QUANTA Lite Gliadin IgA ELISA 708655 Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM Gliadin IgA jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgA przeciwko gliadynie w surowicy człowieka. Wykrywanie tych przeciwciał wspomaga diagnozę pewnych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i zapalenie opryszczkowate skóry. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia lub enteropatia związana z nadwrażliwością na gluten to choroba przewlekła, której główne cechy obejmują stan zapalny i charakterystyczne histologiczne spłaszczenie błony śluzowej przewodu pokarmowego, którego skutkiem jest zespół złego wchłaniania. Dokładna etiologia choroby pozostaje nieznana, ale gliadyna lub rozpuszczalna w alkoholu frakcja glutenu pszennego jest zdecydowanie czynnikiem toksycznym. 1 Początkowo w celu zdiagnozowania celiakii i zaburzeń pokrewnych wykonywano szereg wielokrotnych biopsji jelitowych. Ostatnio zasugerowano wykonywanie badań serologicznych jako badań przesiewowych wykonywanych u pacjentów z podejrzeniem enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten, jak również do monitorowania przestrzegania diety. 2-5 Europejskie Towarzystwo Gastroenterologii Pediatrycznej i Żywienia (European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN)) w celu zmniejszenia liczby biopsji jelita potrzebnych do postawienia rozpoznania zaleciło stosowanie markerów serologicznych, takich jak gliadyna, jak również przeciwciał przeciwko retikulinie (białko tkanki łącznej układu chłonnego) i śródmięsnej. 6 U pacjentów cierpiących na enteropatię związaną z nadwrażliwością na gluten w surowicy wykrywane są zarówno przeciwciała IgA jak i IgG. 2,3 Wydaje się, że przeciwciała IgG przeciw gliadynie są czulszymi, lecz również mniej swoistymi markerami choroby niż przeciwciała klasy IgA. Przeciwciała IgA gliadyny są mniej wrażliwe, ale bardziej swoiste. Strategia stosowania czułych testów przesiewowych w populacji o podwyższonym ryzyku obejmuje badania zarówno w kierunku obecności przeciwciał IgG jak i IgA przeciwko gliadynie, jako że znaczna część pacjentów z celiakią to chorzy z niedoborem IgA. 7 Przeciwciała IgA przeciwko gliadynie są ważne w ocenie aktywności choroby w czasie oraz w celu monitorowania skuteczności stosowania diety bezglutenowej. 5 Zasada badania Oczyszczony antygen gliadyny wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Uprzednio wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjenta są dodawane do oddzielnych dołków, dzięki czemu wszelkie przeciwciała IgA przeciwko gliadynie wiążą się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgA. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgA znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem gliadyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko IgA gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko IgA gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko IgA gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgA, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgA, 1 fiolka zabarwienie żółte, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml 1
Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Dlatego słabo pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA oraz kontrola negatywna ELISA powinny być traktowane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny. 8 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. 2
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami Gliadin IgA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgA HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344 M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, 200 300 i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA oraz kontroli negatywnej ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał IgA przeciwko gliadynie z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki otrzymanej od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać 200 300 µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgA HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 2. 5. Etap płukania: Powtórzyć etap 3. 6. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 3
8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Słabo pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA i kontrola negatywna ELISA powinno się stosować z każdą partią próbek, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo. 2. Uwaga: w związku z tym, że słabo pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA, silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA oraz kontrola negatywna ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie mają one zastosowania w metodach badań związanych z rozcieńczeniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA musi być większa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA, która musi być większa niż absorbancja rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA musi posiadać absorbancję większą niż 1,0, podczas gdy absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekraczać wartości 0,2. c. Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA musi być dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub powinna przekraczać 0,25. d. Kontrola negatywna ELISA i silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA są przeznaczone do monitorowania znacznego braku działania odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA nie zapewnia dokładności przy wartości granicznej testu. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki może być obliczona przez podzielenie średniej gęstości optycznej próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA. Wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA podanej na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki= x słabo pozytywna kontrola testu Gliadin IgA ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu Gliadin IgA ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna 20 30 Możliwe są wyniki od średnio pozytywnych do Silnie pozytywna >30 1. Dodatni wynik wskazuje na obecność przeciwciał IgA przeciwko gliadynie i sugeruje możliwość wystąpienia pewnych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i opryszczkowate zapalenie skóry. 2. Negatywny wynik wskazuje na brak przeciwciał IgA przeciwko gliadynie lub poziomy poniżej ujemnych wartości granicznych testu. 4
3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki uzyskano stosując zestaw testowy INOVA QUANTA Lite Gliadin IgA ELISA. Wartości IgA gliadyny uzyskane metodami badań różnych producentów nie mogą być stosowane zamiennie. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgA nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Negatywny wynik dla IgA przeciwko gliadynie u nieleczonego pacjenta nie wyklucza enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten, zwłaszcza gdy jednocześnie występuje u niego wysoki poziom przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Wynik taki można często wyjaśnić, występującym względnie często w celiakii, selektywnym niedoborem IgA. 2. U leczonych pacjentów z ekspresją przeciwciał IgA, poziom IgA przeciwko gliadynie jest lepszym wskaźnikiem przestrzegania diety niż stężenie przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. 3. Możliwe są wyniki fałszywie pozytywne (wysokie poziomy przeciwciał bez charakterystycznych wyników histologicznych). Wiadomo, że inne schorzenia żołądkowo-jelitowe mogą indukować pojawienie się w układzie krążenia przeciwciał przeciwko gliadynie; są to głównie choroba Crohna, nietolerancja pokarmowa białek (mleko krowie) i zespół złego wchłaniania po infekcji. 4. Związek między opryszczkowatym zapaleniem skóry i enteropatią związaną z nadwrażliwością na gluten jest tak silny, że sugeruje się, że obydwie choroby mają taką samą etiologię; u pacjentów tych, określenie przeciwciał przeciwko gliadynie jest przydatne do wykrywania objawów celiakii oraz oszacowania stopnia zajęcia układu pokarmowego. 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite Gliadin IgA ELISA do wykrywania przeciwciał IgA przeciwko gliadynie oszacowano posługując się dostępnym na rynku testem ELISA. Wyniki testu ELISA ustalono zgodnie z broszurą jego producenta. Normalny zakres Stu siedmiu wybranych losowo dawców krwi przebadano na obecność przeciwciał IgA przeciw gliadynie. Dla jednej próbki (1%) uzyskano wynik przekraczający 20-jednostkową wartość graniczną. Wartość tej próbki wynosiła 31 jednostek. Średnia wartość dla 107 próbek wyniosła 7,9 jednostki ze standardowym odchyleniem 3,9 jednostki. Średnia wartość wynosi 3 standardowych odchyleń poniżej 20-jednostkowej wartości granicznej. 20-jednostkową wartość graniczną stosuje się zarówno dla populacji dziecięcej jak i dorosłej. Swoistość i wrażliwość względna Osiemdziesiąt jeden próbek przesłanych do dużego laboratorium referencyjnego do badania w kierunku celiakii przebadano z zastosowaniem testu QUANTA Lite Gliadin IgA ELISA lub innego dostępnego na rynku zestawu. Wyniki przedstawiono poniżej. INOVA + - + 31 4 Wrażliwość względna 88,6% Referencje Swoistość względna 97,8% - 1 45 Skuteczność względna 93,8% Przy zastosowaniu obu metod w obu przypadkach trzydzieści jeden próbek dało wynik pozytywny a 45 dało wynik negatywny. W teście INOVA jedna próbka dała wynik pozytywny (23 jednostki) i słabo negatywny (20 jednostek) przy zastosowaniu metody referencyjnej. Przy zastosowaniu metody referencyjnej cztery próbki dały wynik słabo pozytywny (23, 23, 26 i 29 jednostek) i negatywny przy użyciu testu INOVA (14, 15, 11 i 18 jednostek). Próbki od dziesięciu pacjentów z aktywną postacią celiakii przebadano zarówno przy użyciu testu INOVA jak i metody referencyjnej. U siedmiu pacjentów obie metody wykazały obecność przeciwciał IgA przeciwko gliadynie. Przy użyciu metody referencyjnej jedna dodatkowa próbka dała wynik słabo pozytywny (26 jednostek), jednakże w teście INOVA dała ona wynik negatywny. Przy użyciu obu metod przebadano dwunastu pacjentów cierpiących na różne dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego bez aktywnej postaci celiakii. W teście INOVA wszystkie 12 próbek dało wynik negatywny a jedynie jedna próbka dała wynik pozytywny w teście referencyjnym lub wykrywającym przeciwciała IgA przeciwko gliadynie. 5
Swoistość i wrażliwość kliniczna Zestawy ELISA QUANTA Lite IgG i IgA gliadyny oceniono w dwóch zewnętrznych badaniach klinicznych. Poniższa tabela podsumowuje wyniki zarówno zewnętrznych oraz wewnętrznych badań klinicznych. Podsumowanie wyników uzyskanych w badaniach klinicznych Grupa pacjentów Liczba Obecność IgA Obecność IgG Obecność G i/lub A Celiakia, nieleczona 62 a 44 (71%) 54 (87%) 59 (95%) Celiakia, pacjent na diecie 32 5 b (16%) 17 (53%) 17 (53%) Inna choroba przewodu pokarmowego 134 3 (2%) 20 (15%) 20 (15%) Wątpliwa celiakia 20 2 c (10%) 4 (20%) 5 d (25%) SLE 29 1 (3%) 1 (3%) 1 (3%) Zespół Sjogrena 26 1 (4%) 0 (0%) 1 (4%) Twardzina 10 0 0 0 Zapalenie wielomięśniowe 6 0 0 0 Normalne 107 1 (1%) 5 (5%) 5 (5%) a b c d Przynajmniej dwóch pacjentów w tej grupie miało udokumentowany niedobór IgA. U obu tych pacjentów uzyskano negatywny wynik na obecność przeciwciał IgA a jednocześnie wynik potwierdzający obecność przeciwciał IgG. Trzech z pięciu pacjentów pozytywnych miało wyniki jedynie słabo pozytywne (<30 jednostek). Obaj pacjenci mieli wyniki jedynie słabo pozytywne (<30 jednostek). Jeden pacjent z wynikiem pozytywnym IgG i IgA przeciw gliadynie oraz przeciwciałami przeciw śródmięsnej mimo wątpliwych wyników biopsji mógł już mieć aktywną lub rozwijającą się celiakię. W tabeli poniżej przedstawiono czułość i swoistość testów na obecność IgG i IgA przeciw gliadynie oraz łączną czułość i swoistość dla powyższych grup pacjentów. Czułość Swoistość IgA przeciw gliadynie 71% 97,6% IgG przeciw gliadynie 87% 91,0% IgG, IgA lub oba 95% 90,0% Reaktywność krzyżowa Aby ocenić potencjalne problemy reaktywności krzyżowej z innymi autoprzeciwciałami, przebadano różne dające wynik pozytywny próbki o wysokim mianie autoprzeciwciał na zestawie QUANTA Lite Gliadin IgA ELISA. Ogółem, przeprowadzono badania dla 28 próbek. Wiele próbek stanowiło wysoko pozytywną kontrolę z innych zestawów testowych autoprzeciwciał INOVA QUANTA Lite. Swoistości obejmowały dwuniciowe DNA (ds)dna, histony, Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, tarczycę, mitochondria, mięśnie gładkie, PR-3, MPO i kardiolipinę. Średnia wartość dla tych 28 próbek wyniosła 6,2 jednostek. Najwyższy wynik dla próbki wynosił 8 jednostek. Średnia wartość wynosi 12,9 standardowych odchyleń poniżej 20- jednostkowej wartości granicznej. Poniższe grupy pacjentów cierpiących na choroby tkanki łącznej przebadano na obecność przeciwciał IgA przeciwko gliadynie. Wynik pozytywny uzyskano tylko u jednego pacjenta z SLE (22 jednostki) i jednego pacjenta z zespołem Sjogrena (22 jednostki). U wszystkich pacjentów z chorobami tkanki łącznej uzyskano wynik pozytywny wskazujący na obecność innych przeciwciał. Wszyscy pacjenci z SLE mieli wyniki pozytywne dla Sm, dsdna lub obu z nich. U wszystkich pacjentów z zespołem Sjogrena wykryto przeciwciała przeciwko SS-A, SS-B lub obu z nich. Wszyscy pacjenci z twardziną mieli wyniki pozytywne dla Scl-70 i wszystkich 6 pacjentów z zapaleniem wielomięśniowym miało wyniki pozytywne dla Jo-1. Grupa pacjentów Nr Liczba wyników pozytywnych SLE 29 1 Zespół Sjogrena 26 1 Twardzina 10 0 Zapalenie wielomięśniowe 6 0 Precyzja i powtarzalność Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez oznaczenie sześciu powtórzeń każdej silnie pozytywnej i umiarkowanie pozytywnej próbki przez cztery kolejne dni. Średnia reaktywność próbki silnie pozytywnej wynosiła 102 jednostek a średnia wartość dla próbki umiarkowanie pozytywnej wynosiła 35. Wartości odchylenia standardowego i współczynnika zmienności dla każdej próbki podsumowano poniżej. Silnie pozytywna Średnio pozytywna SD CV SD CV Łącznie 3,3 3,3% 1,4 4,1% W ramach serii 3,5 3,3% 1,5 4,2% Pomiędzy seriami 2,3 2,3% 0,8 2,2% 6
Piśmiennictwo 1. Trier JS: Celiac Sprue. N Engl J Med 325: 1709-1719, 1991. 2. Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: 150-158, 1991. 3. McMillan SA, Haughton DJ, et al. : Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: 1163-1165, 1991. 4. Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. J Intern Med 241: 403-506, 1992. 5. Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: 941-947, 1991. 6. Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: 909-911, 1990. 7. Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: 367-371, 1992. 8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone 7
Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628655POL Sierpień 2011 Wersja 0 8