Mikroskop to instrument służący do obserwacji małych obiektów, zwykle niewidocznych gołym okiem (tzn. nie mieszczących się w zakresie rozdzielczości ludzkiego oka). Znamy obecnie m.in. mikroskopy optyczne, elektronowe, jonowe, ultradźwiękowe. Metody obrazowania składników materii TECHNIKA OGRANICZENIA ROZDZIELCZOŚĆ Oko Siatkówka 700 000 Å Mikroskop optyczny Dyfrakcja światła Skaningowy ME Transmisyjny ME Spis treści 3 000 Å Dyfrakcja elektronów 30 Å Dyfrakcja elektronów 1 Å 1 Historia 2 Pojęcia podstawowe 2.1 Apertura numeryczna 2.2 Jak zwiększyć zdolność rozdzielczą obiektywu mikroskopu? 2.3 Właściwości światła pogorszające zdolność rozdzielczą mikroskopu: 2.4 Konstrukcja mikroskopu optycznego 2.5 Całkowite powiększenie mikroskopu 3 Rodzaje mikroskopii optycznej 3.1 Mikroskopia transmisyjna 3.2 Mikroskopia kontrastu fazowego 3.3 Mikroskopia polaryzacyjna 3.4 Mikroskopia ciemnego pola 3.5 Mikroskopia fluorescencyjna 3.5.1 Barwienie preparatów 3.5.2 Barwniki fluorescencyjne 3.6 Mikroskopia konfokalna 3.6.1 Zasada działania 3.6.2 Przykłady mikroskopów konfokalnych 4 Mikroskopia elektronowa 4.1 Budowa mikroskopu elektronowego 4.2 Soczewki mikroskopu elektronowego 4.3 Skaningowy mikroskop elektronowy 5 Przygotowanie próbek do badania za pomocą mikroskopii elektronowej Historia Około roku 1590 Holendrzy Zachariasz i Hans Jansenowie skonstruowali pierwszy mikroskop optyczny umożliwiający uzyskiwanie 10-krotnie powiększonego obrazu obiektów. W XVII wieku Antonie van Leeuwenhoek udoskonalił konstrukcje mikroskopu (powiększenie maksymalne 270x), rozwinął produkcję tego urządzenia i jako pierwszy zaobserwował naczynia
włosowate, plemniki, erytrocyty, bakterie, plankton itp. Robert Hooke posługując się zbudowanym przez siebie mikroskopem, w 1665 roku jako pierwszy zobaczył komórkę (fragment korka). Pod koniec XIX wieku stosowanie mikroskopów optycznych w naukach technicznych i przyrodniczych stało się powszechne. Dominował pogląd, że wytwarzając coraz doskonalsze soczewki oraz osiągając coraz większe powiększenia, można będzie zobaczyć coraz więcej szczegółów struktury. Dopiero teoria zdolności rozdzielczej przyrządów optycznych, rozwinięta przez Ernsta Abbego i Williama Strutta wykazała, że zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego zależy od długość fali świetlnej, współczynnika załamania światła i apertury soczewki. Sposobem na poprawę zdolności rozdzielczej mikroskopu jest znalezienie promieniowania o krótszej fali. W roku 1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali w Berlinie Ernst Ruska i Maks Knoll ze współpracownikami. W 1936 roku powstał pierwszy mikroskop elektronowy firmy Siemens. W roku 1982 Gerd Binnig i Heinrich Rohrer skonstruowali w Zurichu mikroskop STM (Scanning Tunneling Microscope), pozwalający na obserwację struktur złożonych z pojedynczych atomów. W 1986 roku powstał pierwszy mikroskop sił atomowych (AFM). Pojęcia podstawowe Prędkość fazowa fali prędkość, z jaką rozchodzą się miejsca fali o tej samej fazie, np. czoło fali. Współczynnik załamania stosunek prędkości fazowej fali w ośrodku odniesienia do prędkości fazowej fali w danym ośrodku: gdzie prędkość fali w ośrodku, w którym fala rozchodzi się na początku, prędkość fali w ośrodku, w którym rozchodzi się po załamaniu. Ośrodkiem odniesienia przy określaniu współczynnika załamania światła jest próżnia. Gdy mowa jest o współczynniku załamania światła, chodzi o współczynnik załamania względem próżni (bezwzględny współczynnik załamania światła). Dyspersja fali zależność prędkości fazowej fali od jej częstotliwości (długości). Dyspersja w optyce zależność współczynnika załamania ośrodka od częstotliwości fali (świetlnej). Jednym ze skutków dyspersji jest rozszczepienie światła białego przez pryzmat. Apertura numeryczna Kąt apertury to kąt pod którym widać źrenicę wejściową układu optycznego, patrząc z punktu przecięcia się głównej osi optycznej przyrządu z płaszczyzną, w której znajduje się przedmiot. Apertura numeryczna jest opisywana wzorem: gdzie: współczynnik załamania ośrodka, w którym znajduje się przedmiot.
Imersja metoda stosowana w mikroskopii w celu zwiększenia zdolności rozdzielczej mikroskopu optycznego. Przestrzeń pomiędzy preparatem a obiektywem wypełnia się przeźroczystą cieczą (imersyjną) o współczynniku załamania zbliżonym do współczynnika załamania szkła soczewki. Zapobiega to załamaniu się światła po przejściu ze środowiska optycznie gęstszego (szkła) do środowiska optycznie rzadszego (powietrza). Zdolność rozdzielcza najmniejsza odległość między dwoma punktami, które w uzyskanym obrazie mogą być jeszcze rozróżniane jako oddzielne. Kryterium Rayleigha (stosowane do określenia zdolności rozdzielczej elementów i układów optycznych): Obrazy dwóch różnych punktów są uważane za oddzielne, gdy główne maksimum dyfrakcyjne pierwszego obrazu pokrywa się z minimum obrazu drugiego. Zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego: gdzie: najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami przedmiotu, które w obrazie mikroskopowym mogą być jeszcze rozróżniane jako oddzielne, współczynnik załamania światła (dla powietrza, dla olejku imersyjnego ), długość fali światła, apertura numeryczna obiektywu mikroskopowego. Jak zwiększyć zdolność rozdzielczą obiektywu mikroskopu? 1. Poprzez zwiększenie apertury numerycznej. W tym celu należy powiększyć współczynnik załamania n przestrzeni między przedmiotem a obiektywem nanosząc na preparat kroplę cieczy immersyjnej, o dużym współczynniku załamania n i w niej zanurzając czoło obiektywu. 2. Stosując do oświetlenia preparatu promieniowanie o długości fali krótszej od światła białego. Właściwości światła pogorszające zdolność rozdzielczą mikroskopu: 1. Dyfrakcja przy dużych powiększeniach utracona zostaje informacja o drobnej strukturze przedmiotu; uginające się światło na krawędziach bardzo małych obiektów powoduje, że szczegóły obserwowanego obiektu stają się coraz mniej widoczne. 2. Aberracje geometryczne nie wszystkie promienie wychodzące z przedmiotu spotykają się po odwzorowaniu w jednym punkcie obrazowym co w rezultacie powoduje utratę lub zafałszowanie niektórych szczegółów obrazu. Aberracja sferyczna cecha układu optycznego polegająca na odmiennych długościach ogniskowania promieni świetlnych ze względu na ich położenie pomiędzy środkiem a brzegiem urządzenia optycznego im bardziej punkt przejścia światła oddala od osi optycznej urządzenia tym bardziej uginają się promienie świetlne. Aberracja chromatyczna cecha układu optycznego, wynikająca z różnych odległości ogniskowania (ze względu na różną wartość współczynnika załamania) dla poszczególnych długości fali światła. W rezultacie występuje rozszczepienie widoczne na granicach kontrastowych obszarów pod postacią kolorowej obwódki.
3. Astygmatyzm, dystorsja, koma. Konstrukcja mikroskopu optycznego Standardowy mikroskop optyczny z oświetleniem próbki od dołu jest przedstawiony na Rys. Figure 1. Składa się on z 1. okularu osadzonego w tubusie; 2. rewolweru; 3. obiektywu; 4. śruby makrometrycznej; 5. śruby mikrometrycznej; 6. stolika; 7. źródła światła (lub zwierciadła oświetlającego); 8. kondensora; 9. statywu. Budowa mikroskopu optycznego. 1. okular osadzony w tubusie; 2. rewolwer; 3. obiektyw; 4. śruba makrometryczna; 5. śruba mikrometryczna; 6. stolik; 7. źródło światła (lub zwierciadło oświetlające); 8. kondensor; 9. statyw.
Całkowite powiększenie mikroskopu Całkowite powiększenie mikroskopu przedstawia się wzorem: gdzie:. długość optyczna tubusu mikroskopu, w mm (odległość pomiędzy ogniskiem obrazowym obiektywu a ogniskiem przedmiotowym okularu, odległość najlepszego widzenia (250 mm), ogniskowa obiektywu, ogniskowa okularu. Powiększenie puste przy zwiększaniu bez zmiany apertury obiektywu prowadzi do rozciągnięcia obrazu bez ujawnienia nowych szczegółów). Powiększenie użyteczne to najmniejsze powiększenie obrazu obiektu przy którym zarejestrujemy lub dostrzeżemy całą informację zawartą w obrazie. Granice użytecznego powiększenia mikroskopu wynikają ze zdolności rozdzielczej obiektywu i zdolności rozdzielczej układu rejestrującego obraz (oka lub aparatu fotograficznego). gdzie zdolność rozdzielcza oka około (0,15 0,3) mm, zdolność rozdzielcza mikroskopu. Przyjmując średnią długość fali dla światła białego można wykazać, że: Rodzaje mikroskopii optycznej Mikroskopia transmisyjna Obserwacja światła przechodzącego przez badany obiekt i rozróżnienie obszarów różniących się stopniem absorpcji. Mikroskopia kontrastu fazowego Obraz powstaje w wyniku nałożenia dwóch wiązek światła bezpośredniej ze źródła i tej, która przechodzi przez badany obiekt. Obserwacja elementów obiektu różniących się współczynnikiem załamania (różne przesunięcie fazowe promieni). Mikroskopia polaryzacyjna Obserwacja obiektów zdolnych do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego liniowo (obiekty biologiczne). Uwidaczniane są obszary różniące się stężeniem tych obiektów. Obraz powstaje przez nałożenie na siebie dwóch wiązek światła spolaryzowanego (przechodzącej przez obiekt i odniesienia)
Mikroskopia ciemnego pola Obserwacja światła rozpraszanego przez obiekt. Technika przydatna do obserwacji struktur typu rzęski, odnóża. Mikroskopia fluorescencyjna Preparat oświetlany jest od strony obiektywu światłem o długości fali pochłanianej przez barwnik, a obserwacje prowadzi się przy długości fali odpowiadającej silnej fluorescencji tego barwnika. Barwienie preparatów Właściwości dobrych barwników: Wnikają do wnętrza komórki. Wiążą się wybiórczo z elementami komórki. Posiadają intensywna absorpcję, która umożliwia obserwacje struktur komórkowych po ich związaniu z barwnikiem Przydatne są barwniki o właściwościach zależnych od ph. Barwniki fluorescencyjne Obserwacja emisji światła na ciemnym tle, co zwiększa czułość metody i poprawia kontrast obserwowanych szczegółów. Z powodu wysokiej czułości w technikach wybiórczego badania cząsteczek biologicznych stosuje się barwniki fluorescencyjne zamiast absorpcyjnych. Siła i barwa fluorescencji mogą zależeć od warunków panujących w środowisku: ph, potencjał redox, lipofilowość, oraz od stężenia niektórych jonów np. Ca 2+. Mikroskopia konfokalna Problem światło pochodzące spoza płaszczyzny ogniskowania zmniejszające ostrość konturów i powodujące wysokie tło. Cel wyeliminowanie obrazów pochodzących spoza płaszczyzny ogniskowania. Uzyskany obraz charakteryzuje się słabszym tłem i ostrzejszymi konturami. Możliwość uzyskania obrazów warstwicowych dla kolejnych przekrojów obiektu poprzez zmianę położenia płaszczyzny ogniskowania. Zasada działania Wiązka lasera skupiana jest na pojedynczym punkcie obserwowanego obiektu. Światło odbite od tego punktu (lub wyemitowane) przechodzi przez układ optyczny (obiektyw) zogniskowany na płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej i trafia do detektora. Obraz obiektu tworzony jest punkt po punkcie dzięki skokowemu przemieszczaniu się wiązki po obiekcie obserwacji. W punkcie przecięcia się promieni z płaszczyzną ogniskowania umieszczona jest przesłona z małym otworkiem do detektora docierają tylko promienie z tej płaszczyzny.
Promienie pochodzące z innych miejsc obiektu zostaną przez przesłonę odbite lub pochłonięte. Zmieniając położenie przesłony z otworem wzdłuż osi optycznej uzyskuje się zmianę płaszczyzny ogniskowania. Przykłady mikroskopów konfokalnych 1. 2. Laserowy skanujący mikroskop konfokalny ( Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM). Dwufotonowy mikroskop konfokalny (TPCM, ang. Two-photon Confocal Microscope). Mikroskopia elektronowa Dyfrakcja i interferencja światła ogranicza zastosowanie mikroskopów optycznych. Wykorzystując światło widzialne można obserwować obiekty o minimalnych rozmiarach rzędu 200 nm. W przypadku promieniowania ultrafioletowego granica przesuwa się do ok. 100 nm. Zastosowanie promieniowania elektromagnetycznego o mniejszej długości fali (promienie X, γ) napotyka na bariery techniczne: brak materiałów z których można wykonać soczewki lub zwierciadła. Mikroskopia elektronowa mogła się rozwinąć dzięki odkryciu elektronu przez Josepha J. Thompsona; odkryciu dwoistej natury falowo-korpuskularnej elektronów przez Victora de Broglie w 1924 r. (nagroda Nobla 1929 r. za odkrycie falowej natury elektronu ); użyciu pola magnetycznego jako soczewki skupiającej elektrony przez Hansa Busha w 1926 r. Według hipotezy de Broglie'a każdy obiekt materialny może być opisywany jako zbiór cząstek, albo jako fala materii. Wzór pozwalający wyznaczyć długość fali materii dla cząstki o określonym pędzie ma postać: gdzie: długość fali cząstki, stała Plancka, pęd cząstki. Dzięki temu, że długość fali materii dla rozpędzonego elektronu jest bardzo mała w porównaniu z długością fali światła, elektrony nadają się do obserwacji małych obiektów, co wykorzystano w konstrukcji mikroskopu elektronowego o wielokrotnie wyższej rozdzielczości niż mikroskop optyczny. Powyższe rozważania dotyczą ruchu swobodnego cząstek. W realnych przypadkach cząstce należy przypisać paczkę falową. Dla elektronu:. Zakładając dalej, że energia kinetyczna elektronu wynosi (przy nieuwzględnieniu zjawisk relatywistycznych)
. otrzymujemy. Dla wysokich napięć (> 6 kv) zauważalny jest efekt relatywistycznego przyrostu masy elektronów:. Stąd wzór na długość fali uwzględniający relatywistyczny przyrost masy elektronów:. Dla napięcia 100 kv otrzymamy. Budowa mikroskopu elektronowego Działo elektronowe pełni rolę analogiczną jak żarówka w mikroskopie świetlnym. Zbudowane jest z trójelektrodowego systemu: katody, tzw. cylindra Wehnelta i anody. Rolę katody pełni wyprofilowane włókno wolframowe, wygięte w kształcie litery V, rozgrzane prądem do temperatury powyżej 1000oC. W procesie termoemisji emituje ono chmurę elektronów. Pomiędzy katodą, a anodą w dolnej części działa, wytworzona jest różnica potencjałów np. 1000000 V. Elektrony, wyemitowane przez katodę, zostają przyśpieszone polem elektrostatycznym i skierowane w stronę otworu w anodzie. Skupienie wiązki osiąga się przez wykorzystanie pola elektrostatycznego wytworzonego przez soczewkę elektrostatyczną (cylinder Wehnelta), znajdującą się między katodą, a anodą, wytwarzającą ujemne pole potencjału powodujące odpychanie elektronów. W efekcie średnica wiązki zostaje zmniejszona (do ok. 100 μm) i skierowana do dalszej części kolumny mikroskopu. Komora preparatu zaopatrzona w śluzę zapobiegającą zapowietrzaniu całego mikroskopu podczas wymiany preparatu. W komorze znajduje się stolik o dużej precyzji przesuwu i goniometr pozwalający nachylać preparat. Układ próżniowy ponieważ wiązka elektronów ulega na atomach gazu rozproszeniu, konieczne jest stosowanie wysokiej próżni wytwarzanej za pomocą układu pomp rotacyjnych i dyfuzyjnych. Etapy uzyskiwania próżni: 1. etap odpompowanie powietrza z wstępnej komory (śluzy) przez którą wprowadza się próbkę
do wnętrza kolumny. 2. etap dokładniejsze usunięcie resztek powietrza z kolumny poprzez otwarcie zaworów łączących wnętrze kolumny z pompą dyfuzyjną i rotacyjną. Resztki gazów pompowane są przez pompę dyfuzyjna do zbiornika próżni, a stąd odciągane przez pompę rotacyjna na zewnątrz. Pompa dyfuzyjna wytwarza próżnię umożliwiającą uzyskanie odpowiednich warunków dla emisji wiązki elektronowej. Soczewka elektromagnetyczna cewka, zasilana prądem stałym, obudowana płaszczem z materiału ferromagnetycznego. W środkowej części płaszcza utworzona jest szczelina, uniemożliwiająca pełne zamknięcie pola magnetycznego w płaszczu ferromagnetycznym. Końce szczeliny są biegunami magnesu N i S, wokół których w specyficzny sposób układają się linie sił pola magnetycznego. Kształt linii pola magnetycznego jest ustalany przez nabiegunniki soczewki. Stabilność układu powiększającego wymaga bardzo wysokiej stabilizacji prądu soczewek, od którego zależy pole magnetyczne wytworzone w soczewkach. Także niewielkie wahania napięcia przyśpieszającego, zmieniając nieznacznie prędkość elektronów, mogą spowodować drgania obrazu na ekranie. Z tego powodu, napięcie przyśpieszające jest stabilizowane z dokładnością lepszą niż 0,1 V. Soczewki mikroskopu elektronowego Układ soczewek kondensora służy do zmiany natężenia i rozbieżności wiązki elektronów padającej na próbkę. Układ powiększający składa się z: 1. 2. 3. Soczewki obiektywowej (najważniejsza część mikroskopu od niej zależy zdolność rozdzielcza). Soczewki pośredniej (mogą być dwie, służą do uzyskiwania obrazu dyfrakcyjnego). Soczewka projekcyjna (służy do uzyskiwania żądanych powiększeń). Wadami soczewek elektronowych są: astygmatyzm związany z tym, że pole magnetyczne nabiegunników nigdy nie jest idealnie symetryczne, oddziaływanie elektrostatyczne zanieczyszczeń gromadzących się na przesłonach z wiązką elektronów. Wady te wpływają na zdolność rozdzielczą mikroskopu, która obecnie wynosi około 1 Å. Do usuwania astygmatyzmu soczewek stosuje się tzw. stygmatory. Korekcja astygmatyzmu polega na wytwarzaniu przez stygmator asymetrycznego pola magnetycznego takiego, by kompensowało asymetrie pola magnetycznego soczewki i przesłony. Skaningowy mikroskop elektronowy Transmisyjny mikroskop elektronowy daje obraz dwuwymiarowy. Źródłem informacji o kształtach struktur subkomórkowych może być skaningowy mikroskop elektronowy. Układ próżniowy i emisji elektronów jak dla TEM. Wiązka skupiona przez układ kondensora, jest kierowana na powierzchnię preparatu. Na
drodze wiązki elektronów znajdują się elektromagnesy odchylające wiązkę. Wiązka, o średnicy 0,1-1 μm biegnie po powierzchni preparatu. Obok próbki znajduje się licznik elektronów odbitych od powierzchni próbki, które wpadając do niego powodują powstanie sygnału prądowego. Sygnał jest wzmacniany i przesyłany na ekran, na którym intensywność świecenia plamki jest proporcjonalna do sygnału z detektora. Plamka przesuwa się z taką samą częstotliwością, jak wiązka po powierzchni próbki dlatego na monitorze tworzy się obraz odpowiadający topografii powierzchni od której zostały odbite elektrony. Powiększenie obrazu w mikroskopie skaningowym jest równe stosunkowi szerokości ekranu monitora do szerokości pola, po którym przebiega wiązka skanująca powierzchnię próbki. Zdolność rozdzielcza zależy od średnicy wiązki: im mniejsza wiązka, tym większą uzyskuje się rozdzielczość obrazu. Na ogół powiększenia uzyskiwane za pomocą mikroskopu skaningowego nie przekraczają jednak kilkudziesięciu tysięcy razy. Przygotowanie próbek do badania za pomocą mikroskopii elektronowej W mikroskopie elektronowym można oglądać preparaty z komórek utrwalonych. Próbki muszą być odwodnione bez zniekształcenia istotnych elementów materiału. We wnętrzu mikroskopu musi panować wysoka próżnia, aby elektrony nie rozpraszały się na cząsteczkach powietrza i w takich warunkach przygotowany preparat musi być trwały. Metody przygotowania preparatu do obserwacji w mikroskopie skaningowym zależą od stopnia uwodnienia badanego obiektu. Obiekty twarde takie jak zarodniki roślin, pokrywy chitynowe skorupiaków nie zmieniają swojej naturalnej struktury i nie wymagają specyficznych metod natomiast tkanki roślinne i zwierzęce o dużej zawartości wody wymagają odpowiednich metod przygotowania do badań w SEM w celu uniknięcia deformacji próbki w próżni mikroskopowej. Etapy przygotowania próbki: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Utrwalanie i osmowanie. Przykłady utrwalaczy: aldehyd glutarowy (GA) 1.5-3% r-r w 0,2 M buforze fosforanowym lub kakodylowym o ph = 7,2; FAA (formaldehyd + kwas octowy lodowaty + alkohol etylowy 70%, 5:5:90); czterotlenek osmu OsO 4, 1-2% r-r w buforze fosforanowym lub kakodylowym. Płukanie w buforze fosforanowym w celu usunięcia utrwalacza z tkanek. Odwadnianie we wzrastających stężeniach alkoholu etylowego lub acetonu. Suszenie. Naklejanie i napylanie próbki pokrywa się złotem technicznym w napylarce próżniowej. Obserwacja i analiza obrazu. W przypadku badań za pomocą elektronowego mikroskopu elektronowego próbki przygotowuje podobnie, dodatkowo preparat musi być bardzo cienki (poniżej 1 μm). W grubszych warstwach elektrony ulegają rozproszeniu i spowolnieniu co uniemożliwia ich zogniskowanie i otrzymanie ostrego obrazu. W związku z tym po utrwaleniu za pomocą roztworu aldehydu glutarowego i
czterotlenku osmu (OsO4) i usztywnieniu, poprzez przesycanie polimerami akrylowymi (metakrylany) lub epoksydowymi utwardzony blok tkanek tnie się na ultracienkie skrawki za pomocą ultramikrotomu z użyciem noży diamentowych lub szklanych, a następnie wybarwia solami metali ciężkich: ołowiu, uranu, złota