Część teoretyczna: KOLOKWIUM 1 Ćwiczenie 6 I. SYSTEMATYKA DROŻDŻY Królestwo: Fungi Podkrólestwo: Dikarya grzyby wyższe Typ: Basidiomycota (podstawczaki) Typ: Ascomycota workowce Podtyp: Saccharomycotina Klasa: Saccharomycetes Rząd: Saccharomycetales Rodzina: Saccharomycetaceae drożdże szlachetne, rozmnażają się płciowo, wytwarzają w workach od 2-4 kulistych zarodników, oraz sztuczna jednostka często w randze typu Deuteromycota ( anamorfic fungi ) grzyby niedoskonałe, anamorficzne. II. WORKOWCE (Ascomycota) Wytwarzaj zarodniki workowe w workach (ascum). Rozmnażają się generatywnie przez wytwarzanie okrągłych lub owalnych zarodników wewnątrz worka (askospory) oraz wegetatywnie przez pączkowanie wieloboczne. Mogą formować grzybnię. Z wyjątkiem Schizosaccharomyces nie wytwarzają enzymu ureazy. Ściana komórkowa jest 3-warstwowa, zbudowana z glukanu i mannanu. Nie wytwarzają pigmentu. Należą tu drożdże fermentujące i nie fermentujące sacharydów. Rodzaj Saccharomyces - drożdże te dają na pożywkach płynnych osad opadający na dno, a na stałych tworzą białe lub kremowe kolonie. Do tego rodzaju należą gatunki drożdży szlachetnych, które charakteryzują się silnymi właściwościami fermentacyjnymi w warunkach beztlenowych rozkładają duże ilości cukru na alkohol, który nie jest przez nie zużywany. Saccharomyces cerevisiae mają komórki owalne lub kuliste, na podłożach płynnych pojedyncze lub podwójne. Fermentują i asymilują większość cukrów, mogą wykorzystywać etanol przy braku innego źródła węgla w środowisku. Używane są w przemyśle fermentacyjnym (drożdże gorzelnicze) oraz do produkcji drożdży paszowych i spożywczych (drożdże piekarskie). 1
Saccharomyces carlsbergensis o owalnych komórkach, od S. cerevisiae odróżnia je zdolność do fermentacji rafinozy. Stosowane są do produkcji piwa (drożdże piwowarskie). Saccharomyces ellipsoideus drożdże winiarskie, od S. cerevisiae różnią się nieco kształtem (bardziej wydłużone komórki), często tworzą pseudogrzybnię. Saccharomyces lactis występują w mleku i produktach mlecznych. Saccharomyces fragilis odgrywają dużą rolę podczas fermentacji kefiru i kumysu. Od S. cerevisiae Różnią się zdolnością do fermentacji laktozy. Rodzaj Schizosaccharomyces należy do drożdży rozszczepkowych, czyli takich, które dzielą się przez podział. Wytwarzanie zarodników poprzedza kopulacja. Schizosaccharomyces pombe jest najczęściej spotykanym gatunkiem, występuje w melasie i sokach z owoców południowych. 2
III. GRZYBY NIEDOSKONAŁE (Deuteromycota, Fungi imperfecti) Obejmuje gatunki drożdży, u których nie zaobserwowano cyklu rozmnażania płciowego, nie będące haploidalnymi przedstawicielami gatunków zarodnikujących. Należą tu m.in. takie rodzaje jak: Cryptococcus, Torulopsis, Candida, Kloeckera, Rhodotorula. Rodzaj Torulopsis podobne do S. cerevisiae tylko mniejsze, rozwój przez paczkowanie, odporne na wysokie stężenia soli i cukru. Występują w solankach, zagęszczonym słodzonym mleku (powodują nieprzyjemny smak i zapach) oraz w śluzowatym winie. Gatunek Torulopsis utilis ze względu na szybkie rozmnażanie i gromadzenie białka w komórkach używany jest do produkcji drożdży paszowych. Rodzaj Candida stanowi formę przejściową między drożdżakami a pleśniami. Wytwarzają pseudogrzybnię, komórki są cylindryczne lub owalne, należą do drożdży dzikich, kożuchujących. Gatunek Candida mycoderma rozkłada alkohol, stanowi szkodliwą mikroflorę piwa, wina, kiszonek, tworzy charakterystyczny wpełzający na ścianki naczyń kożuszek. Może występować także w drożdżach prasowanych. Rodzaj Rhodotorula drożdże wytwarzające barwniki karotenoidowe, ich kolonie mają czerwonoróżowe zabarwienie. Mogą syntetyzować tłuszcze oraz karoten. Występują w powietrzu, są przyczyną zakażeń serów, masła, śmietany, mięsa i drożdży piekarskich, na których tworzą barwne kolonie. 3
Rodzaj Kloeckera komórki mają kształt cytryny, są drobne, rozmnażają się przez paczkowanie biegunowe. Fermentują cukry proste. Gatunek Kloeckera apiculata jest często spotykany na owocach, w fermentujących winach i sokach owocowych. Mogą powodować fermentację moszczów i płynnego owocu z wytworzeniem kwasów lotnych. IV. TEST NA ŻYWOTNOŚĆ Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę błękitu metylenowego, do niego dodajemy zawiesinę drożdży przykrywamy szkiełkiem nakrywkowym i oglądamy pod średnim powiększeniem. Komórki żywe nie wpuszczają barwnika do wnętrza (trucizna). Komórki martwe łatwo wpuszczają barwnik do wnętrza i barwią się na niebiesko. V. TEST NA ODŻYWIENIE Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę płynu Lugola, przenosimy drożdże, nakrywamy szkiełkiem nakrywkowym i oglądamy pod średnim powiększeniem. Glikogen będący materiałem zapasowym tworzy z płynem Lugola kompleks, co przejawia się brunatnym zabarwieniem komórek dobrze odżywionych. Komórki słabo odżywione są prawie przezroczyste. VI. METODY BEZPOŚREDNIE LICZENIA DROBNOUSTROJÓW (METODY MIKROSKOPOWE) - liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór, Komory do liczenia pod mikroskopem mają postać szklanych płytek z wyciętym wgłębieniem podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Komora Thoma ma głębokość 0,1 mm, na jej dnie znajduje się siatka składająca się z 16 dużych kwadratów, które z kolei podzielone są na 16 małych kwadracików. Wymiary małej komory wynoszą: głębokość 0,1 mm, szerokość i długość 0,05 mm, zatem powierzchnia małej komory wynosi 0,0025 mm 2, a jej objętość 0,00025 mm 3. Podczas liczenia drobnoustrojów wyznacza się średnią liczbę komórek w ok. 40 małych kwadracikach. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm 3 wylicza się ze wzoru: L = 4 10 6 n a gdzie: n rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów, a średnia zawartość komórek w jednym kwadraciku. 4
- liczenie drobnoustrojów w preparacie przyżyciowym (bezpośrednim), Polega na wykonaniu preparatu bezpośredniego, tj. naniesieniu kropli zawiesiny drobnoustrojów na powierzchnię szkiełka przedmiotowego i przykrycia szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem liczy się średnią liczbę komórek z 20-50 pól widzenia. - liczenie drobnoustrojów metodą Breeda w preparacie barwionym, Polega na wykonaniu równomiernego rozmazu określonej, niewielkiej ilości hodowli, pobranej tzw. pipetą Breeda (0,01 cm 3 ), na znanej powierzchni (A) szkiełka podstawowego, wcześniej dokładnie odtłuszczonego. Po wykonaniu rozmazu, wysuszeniu i utrwaleniu, preparat wybarwia się odpowiednim barwnikiem, a następnie liczy pod mikroskopem średnią liczbę komórek z trzech preparatów. - metoda DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) Polega na liczeniu pod mikroskopem drobnoustrojów osadzonych na filtrze membranowym, o porach 0,45 m, po uprzednim ich wybarwieniu fluorochromami. adane próbki mogą być wstępnie poddane obróbce enzymatycznej, następnie wybarwiane najczęściej oranżem akrydyny i liczone w mikroskopiefluorescencyjnym. Komórki żywe fluoryzują na pomarańczowo lub żółto, natomiast martwe na zielono. 5
VII. KLASYFIKACJA DROŻDŻY - testy fermentacyjne badają zdolność drożdży w warunkach beztlenowych do wykorzystywania cukrów poprzez fermentacje. Wynikiem pozytywnym jest powstanie CO 2, który zbiera się w rurce Durhama, - testy asymilacyjne badają zdolność drożdży w warunkach tlenowych do wykorzystywania różnych źródeł węgla i azotu. Wynikiem pozytywnym jest zmętnienie roztworu lub pojawienie się kożuszka na jego powierzchni, co świadczy o rozwoju mikroorganizmów, - zarodnikowanie drożdże dzielimy na zarodnikujące (Ascomycota) i niezarodnikujące (Deuteromycota), do pobudzenia wytwarzania zarodników przez komórki drożdżowe używa się podłoży sporulacyjnych o specyficznym składzie (agar octanowy, agar Gorodkowej), uzyskane w ten sposób worki z zarodnikami barwi się metodą Schaeffera-Fultona, kształty zarodników: kuliste, elipsoidalne, nerkowate, półkuliste, kapeluszowate, soczewkowate, w kształcie Saturna, maczugowate, igiełkowate, - inne badania zdolność wzrostu w podwyższonej temperaturze, przy braku witamin, przy wysokiej zawartości cukrów, zdolność do syntezy związków skrobiopodobnych, zdolność do syntezy kwasu octowego. VIII. DROŻDŻE KILLEROWE Drożdże killerowe (ang. Killer yeasts) to szczepy drożdży zainfekowane jednym z wirusów, wytwarzających toksyczne białka, które zabijają blisko spokrewnione, ale niezainfekowane drożdże. 6
Toksyny te są zabójcze dla szczepów z tego samego rodzaju lub rzadziej wobec szczepów z innych rodzajów. Drożdże killerowe wykazują tolerancję wobec toksyn, które same wytwarzają, natomiast mogą być wrażliwe na toksyny innych drożdży killerowych. Drożdże killerowe są powszechnie znajdywane w owocach i kwiatach, w tym winogronach. Odgrywają istotną rolę podczas fermentacji winogron, gdyż mogą spowalniać proces i pozostawiać niepożądane aromaty w winie. Można powiedzieć, że przejmują fermentację w swoje ręce, zabijając zaszczepione drożdże, nawet jeśli znajdują się na początku procesu w znacznie mniejszych ilościach. Rozważa się wykorzystanie do fermentacji odpowiednich gatunków drożdży o właściwościach killerowych, dzięki czemu będzie można ograniczyć rozwój szczepów niepożądanych, bez sterylizacji moszczu na początku procesu. Jak dotąd wśród drożdży opisano zarówno gatunki killerowe, jak i wrażliwe oraz neutralne. Opisano też 11 wzorów aktywności killerowej (K1-K11) w oparciu i interakcje między drożdżami killerowymi. Część praktyczna: Wszystkie doświadczenia wykonujemy w warunkach sterylnych! 1. Morfologia komórek drożdżowych a) z przygotowanych skosów drożdży (5 sztuk) przygotować preparaty przyżyciowe b) na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynu Lugola, do niej dodać niewielką ilość materiału mikrobiologicznego (5 preparatów), delikatnie zamieszać, przykryć szkiełkiem nakrywkowym oglądać pod obiektywem o powiększeniu 40x c) wykonać rysunki dla każdego skosu drożdży i opisać je (sprawozdanie 2) 2. Test na żywotność a) przygotować 1 preparat ze wskazanych drożdży b) barwić wg przepisu wyżej c) policzyć komórki martwe i żywe w 3 polach widzenia oraz podać ich procentowy udział w badanym preparacie (obliczenia w sprawozdaniu 2). 3. Test na odżywianie a) przygotować 1 preparat ze wskazanych drożdży b) barwić wg przepisu wyżej c) policzyć komórki odżywione i nieodżywione w 3 polach widzenia oraz podać ich procentowy udział w badanym preparacie (obliczenia w sprawozdaniu 2). 4. Testy fermentacyjne a) każda grupa otrzymuje 2 podłoża płynne z rurką Durhama, każde podłoże zawiera inny cukier (podaje prowadzący na ćwiczeniach) b) zaszczepić oba podłoża wskazanymi drożdżami (każda grupa innymi) 7
c) odstawić do inkubacji we wskazane miejsce. 5. Testy asymilacyjne a) każda grupa otrzymuje 2 podłoża płynne w małych probówkach, każde podłoże zawiera inny cukier (źródło węgla) i inne źródło azotu (podaje prowadzący na ćwiczeniach) b) zaszczepić oba podłoża wskazanymi drożdżami (każda grupa innymi) c) odstawić do inkubacji we wskazane miejsce. 6. Liczenie drobnoustrojów w komorze Thoma (OSTROŻNIE!) a) komorę Thoma (na sucho) umieścić na stoliku, szukać linii siatki pod obiektywem o powiększeniu 10x, a następnie 40x, kondensor opuszczony do połowy wysokości b) podnieść tubus do góry, nałożyć szkiełko nakrywkowe na komorę w taki sposób, aby powstały barwne pierścienie Newtona c) ponownie odszukać linie siatki komory d) nałożyć badane drożdże (hodowla płynna) za pomocą zakraplacza (patrząc z boku) w taki sposób, aby nie poruszyć mikroskopem i ustawionym obrazem e) patrząc przez okular wyostrzyć obraz i policzyć ilość drobnoustrojów w 40 małych kwadracikach f) po obserwacji komorę ostrożnie umyć detergentem i wodą, oraz wodą destylowaną i osuszyć g) obliczenia umieścić w sprawozdaniu 2 8