Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury badania

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number Praca oryginalna Original Article Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury badania Agnieszka Ćwiklińska 1, Marta Campoverde Parra 1, Barbara Kortas-Stempak 1,3, Małgorzata Wróblewska 2,3, Barbara Moteka 1, Marta Czyżewska 2, Agnieszka Stencel 1, Anastasis Pacanis 1,3 1 Zakład Chemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny; 2 Katedra Biochemii Klinicznej, Gdański Uniwersytet Medyczny; 3 Kolegium Medycyny Laboratoryjnej w Polsce Streszczenie Cel: W Polsce w rutynowych badaniach osadu moczu najczęściej wykorzystuje się półilościową, niestandaryzowaną metodę badania osadu pod szkiełkiem nakrywkowym. Wyniki uzyskiwane tą metodą są obarczone błędem przedanalitycznym i analitycznym, co zmniejsza ich wartość diagnostyczną. Metody: W pracy oceniono precyzję i poprawność dla postępowania ilościowego oraz rutynowego (nieilościowego) na etapie przenoszenia materiału do probówek oraz na etapie usuwania supernatantu po odwirowaniu. Następnie porównano wyniki badania osadu moczu uzyskane metodą rutynową niestandaryzowaną (preparat przygotowany pod szkiełkiem nakrywkowym) oraz metodami standaryzowanymi (preparat pod szkiełkiem i w kamerze). Standaryzacja polegała na wprowadzeniu ilościowego postępowania na etapach przygotowania osadu moczu oraz na etapie wykonania i oceny preparatu mikroskopowego. Wyniki: Dla postępowania ilościowego na etapie przenoszenia materiału do probówki i na etapie usuwania supernatantu uzyskiwano znacząco lepszą precyzję (wartość WZ niższa odpowiednio 2,5- i 6-krotnie). Dla postępowania rutynowego stwierdzano dodatkowo obecność błędu systematycznego. Przy porównaniu wyników badania osadu moczu całkowite średnie wartości WZ dla metody niestandaryzowanej i standaryzowanej (preparat pod szkiełkiem) wyniosły odpowiednio ±28,5% i ±9,4%. Dla metod standaryzowanych (preparat pod szkiełkiem i w kamerze) uzyskano porównywalne wartości WZ (±8,6%) i nie stwierdzono różnicy statystycznie znamiennej między wynikami. Wnioski: Konieczne i uzasadnione jest wprowadzenie ilościowych procedur w rutynowym badaniu osadu moczu. W pracy zaprezentowano przykładową procedurę takiego badania. Routine urine sediment examination the possibilities of improvement of the quality of results by the implementation of the standardized examination procedure Summary Aim: The semiquantitative, non-standardized examination under a coverslip is the most common urine sediment examination method in Polish laboratories. The results obtained with this method have reduced diagnostic value because of the preanalytical and analytical errors. Methods: We evaluated precision and correctness for quantitative and routine (non-quantitative) procedures at stage of urine transfer to centrifuge tubes and the removal of supernatant after centrifugation. Subsequently we compared the urine sediment examination results obtained with the non-standardized method under a coverslip with the results obtained with standardized methods: under a coverslip and in a chamber. In standardized methods we applied the quantitative procedures at stages of preparation of urine sediment and microscopic slide. Results: A significantly better precision was obtained in a quantitative procedure. The coefficient of variation (CV) was 2,5-fold lower in case of urine transfer to centrifuge tubes and 6-fold lower in case of supernatant removal after the centrifugation. A systematic error was found in non-standardized procedure. When we compared the results of urine sediment examination, the overall CV in non-standardized and standardized method under a coverslip was ±28,5% and ±9,4%, respectively. In standardized methods (under a coverslip and in a chamber) the overall CV was comparable (±8,6%) and there was not statistically significant difference between the results. Conclusions: It is necessary and reasonable to put a quantitative procedures into practice in routine urine sediment examination. In this study we presented an exemplary procedure. Słowa kluczowe: osad moczu, rutynowe badanie osadu moczu, źródła błędów, metody badania, procedura Key words: urine sediment, routine urine sediment examination, sources of errors, examination methods, procedure 219

2 Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury... Skróty: ECLM Europejska Konfederacja Medycyny Laboratoryjnej; HPF (high power field) obraz w dużym powiększeniu; LPF (low power field) obraz w małym powiększeniu; PPZOJMED Powszechny Program Zewnętrznej Oceny Jakości w Medycynie Laboratoryjnej; RBC erytrocyty; WBC leukocyty; WZ współczynnik zmienności Wstęp Mikroskopowa ocena elementów upostaciowanych osadu moczu należy do podstawowych, rutynowo wykonywanych analiz laboratoryjnych, przeprowadzanych przede wszystkim w celu oceny funkcji układu wydalniczego. Badanie wykonywane jest najczęściej dla potwierdzenia dodatniego wyniku analizy paskiem testowym na obecność erytrocytów, leukocytów, białka lub bakterii. W osadzie moczu mogą być obecne krwinki czerwone, białe, różnego typu nabłonki, wałeczki, bakterie, grzyby, pierwotniaki, pasożyty, różnego rodzaju kryształy oraz wiele innych elementów, będących artefaktami bez znaczenia diagnostycznego. Tak duża różnorodność składników osadu moczu wymaga od osoby przeprowadzającej badanie dużego doświadczenia zawodowego i wiedzy merytorycznej. W laboratoriach medycznych badanie osadu moczu wykonywane jest najczęściej manualną metodą mikroskopową, na szkiełku. Ta powszechnie stosowana technika badania osadu moczu obejmuje etap przygotowania osadu poprzez zagęszczenie moczu, sporządzenie preparatu mikroskopowego na szkiełku, a następnie jego ocenę w mikroskopie świetlnym. Preparat oceniany jest przy powiększeniu 100- lub 200-krotnym (preparat przeglądowy), a następnie 400-krotnym (preparat właściwy). W rutynowej metodzie badania wyniki składników osadu moczu o wysokiej wartości diagnostycznej (np. erytrocyty, leukocyty, nabłonki nerkowe) są najczęściej podawane w postaci przedziałów wartości (np. 0-2, 3-5, 5-10), widocznych w polu widzenia. Składniki o mniejszej wartości diagnostycznej (np. nabłonki płaskie) lub elementy trudno policzalne (np. bakterie, kryształy) określa się półilościowo, np. pojedyncze, nieliczne, liczne, bardzo liczne [2]. Obecnie na rynku dostępne są również kamery do ilościowej analizy osadu moczu, np. kamera Fast-Read, Pentasquare i Vetriplast, dystrybuowane w Polsce przez różne firmy. Są to wykonane z polistyrenu płytki z 10 komorami pomiarowymi. Powierzchnia każdej komory, do której wprowadza się próbkę, podzielona jest na wyznaczone przez siatkę pola o stałej i ściśle określonej objętości. Postępowanie przy badaniu osadu moczu dla różnych kamer jest nieco odmienne, dlatego badania należy wykonywać wg instrukcji producenta. Badanie osadu moczu można obecnie również przeprowadzać na analizatorach automatycznych. Zasada działania tych urządzeń oparta jest o cyfrową analizę obrazów mikroskopowych [18] lub o techniki cytometrii przepływowej [3, 5]. W analizatorach automatycznych badanie wykonywane jest w moczu niewirowanym, a wyniki są wyrażane jako liczba elementów w jednostce objętości lub w polu widzenia (HPF bądź LPF). Metody automatyczne, w odniesieniu do metod manualnych, zapewniają lepszą precyzję i znacząco skracają czas badania. Należy jednak podkreślić, że w niektórych przypadkach, m.in. kiedy w próbce występują wałeczki, drożdże lub duża ilość elementów upostaciowanych albo nieupostaciowanych, aparaty mogą wykazywać ograniczoną zdolność rozpoznawania elementów osadu i konieczne jest potwierdzenie wyniku za pomocą badania mikroskopowego [4, 11, 17, 18, 19]. Powszechnie wiadomo, że badanie osadu moczu obarczone jest dużym błędem. Wynika to z różnorodności stosowanych metod, wieloetapowości procedury przygotowania materiału i subiektywnego charakteru badania mikroskopowego, ale przede wszystkim ze stosowania półilościowych niestandaryzowanych metod badania osadu moczu [6, 9, 10, 12]. Europejska Konfederacja Medycyny Laboratoryjnej (ECLM) stwierdza, że obecnie nie ma referencyjnej metody badania osadu moczu, która zapewniałaby odpowiednio wysoką jakość zliczania i klasyfikacji cząstek. Przygotowane zostały natomiast wytyczne, które mają pomóc w opracowaniu procedur do badań rutynowych, zapewniających im zadowalającą jakość (tab. I) [13]. W Polsce większość laboratoriów wykonuje badanie osadu moczu manualną metodą mikroskopową, z moczu wirowanego, gdzie preparat przygotowywany jest pod szkiełkiem nakrywkowym. Sposoby postępowania na każdym z etapów badania nie są ujednolicone i różnią się między laboratoriami. Przenoszenie materiału biologicznego do probówki wirowniczej najczęściej odbywa się poprzez nalewanie moczu do ¾ objętości probówki lub w probówkach kalibrowanych do kreski. Stosowane warunki wirowania są różne, zarówno w odniesieniu do czasu wirowania (np. 3, 5, 6, 10, 15 minut), jak i do ilości obrotów/minutę (np. 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 obr./min). Po odwirowaniu moczu supernatant usuwany jest najczęściej poprzez zlanie jednym ruchem lub odciągnięcie za pomocą pipety Pasteura. Nanoszenie kropli osadu odbywa się najczęściej poprzez nakropienie bezpośrednio z probówki wirowniczej lub za pomocą pipety Pasteura. Półilościowe, niestandaryzowane i nieujednolicone postępowanie przy badaniu osadu moczu jest jedną z głównych przyczyn ogromnej zmienności, uzyskiwanej dla tej analizy w Polsce. Wyrazem tego mogą być wyniki uzyskiwane w kontroli zewnątrzlaboratoryjnej, w sprawdzianie oceny osadu moczu, przeprowadzanego w ramach Powszechnego Programu Zewnętrznej Oceny Jakości w Medycynie Labora- 220

3 A. Ćwiklińska i inni Tabela I Zalecenia Europejskiej Konfederacji Medycyny Laboratoryjnej (ECLM) dla badania osadu moczu [13]*. Element Standard Metoda sprawdzenia Czas wykonania badania Badanie wykonać w ciągu 4 godzin od pobrania (jeśli próbka była przechowywana w temp. +4 C) lub w ciągu 30 min (jeśli próbkę Udokumentowany czas pobrania materiału przechowywano w temp. +20 C); jeśli jest to niemożliwe, zastosować środek konserwujący Objętość próbki 5-12 ml Kreska zaznaczona na probówce Wirowanie 400 x g, 5 min.; preferowane w temp. +4 C Kontakt z producentem wirówki Usuwanie supernatantu Odessanie ściśle określonej objętości supernatantu (uzyskanie założonej krotności zagęszczenia) Kalibracja etapu poprzez ważenie usuwanego moczu Metoda barwienia; Zalecane badanie w mikroskopie kontrastowo-fazowym lub w Kontakt z producentem mikroskopu rodzaj mikroskopu mikroskopie świetlnym po uprzednim wybarwieniu preparatu; mikroskop polaryzacyjny w razie potrzeby; ocena preparatu przy małym (LPF) i dużym (HPF) powiększeniu Objętość próbki ocenianej Ściśle zdefiniowana i zmierzona Szkiełko mikroskopowe ze skalą w mikroskopie Oceniane parametry Zdefiniowana lista ocenianych parametrów Zalecenia ECML Jednostka Ilość elementów/l materiału badanego (lub ilość elementów/pole widzenia (HPF) Wyznaczenie współczynnika przeliczeniowego Powtarzalność badania Przygotowanie procedury badania Szkolenie personelu Kontrola wewnątrzlaboratoryjna Kursy treningowe; Podwójna ocena tej samej próbki Dwóch niezależnych badaczy oceniających tę samą próbkę Kontrola zewnątrzlaboratoryjna Uczestnictwo w programach kontroli zewnątrzlaboratoryjnej Dokumentacja wyników badań Kalibracja metody Identyfikowalność ilości mierzonych Ocena wobec próbek niewirowanych *szersze opracowanie zaleceń ECLM w języku polskim zostało opublikowane w czasopiśmie: Badanie i Diagnoza 2001; 7(1) toryjnej (PPZOJMED). W latach przeprowadzono 7 sprawdzianów, w których brało udział średnio 35 polskich laboratoriów. W sumie w sprawdzianach uczestniczyło 248 polskich laboratoriów. Uzyskiwane wartości WZ wahały się w zakresie ±43 ±130%, a średnia wartość WZ wyniosła aż ±83%. Celem tej pracy było wykazanie wpływu sposobu przygotowania i badania osadu na jakość uzyskiwanych wyników oraz opracowanie i zaprezentowanie przykładowej procedury dla rutynowego mikroskopowego badania osadu moczu. Materiał i metody Materiał badany W badaniach wykorzystano próbki pacjentów z pierwszej porannej zbiórki moczu, dostarczane do Pracowni Analityki Ogólnej Laboratorium Centralnego Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku oraz próbki z Oddziału Nefrologicznego ww. szpitala. Badania wykonano w ciągu 4 godzin od chwili dostarczenia moczu do laboratorium. Metody I Ocena etapów przygotowania osadu moczu W doświadczeniach wykorzystano 3 typy probówek, najczęściej stosowane w laboratoriach do badania osadu moczu: probówki stożkowe, z podziałką, wykonane z polistyrenu, o pojemności 10 ml; probówki z wgłębieniem, z podziałką, wykonane z polistyrenu, o pojemności 12 ml; probówki okrągłodenne, z podziałką, szklane, o pojemności 10 ml [ryc. 1]. I1. Ocena etapu przenoszenia materiału do probówki Porównano precyzję i poprawność etapu przenoszenia materiału do probówki w postępowaniu ilościowym oraz ruty- Rycina 1 Rodzaje probówek wirowniczych: 1 - probówka stożkowa, 2 - probówka z wgłębieniem, 3 - probówka okrągłodenna. 221

4 Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury... nowym (nieilościowym). W postępowaniu rutynowym materiał badany nalewano do probówki i uzupełniano do kreski. W postępowaniu ilościowym zdefiniowaną objętość moczu przenoszono pipetą automatyczną. Objętości przenoszonych materiałów weryfikowano metodą wagową. Doświadczenie wykonano dla objętości moczu 5 i 10 ml. Dla każdej metody czynności powtarzano 20-krotnie. I2. Ocena etapu usuwania supernatantu po odwirowaniu Porównano precyzję i poprawność etapu usuwania supernatantu po odwirowaniu w postępowaniu ilościowym oraz rutynowym (nieilościowym). Do probówek odpipetowano po 5 lub 10 ml moczu, wirowano, a następnie usuwano supernatant. W postępowaniu rutynowym supernatant dekantowano jednym ruchem, pozostawiając około 0,5 ml osadu. W postępowaniu ilościowym ściśle określone objętości supernatantu usuwano pipetą automatyczną, uzyskując odpowiednio 10- lub 20-krotne zagęszczenie prób. Uzyskane osady mieszano i ważono na uprzednio wytarowanej wadze. Dla każdej objętości początkowej i krotności zagęszczenia osadu czynności powtarzano 10-krotnie. II Ocena wpływu metody na wyniki badania osadu moczu Doświadczenia oceniające wpływ metody na wyniki badania osadu moczu przeprowadzane były przez jedną osobę. Takie postępowanie pozwoliło wyeliminować zmienność wynikającą z różnych technik wykonywania preparatu i umiejętności rozpoznawania elementów osadu moczu, a różnice między metodami wynikały tylko z charakterystyki metod. II1. Porównanie wyników uzyskanych metodą manualną, na szkiełku, wg procedury rutynowej niestandaryzowanej i standaryzowanej Porównano wyniki oceny liczby erytrocytów i leukocytów w 5 różnych próbach moczu. Dla danej próby moczu przygotowano 5 preparatów metodą rutynową niestandaryzowaną i 5 preparatów metodą standaryzowaną A (preparat pod szkiełkiem nakrywkowym), wg postępowania przedstawionego w tabeli II. Analizę mikroskopową każdego preparatu przeprowadzano jednokrotnie, wg procedury przedstawionej w tabeli II. Wyniki wyrażono w postaci liczby elementów w polu widzenia mikroskopu (powiększenie 400x; HPF). Dla metody niestandaryzowanej przeliczenie liczby elementów na jednostkę objętości jest niemożliwe ze względu na brak możliwości ustalenia krotności zagęszczenia próbki i nieznajomość dokładnej objętości osadu oglądanej w mikroskopie. Tabela II Postępowanie analityczne w porównywanych metodach badania osadu moczu. Etap Metoda standaryzowana A B Preparat pod szkiełkiem Preparat w kamerze Pentasquare Metoda rutynowa niestandaryzowana Objętość próbki moczu Wirowanie Usunięcie supernatantu Uzyskanie jednorodnej zawiesiny Preparat mikroskopowy Ocena preparatu Ilość oglądanych pól widzenia Wyniki 5 ml materiału, przeniesione pipetą automatyczną uzupełnienie do kreski (5 ml) w kalibrowanej probówce 5 minut; 400 x g (2100 obr/min) usunięcie supernatantu za pomocą usunięcie supernatantu za pomocą dekantacja próbki pipety automatycznej: pipety automatycznej 4,50 ml - 4,75 ml pozostaje 0,25 ml osadu o 20x zagęszczeniu - 4,50 ml pozostaje 0,5 ml osadu o 10x zagęszczeniu dokładne wymieszanie pozostałego moczu z osadem naniesienie 13 μl osadu na szkiełko pobranie przy użyciu kapilarnej pipety naniesienie kropli osadu za pomocą podstawowe i przykrycie szkiełkiem Pasteura próbki z probówki i wprowadzenie pipety Pasteura na szkiełko podsta- nakrywkowym o wymiarach jej do komory pomiarowej na wowe i przykrycie szkiełkiem nakryw- 18 mm x 18 mm, płytce Pentasquare kowym o wymiarach 18 mm x 18 mm ocena preparatu w mikroskopie świetlnym, przy powiększeniu: 100x (preparat przeglądowy), a następnie przy powiększeniu 400x; zliczenie ilości erytrocytów i leukocytów 10 pól, systematycznie wybieranych 5 lub 10 kwadratów, w zależności od 10 pól, systematycznie wybieranych z różnych części preparatu próbki* z różnych części preparatu wyrażenie ilości elementów morfotycznych po uśrednieniu, w polu widzenia (wpw) lub po przeliczeniu ilości komórek przypadających na mikrolitr materiału badanego * zgodnie z postępowaniem zalecanym przez producenta kamery Pentasquare 222

5 A. Ćwiklińska i inni II2. Porównanie wyników uzyskanych metodą manualną, wg procedury standaryzowanej, na szkiełku i w kamerze Porównano wyniki oceny liczby erytrocytów i leukocytów w 4 różnych próbkach moczu. Dla danej próby moczu przygotowano 5 preparatów metodą standaryzowaną A (preparat pod szkiełkiem) i 5 preparatów metodą standaryzowaną B (preparat w kamerze), wg postępowania przedstawionego w tabeli II. Analizę mikroskopową każdego preparatu przeprowadzano jednokrotnie, wg procedury przedstawionej w tabeli II. Wyniki wyrażono w postaci liczby elementów w mikrolitrze moczu niewirowanego. Dla preparatu oglądanego pod szkiełkiem przeliczenia dokonano na podstawie wyznaczonego współczynnika [13]. Wyniki uzyskane z badania w kamerze Pentasquare przeliczono na podstawie wzoru podanego przez producenta kamery. Opracowania statystyczne Obliczenia wykonano przy użyciu programów Excel for Windows i Prism 4.0. Normalność rozkładów cechy oceniono za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Obecność różnicy statystycznie znamiennej, w zależności od doświadczenia, oceniano za pomocą testu t dla jednej próby lub testu t dla prób niezależnych. W przypadku stwierdzenia różnicy wariancji zastosowano test t dla prób niezależnych z poprawką Welscha. Znamienność statystyczną ustalono na poziomie p<0,05. Wyniki I Ocena etapów przygotowania osadu moczu I1. Ocena etapu przenoszenia materiału do probówki Wyniki uzyskane na etapie przenoszenia materiału do probówki dla postępowania ilościowego i rutynowego (nieilościowego) przedstawiono w tabeli III. Zbadano precyzję dla obu postępowań, a następnie oceniono poprawność, odnosząc otrzymane średnie do zakładanych objętości materiału badanego w probówce (5 i 10 ml). Średni współczynnik zmienności uzyskany dla postępowania rutynowego wyniósł ±1% i był 2,5-krotnie wyższy od średniego WZ, uzyskanego dla postępowania ilościowego. W badaniu poprawności, dla postępowania rutynowego w przypadku probówki okrągłodennej, dla obu badanych objętości stwierdzono obecność błędu systematycznego, wynoszącego około +2,5%. Dla probówki stożkowej, dla objętości 5 i 10 ml, błąd systematyczny wynosił odpowiednio +2% i +0,6%. W przypadku probówki z wgłębieniem, dla objętości 5 i 10 ml zaobserwowano błąd systematyczny: -1,8% i -0,5%. Niewielki błąd systematyczny: +0,02% stwierdzono w postępowaniu ilościowym, dla probówki stożkowej. I2. Ocena etapu usuwania supernatantu po odwirowaniu Wyniki uzyskane na etapie usuwania supernatantu po odwirowaniu dla postępowania ilościowego i rutynowego (nieilościowego) przedstawiono w tabeli IV. Zbadano precyzję w obu postępowaniach, a następnie oceniono poprawność, odnosząc otrzymane średnie do zakładanych objętości osadu w probówce po usunięciu supernatantu (0,25, 0,5 lub 1 ml). Dla postępowania rutynowego stwierdzono wyraźnie gorszą precyzję. Średni WZ dla postępowania rutynowego wyniósł ok. ±17%, podczas gdy dla postępowania ilościowego uzyskano wartość WZ około ±3%. W postępowaniu rutynowym pozostała po dekantacji objętość moczu w probówkach okrągłodennych i stożkowych wynosiła średnio 0,3 ml i była o 40% niższa od objętości oczekiwanej - 0,5 ml. II Ocena wpływu metody na wyniki badania osadu moczu II1. Porównanie wyników uzyskanych metodą manualną, pod szkiełkiem, wg procedury rutynowej niestandaryzowanej i standaryzowanej W metodzie standaryzowanej dla każdej badanej próbki moczu i każdego liczonego elementu uzyskano znacząco lepszą precyzję (tab. V). Wartość współczynnika zmienności dla metody standaryzowanej wahała się w granicach ±4 ±14%, podczas gdy dla metody rutynowej uzyskano wartości ±18 ±46%. Różnicę statystycznie znamienną między Tabela III Wyniki oceny etapu przenoszenia materiału do probówek dla postępowania rutynowego (nieilościowego) oraz dla postępowania ilościowego; n=20. Postępowanie rutynowe (nieilościowe) Postępowanie ilościowe Wartość oczekiwana 5 ml 10 ml 5 ml 10 ml Probówka: Okrągłodenna Stożkowa Z wgłębieniem Okrągłodenna Stożkowa Z wgłębieniem 5,14 ± 0,04 (*) 5,10 ± 0,06 (*) 4,91 ± 0,05 (*) 0,84 1,28 1,11 10,25 ± 0,08 (*) 10,06 ± 0,11 (*) 9,95 ± 0,10 (*) 0,80 1,15 1,05 Uzyskane wyniki: średnia ± OS [ml] WZ [±%] 4,99 ± 0,02 5,01 ± 0,02 (*) 5,00 ± 0,02 0,48 0,41 0,42 9,99 ± 0,05 10,02 ± 0,03 (*) 10,01 ± 0,04 WZ średnie [±%] 1,07 1,00 0,44 0,39 WZ metody [±%] 1,04 0,41 (*) obecność błędu systematycznego; p<0,05 0,46 0,32 0,39 223

6 Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury... Tabela IV Wyniki oceny etapu usuwania supernatantu po odwirowaniu dla postępowania rutynowego (nieilościowego) oraz dla postępowania ilościowego; n=10. Zakładana krotność zagęszczenia Postępowanie rutynowe (nieilościowe) Postępowanie ilościowe 10x 20x 10x 20x Objętość wirowana 5 ml 10 ml 5 ml 10 ml 5 ml 10 ml Zakładana objętość osadu Probówka: Okrągłodenna Stożkowa Z wgłębieniem Okrągłodenna Stożkowa Z wgłębieniem 0,50 ml 0,50 ml 0,50 ml 1,00 ml 0,25 ml 0,50 ml 0,29±0,05 (*) 0,27±0,05(*) 0,47±0, ,5 15 0,33±0,06 (*) 0,30±0,06 (*) 0,45±0, Uzyskane wyniki: średnia ±OS [ml] 0,51±0,01 0,50±0,01 0,50±0,01 WZ [±%] 2,1 2,4 2,4 1,00±0,02 1,01±0,03 1,01±0,02 2,2 2,8 2,4 0,25±0,01 0,25±0,01 0,25±0,01 3,0 3,3 3,5 0,51±0,01 0,49±0,02 0,51±0,02 WZ średnie [±%] 16,8 16,7 2,3 2,5 3,3 3,2 WZ metody [±%] 16,75 2,4 3,25 (*) obecność błędu systematycznego; p<0,05 2,9 3,3 3,5 Tabela V Wartości WZ uzyskane w metodzie rutynowej niestandaryzowanej i w metodzie standaryzowanej (preparat pod szkiełkiem nakrywkowym), przy zliczaniu ilości erytrocytów i leukocytów w pięciu różnych próbach moczu. n=5. Mocz 1 Mocz 2 Mocz 3 Mocz 4 Mocz 5 RBC WBC RBC WBC RBC WBC RBC WBC RBC WBC Metoda WZ [±%] rutynowa standaryzowana wynikami uzyskanymi porównywanymi metodami stwierdzono w trzech przypadkach. W dwóch z nich w metodzie rutynowej wynik badania liczby elementów morfotycznych był wyższy (ryc. 2). II2. Porównanie wyników uzyskanych metodą manualną, wg procedury standaryzowanej, na szkiełku i w kamerze W doświadczeniu porównującym wyniki uzyskane metodą standaryzowaną, gdzie preparat był przygotowywany na szkiełku (met. A) lub w kamerze (met. B), dla obu metod uzyskano porównywalne wartości współczynnika zmienności, wahające się w przedziale ±3 ±16% (tab. VI). Między wynikami otrzymanymi porównywanymi metodami nie stwierdzono różnicy statystycznie znamiennej dla żadnej z badanej próbki moczu i badanego elementu (ryc. 3). Dyskusja Badanie upostaciowanych elementów osadu moczu jest nieinwazyjnym i tanim badaniem, wykorzystywanym szczególnie w diagnostyce chorób nerek i dróg moczowych. Jednocześnie podkreśla się fakt, że jest to badanie czaso- i pracochłonne, a uzyskiwane wyniki obarczone są dużym błędem [9, 12]. Istnieją różne metody badania osadu moczu, ale żadna z nich nie spełnia kryteriów stawianych metodzie referencyjnej [13]. W Polsce najczęściej stosowaną techniką badania jest półilościowa mikroskopowa metoda badania osadu moczu na szkiełku, którą ECLM nazywa niestandaryzowanym badaniem osadu moczu pod szkiełkiem nakrywkowym i nie rekomenduje do stosowania w laboratoriach. Do czynników wpływających na zmienność w manualnym badaniu osadu moczu zalicza się: czas oczekiwania próbki na badanie, etap wirowania, technikę przygotowania osadu i preparatu mikroskopowego, subiektywizm badania oraz wyrażanie wyniku w postaci liczby elementów w polu widzenia mikroskopu, a więc zależnej od rodzaju mikroskopu, na którym badanie jest przeprowadzane [6, 7, 21]. Czas oczekiwania próbki na badanie wpływa na wielkość błędu w badaniu osadu moczu. Wynika to z faktu, że elementy osadu moczu są nietrwałe i mogą się rozpadać w trakcie przechowywania, szczególnie w moczu o niskim 224

7 A. Ćwiklińska i inni Rycina 2 Wyniki badania osadu moczu, przeprowadzonego metodą rutynową niestandaryzowaną oraz metodą standaryzowaną (preparat przygotowany pod szkiełkiem nakrywkowym), RBC erytrocyty, WBC leukocyty; n = 5; * różnica statystycznie znamienna między wynikami, p < 0,05. Tabela VI Wartości WZ uzyskane w metodzie standaryzowanej (preparat pod szkiełkiem nakrywkowym) i w metodzie standaryzowanej (preparat w kamerze Pentasquare), przy zliczaniu ilości erytrocytów i leukocytów w czterech różnych próbach moczu. n=5. Mocz 6 Mocz 7 Mocz 8 Mocz 9 RBC WBC RBC WBC RBC WBC RBC WBC Metoda standaryzowana WZ [±%] pod szkiełkiem w kamerze ciężarze właściwym i w moczu zasadowym [1]. Dla próbek niekonserwowanych ECLM zaleca schładzanie próbki i możliwość przechowywania do 4 godzin w temp. +4 C (jeśli próbka nie jest przeznaczona do badania krystalurii). W przypadku przechowywania moczu w temp. +20 C badanie powinno być wykonane nie później niż w ciągu 1 godziny od pobrania [13]. W roku 2002 i 2008 opublikowano prace, w których stwierdza się, że próbki pochodzące od osób dorosłych, przechowywane w temp. +4 C lub odpowiednio konserwowane, mogą być poddane badaniu mikroskopowemu w ciągu 24 godzin od pobrania [15, 16]. Etap wirowania wykonywany jest w celu zagęszczenia diagnostycznie ważnych elementów moczu. Jednocześnie ten etap uznaje się za główne źródło błędów, występujących w metodzie manualnej [13]. Gadeholt stwierdził, że odzysk erytrocytów i leukocytów po wirowaniu wynosi średnio 50%, ale rozrzut uzyskiwanych wartości był duży od 20 do 115% [7]. W badaniach własnych uzyskaliśmy średni odzysk 57%, przy rozrzucie 20-98% (wyniki nieprezentowane). Pomimo tego ECLM zaleca wirowanie materiału do badań rutynowych, ponieważ niektóre z elementów istotnych diagnostycznie występują w moczu rzadko i podczas oceny preparatu z moczu niewirowanego osoba wykonująca badanie może te elementy pominąć [10, 13]. Zalecane parametry dla etapu wirowania to czas wirowania: 5 minut, krotność przyspieszenia ziemskiego (RCF) 400 x g. Ilość obr/min dla stosowanej wirówki należy przeliczyć na podstawie wzoru: ilość obr/min = 1000 x [RCF/ (11,18 x r)] 0,5 gdzie: RCF krotność przyspieszenia ziemskiego r promień wirówki [cm] Ważnym parametrem w badaniu osadu moczu jest krotność zagęszczenia materiału, zależna od objętości początkowej moczu w probówce i od objętości osadu, pozostałego po usunięciu supernatantu. Przeprowadzone doświadczenia 225

8 Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury... Rycina 3 Wyniki badania osadu moczu, przeprowadzonego metodą standaryzowaną (preparat pod szkiełkiem nakrywkowym) i metodą standaryzowaną (preparat przygotowany w kamerze Pentasquare), RBC erytrocyty, WBC leukocyty; n=5. wykazały, że na etapie przenoszenia materiału do probówki, przy zastosowaniu postępowania ilościowego (przeniesienie materiału pipetą automatyczną) uzyskuje się 2,5-krotnie mniejsze rozrzuty objętości w porównaniu do postępowania rutynowego, nieilościowego (uzupełnienie do kreski) i postępowanie ilościowe nie jest obarczone błędem systematycznym (tab. III). W przypadku etapu usuwania supernatantu średnia wartość WZ uzyskana dla postępowania ilościowego (odpipetowanie ściśle określonej objętości supernatantu) była prawie 6-krotnie niższa w porównaniu do WZ dla postępowania rutynowego (dekantacja). Przy zastosowaniu postępowania rutynowego, dla probówki okrągłodennej i stożkowej, stwierdzono dodatkowo obecność błędu systematycznego przekraczającego aż -40% (tab. IV). Skutkiem nieilościowego postępowania na etapie przygotowania osadu moczu jest bardzo duży rozrzut otrzymywanych krotności zagęszczenia próbki, co przedstawiono w tabeli VII. Należy pamiętać, że ten ogromny rozrzut krotności zagęszczenia próbki przekłada się na ogromną zmienność wyników badania osadu moczu, np. w moczu zagęszczonym 20-krotnie uzyskujemy wynik badania osadu: 15 erytrocytów w polu widzenia. W przypadku nieprawidłowego zagęszczenia, np. 40-krotnego, możemy spodziewać się około 30 erytrocytów w polu widzenia, czyli uzyskujemy wynik ~ 2-krotnie wyższy. Inni autorzy również zwracają uwagę na bardzo dużą zmienność, wynikającą z techniki przygotowania osadu, szczególnie w przypadku usuwania supernatantu metodą dekantacji [21]. Zalecenia ilościowego przenoszenia materiału i usuwania supernatantu w metodzie standaryzowanej są więc w pełni uzasadnione. Kolejnym etapem decydującym o jakości badania osadu moczu jest wykonanie preparatu mikroskopowego. W metodzie niestandaryzowanej osad nakrapiany jest bezpośrednio z probówki lub za pomocą pipety Pasteura. Gadeholt w swych badaniach stwierdził, że w przypadku nakrapiania pipetą Pasteura grubość przeglądanej warstwy może wahać się od 0,025 do 0,08 mm, przy nakrapianiu bezpośrednio z probówki różnice mogą być 10-krotne: 0,01-0,1 mm. Różna grubość przeglądanej warstwy powoduje odpowiednio 3- i 10-krotne różnice w wynikach, tylko ze względu na technikę nakrapiania osadu [7]. W przedstawianej pracy w metodzie niestandaryzowanej osad był nakrapiany pipetą Pasteura, w metodzie standaryzowanej ilościowo odpipetowywano na szkiełko 13µl osadu. Całkowity średni WZ dla metody standaryzowanej wyniósł ±9,4%, dla metody rutynowej ±28,5%. Sam etap przygotowania preparatu i zliczania elementów dawał natomiast wartość WZ = ±9% w metodzie standaryzowanej i ±23% w niestandaryzowanej (obliczone na podstawie równania propagacji wariancji [14]). W postępowaniu zalecanym przez ECLM zaleca się ilościowe nakładanie osadu na szkiełko. Nasze badania potwierdziły, że takie postępowanie prawie 2,5-krotnie poprawia precyzję wyników. Objętość osadu nakładana na szkiełko powinna być dobrana do wielkości szkiełka nakrywkowego tak, aby cała kropla znajdowała się pod szkiełkiem, a grubość warstwy umożliwiała dokładne przejrzenie preparatu [13]. W pracy porównywano również wyniki badania osadu moczu, uzyskane metodami standaryzowanymi, gdzie preparat przygotowywany był na szkiełku (met. A) lub w kamerze (met. B) (tab. II). Dla obu metod uzyskano porównywalną precyzję i nie stwierdzono różnic statystycznie znamiennych 226

9 A. Ćwiklińska i inni Tabela VII Zakresy krotności zagęszczenia, wyliczone na podstawie wyników doświadczeń oceniających etapy przygotowania osadu moczu, dla założonego 20-krotnego zagęszczenia prób badanych. Postępowanie Probówka Objętość materiału rutynowe (nieilościowe) w probówce Objętość osadu po usunięciu supernatantu Wyliczona krotność zagęszczenia średnia średnia ±2OS średnia średnia ±2OS średnia zakres okrągłodenna 10,25 10,09 10,41 0,33 0,21 0, stożkowa 10,06 9,84 10,28 0,30 0,18 0, z wgłębieniem 9,95 9,75 10,15 0,45 0,31 0, ilościowe okrągłodenna 9,99 9,89 10,09 0,51 0,49 0, stożkowa 10,02 9,96 10,08 0,49 0,45 0, z wgłębieniem 10,01 9,93 10,09 0,51 0,47 0, Tabela VIII Przykładowe, prezentowane w literaturze przedziały referencyjne dla badania osadu moczu. Metoda Jednostka Przedział referencyjny Źródło badanie z moczu wirowanego, na szkiełku badanie z moczu wirowanego, na szkiełku badanie z moczu niewirowanego, na szkiełku badanie z moczu niewirowanego, w kamerze badanie z moczu wirowanego, w kamerze; standaryzowana procedura badanie z moczu niewirowanego, w kamerze badanie z moczu niewirowanego, aparat Sysmex UF-100 badanie z moczu wirowanego, pod szkiełkiem, standaryzowana procedura badanie z moczu wirowanego, w kamerze badanie z moczu niewirowanego, aparat iq200 wpw (HPF) RBC 0-3; WBC 1-5 Węgrowicz-Rebandel [20] wpw (HPF) RBC 0-2; Althof [8] WBC 0-1 (mężczyźni); 0-5 (kobiety) wpw (HPF) RBC 0-2 (suma! z 10 pól widzenia) WBC 0-4 (suma! z 10 pół widzenia) μl moczu natywnego RBC - < 3 WBC - < 6 μl moczu natywnego RBC - < 1 Győry [9] WBC - < 3 bakterie - < 100 wałeczki - < 0,015 μl moczu natywnego <10 komórek μl moczu natywnego Kobiety: Mężczyźni: RBC - 12 RBC - 4 WBC- 36 WBC - 7 Nabłonki - 48 Nabłonki - 2 Bakterie Bakterie Wałeczki - 0,2 Wałeczki - 0,42 Dzieci: RBC - 3 WBC - 9 Nabłonki - 4 Bakterie - 90 Wałeczki - 0,015 μl moczu natywnego RBC 0-1,5 Lamchiagdhase [17] WBC 0-2,2 nabłonki płaskie 0-2,7 μl moczu natywnego RBC 0-8 WBC 0-13 nabłonki płaskie 0-11,9 μl moczu natywnego RBC 0-11 WBC 0-9 nabłonki płaskie 0-11,9 227

10 Rutynowe badanie osadu moczu możliwości poprawy jakości wyników poprzez wdrożenie standaryzowanej procedury... między wynikami (tab. VI, ryc.3). W naszych doświadczeniach dogodniejsze analitycznie okazało się jednak stosowanie kamer, ponieważ ich konstrukcja zapewniała łatwiejsze przygotowanie preparatu mikroskopowego. Kamera zapewniała również większą wydajność pracy, ponieważ na jednej płytce możliwa była ocena dziesięciu preparatów, a obecność siatki pomiarowej dodatkowo ułatwiała znalezienie obrazu mikroskopowego. Wyniki badania osadu moczu wyrażane są najczęściej w postaci liczby składników w polu widzenia mikroskopu (HPF), natomiast jednostką, która być może niedługo stanie się jednostką referencyjną, jest liczba elementów obecnych w danej objętości moczu. Różne źródła podają odmienne przedziały referencyjne, zależne od metody badania i sposobu ustalania zakresu tych wartości. W tabeli VIII przedstawiono przykładowe prezentowane w literaturze przedziały referencyjne. W przypadku przedstawiania liczby elementów w polu widzenia mikroskopu należy pamiętać, że wynik wyrażany w tej jednostce ściśle zależy od krotności zagęszczenia osadu i wielkości pola widzenia mikroskopu, dlatego oba parametry muszą być znane i kontrolowane [12]. Krotność zagęszczenia zależy od etapu przygotowania osadu, dlatego na tym etapie dla wszystkich próbek badanych należy postępować w sposób standaryzowany. Pole widzenia mikroskopu zależy natomiast od rodzaju mikroskopu, a dokładnie od numeru pola widzenia (parametr nadawany przez producenta). Dzieląc numer pola widzenia przez powiększenie obiektywu, uzyskujemy średnicę pola widzenia. W badaniach własnych, w doświadczeniu porównującym wyniki uzyskane z trzech mikroskopów (numery pola widzenia 15, 18 i 20), dla wyników wyrażanych w polu widzenia danego mikroskopu uzyskaliśmy średni WZ równy ±27%. Po przeliczeniu wyników na ujednoliconą wielkość pola widzenia średni WZ wyniósł ±5% (wyniki nieprezentowane). Należy więc brać pod uwagę wielkość pola widzenia, szczególnie w przypadku korzystania z różnych mikroskopów w jednym laboratorium, przy wymianie sprzętu, zmianie metody oraz przy porównywaniu czy przeliczaniu wyników na jednostkę objętości, np. dla potrzeb kontroli zewnątrzlaboratoryjnej. Badacze podkreślają także wpływ techniki liczenia w badaniu osadu moczu. Elementy osadu podlegają rozkładowi Poissona, gdzie WZ=100%/ n (n liczba cząstek), stąd np. teoretyczny WZ dla n=100 wynosi ±10%, podczas gdy dla n=10 osiąga już wartość ±32%. [14]. Wynika z tego, że aby uzyskać lepszą precyzję oznaczenia, należy zliczyć odpowiednią ilość komórek, czyli konieczne jest przeglądanie odpowiedniej ilości pól widzenia. ECLM zaleca ocenę co najmniej 10 pól widzenia, wybieranych z różnych części preparatu. W przypadku małej liczby elementów, liczba oglądanych pól powinna być większa. Zalecane jest wyrażanie wyniku w postaci średniej liczby elementów w polu widzenia, a nie w postaci przedziału [13]. Problemem w standaryzacji badania osadu jest również subiektywizm badania mikroskopowego, dlatego zaleca się szkolenia personelu w zakresie rozpoznawania elementów osadu [13]. Również na rynku polskim dostępne są materiały szkoleniowe, m.in. atlasy osadu moczu [2, 8, 20]. PPZOJ- MED umożliwia laboratoriom udział w sprawdzianie internetowym, gdzie prezentowane są zdjęcia elementów osadu moczu, które należy zaklasyfikować do odpowiednich grup. Po zakończeniu sprawdzianu laboratoria otrzymują wyniki, w których prezentowana jest prawidłowa odpowiedź z uzasadnieniem przynależności elementów do danych grup. W przypadku badań w mikroskopie świetlnym, ECLM zaleca wybarwianie preparatów. Barwienie ma na celu ułatwienie klasyfikacji niektórych komórek jądrzastych i różnicowania składników wałeczków, niekiedy jednak wybarwione tło może utrudniać identyfikację elementów, np. erytrocytów [13, 14]. Wnioski Badanie osadu moczu jest ważną częścią badania ogólnego moczu, wykonywanego najczęściej w diagnostyce chorób nerek i układu moczowego. Niestety badanie to obarczone jest dużym błędem. Czas oczekiwania próbki na badanie, straty podczas wirowania, wieloetapowość procedury przygotowania materiału do oceny mikroskopowej czy subiektywizm tego badania są elementami, które trudno wyeliminować w manualnej metodzie badania osadu moczu, ale rezygnacja z półilościowej procedury przygotowania i badania osadu znacząco może popełniany błąd zmniejszyć. Z tego względu dla celów rutynowej diagnostyki badania osadu moczu proponuje się następujące postępowanie: I Badanie osadu moczu w mikroskopie, pod szkiełkiem nakrywkowym. 1. Dokładnie wymieszać próbkę. 2. Do probówki wirowniczej za pomocą pipety automatycz- Tabela IX Zalecana objętość osadu nanoszonego na szkiełko podstawowe w procedurze ilościowej. Wielkość szkiełka nakrywkowego [mm x mm] Objętość nanoszonego osadu [μl] Grubość preparatu [mm] 18 x ,04 20 x x x

11 A. Ćwiklińska i inni nej przenieść ILOŚCIOWO 10* ml moczu. Wirować próbkę przez 5 minut, przy przyspieszeniu (RCF)=400 x g Ostrożnie, nie naruszając osadu, ILOŚCIOWO (pipetą) usu- nąć 9,5* ml supernatantu (20-krotne zagęszczenie moczu) *w przypadku małej objętości próbki, do badania można użyć 5 ml materiału, po odwirowaniu usunąć 4,75 ml supernatantu (20-krotne zagęszczenie moczu) Mocz pozostający w probówce dokładnie wymieszać z osadem. Na szkiełko podstawowe pipetą automatyczną nanieść odpowiednią objętość osadu (tab. IX), delikatnie przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Oglądać preparat w małym powiększeniu (LPF) prepa- rat przeglądowy. Ocenić obecność i rozkład elementów osadu moczu wy- stępujących rzadko (w szczególności wałeczków). Oglądać preparat w dużym powiększeniu (HPF) pre- parat właściwy. 10. Policzyć elementy osadu widoczne w polu widzenia. Aby uzyskać dobrą precyzję analizy, należy policzyć liczbę elementów w co najmniej 10 polach widzenia. Pola do liczenia powinny być wybierane systematycznie z różnych części preparatu. 11. Elementy o dużej wartości diagnostycznej wyrazić ilościowo, po uśrednieniu z pól widzenia. Obecność elementów o mniejszej wartości diagnostycznej wyrazić półilościowo. II Jeżeli badanie osadu moczu jest wykonywane przy użyciu kamery, przygotowanie preparatu przeprowadzić ILOŚCIO- WO, a ocenę i liczenie elementów zgodnie z instrukcją producenta. III Wyniki wyrażać w odniesieniu do wartości referencyjnych, odpowiednich dla zastosowanej metody badania. Piśmiennictwo 1. Addis T. The number of formed elements in the urinary sediment of normal individuals. J Clin Invest 1926; 2(5): Althof S, Kindler J. Atlas osadu moczu. Techniki badawcze i interpretacja wyników. Red. M. Mantur, Wydawnictwo Medyczne Sapota, Wrocław Chan RWY, Szeto CC. Advances in the clinical laboratory assessment of urinary sediment. Clin Chim Acta 2004; 340: Chien TI, Kao JT, Liu HL i wsp. Urine sediment examination: A comparison of automated urinalysis systems and manual microscopy. Clin Chim Acta 2007; 384: Delanghe JR, Kouri TT, Huber AR i wsp. The role of automated urine particle flow cytometry in clinical practice. Clin Chim Acta 2000; 301: Dotson MA. An Examination of Urine Microscopic Sediment Analysis. Sysmex J Int 2001; 11(1): Gadeholt H. Quantitative Estimation of Urinary Sediment, with Special Regard to Sources of Error. Br Med J 1964; 1: Głębski J, Opolska P. Atlas osadu moczu. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa Győry AZ, Hawkins T, Ross M i wsp. Clinical value of urine microscopy by manual and automated methods. Laboratory Hematology 1998; 4: Győry AZ, Kesson AM, Talbot JM. Microscopy of urine now you see it, now you don t! Am Heart J 1980; 99(4): Hannemann-Pohl K, Kampf SC. Automation of Urine Sediment Examination: a Comparison of the Sysmex UF-100 Automated Flow Cytometer with Routine Manual Diagnosis (Microscopy, Test Strips, and Bacterial Culture). Clin Chem Lab Med 1999; 37(7): Kesson AM, Talbott JM, Győry AZ. Microscopic examination of urine. Lancet 1978; 312: Kouri T, Fogazzi G, Gant V i wsp. ECLM European Urinalysis Guidelines. Scand J Clin Lab Invest 2000; 60(suppl 231): Kouri T, Győry A, Rowan RM. ISLH Recommended Reference Procedure for the Enumeration of Particles In Urine. Laboratory Hematology 2003; 9: Kouri T, Malminiemi O, Penders J i wsp. Limits of preservation of samples for urine strip tests and particle counting. Clin Chem Lab Med 2008; 46(5): Kouri T, Vuotari L, Pohjavaara S i wsp. Preservation of Urine for Flow Cytometric and Visual Microscopic Testing. Clin Chem 2002; 48(6): Lamchiagdhase P, Preechaborisutkul K, Lomsomboon P i wsp. Urine sediment examination: A comparison between the manual method and the iq200 automated urine microscopy analyzer. Clin Chim Acta 2005; 358: Linko S, Kouri TT, Toivonen E i wsp. Analytical performance of the Iris iq200 automated urine microscopy analyzer. Clin Chim Acta 2006; 372: Shayanfar N, Tobler U, von Eckardstein A i wsp. Automated urinalysis: first experiences and a comparison between the Iris iq200 urine microscopy system, the Sysmex UF-100 flow cytometer and manual microscopic particle counting. Clin Chem Lab Med 2007; 45(9): Węgrowicz-Rebandel I, Rebandel H. Atlas osadu moczu. Wydawnictwo Lekarskie PWZL, Warszawa Winkel P, Statland BE, Jørgensen K. Urine Microscopy, an Ill- Defined Method, Examined by a Multifactorial Technique. Clin Chem 1974; 20(4): Adres Autorów: Zakład Chemii Klinicznej Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki 7, budynek Gdańsk acwik@amg.gda.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: ) (Praca przekazana do opublikowania: ) 229