygi) Fot. 3. Fot. 1. Brak porażenia po inokulacji S. sclerotiorum Fot. 2. Porażenie po inokulacji S. sclerotiorum w stopniu 1 Fot. 3. Porażenie po inokulacji S. sclerotiorum w stopniu 2 Uzyskane dane posłużyły do obliczeń indeksów porażenia (IP), przy użyciu wzoru Townsenda-Heubergera (1943): = n v IP 100 V N IP Indeks porażenia n liczba roślin w poszczególnych stopniach porażenia v stopień porażenia V najwyższy stopień porażenia N całkowita liczba badanych obiektów Porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec dziesięciu odmian rzepaku ozimego Po ocenie stopnia porażenia roślin przez izolaty: 01MAL, 31MAL, 04BOR, 24BOR, 05BAK, 24BAK, S.s.-3, zbierano wszystkie wcześniej inokulowane przez S. sclerotiorum łodygi i podsuszano je w temperaturze pokojowej. Po dwóch tygodniach z miejsca zakażenia znajdującego się pod paskiem z folii aluminiowej, przy pomocy sterylnego skalpela, odcinano 15 fragmentów porażonej tkanki i umieszczano na płytkach Petriego z pożywką PDA. Po czterech dniach wzrostu grzybni pasażowano izolaty w celu pozbycia się wszelkich zanieczyszczeń. Po kilkukrotnym pasażowaniu przenoszono fragment kolonii każdego izolatu (w siedmiu powtórzeniach) na płytki Petriego z pożywką PDA i dodatkiem indykatora 27

31 kwasowości zieleni bromokrezolowej. Po 48 godzinach od założenia doświadczenia mierzono średnice przebarwień powstałych w wyniku wytwarzania kwasu szczawiowego przez rozrastającą się grzybnię S. sclerotiorum. Otrzymane wyniki zostały opracowane przy pomocy programu STATISTICA 9, wykorzystując analizę korelacji porównano średnice przebarwień ze średnim indeksem porażenia rzepaku ozimego przez dany izolat Obliczenia statystyczne Współczynnik korelacji Do oceny zależności między wielkością kolonii izolatów S. sclerotiorum pochodzących z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytworzonego kwasu szczawiowego, a także w badaniach zależności zdolności wytwarzania kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum i ich chorobotwórczości wobec wybranych odmian rzepaku ozimego zastosowano współczynnik korelacji Pearsona (r), który określa poziom zależności liniowej między dwoma badanymi cechami (zmiennymi losowymi). Współczynnik korelacji Pearsona przyjmuje wartość z przedziału [-1, 1]. W przypadku tzw. ujemnej korelacji wraz ze wzrostem (spadkiem) wartości jednej cechy maleje (rośnie) wartość drugiej cechy. Natomiast, gdy korelacja jest dodatnia to wzrost/spadek wartości jednej cechy wpływa na wzrost/spadek drugiej cechy (Kala 1997). Wartość bezwzględna współczynnika r oznacza siłę korelacji między zmiennymi. Przy interpretacji jego wielkości wykorzystano klasyfikację wg J. Guilford'a (1964): r = 0 - brak korelacji 0,0 < r 0,1 - korelacja nikła 0,1 < r 0,3 - korelacja słaba 0,3 < r 0,5 - korelacja przeciętna 0,5 < r 0,7 - korelacja wysoka 0,7 < r 0,9 - korelacja bardzo wysoka 0,9 < r < 1,0 - korelacja niemal pełna r = 1 - korelacja pełna. 28

32 Jednoczynnikowa i dwuczynnikowa analiza wariancji oraz test Duncana Otrzymane wyniki w badaniach wytwarzania kwasu szczawiowego przez 7 izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego, opracowano przy pomocy jednoczynnikowej analizy wariancji. Przy opracowaniu wyników wytwarzania kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum z lat wykorzystano dwuczynnikową analizę wariancji. W celu zbadania, między którymi grupami występują istotne różnice wykonano test post-hoc test Duncana. Do obliczeń analizy wariancji jednoczynnikowej wykorzystano program Excel 2007, natomiast do obliczeń dwuczynnikowej analizy wariancji i testu Duncana program MStat ( Domański 1990) Analiza skupień na podstawie podobieństwa Nei i Li Analiza skupień na podstawie podobieństw Nei i Li (1979) służy do określania częstości występowania genów lub fragmentów DNA. Uzyskane wyniki po analizie izolatów S. sclerotiorum metodą RAPD i SSR przepisano w systemie zero-jedynkowym. Dane w postaci binarnej pozwalają wyznaczyć miarę podobieństw w oparciu o tabelę krzyżową rozkładu częstości występowania zer ijedynek w obrębie badanych genotypów (Mańkowski i in. 2011). W pracy wykorzystano miarę Nei i Li, która szacuje podobieństwo genetyczne (SI similarity index) między parami wszystkich obiektów. SI = 2N xy N x +N y Nxy liczba prążków wspólnych dla genotypów X i Y Nx liczba prążków występujących w genotypie X Ny liczba prążków występujących w genotypie Y Otrzymane indeksy podobieństw posłużyły do hierarchicznej analizy skupień, tworząc tzw. drzewa binarne (dendrogramy). Gdy połączenia między genotypami lub skupieniami są bliższe początku wykresu to genotypy tworzące dane skupienie są mniej zróżnicowane między sobą (Mańkowski i in. 2011). 29

33 Do przeprowadzenia obliczeń miary podobieństw wg Nei i Li oraz tworzenia dendrogramów wykorzystano program GenStat v Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) Na podstawie markerów RAPD wszystkich badanych populacji S. sclerotiorum w latach i markerów SSR populacji patogena z 2014 roku wykonano analizę wariancji molekularnej (AMOVA). Analiza ta określa procent zmienności genetycznej na poszczególnych poziomach hierarchii. Zróżnicowanie obliczono między populacjami patogena z danych miejscowości (Borowo, Małyszyn, Bąków) oraz wewnątrz populacji S. sclerotiorum z danej miejscowości. 30

34 4. Dane meteorologiczne Dane meteorologiczne: temperaturę i sumę opadów uzyskano ze stacji meteorologicznych zlokalizowanych w Małyszynie, Borowie i Bąkowie. Na rycinie 3 przedstawiono warunki pogodowe w poszczególnych miejscowościach podczas prowadzenia badań polowych w sezonach wegetacyjnych od sierpnia 2011 r. do lipca 2014 r. W Małyszynie, gdzie oprócz poszukiwania izolatów S. sclerotiorum prowadzono doświadczenie polowe, najcieplejsze sezony wegetacyjne były w latach 2011/2012 ze średnią temperaturą 10,84 C oraz 2013/2014 ze średnią temperaturą 10,33 C. Sezon 2012/2013 ze względu na ujemne wartości średnich temperatur miesięcznych w grudniu 2012 oraz styczniu i marcu 2013 r., charakteryzował się niższą średnią temperaturą, która wynosiła 8,67 C. Kwiecień 2013 był chłodny, ze średnią miesięczną temperaturą 8 C. Utrzymujące się niskie temperatury w tym roku opóźniły kwitnienie rzepaku i równocześnie termin inokulacji, co mogło mieć wpływ na końcowy wynik indeksów porażenia. Średnia temperatura w miesiącu maju, w okresie kiedy inokulowano rośliny rzepaku, kształtowała się na podobnym poziomie we wszystkich trzech sezonach wegetacyjnych, tj.: w maju 2012 r. wyniosła 14,6 C, w maju 2013 r. 14,3 ºC oraz w maju 2014 r. 13,1 C. Najniższą średnią miesięczną temperaturę odnotowano w lutym 2012 r. (-3,2 C), natomiast najwyższą w lipcu 2014 r. (20ºC). Największą sumę opadów w Małyszynie odnotowano w sezonie wegetacyjnym 2012/2013, która wyniosła 640,6 mm. Pozostałe sezony odznaczały się mniejszą ilością opadów: 2011/ ,3 mm i 2013/ mm. Największe opady wystąpiły w lipcu i sierpniu W ciągu tych dwóch miesięcy odnotowano 243 mm opadów deszczu. Obfite w opady były również miesiące: maj i czerwiec 2013 (suma dwóch miesięcy 185 mm), a także maj 2014 (100 mm). Bardzo suchym miesiącem był listopad 2011 r. z sumą opadów 2,8 mm. Również miesiące: marzec i grudzień 2012 r. oraz marzec, kwiecień i grudzień 2013 r. charakteryzowały się niską sumą miesięcznych opadów, znacznie odbiegających od średnich wieloletnich z tych miesięcy. W Borowie najcieplejszym sezonem wegetacyjnym był 2013/2014 ze średnią temperaturą 10,68 C. W tym okresie nie odnotowano żadnych ujemnych wartości średnich miesięcznych temperatur. Najzimniejszym sezonem okazał się 2012/2013 (8,42 C). Podobnie, jak w Małyszynie w tym okresie, ujemne średnie miesięczne temperatury utrzymywały się od grudnia 2012 r. do marca 2013 r. Sezon 2011/

35 zakończył się ze średnią temperaturą 9,25 C. W tym czasie najzimniejszym miesiącem okazał się luty, który jako jedyny charakteryzował się ujemną średnią temperaturą miesięczną (-4 C). Najbardziej obfite opady w Borowie były w sezonie 2012/2013 z sumą opadów 429,8 mm. Suma opadów w sezonie 2011/2012 wyniosła 390,6 mm, a w 2013/2014 tylko 296,8 mm. Ostatni sezon badawczy charakteryzował się siedmioma suchymi miesiącami, które znacznie odbiegały od średnich miesięcznych. Najmniej opadów odnotowano od kwietnia do lipca 2014 r. (49,5 mm), a najbardziej suchy był maj (3 mm) i czerwiec (0 mm). Susza również trwała na początku sezonu 2011/2012 od sierpnia do grudnia 2011 r. Największe opady wystąpiły w czerwcu 2012 r. z sumą miesięczną równą 109 mm. Bąków charakteryzował się niższymi średnimi temperaturami niż dwie pozostałe miejscowości. Najcieplejszym sezonem był 2013/2014 ze średnią temperaturą 7,96 C. Dwa wcześniejsze sezony kształtowały się na niższym poziomie: 2011/2012 6,88 C i 2012/2013 6,85 C. Podobnie jak w Małyszynie i Borowie najzimniejszy był okres od grudnia 2012 do marca 2013 r., kiedy odnotowywano średnie ujemne miesięczne temperatury (grudzień -2,5 C, styczeń -3,9 C, luty -1,5 C, marzec -2,7 C). Również początek 2012 roku okazał się mroźny ze średnimi ujemnymi miesięcznymi temperaturami (styczeń -1,4 C, luty -7,7 C), co miało wpływ na niższą średnią temperaturę w sezonie 2011/2012. W związku z bardzo dużymi opadami w rejonie Bąkowa, w maju 2013 r. (115,1 mm) i czerwcu 2013 r. (140 mm), największą sumą opadów charakteryzował się sezon 2012/2013. Duże opady odnotowano również w sezonie 2013/2014 (645,1 mm). W tym okresie najbardziej mokre okazały się miesiące: maj 110,7 mm i lipiec 115,8 mm. Sezon wegetacyjny 2011/2012 charakteryzował się najmniejszą sumą opadów - 509,2 mm. Bardzo suchymi miesiącami w tym okresie były wrzesień 13,2 mm i listopad 0,2 mm. Bardzo małymi opadami odznaczał się również luty 2014 r. z sumą miesięcznych opadów 5,7 mm. Okres siedmiu dni po inokulacji w Małyszynie charakteryzował się umiarkowaną średnią temperaturą na poziomie 14,1 C w 2012 r. i 13,3 C w 2014 r. (Tab. 6). Znacznie cieplejszy był ten okres w roku 2013, kiedy średnia tygodniowa temperatura wyniosła 18,0 C. Chłodny tydzień po inokulacji roślin rzepaku w latach 2012 i 2014 łączył się z większą niż w roku 2013 sumą opadów w tym czasie. W roku 2013, kiedy okres siedmiu 32

36 dni po inokulacji był najcieplejszy, charakteryzował się jednocześnie najmniejszymi opadami na poziomie 5,4 mm. Tab. 6. Warunki meteorologiczne panujące w okresie siedmiu dni od początku opadania płatków kwiatowych roślin rzepaku ozimego w Małyszynie Miejscowość Średnie temperatury o C w latach Suma opadów w mm w latach Liczba dni z opadami w latach Małyszyn ,0 13,3 11,8 5,4 21,0 5,0 2 7,0 33

37 mm ºC VIII IX X XI XII I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII I II III IV V VI VII Suma opadów Małyszyn Suma opadów Borowo Suma opadów Bąków Temperatura Małyszyn Temperatura Borowo Temperatura Bąków -10 Ryc. 3. Warunki meteorologiczne odnotowane w okresie prowadzenia doświadczeń w Małyszynie, Borowie i Bąkowie 34

38 5. Wyniki 5.1. Charakterystyka wybranych populacji S. sclerotiorum Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum z lat W 2012 roku wyizolowano i scharakteryzowano pod względem zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego, a więc agresywności, 57 izolatów S. sclerotiorum pochodzących z trzech miejscowości (Tab.7). Po statystycznej analizie średnic przebarwień stwierdzono występowanie 26 grup jednorodnych. Najbardziej zróżnicowaną pod względem zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego okazały się izolaty S. sclerotiorum pochodzące z Małyszyna. Ich zakres średnic przebarwień wynosił od 16,5 42,5 mm. Znaczne różnice w wytwarzaniu kwasu szczawiowego wyrażone wielkością średnic przebarwień na pożywce (14,0 37,5 mm) stwierdzono również w przypadku izolatów patogena z Bąkowa. Najmniej zróżnicowane pod tym względem były izolaty S. sclerotiorum z Borowa, których zakres przebarwień powstałych na skutek wytwarzania kwasu szczawiowego wynosił 15,0 24,5 mm. Największą zdolnością do wytwarzania kwasu szczawiowego charakteryzował się izolat z Małyszyna: 45 MAL/12. Natomiast najmniejsze ilości kwasu szczawiowego notowano u grupy izolatów: 11BAK/12, 09BAK/12, 07BAK/12, 04BOR/12, 09MAL/12, 08BAK/12, 37MAL/12 i 09BOR/12. 35

39 Tab. 7. Ocena zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego w warunkach in vitro przez izolaty S. sclerotiorum wyizolowane w roku 2012 Izolat Średnica przebarwień [mm] pożywki pod wpływem wytworzonego kwasu szczawiowego Grupy jednorodne 45MAL/12 42,5 40MAL/12 39,5 06BAK/12 37,5 28MAL/12 36,0 41MAL/12 35,0 23MAL/12 35,0 18MAL/12 33,0 15MAL/12 32,5 27MAL/12 32,5 33MAL/12 32,0 19MAL/12 31,0 34MAL/12 30,5 29MAL/12 30,0 11MAL/12 30,0 20MAL/12 29,0 26MAL/12 27,5 14MAL/12 26,5 02BAK/12 26,0 01MAL/12 25,5 02MAL/12 25,0 49MAL/12 25,0 05BAK/12 25,0 06MAL/12 25,0 24MAL/12 25,0 30MAL/12 24,5 03BAK/12 24,5 08BOR/12 24,5 19MAL/12 24,0 07MAL/12 23,0 04MAL/12 22,5 03BOR/12 22,5 10BOR/12 22,5 08MAL/12 22,0 48MAL/12 21,5 12MAL/12 21,5 03MAL/12 21,5 39MAL/12 20,5 04BAK/12 20,5 05MAL/12 20,5 52MAL/12 20,0 01BOR/12 20,0 16MAL/12 20,0 07BOR/12 19,5 10BAK/12 19,0 05BOR/12 18,5 02BOR/12 18,0 06BOR/12 18,0 10MAL/12 17,0 12BAK/12 17,0 09BOR/12 16,5 37MAL/12 16,5 08BAK/12 15,5 09MAL/12 15,5 04BOR/12 15,0 07BAK/12 15,0 09BAK/12 14,5 11BAK/12 14,0 NIR α0,05 2,

40 W roku 2013 wśród 75 izolatów S. sclerotiorum wyodrębniono 27 grup jednorodnych różniących się wielkością przebarwień pożywki spowodowanych wytwarzaniem kwasu szczawiowego (Tab. 8). Izolaty pochodzące z Bąkowa okazały się najbardziej zróżnicowane pod względem wytwarzania kwasu szczawiowego (15,0 45,0). Natomiast wielkości przebarwień pożywki wytwarzanych przez izolaty patogena z dwóch pozostałych miejscowości były mniejsze i wynosiły odpowiednio 20,0 43,5 mm (Małyszyn) i 23,0 45,5 mm (Borowo). Największą zdolnością do wytwarzania kwasu szczawiowego charakteryzowały się izolaty S. sclerotiorum: 08BOR/13, 55BAK/13, 03BOR/13, 20MAl/13, a najmniejszą zdolnością do wytwarzania tego kwasu charakteryzował się izolat 46 BAK/13. Przy czym grupy jednorodne tworzyły nie tylko izolaty z jednej miejscowości, ale pochodzące z różnych miejsc zebrania. Powstanie wielu grup jednorodnych świadczy o dużym zróżnicowaniu izolatów. 37

41 Tab. 8. Ocena zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego w warunkach in vitro przez izolaty S. sclerotiorum wyizolowane w roku 2013 Izolat Średnica przebarwień [mm] pożywki pod wpływem wytworzonego kwasu szczawiowego Grupy jednorodne Izolat Średnica przebarwień [mm] pożywki pod wpływem wytworzonego kwasu szczawiowego Grupy jednorodne 08 BOR/13 45,50 35 BAK/13 30,50 55 BAK/13 45,00 38 BAK/13 30,50 03 BOR/13 44,50 59 BAK/13 30,50 20 MAL/13 43,50 16 MAL/13 30,50 16 BOR/13 43,00 32 BAK/13 30,00 22 BOR/13 43,00 29 MAL/13 30,00 09 BAK/13 42,50 07MAL/13 29,50 19 MAL/13 41,50 11 BOR/13 29,50 49 BAK/13 40,50 60 BAK/13 29,00 28 BOR/13 40,00 29 BAK/13 28,00 18 BAK/13 40,00 20 BOR/13 27,00 53 BAK/13 39,50 04MAL/13 27,00 47 BAK/13 38,00 13 BAK/13 27,00 41 BAK/13 37,50 24 MAL/13 26,50 06 BOR/13 37,00 10 BOR/13 26,00 07 BAK/13 36,50 17 MAL/13 26,00 02 BOR/13 36,50 52 BAK/13 26,00 45 BAK/13 36,50 21 BOR/13 25,50 40 BAK/13 36,00 15 BAK/13 25,50 23 BOR/13 35,50 14 BOR/13 25,50 22 MAL/13 35,50 08 MAL/13 25,50 05 BOR/13 35,00 37 BAK/13 25,50 04 BOR/13 35,00 58 BAK/13 25,00 28 MAL/13 35,00 02 BAK/13 25,00 01 MAL/13 35,00 27 BAK/13 25,00 03 MAL/13 34,50 17 BAK/13 24,50 54 BAK/13 34,50 27 BOR/13 23,50 11 MAL/13 33,50 18 BOR/13 23,00 18 MAL/13 33,50 15 BOR/13 23,00 11 BAK/13 33,50 26 MAL/13 23,00 02 MAL/13 32,00 27 MAL/13 23,00 26 BOR/13 32,00 44 BAK/13 22,50 09 MAL/13 32,00 33 BAK/13 21,50 19 BOR/13 31,50 21 BAK/13 20,50 01 BOR/13 31,00 13 MAL/13 20,00 25 BOR/13 31,00 42 BAK/13 18,50 14 MAL/13 30,50 46 BAK/13 15,00 04 BAK/13 30, NIR α0,05 1, NIR α0,05 1, Pochodzenie izolatów: MAL Małyszyn, BAK Bąków, BOR Borowo W roku 2014 wśród 96 izolatów S. sclerotiorum wyodrębniono 40 grup jednorodnych (Tab. 9). Pod względem zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego najbardziej zróżnicowane były izolaty pochodzące z Borowa (15,5 72,0 mm) i Bąkowa (19,5 70,5 mm). Znacznie mniej różniły się między sobą izolaty z Małyszyna (17,0 47 mm). Do grupy izolatów charakteryzujących się największą zdolnością do wytwarzania kwasu szczawiowego należały: 30BOR/14, 24BAK/14, 14BAK/14, 02BAK/14, 03BAK/14, 38BOR/14 i 08BAK/14. Najmniej tego kwasu wytwarzały izolaty: 06MAL/14, 26BOR/14 i 01BOR/14. 38

42 Tab. 9. Ocena zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego w warunkach in vitro przez izolaty S. sclerotiorum wyizolowane w roku 2014 Izolat Średnica przebarwień [mm] pożywki pod wpływem wytworzonego kwasu szczawiowego Grupy jednorodne Izolat Średnica przebarwień [mm] pożywki pod wpływem wytworzonego kwasu szczawiowego Grupy jednorodne 30BOR/14 72,00 44 MAL/14 30,00 24 BAK/14 70,50 25 MAL/14 30,00 14 BAK/14 70,00 17 MAL/14 29,50 02 BAK/14 70,00 32 BAK/14 29,00 03 BAK/14 70,00 22 BAK/14 28,50 38 BOR/14 70,00 34 BOR/14 27,50 08 BAK/14 69,50 22 BOR/14 27,50 18 BAK/14 68,00 06 BOR/14 27,50 10 BAK/14 68,00 21 BOR/14 26,50 05 BAK/14 67,00 31 BAK/14 26,00 16 BAK/14 66,50 27 BOR/14 26,00 20 BAK/14 66,50 18 BOR/14 26,00 40 BAK/14 66,00 24 MAL/14 25,50 11 BAK/14 65,00 13 BOR/14 25,50 04 BAK/14 65,00 04 MAL/14 24,50 21 BAK/14 64,50 24 BOR/14 24,50 25 BOR/14 62,50 16 MAL/14 24,50 26 BAK/14 61,50 11 BOR/14 24,50 06 BAK/14 61,50 28 BOR/14 24,00 34 BAK/14 61,50 14 BOR/14 23,50 19 BAK/14 61,00 03 MAL/14 23,00 25 BAK/14 60,50 08 BOR/14 23,00 28 BAK/14 60,50 30 MAL/14 22,00 07 BAK/14 58,50 08 MAL/14 21,50 30 BAK/14 57,50 05 MAL/14 21,50 07 BOR/14 55,00 02 BOR/14 21,00 38 BAK/14 52,00 35 MAL/14 21,00 36 BAK/14 47,00 07 MAL/14 20,50 14 MAL/14 47,00 38 MAL/14 20,00 13 MAL/14 46,00 15 MAL/14 20,00 12 MAL/14 46,00 36 BOR/14 20,00 29 BAK/14 45,50 19 MAL/14 19,50 01 MAL/14 44,00 20 BOR/14 19,50 31 BOR/14 42,50 21 MAL/14 19,50 10 MAL/14 42,00 35 BAK/14 19,50 09 MAL/14 41,00 29 BOR/14 19,00 37 MAL/14 36,50 33 MAL/14 19,00 11 MAL/14 36,00 28 MAL/14 19,00 39 MAL/14 35,50 05 BOR/14 19,00 34 MAL/14 35,50 47 MAL/14 18,50 22 MAL/14 35,50 23 BOR/14 18,50 43 MAL/14 34,50 02 MAL/14 18,00 35 MAL/14 34,00 29 MAL/14 18,00 39 BAK/14 33,00 46 MAL/14 17,50 42 BAK/14 33,00 45 MAL/14 17,00 40 BOR/14 32,50 01 BOR/14 16,00 50 MAL/14 31,50 26 BOR/14 15,50 33 BAK/14 30,50 06 MAL/14 13,00 NIR α0,05 2,960 NIR α0,05 2,960 Pochodzenie izolatów: MAL Małyszyn, BAK z Bąków, BOR Borowo 39

43 Wytwarzanie kwasu szczawiowego przez siedem izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Corocznie badano poziom wytwarzania kwasu szczawiowego przez siedem izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności roślin rzepaku ozimego. W 2012 roku największe średnice przebarwień pod wpływem wytwarzanego kwasu szczawiowego tworzyły izolaty 01MAL/09 (28,7 mm), 24BOR/09 (28,6 mm) i 24BAK/09 (25,5 mm), a najmniejsze średnice przebarwień wystąpiły w przypadku izolatów 31MAL/09 (15,2 mm) i S.s.-3 (16,3 mm) (Tab. 10 i 11). W 2013 roku izolatem, który charakteryzował się największą zdolnością do tworzenia przebarwień był 24BAK/09. Natomiast izolaty 31MAL/09, 04BOR/09, 24BOR/09 i S.s.-3 wytwarzały najmniejsze średnice przebarwień (Tab. 12 i 13). Jeszcze inaczej przedstawiało się wytwarzanie kwasu szczawiowego przez tych siedem izolatów w roku 2014 (Tab. 14 i 15). W warunkach laboratoryjnych największe przebarwienia tworzył izolat 05BAK/09 (28,7 mm), a najmniejsze izolat 24BAK/09. Średnie średnice przebarwień w latach były istotnie większe u izolatów 01MAL/09, 05BAK/09 04BOR/09 i 24BAK/09, niż u izolatu 31MAL/09 (Tab. 16 i 17). Tab. 10. Średnice przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w 2012 roku Średnice przebarwień [mm] wywołanych przez izolaty z Małyszyna z Bąkowa z Borowa z Poznania 01MAL/09 31MAL/09 05BAK/09 24BAK/09 04BOR/09 24BOR/09 S.s.-3 28,7 (A) 15,2 (B) 17,5 (AB) 25,5 (A) 24,2 (AB) 28,6 (A) 16,3 (B) NIR α 0,05=11,32 Tab.11. Jednoczynnikowa analiza wariancji dla średnic przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w 2012 roku ANALIZA WARIANCJI α = 0,05 Źródło wariancji SS df MS F Wartość-p Test F Pomiędzy grupami 1295, ,8889 5, , , W obrębie grup 1383, ,5190 Razem 2678,

44 Tab. 12. Średnice przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w 2013 roku Średnice przebarwień [mm] wywołanych przez izolaty z Małyszyna z Bąkowa z Borowa z Poznania 01MAL/09 31MAL/09 05BAK/09 24BAK/09 04BOR/09 24BOR/09 S.s.-3 15,6 (CD) 11,3 (D) 20,7 (B) 25,5 (A) 14,8 (D) 11,7 (D) 14,1 (D) NIR α 0,05=4,96 Tab. 13. Jednoczynnikowa analiza wariancji dla średnic przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w 2013 roku ANALIZA WARIANCJI Źródło wariancji SS df MS F Wartość-p Test F Pomiędzy grupami 840, , ,4999 1,51E-09 2, W obrębie grup 265, ,5762 Razem 1106, Tab. 14. Średnice przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w 2014 roku Średnice przebarwień [mm] wywołanych przez izolaty z Małyszyna z Bąkowa z Borowa z Poznania 01MAL/09 31MAL/09 05BAK/09 24BAK/09 04BOR/09 24BOR/09 S.s.-3 23,00 (B) 14,17 (D) 28,67 (A) 10,17 (E) 23,00 (B) 20,17 (C) 13,00 (D) NIR α 0,05=2,27 Tab.15. Jednoczynnikowa analiza wariancji dla średnic przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w 2014 roku ANALIZA WARIANCJI Źródło wariancji SS df MS F Wartość-p Test F Pomiędzy grupami 1584, , ,5522 3,44E-24 2, W obrębie grup 55, ,5952 Razem 1640, Tab. 16. Średnie średnice przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w latach Średnice przebarwień [mm] wywołanych przez izolaty z Małyszyna z Bąkowa z Borowa z Poznania 01MAL/09 31MAL/09 05BAK/09 24BAK/09 04BOR/09 24BOR/09 S.s.-3 22,4 (A) 13,6 (C) 22,3 (A) 20,4 (A) 20,7 (A) 20,2 (AB) 14,5 (BC) NIR α 0,05=6,04 41

45 Tab.17. Jednoczynnikowa analiza wariancji dla średnic przebarwień [mm] powstałych pod wpływem wytwarzania kwasu szczawiowego przez wybrane izolaty S. sclerotiorum w latach ANALIZA WARIANCJI Źródło wariancji SS df MS F Wartość-p Test F Pomiędzy grupami 1486, ,823 6,298 8,97E-06 2,176 W obrębie grup 4682, ,351 Razem 6169, Zależność między wielkością kolonii izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego Izolaty S. sclerotiorum pozyskane w 2014 roku poddano ocenie zależności między wielkością ich kolonii, a wielkością przebarwień pożywki pod wpływem kwasu szczawiowego (Tab. 18). Otrzymane wyniki poddano analizie korelacji Pearsona. Stwierdzono, że między średnicami kolonii i średnicami przebarwień istnieje niemal pełna korelacja. Większym średnicom kolonii towarzyszyły odpowiednio większe średnice przebarwienia pożywki (Tab. 19). Korelacja między średnicami kolonii grzyba i przebarwień pożywki oddzielnie dla każdej z trzech grup izolatów pochodzących z trzech miejscowości również jest niemal pełna. Współczynnik korelacji wynoszą dla izolatów pochodzących: z Małyszyna r = 0,994348, z Borowa r = 0, i z Bąkowa r = 0,

46 Tab. 18. Wielkości 48 godzinnych kolonii izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego L.p. Izolat Średnia średnica kolonii Średnia średnica przebarwień L.p. Izolat Średnia średnica kolonii Średnia średnica przebarwień 1 01 MAL/14 43,0 44, BOR/14 22,5 26, MAL/14 13,0 18, BOR/14 22,5 27, MAL/14 18,0 23, BOR/14 13,5 18, MAL/14 21,5 24, BOR/14 19,0 24, MAL/14 18,5 21, BOR/14 60,5 62, MAL/14 10,0 13, BOR/14 10,5 15, MAL/14 16,5 20, BOR/14 23,5 26, MAL/14 18,0 21, BOR/14 20,0 24, MAL/14 37,5 41, BOR/14 15,0 19, MAL/14 41,0 42, BOR/14 71,0 72, MAL/14 35,0 36, BOR/14 40,5 42, MAL/14 44,0 46, BOR/14 24,5 27, MAL/14 45,0 46, BOR/14 33,0 34, MAL/14 45,0 47, BOR/14 15,0 20, MAL/14 15,5 20, BOR/14 69,0 70, MAL/14 21,5 24, BOR/14 29,5 32, MAL/14 25,5 29, BAK/14 69,0 70, MAL/14 16,0 19, BAK/14 68,5 70, MAL/14 15,0 19, BAK/14 63,0 65, MAL/14 30,5 35, BAK/14 65,5 67, MAL/14 21,5 25, BAK/14 60,0 61, MAL/14 25,5 30, BAK/14 56,5 58, MAL/14 14,0 19, BAK/14 67,5 69, MAL/14 11,5 18, BAK/14 67,0 68, MAL/14 17,0 22, BAK/14 64,0 65, MAL/14 14,5 19, BAK/14 69,0 70, MAL/14 33,5 35, BAK/14 65,5 66, MAL/14 17,5 21, BAK/14 67,0 68, MAL/14 34,5 36, BAK/14 60,0 61, MAL/14 17,5 20, BAK/14 65,5 66, MAL/14 33,0 35, BAK/14 63,5 64, MAL/14 31,5 34, BAK/14 25,5 28, MAL/14 25,0 30, BAK/14 69,5 70, MAL/14 13,0 17, BAK/14 58,0 59, MAL/14 15,5 17, BAK/14 60,5 61, MAL/14 15,0 18, BAK/14 59,0 60, MAL/14 26,5 31, BAK/14 43,5 45, BOR/14 11,0 16, BAK/14 56,5 57, BOR/14 16,0 21, BAK/14 23,0 26, BOR/14 14,0 19, BAK/14 24,5 29, BOR/14 23,5 27, BAK/14 28,0 30, BOR/14 54,0 55, BAK/14 60,5 61, BOR/14 19,0 23, BAK/14 15,0 19, BOR/14 21,0 24, BAK/14 44,0 47, BOR/14 22,5 25, BAK/14 50,5 52, BOR14 19,0 23, BAK/14 30,0 33, BOR/14 22,5 26, BAK/14 65,0 66, BOR/14 15,5 19, BAK/14 31,0 33,0 Średnio 34,34 37,69 Pochodzenie izolatów: MAL Małyszyn, BAK Bąków, BOR Borowo 43

47 Tab. 19. Analiza korelacji wielkości kolonii izolatów S. sclerotiorum z 2014 roku i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego Zmienna średnica kolonii średnica przebarwień Korelacje (Arkusz STATISTICA 9) Oznaczone współczynniki korelacji są istotne z p 0,05 N=96 Średnia Odchylenie standardowe średnica kolonii średnica przebarwień 34, , , , , , , , Analizy molekularne wybranych izolatów S. sclerotiorum Analiza podobieństw na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w latach Uzyskane produkty amplifikacji z dwunastoma starterami RAPD dla izolatów S. sclerotiorum otrzymanych w latach poddano analizie podobieństw według Nei & Li, a następnie wykreślono dendrogram podobieństw. Na podstawie otrzymanych wyników w 2012 roku stwierdzono duże podobieństwo między izolatami patogena pochodzącymi z tej samej miejscowości. Najbardziej odległe genetycznie okazał się izolat z Bąkowa (06BAK/12) i izolat z Małyszyna (02MAL/12) (Ryc. 4). 44

48 Ryc. 4. Dendrogram podobieństwa na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2012 W 2013 roku po analizach molekularnych i przeprowadzonych obliczeniach statystycznych wśród użytych 75 izolatów S. sclerotiorum wyodrębniono grupy podobieństw charakterystyczne dla danej miejscowości, z której pochodziły. Najbardziej zróżnicowane względem siebie były izolaty uzyskane z pól Małyszyna (26MAL/13, 27MAL/13 oraz 20MAL/13, 28 MAL/13) (Ryc. 5). 45

49 Ryc. 5. Dendrogram podobieństwa na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2013 Wyniki otrzymane po badaniach RAPD oraz analizach statystycznych 96 izolatów S. sclerotiorum wyizolowanych w 2014 roku również wskazują na duże podobieństwo między izolatami pochodzącymi z tej samej miejscowości. Najbardziej odległe genetycznie były izolat 34BOR/14 z Borowa i 19MAL/14 z Małyszyna. Bardzo zróżnicowane okazały się także izolaty z Bąkowa (33BAK/14, 11BAK/14, 05BAK/14) (Ryc. 6). 46

50 Ryc. 6. Dendrogram podobieństwa na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku Analiza podobieństw na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD siedmiu izolatów S. sclerotiorum używanych do inokulacji rzepaku ozimego Po wykonaniu badań RAPD z dwunastoma starterami i uzyskaniu produktów amplifikacji dla izolatów S. sclerotiorum wybranych do inokulacji roślin rzepaku ozimego, przeprowadzono analizę podobieństw metodą Nei & Li. Na podstawie otrzymanych wyników wykreślono dendrogram podobieństw (Ryc. 7). Najbardziej odległe genetycznie okazały się izolaty 01MAL/09 i 31MAL/09. Natomiast największym podobieństwem charakteryzowały się izolaty S.s.-3 i 24BAK/09. 47

51 Ryc. 7. Dendrogram podobieństwa na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum używanych do inokulacji roślin rzepaku ozimego Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w latach Wykonana analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum wykazała w poszczególnych latach badawczych niewielkie różnice między izolatami patogena pochodzącymi z trzech różnych miejscowości. Największe różnice między populacjami grzyba z różnych lokalizacji wystąpiły w 2012 roku na poziomie 13 % (Tab. 20). W kolejnych latach różnice były mniejsze i wynosiły: w 2013 roku 4%, a w 2014 roku 7% (Tab. 21 i 22). 48

52 Tab. 20. Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie markerów RAPD dla izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2012, p 0,001 Źródło Stopnie Suma Średnia Odchylenie Wariancja swobody kwadratów kwadratów standardowe % Między populacjami 2 92,639 46,319 2,112 13% Wewnątrz populacji ,765 14,236 14,236 87% Suma ,404 16, % Tab. 21. Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie markerów RAPD dla izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2013, p 0,001 Źródło Stopnie swobody Suma Średnia kwadratów kwadratów Odchylenie standardowe Wariancja % Między populacjami 2 59,580 29,790 0,584 4% Wewnątrz populacji ,127 15,474 15,474 96% Suma ,707 16, % Tab. 22. Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie markerów RAPD dla izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2014, p 0,001 Źródło Stopnie swobody Suma Średnia kwadratów kwadratów Odchylenie standardowe Wariancja % Między populacjami 2 116,359 58,180 1,280 7% Wewnątrz populacji ,391 17,563 17,563 93% Suma ,750 18, % Analiza podobieństw na postawie polimorfizmu produktów amplifikacji przy użyciu markerów mikrosatelitarnych izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w 2014 roku i siedmiu izolatów wybranych do oceny stopnia odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Otrzymane dane po przeprowadzonych badaniach molekularnych z użyciem markerów mikrosatelitarnych poddano również analizie podobieństw wg Nei & Li. Uzyskane wyniki i wykreślony dendrogram podobieństw wskazuje na duże zróżnicowanie izolatów S. sclerotiorum. W przeciwieństwie do analiz RAPD nie można wskazać grup podobieństw związanych z pochodzeniem izolatów patogena (Ryc. 8). 49

53 Ryc. 8. Dendrogram podobieństwa na podstawie polimorfizmu produktów amplifikacji metodą SSR izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2014 Dodatkowo wykonana analiza wariancji (AMOVA) wskazuje na 100% zróżnicowania w obrębie populacji S. sclerotiorum z danych miejscowości (Tab. 23). Tab. 23. Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) na podstawie markerów mikrosatelitarnych dla izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w roku 2014, p 0,001 Źródło Stopnie swobody Suma Średnia kwadratów kwadratów Odchylenie standardowe Wariancja % Między populacjami 2 9,752 4,876 0,000 0 Wewnątrz populacji ,394 5,434 5, Suma ,146 5,

54 5.2. Charakterystyka odporności różnych typów odmian rzepaku ozimego Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w trzech kolejnych latach Wszystkie izolaty S. sclerotiorum użyte do inokulacji porażały użyte w pracy odmiany rzepaku ozimego. W 2012 roku najmniej agresywne wobec roślin rzepaku były izolaty 31MAL/09, 05BAK/09 i S.s.-3. Z kolei izolaty patogena 01MAL/09, 24BAK/09, 04BOR/09 i 24BOR/09 porażały rośliny w 100% (Tab. 24, Ryc. 9). Indeksy porażenia wszystkich odmian rzepaku ozimego przez S. sclerotiorum nie różniły się w stopniu istotnym statystycznie. Tab. 24. Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w sezonie 2011/2012 Odmiany wytwarzające mało kwasu szczawiowego przebarwienia < 20 mm Indeksy porażenia rzepaku przez izolaty wytwarzające dużo kwasu szczawiowego przebarwienia >20 mm 31MAL/09 05BAK/09 S.s.-3 01MAL/09 24BAK/09 04BOR/09 24BOR/09 POZNANIAK 0 0 0, BOGART 0,05 0,1 0, DK EXAMPLE 0,2 0 0, GLADIUS 0,05 0,1 0, VECTRA 0,15 0,1 0, CALIFORNIUM 0,15 0,05 0, CABRIOLET 0,1 0,15 0, MONOLIT 0,1 0,1 0, BOJAN 0,2 0,05 0, ADRIANA 0,3 0,1 0, Średnio 0,13 0,075 0,

55 Ryc. 9. Zróżnicowanie porażenia badanych odmian rzepaku ozimego, inokulowanego wybranymi izolatami S. sclerotiorum (sezon wegetacyjny 2011/2012) W sezonie wegetacyjnym 2012/2013 użyte do inokulacji roślin izolaty S. sclerotiorum charakteryzowały się mniejszą niż w poprzednim sezonie patogenicznością. Izolaty 31MAL/09 i S.s.-3 porażały rośliny rzepaku w istotnie mniejszym stopniu niż izolat 05BAK/09 (Tab. 25, Ryc. 10). W tym sezonie nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie między indeksami porażenia poszczególnych odmian rzepaku. Tab. 25. Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w sezonie 2012/2013 Indeksy porażenia rzepaku przez izolaty Odmiany wytwarzające mało kwasu szczawiowego przebarwienia < 20 mm wytwarzające dużo kwasu szczawiowego przebarwienia >20 mm 01MAL/09 31MAL/09 04BOR/09 24BOR/09 S.s.-3 05BAK/09 24BAK/09 POZNANIAK 0,15 0 0,55 0,7 0,2 0,55 0,7 BOGART 0,05 0,1 0,5 0,15 0 0,4 0 DK EXAMPLE 0,4 0,05 0,5 0,25 0 0,6 0,6 GLADIUS 0,15 0 0,3 0,15 0,2 0,55 0,35 VECTRA 0,25 0 0,3 0,2 0,05 0,7 0,45 CALIFORNIUM 0,4 0,15 0,35 0,05 0,2 0,7 0,25 CABRIOLET 0,25 0 0,1 0,2 0,2 0,5 0,35 MONOLIT 0,15 0 0,3 0,1 0 0,55 0,4 BOJAN 0,2 0,15 0,15 0,2 0,1 0,5 0,25 ADRIANA 0,4 0 0,5 0,3 0,3 0,5 0,45 Średnio 0,24 0,04 0,36 0,23 0,13 0,55 0,38 52

56 Ryc. 10. Zróżnicowanie porażenia badanych odmian rzepaku ozimego inokulowanego wybranymi izolatami S. sclerotiorum (sezon wegetacyjny 2012/2013) W 2014 roku izolat 31MAL/09 okazał się istotnie mniej patogeniczny od większości pozostałych izolatów (Tab. 26, Ryc. 11). Podobnie jak w latach wcześniejszych nie wystąpiły różnice istotne statystycznie między indeksami porażenia poszczególnych odmian rzepaku. Tab. 26. Indeksy porażenia odmian rzepaku ozimego inokulowanych wybranymi izolatami S. sclerotiorum w sezonie 2013/2014 Indeksy porażenia rzepaku przez izolaty: Odmiany wytwarzające mało kwasu szczawiowego przebarwienia < 20 mm wytwarzające dużo kwasu szczawiowego przebarwienia >20 mm 31MAL/09 24BAK/09 S.s.-3 01MAL/09 05BAK/09 04BOR/09 24BOR/09 POZNANIAK 0,05 0,15 0,2 0,85 0,85 0,9 0,5 BOGART 0,05 0,65 0,4 1 0,9 0,85 0,85 DK EXAMPLE 0,05 0,25 0,3 0,8 1 0,9 0,4 GLADIUS 0,15 0,15 0,5 0,65 1 0,6 0,45 VECTRA 0 0,25 0,5 0,8 0,7 0,85 0,5 CALIFORNIUM 0,05 0,55 0, ,65 CABRIOLET 0,1 0,6 0,55 1 0,9 1 0,55 MONOLIT 0,15 0,6 0,5 0,85 0,95 0,8 0,7 BOJAN 0,1 0,55 0,45 0,9 0,95 0,85 0,8 ADRIANA 0 0,8 0,45 0, ,9 Średnia 0,07 0,46 0,44 0,85 0,93 0,88 0,63 53

57 Ryc. 11. Zróżnicowanie porażenia badanych odmian rzepaku ozimego inokulowanego wybranymi izolatami S. sclerotiorum (sezon wegetacyjny 2013/2014) Analiza korelacji wykazała bardzo wysoką, dodatnią zależność między średnią indeksów porażenia roślin rzepaku, w okresie trzech lat, wszystkich badanych odmian z sumą opadów (Tab. 27) w okresie siedmiu dni od inokulacji roślin grzybem S. sclerotiorum (r = 0,79). Natomiast dla indeksów porażenia inokulowanych roślin rzepaku wszystkich badanych odmian i średniej tygodniowej temperatury analiza korelacji była niemal pełna i ujemna (r = - 0,98) (Tab. 28). Tab. 27. Analiza korelacji indeksów porażenia (IP) wszystkich odmian inokulowanych roślin rzepaku w trzech kolejnych latach i tygodniowej sumy opadów po inokulacji Zmienna Korelacje (Arkusz STATISTICA 9) Oznaczone współczynniki korelacji są istotne z p 0,05 N= 3 Średnia Odchylenie standardowe IP Tygodniowa suma opadów [mm ] IP 0, , ,00 0,79 Tygodniowa suma opadów [mm] 12, , ,79 1,00 54

58 Tab. 28. Analiza korelacji indeksów porażenia (IP) wszystkich odmian inokulowanych roślin rzepaku w trzech kolejnych latach i tygodniowej sumy opadów po inokulacji Zmienna Korelacje (Arkusz STATISTICA 9) Oznaczone współczynniki korelacji są istotne z p 0,05 N= 3 Średnia Odchylenie standardowe IP Średnia tygodniowa temperatura ( C) IP 0, , ,00-0,98 Średnia tygodniowa temperatura ( C) 15, , ,98 1, Porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec dziesięciu odmian rzepaku ozimego Każdego roku przeprowadzono porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec roślin rzepaku ozimego. Wyniki współczynników korelacji Pearsona w ciągu badanych lat były dodatnie na poziomie niemal pełnym (2012 tab. 29) i bardzo wysokim (lata 2013 i 2014 tab. 30 i 31). Duże zróżnicowanie izolatów S. sclerotiorum pod względem agresywności może być przyczyną trudności w selekcji odmian odpornych na tego patogena. 55

59 Tab. 29. Porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec rzepaku ozimego w roku 2012 Zmienna Korelacje (Arkusz STATISTICA 9) Oznaczone współczynniki korelacji są istotne z p 0,05 N=7 Średnica przebarwień Średnio Odchylenie standardowe Średnica przebarwień 22, , , , IP 0, , , , IP Tab. 30. Porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec rzepaku ozimego w roku 2013 Zmienna Korelacje (Arkusz STATISTICA 9) Oznaczone współczynniki korelacji są istotne z p 0,05 N=7 Średnica przebarwień Średnio Odchylenie standardowe Średnica przebarwień 16,2428 5, , , IP 0, , , , IP Tab. 31. Porównanie zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec rzepaku ozimego w roku 2014 Zmienna Korelacje (Arkusz STATISTICA 9) Oznaczone współczynniki korelacji są istotne z p 0,05 N=7 Średnica przebarwień Średnio Odchylenie standardowe Średnica przebarwień 0, , ,000 0, IP 18, , , ,000 IP 56

60 6. Dyskusja Patogen S. sclerotiorum jest zagrożeniem dla ponad 400 gatunków roślin dwuliściennych (Bolland i Hall 1994). Stanowi on obiekt wielu badań mających na celu dokładne poznanie mechanizmów patogenezy oraz zróżnicowania fenotypowego i genotypowego jego izolatów. Niezbędnym w procesie infekcji roślin oraz wskaźnikiem chorobotwórczości jest kwas szczawiowy wytwarzany przez S. sclerotiorum (Hegedus i Rimmer 2005; Godoy i in. 1990; Li i in. 2008a; Williams i in. 2011). Podczas wzrostu grzyba, wytwarzany kwas szczawiowy tworzy kwaśne środowisko, w którym mogą aktywować się enzymy niszczące ścianę komórkową roślin (Maxwell i Lumsden 1970; Marciano i in. 1983; Kim i in. 2008). Kwas szczawiowy z jonami wapnia doprowadza do powstawania kryształów szczawianu wapnia przyczyniając się do blokowania wiązek naczyniowych roślin (Kim i in 2008), a także destabilizacji związków pektynowych zawartych w ścianie komórkowej gospodarza, jednocześnie zakłócając jej integralność (Bateman i Beer 1965; Maxwell i Lumsden 1970). Ponadto związek ten powoduje anormalne otwieranie się komórek szparkowych i hamuje ich zamykanie podczas infekcji doprowadzając do więdnięcia rośliny (Guimarães i Stotz 2004; Kim i in. 2008). Kwas szczawiowy również ogranicza usuwanie reaktywnych form tlenu (wolnych rodników), które powstają w wyniku reakcji obronnej gospodarza (Cessna i in. 2000). Mutanty S. sclerotiorum nie wytwarzające kwasu szczawiowego charakteryzują się brakiem zdolności do zakażania roślin. Fakt ten wskazuje na rolę tej substancji w inicjowaniu szeregu procesów prowadzących do zamierania roślin, w których rozwija się patogen. Mając na uwadze dużą rolę kwasu szczawiowego w patogenezie powodowanej przez S. sclerotiorum wiele badań prowadzono w celu detekcji zróżnicowania pod względem produkcji tego kwasu przez występujące w naturze izolaty grzyba S. sclerotiorum. W przedstawionej pracy w każdym z trzech lat badań stwierdzano duże zróżnicowanie w wytwarzaniu kwasu szczawiowego przez poszczególne izolaty S. sclerotiorum, w testach na płytkach Petriego z pożywką PDA z dodatkiem indykatora kwasowości. W 2012 r. wśród 57 izolatów patogena stwierdzono 26 grup jednorodnych, w roku 2013 wśród 75 badanych izolatów grzyba zanotowano 27 grup jednorodnych, a w roku 2014 analizowano 96 izolatów S. sclerotiorum, wśród których wyszczególniono 40 grup jednorodnych. 57

61 Bardzo duże zróżnicowanie izolatów w wytwarzaniu kwasu szczawiowego przez S. sclerotiorum odnotowano w badaniach prowadzonych na innym materiale roślinnym (Starzycka i in. 2002; Durman i in. 2005; Starzycka i Starzycki 2011; Mo i in. 2007; Li i in. 2008b; EL-Argawy 2012). W badaniach z 2002 roku (Starzycka i in. 2002) testowano izolaty S. sclerotiorum pochodzące z Chin i Polski. Na 16 izolatów chińskich 13 wyizolowano z porażonych roślin rzepaku, 2 izolaty ze słonecznika, a 1 z szałwii. Polskie izolaty patogena pochodziły tylko z rzepaku. Zarówno w grupie patogena pochodzącego z Polski, jak i z Chin stwierdzono bardzo dużą zmienność pod względem wytwarzania kwasu szczawiowego. Na podstawie analizy z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC stwierdzono, że w podłożu po 3 tygodniach hodowli patogena stężenie tego kwasu wynosiło od 0,44 3,18mM. Największe i najmniejsze stężenia kwasu szczawiowego stwierdzono u izolatów chińskich co świadczy o bardzo dużym zróżnicowaniu pod względem tej cechy chińskiej populacji grzyba. U polskich izolatów stężenie kwasu szczawiowego kształtowało się na poziomie 0,48 0,97 mm. W pracy tej nie odnotowano korelacji między masą grzybni, a zdolnością danych izolatów do produkcji kwasu szczawiowego. Natomiast w przedstawionej pracy stwierdzono niemal pełną korelację (r = 0,99) w między średnicą kolonii poszczególnych izolatów S. sclerotiorum i średnicą przebarwień pożywki powstałych na skutek wytwarzania kwasu szczawiowego przez te izolaty. Bardzo duże zróżnicowanie w produkcji kwasu szczawiowego przez S. sclerotiorum również stwierdzono w badaniach 121 izolatów grzyba pochodzących z argentyńskich pól soi, słonecznika i sałaty wyznaczając 46 grup jednorodnych (Durman i in. 2005). Po analizie z wykorzystaniem spektrofotometru ustalono, że wytwarzanie kwasu szczawiowego przez poszczególne izolaty kształtowało się na poziomie od 18 do 110 mg na mg suchej masy grzybni. Największe ilości kwasu szczawiowego wytwarzały izolaty pochodzące z soi. Wśród zgromadzonej populacji grzyba S. sclerotiorum pochodzącego z pól uprawnych rzepaku znajdujących się w Małyszynie uzyskano podobne wyniki (Starzycka i Starzycki 2011). W badaniach nad poziomem wytwarzania kwasu szczawiowego przez 61 izolatów patogena na pożywkach z indykatorem kwasowości (zieleń bromokrezolowa) stwierdzono 29 grup jednorodnych. Po 24 godzinach od inokulacji na płytkach Petriego największe średnice przebarwień zanotowano u siedmiu izolatów S. sclerotiorum. Dodatkowo stwierdzono, że istnieje wysoki współczynnik korelacji 58

62 (0,74) dla poziomu wytwarzanego kwasu szczawiowego przez te same izolaty S. sclerotiorum po 24 godzinach i po 120 godzinach (5 dniach). W prezentowanej pracy wytwarzanie kwasu szczawiowego oceniano przez pomiar średnic przebarwień z 48 godzinnymi koloniami S. sclerotiorum na pożywce z indykatorem kwasowości. Uznano, że jest to najwłaściwszy czas w związku z tym, że kwas szczawiowy odgrywa istotną rolę w początkowych fazach infekcji. W badaniach Mo i in. (2007), którzy przeanalizowali 160 izolatów S. sclerotiorum z różnych części świata (71 izolatów z Chin, 39 z Kanady, 20 z USA i 30 z Anglii) stwierdzono duże ich zróżnicowanie nie tylko pod względem wytwarzania kwasu szczawiowego. Różniły się one również szybkością wzrostu liniowego grzybni, liczbą wytwarzanych sklerocjów i agresywnością. Dodatkowo zaobserwowano dodatnią korelację między stężeniem wytwarzanego kwasu szczawiowego w początkowej fazie rozwoju patogena, a jego agresywnością. Do takich samych wniosków doszedł zespól Li i in. (2008b). Analiza korelacji wykazała, że w próbie 205 izolatów S. sclerotiorum pochodzących z Angli, Kanady i Chin istnieje dodatnia zależność (r = 0,739) między ich agresywnością, a produkcją kwasu szczawiowego. Podobne wyniki uzyskano w przedstawionej pracy, w której porównywano zdolność wybranych izolatów S. sclerotiorum do produkcji kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczość wobec roślin rzepaku. Dla wyników badań z lat 2013 i 2014 współczynnik korelacji Pearsona dla tych cech był bardzo wysoki (r = 0,73 i r = 0,82), a w 2012 niemal pełny (r = 0,95). Również praca EL-Argawy (2012) wskazuje, że produkcja kwasu szczawiowego jest ściśle związana ze stopniem patogeniczności S. sclerotiorum. W pracy tej użyto pięć izolatów pochodzących z upraw fasoli znajdujących się w rejonie EL-Behra (Egipt), charakteryzujących się różnym stopniem chorobotwórczości. Najbardziej chorobotwórczy izolat SS34 wytwarzał największe ilości kwasu szczawiowego (5,46 mg/l), a najmniej patogeniczny izolat SS2 produkował go najmniej (2,46 mg/l). Średnio chorobotwórcze izolaty charakteryzowały się umiarkowaną produkcją kwasu szczawiowego mieszczącą się w granicach 3,33-3,68 mg/l). Pod względem genetycznym grzyb S. sclerotiorum jest bardzo zróżnicowany. W przedstawionej pracy wykorzystano dwie analizy ukazujące polimorfizm DNA badanego patogena. Technika RAPD, która jest stosunkowo łatwa i tania, wykorzystuje amplifikacje losowych fragmentów genomowego DNA stosując startery o długości par zasad. Dzięki temu uzyskuje się unikalne zestawy prążków (amplikonów) w żelu agarozowym odpowiednie dla danego genotypu, które pozwalają wykryć na 59

63 poziomie DNA różnice między badanymi obiektami (Matuszczak, 2013). Ważne przy tej metodzie jest branie pod uwagę tylko wyraźnych prążków, gdyż wadą tej analizy jest słaba powtarzalność (Ellsworth i in. 1993, Khandka i in. 1997, Perez i in. 1998). Podejmowane próby badań populacji S. sclerotiorum przy pomocy analizy RAPD najczęściej ukazują tylko dużą różnorodność izolatów patogena z brakiem powiązania z konkretną cechą, taką jak pochodzenie, czy patogeniczność. Do takich wniosków doszli między innymi Colagar i in. (2010) badając 12 izolatów grzyba odszczepionych z rzepaku typu Canola, z różnych prowincji Iranu. Łącznie użyli 18 starterów, ale tylko 3 według autorów najbardziej różnicowały patogena (Ar081, Ar173, Ar0R2). Te trzy wybrane startery amplifikowały łącznie 284 fragmenty DNA, których wielkość mieściła się w przedziale od pz. Utworzony dendrogram podobieństw uporządkował większość izolatów S. sclerotiorum w różnych grupach, udowadniając dużą różnorodność genetyczną między badanymi izolatami. Stwierdzono, że markery RAPD wykorzystane w pracy mogą być użytecznym narzędziem do badania różnic genetycznych izolatów patogena, ale różnice te nie mają istotnego związku z ich położeniem geograficznym. Podobnie, zakres różnorodności genetycznej 17 izolatów S. sclerotiorum przy pomocy analizy RAPD określono w Indiach (Sharma i in., 2013). Do analiz wykorzystano tu aż 50 starterów i uzyskano łącznie 692 amplikony wielkości pz, z czego 385 była polimorficzna. Na podstawie współczynnika podobieństwa o zakresie 0,18-0,87 utworzono dendrogram z czterema głównymi klastrami. Porównywalne wyniki współczynnika podobieństw wg Nei & Li otrzymano w obecnej pracy, który kształtował się na poziomie 0,2 0,9 dla izolatów z lat 2012 i 2013 oraz 0,1 0,9 dla izolatów z 2014 roku. Również w badaniach izolatów S. sclerotiorum z różnych gospodarzy (fasola, pomidor, papryka, groch, sałata, słonecznik, marchew, rzodkiew, rzepak, kapusta) i z różnych regionów Brazylii metodą RAPD z 16 starterami, uzyskane różnice genetyczne nie były powiązane z gospodarzem, czy pochodzeniem geograficznym (Litholdo Junior i in., 2011). Ponadto przeprowadzona analiza statystyczna AMOVA wykazała 99,1% zróżnicowania między izolatami patogena w regionach geograficznych, a jedynie 0,89% wiązało się z różnicami między izolatami z danego gospodarza. W pracy tej przy wykorzystaniu 12 starterów RAPD corocznie stwierdzano duże zróżnicowanie izolatów S. sclerotiorum, a dalsza analiza podobieństw według Nei & Li pozwoliła na pogrupowanie populacji patogena uzyskanego z roślin rzepaku w dużej mierze zgodnie z ich pochodzeniem. W przedstawionej pracy wykonana analiza AMOVA również wskazała bardzo duże zróżnicowanie wewnątrz populacji 60

64 z danej miejscowości na poziomie 87% w 2012 r., 96% w 2013 r. i 93% w 2014 r., a między populacjami z danych miejscowości tylko odpowiednio na poziomie 13%, 4% i 7%. Częściową korelację markerów RAPD z miejscem pochodzenia izolatów S. sclerotiorum stwierdzili Mandal i Dubey (2012). W swoich badaniach różnicowania 24 izolatów wyizolowanych przede wszystkim z ciecierzycy, grochu i gorczycy, z 10 różnych stanów Indii, przy pomocy 21 starterów RAPD uzyskano łącznie 109 produktów amplifikacji, z których 48,6% było polimorficznych. Większość izolatów wykazywała 90% podobieństwo. Do podobnych wniosków doszli Tok i in. (2016). Badając zróżnicowanie 60 izolatów S. sclerotiorum odszczepionych z bakłażana, z 6 różnych regionów Turcji przy pomocy 10 starterów RAPD wykazano ponad 90% podobieństwo między badanymi izolatami. Ponadto stwierdzono częściową korelację z grupami zgodności grzybniowej, a także pochodzeniem geograficznym i wirulencją. Zastosowana analiza RAPD z pięcioma starterami (R1, R2, R3, R4, R5) pozwoliła nie tylko ukazać zróżnicowanie badanych izolatów S. sclerotiorum, ale również odnaleźć zależność między jednym z markerów, a patogenicznością patogena (El-Argawy, 2012). Startery R1 i R4 wykazywały największy polimorfizm. Jednak najskuteczniejszym markerem wykrywającym różnice stopnia patogeniczności był R3, który amplifikował 9 fragmentów DNA dla izolatu produkującego duże ilości kwasu szczawiowego i 4 fragmenty dla izolatu o małej zdolności do jego tworzenia. Dalsza analiza podobieństw wg Nei & Li i utworzony dendrogram podobieństw potwierdziła dużą różnicę genetyczną między izolatem najbardziej i najsłabiej patogenicznym, umieszczając oba izolaty w dwóch skrajnych klastrach. W niniejszej pracy niestety nie doszukano się powiązań użytych starterów RAPD z produkcją kwasu szczawiowego przez zebrane izolaty w ciągu trzech kolejnych lat. Drugą metodą badań molekularnych, którą zastosowano w pracy była analiza z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych (SSR). DNA mikrosatelitarne odznacza się występowaniem krótkich sekwencji nukleotydów w powtórzeniach tandemowych (Litt i Luty, 1989). Markery SSR są z reguły specyficzne dla danego gatunku, a gdy znane są odpowiednie startery metoda ta nie sprawia trudności (Matuszczak, 2013). Również i w tej analizie dobór odpowiednich starterów pozwala nie tylko na ocenę zróżnicowania badanych populacji grzyba S. sclerotiorum, ale także umożliwia odnalezienie związku z innymi cechami patogena. 61

65 Wspomniani wcześniej autorzy (Tok i in. 2016) w swojej pracy wykorzystali analizę SSR z 6 parami markerów mikrosatelitarnych. Na podstawie otrzymanych wyników w wykreślonym dendrogramie 60 izolatów S. sclerotiorum wystąpiły 3 główne grupy. Jednak podobnie, jak przy analizach RAPD nie odnaleziono powiązania między przynależnością do grupy grzybniowej i pochodzeniem. Również w badaniach Zancan i in. (2015) nad 25 izolatami S. sclerotiorum pochodzącymi z różnych odmian fasoli nie stwierdzono korelacji analiz SSR z agresywnością. W przedstawionej pracy, podobnie jak w pracach Atallah i in. (2004) oraz Attanayake i in. (2012) wykorzystano markery mikrosatelitarne opracowane wcześniej przez Sirjusingh i Kohn (2001). Określona przez tych autorów duża liczba haplotypów S. sclerotiorum odszczepionych z upraw ziemniaka znajdujących się w dorzeczu Kolumbii stanu Waszyngton nie miała związku z badaną patogenicznością grzyba. Na podstawie analizy statystycznej AMOVA określono 92% zmienności populacji patogena na badanym obszarze. Podobnie sytuacja przedstawiała się w obecnej pracy z izolatami S. sclerotiorum pochodzącymi z upraw rzepaku ozimego, z trzech województw, w której uzyskano wiele haplotypów bez związku z miejscem pochodzenia, czy produkcją kwasu szczawiowego. Dodatkowo w tym przypadku polimorfizm w obrębie populacji grzyba z danej miejscowości wyniósł 100%. Bardzo obszerne analizy wykonał Clarkson i in. (2013) w Wielkiej Brytanii badając 384 izolaty S. sclerotiorum zebrane z sześciu różnych upraw znajdujących się na terenie Anglii i Walii. Po analizie SSR otrzymano 228 haplotypów, a jeden z nich był szeroko rozpowszechniony wśród wielu gatunków roślin, z których pochodziły izolaty oraz występował na różnych obszarach, co świadczyło o multiklonalnej populacji S. sclerotiorum w Wielkiej Brytanii. Natomiast w Stanach Zjednoczonych Carbone i Kohn (2001) w badaniach nad 178 izolatami patogena wyizolowanymi z 8 stanów wschodniej części kraju, przy pomocy markerów mikrosatelitarnych wyodrębnili 34 haplotypy, przy czym z niektórych upraw uzyskiwano wiele haplotypów. W innej pracy dotyczącej populacji 238 izolatów S. sclerotiorum z czterech gatunków roślin uprawnych, z Północnej Dakoty, Oregonu i Waszyngtonu również stwierdzono dużą liczbę haplotypów (Attanayaka i in., 2014). Do stwierdzenia zależności między haplotypami a grupami zgodności grzybniowej doszli Aldrich-Wolfe i in. (2015), badając przy pomocy markerów mikrosatelitarnych 145 izolatów S. sclerotiorum pochodzących z różnych gospodarzy (rzepaku, fasoli, soi, marchwi, słonecznika tytoniu, ziemniaka), z północno-centralnego 62

66 regionu USA. Na podstawie wyników zidentyfikowano 52 haplotypy. W dalszych badaniach zaobserwowano, że izolaty należące do tej samej grupy zgodności grzybniowej charakteryzowały się identyczną kombinacją alleli lub różniły się liczbami 2 12 polimorficznych loci. Stwierdzono również, że większość zmian genetycznych występuje w obrębie całej kolekcji izolatów (AMOVA 92,9%) niż pomiędzy izolatami S. sclerotiorum z różnych upraw (7,1%). Rozkład populacji haplotypów w badanych regionach sugeruje, że specyficzne haplotypy są często spotykane u wielu gatunków roślin, natomiast roślina na której rozwija się patogen nie stanowi bariery dla jego genów. Analiza z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych została także wykorzystana do porównania 50 izolatów S. sclerotiorum pobranych z opadających płatków rzepaku, stanowiących inokulum i 55 izolatów patogena otrzymanych z porażonych łodyg (Sexton i in., 2006). Tutaj zidentyfikowano 50 haplotypów z różnorodnością genów 0,40 0,71, nie stwierdzając jednocześnie istotnych różnic między populacją grzyba będącą inokulum, a populacją z porażonych łodyg. Obecnie uprawiane odmiany rzepaku ozimego są podwójnie ulepszone i pochodzą z tych samych form wyjściowych, co powoduje znaczne zawężenie puli genowej gatunku ( Bartkowiak-Broda, 2005; Liersch, 2005; Hasan i in., 2006). Z tego też powodu jest bardzo trudno odnaleźć źródło odporności u B. napus na S. sclerotiorum. W związku z ograniczaniem liczby substancji biologicznie czynnych chemicznych środków ochrony roślin istnieje potrzeba zidentyfikowania skutecznych źródeł odporności roślin na tego patogena. Do tej pory w uprawie rzepaku odnajdywano głównie częściową odporność na S. sclerotiorum (Baswana i in., 1991; Delourme i in., 2011). Potwierdza to wiele badań przeprowadzanych na całym świecie łącznie z wynikiem obecnej pracy, w której tylko kilka odmian wykazywało całkowitą odporność na dany izolat S. sclerotiorum, niestety bez powtarzalności w kolejnych latach. W roku 2012 najodporniejszymi odmianami były Poznaniak, który wykazywał całkowitą odporność wobec izolatów 31MAL/09 i 05BAK/09 oraz DK Example z całkowitą odpornością na izolat 05BAK/09. W następnym roku całkowitą odpornością na izolat 31MAL/09 charakteryzowały się odmiany: Poznaniak, Gladius, Vectra, Cabriolet, Monolit i Adriana, a także Bogart, DK Example i Monolit na porażenie przez izolat S.s.-3 oraz odmiana Bogart na izolat 24BAK/09. W 2014 roku całkowicie odpornymi tylko na izolat 31MAL/09 były odmiany: Vectra i Adriana. Warto zwrócić uwagę, że dziesięć badanych odmian było 63

67 w najmniejszym stopniu porażanych przez izolat 31MAL/09, który charakteryzował się najsłabszą produkcją kwasu szczawiowego. W innych dwuletnich badaniach ( ) na terenie zachodniej Polski stwierdzono tylko częściową odporność odmian rzepaku ozimego na pojedynczy izolat S. sclerotiorum (S.s.-3) (Starzycka i in. 2009). Najniższymi indeksami porażenia (IP = 0,55-0,62) charakteryzowały się takie odmiany, jak: Taurus, Libomir, Toccata i Hycolor. Również w Iranie, gdzie przeprowadzono badania in vitro i in vivo siedmiu genotypów B. napus na porażenie przez S. sclerotiorum pochodzących z 3 różnych grup zgodności grzybniowej (Alavi i Dalili, 2014). Zarówno w testach laboratoryjnych, jak i polowych, żaden z analizowanych genotypów nie wykazywał całkowitej odporności na tego patogena. Tylko jedna linia rzepaku Z-15 charakteryzowała się znacznym stopniem odporności w obu testach. Z kolei w badaniach Ahmadifar i Dalil (2013) 11 linii i odmian rzepaku wykazano istotne różnice w odporności roślin w warunkach polowych i szklarniowych. Stwierdzono, że część genotypów odznaczała się wysokim stopniem odporności zarówno w szklarni, jak i w uprawie polowej: RWG3.1, RG3308, 19RAS, RWRG3.2 i RG3SAR. Czasami w różnych badaniach odporności odmian obserwowane są sprzeczne wyniki. Przykładem może być odmiana Mystic, która w jednym teście była częściowo odporna, a w innym podatna (Uloth i in. 2013; Taylor i in. 2015). Powodem takiej sytuacji może być brak standaryzacji między badaniami, a także różnice techniczne związane z inokulacją roślin (Debryshire i Denton-Giles 2016). Testy odporności roślin często ograniczają się do inokulacji pojedynczym izolatem, co może przekładać się na różne wyniki. Jak potwierdzono w tej pracy istnieje wiele genotypów S. sclerotiorum o różnym stopniu patogeniczności, dlatego badania odporności oparte na jednym patotypie często nie korelują ze stopniem odporności roślin w warunkach polowych, gdzie występuje wiele izolatów patogena należących do różnych patotypów (Ge i in. 2012). W poszukiwaniu odporności B. napus na porażenie powodowane przez S. sclerotiorum wykorzystuje się także najnowsze techniki z biologii molekularnej. Pomimo odkrycia loci cech ilościowych (QTL) związanych z odpornością rzepaku (Wei i in. 2014; Zhao i Meng 2003a; Zhao i Meng 2003b; Wu i in. 2013; Feng i in. 2012; Harper i in. 2012; Lu i in. 2014), otrzymanie całkowicie odpornych odmian rzepaku na tego patogena, jak dotąd nie udało się. Brak całkowitej odporności rzepaku, przyczyniło się do jej poszukiwań u roślin pokrewnych z zamiarem introgresji do B. napus. Badania odporności roślin nie tylko 64

68 rzepaku ale również Brassica juncea podjął zespół chińskich i australijskich naukowców (Li i in. 2007). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono znaczne zróżnicowanie w stopniu odporności na S. sclerotiorum w obrębie genotypów z obu krajów. Najodporniejszymi liniami rzepaku okazały się: Fan 168, Fan 028, Zhougyou-za No.8 z Chin oraz RR002, Ag-Spectrum, Oscar, Lantern z Australii. Linie B. juncea były bardzo podatne. Z roślin pokrewnych do B. napus wysoki stopień odpornści na S. sclerotiorum wykazują takie gatunki, jak: B. incana, B. insularis, B. oleracea, B. rapa var. chinensis, B. rupestris i B. villosa (Mei i in., 2013; Uloth i in., 2013, 2014). Wykazano, że reakcje obronne u B. oleracea występują podczas próby penetracji tkanek rośliny przez patogena (Uloth i in. 2014). Oznacza to, że ściana komórkowa odgrywa bardzo ważną rolę w obronie przeciw S. sclerotiorum. Zostały podjęte próby przeniesienia genów odporności z B. oleracea i innych gatunków dzikorosnących należących do rodziny Brassicaceae do rzepaku. Obiecujące wyniki otrzymano dla linii rzepaku z przeniesionymi genami pochodzącymi z Erucastrum cardaminoides, Diplotaxis tenuisiliqua, Erucastrum abyssinicum, Capsella bursa-pastoris, Sinapis arvensis (Ding i in. 2013; Chen i in. 2007; Garg i in. 2010; Wei i in. 2010). Obecnym wyzwaniem jest genetyczne ustabilizowanie tych linii do odpowiednich odmian o charakterystycznych cechach dla rzepaku. Sposobem otrzymania roślin rzepaku z odpornością na S. sclerotiorum może być wykorzystanie metody selekcji linii podwojonych. Ten sposób hodowli został zaprezentowany przez Liu i in. (2005). W swoich badaniach z otrzymanych 54 linii DH po inokulacji, a także po traktowaniu roślin roztworem kwasu szczawiowego (3 mmol/l) wytypowano dwie linie: M083 i M004. Odznaczały się one najwyższym stopniem odporności, większym od wzorca jakim jest odmiana Zhongyou 821 o częściowej odporności. Linia M083 oprócz wysokiego stopnia odporności charakteryzowała się również dużą liczbą łuszczyn oraz dużą masą 1000 nasion. Jeszcze inną metodą poszukiwania źródeł odporności na S. sclerotiorum jest otrzymywanie roślin rzepaku w wyniku resyntezy. Ten sposób wykorzystali Ding i in. (2013) oceniając 55 lini zresyntetyzowanych (RS) pochodzących z 7 dzikich i 2 uprawnych typów B. oleracea. W odniesieniu do wzorca Zhongyou 821 o częściowej odporności na S. sclerotiorum, linie RS wykazywały większą odporność. Chociaż poziom odporności form RS był niższy niż linii rodzicielskich, stwierdzono umiarkowaną korelację między liniami RS, a liniami rodzicielskimi. Rośliny rzepaku 65

69 zresyntetyzowanego stanowią cenne źródło pozyskiwania nowych cech w tym odporności na patogeny. Brak postępu w hodowli odmian rzepaku odpornych na S. sclerotiorum jest spowodowany nie tylko brakiem źródeł odporności, ale także wystandaryzowanej metody selekcji. Otrzymane wyniki badań skłaniają do refleksji, że dla zapewnienia postępu w hodowli odmian rzepaku odpornych lub tolerancyjnych na tego patogena konieczne są badania w kierunku: stworzenia populacji mapującej dla wygenerowania loci QTL i opracowania markerów molekularnych specyficznych lub sprzężonych z cechą odporności; poszukiwania markerów fenotypowych dla genotypów mających odporność; tworzenia linii syntetycznych lub pół syntetycznych dla wprowadzenia genów z gatunków ancestralnych lub innych gatunków pokrewnych; zastosowania metody piramidyzacji genów odporności pochodzących z różnych źródeł. W procesie patogenezy oraz rozwoju grzyba czynniki pogody odgrywają bardzo ważną rolę. W przypadku S. sclerotiorum stwierdzono, że chłód i duża wilgotność sprzyjają kiełkowaniu sklerocjów w glebie oraz tworzeniu apotecjów (Krüger 1975a; Partyka i Mai 1962). Najbardziej sprzyjającymi do kiełkowania przetrwalników są temperatury od 7 do 11 C (Krüger 1976). Wysoka temperatura i niska wilgotność w warunkach in vitro opóźnia rozwój patogena poprzez zahamowanie wzrostu grzybni, tworzenia się mniejszej liczby słabo dojrzałych sklerocjów (Singh i in. 1985). W przypadku tworzenia apotecjów optymalne są temperatury od 10 do 20 C (Coley- Smith i Cook 1971; Saito 1977; Willetts i Wong 1980), choć niektórzy twierdzą, że potrzebny jest okres niższych temperatur na poziomie 0 do 5 C (Kohn 1979; Philips 1987; Sun i Yang 2000; Mila i Yang 2008). Najkorzystniejszymi dla wzrostu grzybni są temperatury z przedziału 20 do 25 C (Cuong i Dohroo 2006 oraz Hoyte 2012), co potwierdziły badania przeprowadzone w Polsce (Wójtowicz i in. 2016). W obecnej pracy stwierdzono duży wpływ temperatury i sumy opadów na ilość pobieranych izolatów S. sclerotiorum z danych miejscowości w poszczególnych latach co było związane z liczbą i stopniem porażenia badanych odmian. W Małyszynie we wszystkich trzech sezonach bardzo deszczowy maj oraz średnie temperatury w maju kształtujące się na poziomie 13,1 do 14,6 C przekładały się na dużą liczbę pobieranych z pól rzepaku izolatów grzyba S. sclerotiorum (2012 r. 36 izolatów, 2013 r

70 i 2014 r. 37). Również w Bąkowie obfite opady przypadające na okres kwitnienia i dojrzewania rzepaku w wyżej wymienionych latach miały związek z dużą liczbą pobranych izolatów S. sclerotiorum (2013 r. 32 izolaty; 2014 r. 32 izolaty) w przeciwieństwie do bardziej suchego roku 2012, kiedy z pobranego materiału wyodrębniono tylko 11 izolatów. W Borowie przebieg pogody nie odzwierciedlał zwiększającej się z roku na rok liczby pobieranych do badań izolatów S. sclerotiorum. Większe liczby uzyskiwanych izolatów patogena mogły też mieć związek z większym nasileniem obecności grzyba w glebie. Jajor i in., (2010) donoszą, że na infekcję rzepaku przez S. sclerotiorum istotny wpływ ma przebieg pogody, a zwłaszcza wilgotność powietrza. Według Mehta (2014) wilgotność powyżej 80% oraz zakres temperatur 5 25 C przyczynia się do szybkiego rozwoju patogena. Podobne wyniki otrzymał Clarkson i in. (2014) w badaniach nad porażeniem sałaty przez S. sclerotiorum. Na podstawie tych wyników stwierdzono, że rozwój choroby jest szybki, gdy wilgotność względna powietrza wynosi % przy temperaturze 20 C. Szybkiemu rozwojowi choroby sprzyjają również temperatury C przy wilgotności 85%. W przedstawionych badaniach nad stopniem odporności roślin rzepaku stwierdzono duży wpływ sumy opadów i temperatury w okresie siedmiu dni po przeprowadzonej inokulacji. Analiza korelacji wykazała bardzo wysoką dodatnią zależność między średnią indeksów porażenia inokulowanych roślin rzepaku wszystkich badanych odmian z sumą siedmiodniowych opadów (r = 0,79). Natomiast w przypadku związku średnich tygodniowych temperatur (od momentu inokulacji) ze średnią indeksów porażenia uzyskano ujemną, niemal pełną korelację (r = -0,98), co oznacza, że im wyższa temperatura tym występował niższy indeks porażenia. 67

71 7. Podsumowanie i wnioski Izolaty S. sclerotiorum zebrane w latach i siedem izolatów tego gatunku wybranych do oceny stopnia odporności odmian rzepaku ozimego istotnie różniło się między sobą pod względem wytwarzania kwasu szczawiowego Otrzymane wyniki świadczą o potencjalnym zagrożeniu występowania zgnilizny twardzikowej na rzepaku nie tylko w tych miejscowościach, gdyż są one reprezentacyjne dla regionów Polski. Wytwarzanie kwasu szczawiowego zależało od szybkości wzrostu liniowego grzybni izolatów S. sclerotiorum. Stwierdzono niemal pełną korelację Pearsona pomiędzy wielkością średnicy 48 godzinnych kolonii izolatów S. sclerotiorum z roku 2014 i powstających przebarwień pod wpływem wytwarzanego przez te izolaty kwasu szczawiowego. W dostępnej literaturze nie znaleziono informacji o takiej zależności wykazanej w niniejszej pracy. Na podstawie analizy RAPD z dwunastoma starterami dla izolatów S. sclerotiorum z lat oraz analizy podobieństw Nei & Li corocznie stwierdzano duże podobieństwo między izolatami patogena pochodzącymi z tej samej miejscowości. Przy pomocy analizy RAPD i analizy podobieństw wg Nei & Li siedmiu izolatów S. sclerotiorum wybranych do oceny stopnia odporności odmian rzepaku ozimego wyodrębnione izolaty 01MAL/09 i 31MAL/09 były najbardziej odległe genetycznie. Największym podobieństwem odznaczały się izolaty S.s.-3 i 24BAK/09. Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) produktów amplifikacji metodą RAPD izolatów S. sclerotiorum uzyskanych z trzech miejscowości w latach wykazała każdego roku niewielkie różnice genetyczne między izolatami patogena w zależności od miejsca pochodzenia (13% r., 4% r., 7% r.). Na podstawie analizy podobieństw polimorfizmu produktów amplifikacji oraz analizy wariancji molekularnej (AMOVA) przy użyciu starterów mikrosatelitarnych dla izolatów S. sclerotiorum stwierdzono bardzo duże ich zróżnicowanie. To zróżnicowanie nie korespondowało z wyodrębnionymi grupami podobieństw związanych z pochodzeniem izolatów patogena, czy zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego. Duży stopień porażania 10 odmian rzepaku przez S. sclerotiorum związany jest z dużym zróżnicowaniem izolatów tego gatunku pod względem zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego, dużą molekularną zmiennością genetyczną oraz 68

72 dużymi różnicami ich chorobotwórczości. Ponadto badane odmiany z trzech różnych typów charakteryzują się małym zróżnicowaniem pod względem odporności na tego patogena. W ciągu trzech lat badań wyodrębniono najmniej patogeniczny spośród siedmiu badanych izolat 31MAL/09, który również charakteryzował się niską produkcją kwasu szczawiowego. Analiza korelacji Pearsona wykorzystana do porównania zdolności wybranych izolatów S. sclerotiorum do wytwarzania kwasu szczawiowego i ich chorobotwórczości wobec roślin rzepaku wykazała dodatnią bardzo wysoką zależność. Suma opadów oraz temperatura w okresie siedmiu dni od inokulacji roślin rzepaku ozimego przez S. sclerotiorum mają duży wpływ na stopień ich porażenia. Wykazano dodatnią, bardzo wysoką korelację między średnią indeksów porażenia inokulowanych roślin rzepaku wszystkich badanych odmian z sumą siedmiodniowych opadów (r = 0,79). Ujemną, niemal pełną korelację uzyskano dla średnich indeksów porażenia i średnich temperatur dla okresu siedmiu dni od inokulacji (r = -0,98). 69

73 8. Streszczenie Sclerotinia sclerotiorum jest jednym z najgroźniejszych patogenów rzepaku, powodującym chorobę zwaną zgnilizną twardzikową. Grzyb ten poraża również około 400 innych gatunków roślin dwuliściennych i charakteryzuje się dużą zmiennością. Celem badań była charakterystyka populacji S. sclerotiorum występujących w trzech miejscowościach. Badania dotyczyły wytwarzania kwasu szczawiowego oraz molekularnej zmienności genetycznej tego patogena pochodzącego z rzepaku, a także oceny odporności na niego trzech typów odmian rzepaku ozimego. Materiał badawczy stanowiły izolaty S. sclerotiorum zebrane w latach , z trzech lokalizacji: Małyszyna (województwo lubuskie), Borowa (województwo wielkopolskie) i Bąkowa (województwo opolskie) oraz dziesięciu różnych odmian rzepaku ozimego. Do badania odporności odmian na S. sclerotiorum wykorzystano siedem izolatów patogena (01MAL/09, 31MAL/09, 04BOR/09, 24BOR/09, 05BAK/09, 24BAK/09 i S.s.-3) wcześniej scharakteryzowanych pod względem produkcji kwasu szczawiowego oraz potwierdzonej przynależności gatunkowej (analiza sekwencji regionu ITS). Stwierdzono duże zróżnicowanie izolatów S. sclerotiorum pod względem zdolności wytwarzania kwasu szczawiowego. W każdej miejscowości znajdowały się izolaty grzyba produkujące duże i małe ilości tego kwasu. Corocznie oceniano poziom produkcji kwasu szczawiowego w warunkach in vitro przez siedem izolatów S. sclerotiorum wykorzystywanych do oceny stopnia odporności odmian rzepaku. Wykazano występowanie zmienności tej cechy u tych izolatów w latach Tylko izolat 31MAL/09 odznaczał się zawsze podobnym, niskim poziomem wytwarzania kwasu szczawiowego. Dodatkowo przeprowadzona analiza korelacji Pearsona wykazała na płytkach Petriego niemal pełną zależność między wielkością kolonii S. sclerotiorum pochodzących z 2014 roku i powstałych przebarwień pod wpływem wydzielanego kwasu przez te kolonie. Analizy molekularne z wykorzystaniem markerów RAPD oraz mikrosatelitarnych potwierdziły zróżnicowanie między badanymi izolatami S. sclerotiorum na poziomie DNA. Na podstawie analizy RAPD oraz wykorzystania miary podobieństw według Nei i Li stwierdzono grupy podobieństw dla izolatów grzyba pochodzących z tej samej miejscowości. Jednak analiza wariancji molekularnej (AMOVA) wykazała między izolatami z różnych miejscowości niski poziom różnic wynoszący 4 13% w zależności 70

74 od roku. Analizy z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych oraz utworzony dendrogram na podstawie miary podobieńsw Nei i Li ukazały bardzo duże zróżnicowanie między badanymi izolatami S. sclerotiorum, a dodatkowo przeprowadzona analiza wariancji molekularnej (AMOVA) wykazała 100% zróżnicowanie w obrębie populacji grzyba z danych miejscowości. Odmiany rzepaku ozimego każdego roku ulegały porażeniu przez wybrane izolaty S. sclerotiorum. Różnice w stopniu porażenia roślin jednak nie były istotne statystycznie. Izolat 31MAL/09, który wytwarzał najmniej kwasu szczawiowego okazał się najmniej patogeniczny. Dodatkowo jednoznacznie stwierdzono wpływ poziomu produkcji kwasu szczawiowego przez izolaty S. sclerotiorum na chorobotwórczość wobec roślin rzepaku. Współczynnik korelacji Pearsona dla powyższych cech był niemal pełny w 2012 roku (r = 0,95) i bardzo wysoki w latach 2013 (r = 0,73) oraz 2014 (r = 0,82). Porażenia roślin rzepaku w bardzo dużym stopniu zależały od sumy opadów oraz temperatury w okresie siedmiu dni od ich inokulacji wybranymi izolatami S. sclerotiorum. Analiza korelacji wykazała dodatnią, bardzo wysoką zależność między sumą tygodniowych opadów od momentu inokulacji, a stopniem porażenia rzepaku (r = 0,79), natomiast dla temperatur w tym okresie i stopnia porażenia stwierdzono niemal pełną korelację ujemną (r = -0,98). Przeprowadzone badania potwierdzają istnienie różnorodności i zmienności genetycznej populacji S. sclerotiorum oraz niestety niski poziom odporności na tego patogena ocenianych 10 odmian rzepaku ozimego. 71

75 Summary Sclerotina sclerotiorum is one of the most serious rapeseed pathogens which causes its disease known as sclerotinia stem rot. This fungus also affects about 400 other species of dicotyledonous plants and is characterised by considerable variability. The aim of the investigation was characterisation of S. sclerotiorum populations in three different places. The performed experiments focused on oxalic acid production by this pathogen and its genetic molecular variability derived from rapeseed as well as on the evaluation of three types of winter rapeseed cultivars resistance to the pathogen. The experimental material comprised ten different winter rapeseed cultivars as well as S. sclerotiorum isolates collected in years from the following three locations: Małyszyn (Lubuskie Voivodeship), Borowo (Wielkopolska Voivodeship) and Bąków (Opole Voivodeship). The following seven isolates of the pathogen (01MAL/09, 31MAL/09, 04BOR/09, 24BOR/09, 05BAK/09, 24BAK/09 and S.s.-3) were employed to investigate the resistance of rapeseed cultivars to S. sclerotiorum. They were earlier characterised with regard to oxalic acid production and confirmed genetic affiliation (DNA ITS). It was determined significant variability of S. sclerotiorum isolates with respect to their ability to produce oxalic acid. In each site, there were fungal isolates which produced high and low quantities of this acid. Every year, the author evaluated, in in vitro conditions, levels of oxalic acid production by seven S. sclerotiorum isolates utilised for the assessment of the degree of resistance of rapeseed cultivars. It was demonstrated that the above characteristic in the examined isolates varied in years Only isolate 31MAL/90 was always characterised by a similar, low level of the oxalic acid production. In addition, the performed Pearson s correlation analysis showed, on Petri dishes, almost total dependence between the size of S. sclerotiorum colonies derived from 2014 and the developed discolorations under the influence of the acid secreted by these colonies. Molecular analyses employing RAPD and microsatellite markers corroborated differences between the examined S. sclerotiorum isolates at the DNA level. On the basis of RAPD analysis and employing the measure of similarities according to Nei and Li, similarity groups were established for fungal isolates derived from the same site. However, the analysis of molecular variance (AMOVA) carried out between isolates derived from different site demonstrated a low level of differences ranging from 4 to 13%, depending on the year. Analyses utilising microsatellite markers as well as the plotted dendrogram on the basis of the measure of similarities according to Nei and Li showed 72

76 very strong variability between the examined S. sclerotiorum isolates and, in addition, the performed analysis of molecular variance (AMOVA) revealed 100% variability within fungal populations derived from given sites. Every year, ten cultivars of winter rapeseed were inoculated by the selected S. sclerotiorum isolates. However, differences in the degree of plant infection were not statistically significant. The 31MAL/09 isolate, which produced the smallest quantities of oxalic acid, turned out to be the least pathogenic. Moreover, it was demonstrated unequivocally that the level of oxalic acid produced by S. sclerotiorum isolates influenced pathogenicity towards rapeseed plants. Pearson s coefficient for the above traits was almost full in 2012 (r = 0.95) and very high in 2013 (r = 0.73 and 2014 (r = 0.82) The infection of the rapeseed plants depended, to a large extent, on total precipitation and temperature during seven days following their inoculation with the selected S. sclerotiorum isolates. The performed correlation analysis revealed high dependence between the sum of weekly precipitation from the moment of inoculation and the degree of rapeseed infection (r = 0.79), whereas in the case of temperatures during this period and the degree of infection negative, nearly complete correlation (r = -0.98) was obtained. The discussed experiments confirmed the existence of genetic diversity and variability of S. sclerotiorum populations and, unfortunately, a low level of resistance to this pathogen of the 10 evaluated winter rapeseed cultivars. 73

77 9. Literatura 1. Abawi G. S., Grogan R. G Source of primary inoculum and effects of temperature and moisture on infection of beans by Whetzelinia sclerotiorum. Phytopathology 65: Abawi G. S., Grogan R. G Epidemiology of diseases caused by Sclerotinia species. Phytopathology 69: Ahmadifar M., Dalil A Evaluation of Rapeseed Genotypes Resistance to Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) De Bary. American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 13 (4): Akkaya M..S., Bhagwat A.A., Cregan P.B Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132: Alavi N., Dalili A Evaluation of resistance in rapeseed lines against Sclerotinia rot (Sclerotinia sclerotiorum). Journal of Oilseed Brassica, 5(1) : Aldrich-Wolfe L., Travers S., Nelson B. D. Jr Genetic Variation of Sclerotinia sclerotiorum from Multiple Crops in the North Central United States. PLoS ONE 10(9): e Arseniuk E., Oleksiak T Polski wkład w rozwój hodowli i uprawy rzepaku. W: Rzepak nowe wyzwania (red. G. Milewski), s Wyd. Bizness-Press. 8. Atallah Z. K., Larget B., Chen X., Johnson D. A High genetic diversity, phenotypic uniformity, and evidence of out crossing in Sclerotinia sclerotiorum in the Columbia basin of Washington state. Phytopathology 94: Attanayake R. N., Porter L., Johnson D. A., Chen W Genetic and phenotypic diversity and random association of DNA markers of isolates of the fungal plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum from soil on a fine geographic scale. Soil. Biol. Biochem. 55: Attanayake R. N., Tennekoon V., Johnson D. A., Porter L. D., del Río-Mendoza L., Jiang D., Chen W Inferring outcrossing in the homothallic fungus Sclerotinia sclerotiorum using linkage disequilibrium decay. Heredity 113: Bardin S. D., Huang H. C Research on biology and control of Sclerotinia diseases in Canada. Can J Plant Pathol. 23(1): Bartkowiak-Broda I Studia nad systemami męskiej niepłodności u rzepaku Brassica napus L. var. oleifera. Hodowla RoślinAklimatyzacja i Nasiennictwo t.: 35, z.: 3/4. Rozprawa habilitacyjna. 74

78 13. Bartkowiak-Broda I Wzajemny związek postępu w agrotechnice i hodowli rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste, t. XXIII, s Bartkowiak-Broda I Kierunki hodowli i nasiennictwo. W: Muśnicki Cz., Bartkowiak-Broda I., Mrówczyński M.: Technologia produkcji rzepaku, wyd. Wieś Jutra, Warszawa Bartkowiak-Broda I Nowe odmiany rzepaku, nowa jakość oleju. Teraz Rzepak Teraz Olej, tom II; Olej Rzepakowy Nowy Surowiec, Nowa Prawda: Bartkowiak-Broda I Nowe kierunki hodowli warunkiem wzrostu znaczenia rzepaku jako rośliny oleisto-białkowej. W: Rzepak integrowana produkcji (red. Ludwik Zaremba), s Wyd. Bizness-Press. 17. Bartkowiak-Broda I., Muśnicki Cz., Grzebisz W., Praczyk T Rozwój rzepaku w: Muśnicki Cz., Bartkowiak-Broda I., Mrówczyński M.: Technologia produkcji rzepaku, wyd. Wieś Jutra, Warszawa: Baswana K. S., Rastogi K. B., Sharma P. P Inheritance of stalk rot resistance in cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L). Euphytica 57: Bateman D. F., Beer S. V Simultaneous production and synergistic action of oxalic acid and polygalacturonase during pathogenesis by Sclerotinia rolfsii. Phytopathology 55: Bolland G. J., Hall R Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum. Can. J. Plant Pathol. 16: Brun H., Jouan B., Plessis J., Tribodet, M Properties preventives et curatives de la procym-adone et du benomyl dams la lutte centre Sclerotinia sclerotiorum sur colza. In: 6th Rapeseed Conf. Paris, May, p. 187 (Abstr.). 22. Carbone I., Kohn L. M A microbial population-species interface: nested cladistics and coalescent inference with multilocus data. Mol Ecol 10: Cegielska-Taras T., Szała L Regeneracja roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego Brassica napus L. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XVIII: Cegielska-Taras T., Szała L., Gazecka B. Liersch A., Popławska W., Bartkowiak- Broda I Wczesna selekcja androgenicznych linii rzepaku ozimego z genem restorerem dla systemu CMS ogura i niską zawartością glukozynolanów. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej w Krakowie 250: Cessna S. G., Sears V. E. Dickman M. B., Low P. S Oxalic acid, a pathogenicity factor for Sclerotinia sclerotiorum suppresses the oxidative burst of the host plant. Plant Cell 12:

79 26. Chen C., Harel A., Gorovoits R., Yarden O., Dickman M. B MPAK regulation of sclerotial development in Sclerotinia sclerotiorum is linked with ph and camp sensing. Mol. Plant Microbe. Interact. 17: Chen H.F., Wang H., Li Z.Y Production and genetic analysis of partial hybrids in intertribal crosses between Brassica species (B. rapa, B. napus) and Capsella bursapastoris. Plant Cell Reports 26, Clarkson J. P., Coventry E., Kitchen J., Carter H. E., Whipps J. M Population structure of Sclerotinia sclerotiorum in crop and wild hosts in the UK. Plant Pathology 62, Clarkson J. P., Fawcett L., Anthony S. G., Young C A Model for Sclerotinia sclerotiorum Infection and Disease Development in Lettuce, Based on the Effects of Temperature, Relative Humidity and Ascospore Density. PLOS ONE 9(4): e Clifton P. M Rapeseed: Nutritional aspects of a novel oil. 10 th International Rapeseed Congress, Canberra Australia Colagar AH, Saadati M, Zarea M and Talei SA Genetic variation of the Iranian Sclerotinia sclerotiorum isolates by standardizing DNA polymorphic fragments. Biotechnol. 9: Coley-Smith J. R., Cooke R. C Survival and germination of fungal sclerotia. Annu. Rev. Phytopath. 9: Cuong N.D., Dohroo N.P Morphological, cultural and physiological studies on Sclerotinia sclerotiorum causing stalk rot of cauliflower. Omonrice 14: Czyżewski J. A Choroby i szkodniki roślin ozdobnych. PWRiL, Warszawa. 35. Derbyshire M. C., Denton-Giles M The control of sclerotinia stem rot on oilseed rape (Brassica napus): current practices and future opportunities. Plant Pathology 65: Delourme R., Barbetti M., Snowdon R., Zhao J., Manazanares-Dauleux M. J Genetics and genomics of disease resistance. In: D Edwards, J Batley, IAP Parkin, C Kole, eds. Genetics, genomics and breeding of oilseed brassicas. Boca Raton, FL: Science Publishers, Delourme R., Falentin C., Huteau V., Clouet V., Horvais R., Gandon B., Specel S., Hanneton L., Dheu J. E., Deschamps M., Margale E., Vincourt P., Renard M Genetic control of oil content in oilseed rape (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet. 113:

80 38. del Río L. E., Bradley C. A., Henson R. A., Endres G. J., Hanson B. K., McKay K., Halvorson M., Porter P. M., Le Gare D. G., Lamey H. A Impact of Sclerotinia Stem Rot on Yield of Canola. Plant Disease 91: Dembiński F Rzepak i rzepik PWRiL. 40. Ding Y., Mei J., Li Q., Liu Y., Wan H., Wang L. Becker H. C., Qian W Improvement of Sclerotinia sclerotiorum resistance in Brassica napus by using B. oleracea. Genet. Resour. Crop. Evol. 60: Domański Cz Testy statystyczne. Państwowe Wydawnictwo Ekonomiczne. 42. Durman S. B., Menendez A. B., Godeas A. M Variation in oxalic acid production and mycelial compatibility within field populations of Sclerotinia sclerotiorum. Soil. Biol. Biochem. 37: Dutton M. V., Evans C. S Oxalate production by fungi: its role in pathogenicity and ecology in the soil environment. Can. J. Microbiol. 42: EL-Argawy E Oxalic acid production by Sclerotinia sclerotiorum and its relation to pathogenicity. J. Plant Prot. and Path., Mansoura Univ., Vol. 3 (3): Ellsworth D. L., Rittenhouse K. D., Honeycutt R. L Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. Biotechniques 14 (2): Feng J., Long Y., Shi L., Shi J., Barker G., Meng J Characterization of metabolite quantitative trait loci and metabolic networks that control glucosinolate concentration in the seeds and leaves of Brassica napus. New Phytologist 193, Fernando D.W.G., Nakkeeran S., de Kievit T., Poritsanos N., Zhang Y., Paulitz T.C., Li Z., Ramarathnam R Multiple mechanisms of biocontrol by Pseudomonas chlororaphis PA23 affect stem rot of canola caused by Sclerotinia sclerotiorum. Proceedings of the 12th International Rapeseed Congress, , Wuhan, Chiny, 4: Fu S., Lu Z., Chen Y., Gi C., Pu H., Zhang J Inheritance of apetalous character in Brassica napus L. and its potential in breeding. Proceedings of the Symposium on China International Rapeseed Sciences, Garg H., Kohn L.M., Andrew M., Li H., Sivasithamparam K., Barbetti M.J. 2010a. Pathogenicity of morphologically different isolates of Sclerotinia sclerotiorum with Brassica napus and B. juncea genotypes. Eur. J. Plan.t Pathol. 126: Ge X. T., Li Y. P., Wan Z. J., You M., Finnegan P. M., Banga S. S., Sandhu P. S., Garg H., Salisbury P. A., Barbetti M Delineation of Sclerotinia sclerotiorum 77

81 pathotypes using differentia resistance responses on Brassica napus and B. juncea genotypes enables identification of resistance to prevailing pathotypes. Field Crops Res. 127: Godoy G., Steadman J. R., Dickman M. B., Dam R Use of mutants to demonstrate the role of oxalic acid in pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum on Phaseolus vulgaris. Physiol. Mol. Plant Pathol. 37: Gracia-Garza J. A., Neumann S., Vyn T. J., Boland, G. J Influence of crop rotation and tillage on production of apothecia by Sclerotinia sclerotiorum. Can. J. Plant Pathol. 24: Guimarães R. L., Stotz H. U Oxalate production by Sclerotinia sclerotiorum deregulates guard cells during infection. Plant Physiol. 136: Guilford J. P Podstawowe metody statystyczne w psychologii i pedagogice. Wydawnictwo PWN, wyd. II, tłumaczenie Józef Wojtyniak. 55. Harper A. L., Trick M., Higgins J. Fiona Fraser, Clissold L., Wells R., Hattori C., Werner P., Bancroft I Associative transcriptomics of traits in the polyploid crop species Brassica napus. Nature Biotechnology 30, Hasan M., Seyis F., Badani A. G., Pons-Kuhnemann J., Lühs W., Friedt W., Snowdon R. J Analysis of genetic diversity in the Brassica napus L. gene pool using SSR markers. Genet. Resour. Crop Evol. 53: Hegedus D. D., Rimmer S. R Sclerotinia sclerotiorum: when to be or not to be a pathogen? FEMS Microbiology Letters 251, Hoyte S. M Epidemiology and management of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary in kiwifruit (Actinidia deliciosa (A. Chev.)) [Accessed: ]. 59. Jajor E., Korbas M., Horoszkiewicz-Janka J., Wójtowicz M Wpływ ochrony fungicydowej i warunków meteorologicznych na porażenie odmian rzepaku przez Sclerotinia sclerotiorum. Progress in Plant Protection 50 (3): Kala R Elementy wnioskowania parametrycznego dla przyrodników. Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, pod redakcją prof. dr hab. Zefiryna Adamskiego. 61. Karaoglu H., Lee C.M.Y., Meyer W Survey of simple sequence repeats in completed fungal genomes Mol. Bio. Evol., 22:

82 62. Khandka D. K., Tuna M., Tal M., Nejidat A., Golan-Goldhirsh A Variability in the pattern of random amplified polymorphic DNA. Electrophoresis 18 (5): Kim K. S., Min J. Y., Dickman M. B Oxalic acid is an elicitor of plant programmed cell death during Sclerotinia sclerotiorum disease development. Mol. Plant Microbe Int. 21: Koch S., Dunker S., Kleinhenz B., Röhrig M., Tiedemann A. 2007a. A crop lossrelated forecasting model for Sclerotinia stem rot in winter oilseed rape. Phytopathol. 97(9): Koch S., Dunker S., Kleinhenz B., Rohrig M., Tiedmann A. 2007b. SklerPro a crop loss-related forecasting model for chemical control of Sclerotinia stem rot in winter oilseed rape in Germany. Proceedings of the 12th International Rapeseed Congress, , Wuhan, Chiny, 4: Kohn L. M Delimitation of the economically important pathogenic Sclerotinia species. Phytopathology 69: Korbas M., Czubiński T., Horoszkiewicz-Janka J., Jajor E., Danielewicz J Atlas chorób roślin rolniczych dla praktyków. Polskie Wydawnictwo Rolnicze Sp. Z o.o., Poznań 2015 wydanie I, redakcja Top Agrar: Krüger W Control measures for Sclerotinia sclerotiorum in rape. Phytopath. Z. 77: Krüger W. 1975a. Influence of more environmental factors on the development of apothecia and ascospores of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Z. Pflimzenkaran Kh Planzensehtz. 82: Krüger W. 1975b. Influence of weather on the attack of rape by Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Nachrichtenble Devet. Pflanzenschutzd. (Braunschweig) 27: Krüger W The influence of environmental factors on the apothecial development of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Nachrichtenblatt Deut. Pflanzensehtzd. (Braunschweig.) 28: Krüger W On the effect of calcium cyanamide on the development of apothecia of Whetzelinia sclerotiorum (Lib.) Korf and Dumont, the agent of stalk rot of rape. Rev. Plant. Pathol. 59: 5438 (Abstr.). 73. Kryczyński S., Weber Z. (red.) Choroby roślin uprawnych. Fitopatologia 2. PWRiL:

83 74. Krzymański J Variation in thioglucosides in rapeseed meal (Brassica napus). Meeting of Associate Commitees of the National Research Council on Plant Breeding, 20 February 1968, Winnipeg, Kanada. 75. Krzymański J Genetyczne możliwości ulepszania składu chemicznego nasion rzepaku ozimego. Hodowla Roślin, Aklimatyzacja i Nasiennictwo. 14(2): Krzymański J Agronomy of Brassicas. Proceedings of the International Symposium on Brassicas September, Rennes, France. Acta Horticulturae 459: Krzymański J Nieżywnościowe wykorzystanie rzepaku. W: Muśnicki Cz., Bartkowiak-Broda I., Mrówczyński M.: Technologia produkcji rzepaku, wyd. Wieś Jutra, Warszawa: Krzymański J., Piotrowska A., Ogrodowczyk M Zdolność kombinacyjna odmian i rodów rzepaku ozimego oraz przewidywane plonowanie syntetyków z nich utworzonych. Rośliny Oleiste t. XX, z. 2: Kurian P., Stelzig D. A The synergistic role of oxalic acid and endopolygalacturonase in bean leaves infected by Cristulariella pyramidalis. Phytopathology 69: Li GQ, Huang HungChang, Ren Li, Huang Juan, Barka EA and Clément C. 2008a. Role of oxalic acid in pathogenesis, sclerotial development and management of the plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum. In: Plant-microbe interactions (ISBN ): Li Z., Zhang M., Wang Y., Li R. and Dilantha Frernando, W. G. 2008b. Mycelial compatibility group and pathogenicity variation of Sclerotinia sclerotiorum populations in sunflower from China, Canda and England. Plant Pathology Journal, 7 (2): Li C., Li H., Sivasithamparam K., Fu T., Li Y., Liu S., Barbetti M Sources of resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Brassica napus and B. juncea germplasm for China and Australia. In 12th International Rape Seed Congress, Wuhan, Vol. 4: Liersch A Wpływ zmienności genetycznej na efekt heterozji u rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera) Praca doktorska, ZGiHRO IHAR w Poznaniu. 84. Liersch A., Bartkowiak-Broda I., Ogrodowczyk M Ocena plonowania i cech jakościowych różnego typu odmian mieszańcowych rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste Oilsedd Crops XXI:

84 85. Litholdo Júnior C. G., Gomes E. V., Lobo Júnior M., Nasser L. C. B., Petrofeza S Genetic diversity and mycelial compatibility groups of the plant-pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum in Brazil. Genet. Mol. Res. 10: Litt M., Luty J. A A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics 44: Liu S., Wang H., Zhang J., Fitt B. D. L., Xu Z. Evans N., Liu Y., Yang W., Guo X In vitro mutation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep, 24: Lu G. Y., Harper A. L., Trick M., Morgan C., Fraser F., O'Neill C., Bancroft I Associative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolate content in Brassica napus. DNA Research 21, Lucas J. A Survival, surfaces and susceptibility the sensory biology of pathogens. Plant Pathol. 53: Magro P., Marciano P., Lenna P Oxalic acid production and its role in pathogenesis of Sclerotinia sclerotiorum. FEMS Microbiol. Lett. 24: Mandal A.K., Dubey S.C World Journal of Microbiology and Biotechnology 28 (4): Mańkowski D. R., Laudański Z., Janaszek M Przydatność wybranych miar podobieństwa dla danych binarnych do analiz wielocechowych w badaniach molekularnych. Biuletyn Instytutu Hodowli I Aklimatyzacji Roślin 262: Marciano P., Lenna P. Di, Magro P Oxalic acid, cell wall-degrading enzymes and ph in pathogenesis and their significance in the virulence of two Sclerotinia sclerotiorum isolates on sunflower. Physiol. Mol. Plant Pathol. 22: Matuszczak M Markery molekularne w badaniach rzepaku (Brassica napus L.) I. Przegląd stosowanych technik. Rośliny Oleiste Oilseed Crops XXXIV (2): Maxwell D. P., Lumsden R. D Oxalic acid production by Sclerotinia sclerotiorum in infected bean and in culture. Phytopathology 60: Mehta N Epidemiology and forecasting for the management of rapeseed-mustard diseases. Journal of Mycology and Plant Pathology, 44 (2): Mei J., Ding Y., Lu K., Wei D., Liu Y., Disi J.O., Li J., Liu L., Liu S., McKay J., Qian W. 2013a. Identification of genomic regions involved in resistance against Sclerotinia sclerotiorum from wild Brassica oleracea. Theor. Appl. Genet. 126,

85 98. Mei J.Q., Ding Y.J., Lu K. et al. 2013b. Identification of genomic regions involved in resistance against Sclerotinia sclerotiorum from wild Brassica oleracea. Theoretical and Applied Genetics 126, Mert-Türk F., Ipek M., Mermer D., Nicholson P Microsatellite and morphological markers reveal genetic variation within a population of Sclerotinia sclerotiorum from oilseed rape in the Çanakkale Province of Turkey. J Phytopathol 155: Mila A. L., Yang X. B Effects of fluctuating soil temperature and water potential on sclerotia germination and apothecial production of Sclerotinia sclerotiorum. Plant Dis. 92: Mo M., Li Z., Li R., Chen Y., Fernando D.W.G Analysis of mycelial compatibility and pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum isolated from oilseed crops in Canada, China, USA and England. Proceedings of the 12th International Rapeseed Congress, , Wuhan, Chiny, 4: Morrall R. A. A., Duczek I. J., Mc Kenzie D. L., McGee, D. C Some aspects of Sclerotinia sclerotiorum in Saskatchewan Can. Plant Dis. Surv. 56: Muśnicki Cz Rośliny Oleiste. Rozdział skryptu do ćwiczeń dla studentów Akademii Rolniczej w Poznaniu Szczegółowa uprawa roślin pod redakcją A. Dubasa i S. Gładysiaka. AR Poznań: Nei M., Li W. H Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: Nowakowska J., Bartkowiak-Broda I. Ogrodowczyk M Wstępne badania związku między efektem heterozji mieszańców F1 rzepaku ozimego (Brassica napus L.) adystnsem genetycznym linii rodzicielskich. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXVI (1): Noyes R. D., Hancock J. G Role of oxalic acid in the Sclerotinia wilt of sunflower. Physiol. Plant Pathol. 8: Palmer C-L., Skinner W Mycosphaerella graminicola: latent infection, crop devastation and genomics. Mol. Plant Pathol. 3 (2): Parker P. G., Snow A. A., Schug M. D., Booton G. C., Fuerst P. A What molecules can tell us about populations: choosing and using a molecular marker. Ecology 79 (2): Partyka R. E., Mai W. F Effect of environment and some chemicals on Sclerotinia sclerotiorum in laboratory and potato field. Phytopathology 52:

86 110. Pedersen A., Baumstark M. W. Marckmann P. Gylling H. Sandström B An olive oil-rich diet results in higher concentrations of LDL cholesterol and higher number of LDL subfractioin particles than rapeseedoil and sunflower oil diets. Journal of Lipid Research 41: Perez T., Albornoz J., Dominguez A An evaluation of RAPD fragment reproducibility and nature. Molecular Ecology 7 (10): Phillips A. J. L Carpogenic germination of sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum: A review. Phytophylactica 19: Pietruszyński Z Uprawa rzepaku i rzepiku. Warszawa CZPT Purdy L. H Sclerotinia sclerotiorum: History, diseases and symptomatology, host range, geographical distribution and impact. Phytopathology 69: Rollins J. A The Sclerotinia sclerotiorum pac1 gene is required for sclerotial development and virulence. Mol. Plant Microbe Interact. 16: Rollins J. A., Dickman M. B ph signaling in Sclerotinia sclerotiorum identification of a pac C/ RIM 1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 67: Rouxel T., Penaud A., Pinochet X., Brun H., Gout L., Delourme R., Schmit J., Balesdent M.H A 10-year survey of populations of Leptosphaeria maculans in France indicates a rapid adaptation towards the Rlm1 resistance gene of oilseed rape. Eur. J. Plant Pathol. 109 (8): Rybacki R Rzepak jako surowiec dla przemysłu olejarskiego. W: Muśnicki Cz., Bartkowiak-Broda I., Mrówczyński M.: Technologia produkcji rzepaku, Wieś Jutra, Warszawa: Saito I Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Studies on the maturation and germination of sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, a causal fungus of bean stem rot. Report Hokkaido Prefectural Agric. Exp. Stn. No. 26, March, Hokkaido Central Agricultural Experiment Station, , Japan, 106 p Scarth R., McVetty P. B. E Designer oil canola a review of a new food-grade oils with focus on high oleic, low linolenic types. Proc. Of the Xth International Rapeseed Congress. Canberra, Australia, September 26-29, Schwartz H. F., Steadman J. R Factors affecting sclerotium population of and apothecium production by Sclerotinia sclerotiorum. Phytopathology 68: Sexton A. C., Whitten A. R., Howlett B. J Population structure of Sclerotinia sclerotiorum in an Australian canola field at flowering and stem-infection stages of the disease cycle. Genome 49:

87 123. Sharma P., Meena P. D., Kumar S., Chauhan J. S Genetic diversity and morphological variability of Sclerotinia sclerotiorum isolates of oilseed Brassica in India. African Journal of Microbiology Research 7 (18): Singh V. P., Singh R. B., Gupta, S Effect of temperature on sclerotial germination, growth and sclerotial formation in Sclerotinia sclerotiorum. J. Plant Dis. Prot. 92: Sirjusingh C., Kohn L. M Characterization of microsatellites in the fungal plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum. Mol. Ecol. Notes 1: Słomski R., Kowalska K., Jura J Analiza powtórzeń minisatelitarnych w DNA. Słomski R. red. (2004). Przykłady analiz DNA. AR Poznań Smith V. L., Punja Z. K., Jenkins S. F A histological study of infection of host tissue by Sclerotinia rolfsii. Phytopathology 76: Song K M, Osborn T C Polyphyletic origins of Brassica napus: new evidence based on organelle and nuclear RFLP analyses. Genome 35: Sosnowski M. R., Scott E. S., Ramsey M. D Pathogenic variation of South Australian isolates of Leptosphaeria maculans and interactions with cultivars of canola (Brassica napus) Australas. Plant Path. 34 (3): Spasibionek S., Matuszczak M., Piętka T., Krótka K., Krzymański J Możliwości dalszego obniżania zawartości glukozynolanów w nasionach rzepaku podwójnie ulepszonego (Brassica napus L.) Rośliny oleiste t. XXXVII: Starzycka E., Kachlicki P., Starzycki M Zróżnicowanie polskich i chińskich izolatów Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary pod względem zdolności do wytwarzania kwasu szczawiowego. Rośliny Oleiste Oilseed Crops t. XXIII (2): Starzycka E., Starzycki M Najważniejsze wyniki badań nad zgnilizną twardzikową rzepaku przedstawione na XII Międzynarodowym Kongresie Rzepakowym w Wuhan. Rośliny Oleiste Oilseed Crops t. XXIX (2): Starzycka E., Starzycki M In vivo and in vitro investigations on ph changes in winter rape (Brassica napus) under the influence of Sclerotinia sclerotiorum mycotoxin. Phytopathologia 61: Starzycka E., Starzycki M., Cichy H., Mikołajczyk K Badanie odporności rzepaku ozimego na porażenie przez Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Rośliny Oleiste Oilseed t. XIX (2):

88 135. Starzycka E., Starzycki M., Kauzik M., Woś H., Cichy H., Budzianowski G Ocena odporności rzepaku ozimego na porażenie przez Leptosphaeria spp. i Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary w doświadczeniach przeprowadzonych w Małyszynie i Borowie, w latach Rośliny Oleiste Oilseed t. XXX (2): Sun P., and Yang X. B Light, temperature, and moisture effects on apothecium production of Sclerotinia sclerotiorum. Plant Dis. 84: Taylor A., Coventry E., Jones J. E., Clarkson J. P Resistance to a highly aggressive isolate of Sclerotinia sclerotiorum in a Brassica napus diversity set. Plant Pathology 64: Tok F. M., Derviş S., Arslan M Analysis of genetic diversity of Sclerotinia sclerotiorum from eggplant by mycelial compatibility, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) analyses. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 30:5, Townsend G. R., Heuberger J.V Methods for estimating losses caused by diseases in fungicide experiments. Plant Disease Report, vol. 24: Tóth G., Gáspári Z., Jurka J Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res. 10 (7): U N Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization. Japanese Journal of Botany 7, Uloth M. B., You M. P.,. Finnegan P. M, Banga S. S., Banga S. K., Sandhu P. S., Yi H., Salisbury P A.,. Barbetti M. J New sources of resistance to Sclerotinia sclerotiorum for crucifer crops. Field Crops Research 154: Uloth M., You M. P., Finnegan P. M., Banga S. S., Yi H., Barbetti M. J Seedling resistance to Sclerotinia sclerotiorum as expressed across diverse cruciferous species. Plant Dis. 98: Walker J. C Plant Pathology, 3rd ed. McGraw-Hill, New York, s Wang H., Liu G., Zheng Y., Wang X., Yang Q Breeding of the Brassica napus cultivar Zhongshuang 9 with high-resistance to Sclerotinia sclerotiorum and dynamics of its important defense enzyme activity. Scientia Agric. Sinica. 37: Warwick S. I., Francis A., Al-Shehbaz I. A Brassicaceae: Species checklist and database on CD-Rom Plant Systematics and Evolution, Vol. 259, Issue 2 4:

89 147. Wei W., Li Y., Wang L., Liu S., Yan X., Mei D., Li Y., Xu Y., Peng P., Hu Q Development of a novel Sinapis arvensis disomic addition line in Brassica napus containing the restorer gene for Nsa CMS and improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum and pod shattering. Theoretical and Applied Genetics 120, Wei D. Y., Mei J. Q., Fu Y., Disi J. O., Li J. N., Qian W Quantitative trait loci analyses for resistance to Sclerotinia sclerotiorum and flowering time in Brassica napus. Molecular Breeding 34, Welsh J., McClelland M Finger printing genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Research, 18 (24): Willetts H. J., Wong J. A. L The biology of Sclerotinia sclerotiorum, S. trifoliorum and S. minor with emphasis on specific nomenclature. Bot. Rev. 46: Williams B., Kabbage M., Kim H. J., Britt R., Dickman M. B Tipping the balance: Sclerotinia sclerotiorum secreted oxalic acid suppresses host defenses by manipulating the host redox environment. PLoS Pathog. 7: e Williams J. R., Stelfox D Dispersal of ascospores of Sclerotinia sclerotiorum in relations to Sclerotinia stem rot of rapeseed. Plant Dis. Reptr. 63: Williams J. R., Stelfox D Influence of farming practices in Alberta on germination and apothecium production of sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum. Can. J. Plant Pathol. 2: Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Research, 18 (22): Wolko J Możliwość poszerzenia zmienności genetycznej u Brassica napus L. Rośliny Oleiste Oilseed Crops t.xxxiii (2): Wójtowicz A., Jajor E., Wójtowicz M., Pasternak M Influence of temperature on mycelial growth and number of sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum the cause of Sclerotinia stem rot. Progress in Plant Protection 56 (2): Wu J., Cai G. Q., Tu J. Y., Li L., Liu S., Luo X., Zhou L., Fan C., Zhou Y Identification of QTLs for resistance to sclerotinia stem rot and BnaC.IGMT5.a as a candidate gene of the major resistant QTL SRC6 in Brassica napus. PLoS ONE 8, e

90 158. Yang B., Srivastava S., Deyholos M.K., Kav N.N.V Transcriptional profiling of canola (Brassica napus L.) responses to the fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum. Plant Sci. 173, Yu B., Liu P., Hong D., He Q., Yang G Improvement of Sclerotinia resistance of a Polima CMS restorer line of rapeseed via phenotypic selection, marker-assisted background selection and microspore culture. Plant Breeding, 129: Zancan W. L. A., Steadman J. R., Higgins R., Jhala R., Machado J. C Genetic and aggressiveness variation among Sclerotinia sclerotiorum dry bean isolates from Brazil fields. Bioscience Journal. 31: Zeng L.-M., Zhang J., Han Y.-C., Yang L., Wu M.-d., Jiang D.-H., Che, W., Li G. Q Degradation of oxalic acid by the mycoparasite Coniothyrium minitans plays an important role in interacting with Sclerotinia sclerotiorum. Environ Microbiol, 16: Zhao J., Meng J. 2003a. Genetic analysis of loci associated with partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum in rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet. 106: Zhao J., Meng J. 2003b. Detection of loci controlling seed glucosinolate content and their association with Sclerotinia resistance in Brassica napus. Plant Breed. 122: Zhao J.W., Buchwaldt L., Rimmer S.R., Sharpe A., McGregor L., Bekkaoui D., Hegedus D Patterns of differential gene expression in Brassica napus cultivars infected with Sclerotinia sclerotiorum. Mol. Plant Pathol. 10, Zhao J.W., Udall J.A., Quijada P.A., Grau C.R., Meng J.L., Osborn T.C Quantitative trait loci for resistance to Sclerotinia sclerotiorum and its association with a homeologous non-reciprocal transposition in Brassica napus L. Theoretical and Applied Genetics 112,

91 Załącznik 1. Tab. 32. Wyniki sekwencjonowania ITS wybranych siedmiu izolatów S. sclerotiorum. L.p. Izolat Sekwencja wzorca z Banku Genów ID: Subject do sekwencji badanej: Query 1. 01MAL/09 ID: gb KT Query 27 CTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGGCCTTGTA 86 Sbjct 49 CTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGGCCTTGTA 108 Query 87 TGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATATAATAGT 146 Sbjct 109 TGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATATAATAGT 168 Query 147 TAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG 206 Sbjct 169 TAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG 228 Query 207 ATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC 266 Sbjct 229 ATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC 288 Query 267 CCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTG 326 Sbjct 289 CCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTG 348 Query 327 GTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTGGGTCCT 386 Sbjct 349 GTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTGGGTCCT 408 Query 387 GAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCAAATTTT 446 Sbjct 409 GAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCAAATTTT 468 Query 447 CTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 496 Sbjct 469 CTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT MAL/09 ID: gb KT Query 28 CCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCCGGGGCCTTG 87 Sbjct 46 CCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCCGGGGCCTTG 105 Query 88 TATGCTCGCCAGANAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATATAATA 147 Sbjct 106 TATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATATAATA 165 Query 148 GTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG 207 Sbjct 166 GTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG 225 Query 208 CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG 267 Sbjct 226 CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG 285 Query 268 CCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCT 327 Sbjct 286 CCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCT 345 Query 328 TGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTGGGTC 387 Sbjct 346 TGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTGGGTC 405 Query 388 CTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCAAATT 447 Sbjct 406 CTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCAAATT 465 Query 448 TTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 499 Sbjct 466 TTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT BOR/09 ID: gb KT Query 17 GTANANCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGGC 76 Sbjct 43 GTAGACCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGGC 102 Query 77 CTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATAT 136 Sbjct 103 CTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATAT 162 Query 137 AATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA 196 Sbjct 163 AATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA 222 Query 197 AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT

92 Sbjct 223 AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT 282 Query 257 TGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTC 316 Sbjct 283 TGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTC 342 Query 317 AGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTG 376 Sbjct 343 AGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTG 402 Query 377 GGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCA 436 Sbjct 403 GGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCA 462 Query 437 AATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 492 Sbjct 463 AATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT BOR/09 ID: gb KT Query 25 GGTANNNCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCNCNNNNGGG 84 Sbjct 42 GGTAGACCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGG 101 Query 85 CCTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATA 144 Sbjct 102 CCTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATA 161 Query 145 TAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG 204 Sbjct 162 TAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG 221 Query 205 AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 264 Sbjct 222 AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 281 Query 265 TTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCT 324 Sbjct 282 TTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCT 341 Query 325 CAGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCT 384 Sbjct 342 CAGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCT 401 Query 385 GGGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCC 444 Sbjct 402 GGGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCC 461 Query 445 AAATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA 503 Sbjct 462 AAATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA BAK/09 ID: gb KT Query 21 GGTANNNCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGG 80 Sbjct 42 GGTAGACCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGG 101 Query 81 CCTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATA 140 Sbjct 102 CCTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATA 161 Query 141 TAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG 200 Sbjct 162 TAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG 221 Query 201 AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 260 Sbjct 222 AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 281 Query 261 TTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCT 320 Sbjct 282 TTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCT 341 Query 321 CAGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCT 380 Sbjct 342 CAGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCT 401 Query 381 GGGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCC 440 Sbjct 402 GGGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCC 461 Query 441 AAATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 497 Sbjct 462 AAATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT BAK/09 ID: gb KT Query 26 CTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGGCCTTGTA 85 Sbjct 49 CTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGGCCTTGTA 108 Query 86 TGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATATAATAGT 145 Sbjct 109 TGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATATAATAGT 168 Query 146 TAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG

93 7. S.s.-3 ID: gb KT Sbjct 169 TAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG 228 Query 206 ATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC 265 Sbjct 229 ATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC 288 Query 266 CCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTG 325 Sbjct 289 CCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTG 348 Query 326 GTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTGGGTCCT 385 Sbjct 349 GTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCTGGGTCCT 408 Query 386 GAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCAAATTTT 445 Sbjct 409 GAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCCAAATTTT 468 Query 446 CTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 495 Sbjct 469 CTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT 518 Query 24 GGTANNNCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCNNCGGGG 83 Sbjct 42 GGTAGACCTCCCACCCTTGTGTATTATTACTTTGTTGCTTTGGCGAGCTGCTCTTCGGGG 101 Query 84 CCTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATA 143 Sbjct 102 CCTTGTATGCTCGCCAGAGAATATCAAAACTCTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTACTATA 161 Query 144 TAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG 203 Sbjct 162 TAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG 221 Query 204 AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 263 Sbjct 222 AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 281 Query 264 TTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCT 323 Sbjct 282 TTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCT 341 Query 324 CAGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCT 383 Sbjct 342 CAGCTTGGTATTGAGTCCATGTCAGTAATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGCT 401 Query 384 GGGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCC 443 Sbjct 402 GGGTCCTGAACGTAGTAATATCTCTCGTTACAGGTTCTCGGTGTGCTTCTGCCAAAACCC 461 Query 444 AAATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 503 Sbjct 462 AAATTTTCTATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 521 Query 504 TA 505 Sbjct 522 TA

94 Załącznik 2 Produkty amplifikacji reakcji PCR po analizie DNA metodą RAPD dla izolatów S. sclerotiorum (przykładowe żele dla użytych starterów): Ryc. 12. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPR-01 91

95 pz pz pz Ryc. 13. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPR-02 92

96 pz pz pz Ryc. 14. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPR-03 93

97 pz pz pz Ryc. 15. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPR-04 94

98 pz pz pz pz Ryc. 16. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPS-01 95

99 pz pz pz pz Ryc. 17. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPO-02 96

100 pz pz pz pz Ryc. 18. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPO-04 97

101 pz pz pz pz Ryc. 19. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPO-05 98

102 pz pz pz pz Ryc. 20. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPP-01 99

103 pz pz pz pz Ryc. 21. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPP

104 pz pz pz pz Ryc. 22. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPP

105 pz pz pz pz Ryc. 23. Rozdział elektroforetyczny DNA izolatów S. sclerotiorum uzyskanych w roku starter OPP

106 pz pz pz pz Ryc. 24. Rozdział elektroforetyczny DNA 7 izolatów S. sclerotiorum wybranych do inokulacji odmian rzepaku 12 starterów 103

107 Załącznik 3. Przykładowe rozdziały fragmentów dla markerów mikrosatelitarnych uzyskane na sekwenatorze i odczytane przy pomocy Peak Scanner Software v1.0 (Ryc ). Ryc. 25. Marker dla locus 17-3 (GenBak: AF377911) (fragment DNA znakowane barwnikiem 6FAM niebieski) Ryc. 26. Marker dla locus (GenBak: AF377923) (fragment DNA znakowane barwnikiem VIC zielony) 104

108 Ryc. 27. Marker dla locus 92-4 (GenBak: AF377919) (fragment DNA znakowane barwnikiem NED żółty) Ryc. 28. Marker dla locus (GenBak: AF377921) (fragment DNA znakowane barwnikiem PET czerwony) 105

109 Ryc. 29. Marker dla locus 5-2 (GenBak: AF377900) (fragment DNA znakowane barwnikiem 6FAM niebieski) Ryc. 30. Marker dla locus 7-2 (GenBak: AF377902) (fragment DNA znakowane barwnikiem VIC zielony) 106