Aleksandra Januszkiewicz, Anna Chróst, Tomasz Wołkowicz, Grzegorz Madajczak, Monika Wasiak, Jolanta Szych

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 287-298 Aleksandra Januszkiewicz, Anna Chróst, Tomasz Wołkowicz, Grzegorz Madajczak, Monika Wasiak, Jolanta Szych Ognisko wywołane przez enteroagregacyjny i werotoksyczny szczep Escherichia coli O104:H4 w Europie postępowanie diagnostyczne w Polsce oraz charakterystyka szczepu Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Opisano ognisko krwotocznego zapalenia okrężnicy i zespołu hemolityczno - mocznicowego wywołane przez werotoksyczny szczep E. coli O104:H4 (VTEC O104:H4) powiązane z ogniskiem o międzynarodowym zasięgu, a także przedstawiono postępowanie w zakresie laboratoryjnej diagnostyki wdrożone w NIZP-PZH w związku z wystąpieniem zachorowań w Polsce. Ponadto przedstawiono charakterystykę izolatów epidemicznego szczepu pałeczki okrężnicy wyhodowanych od osób chorych w Polsce. Zakażenia przewodu pokarmowego wywołane przez shigatoksyczne/werotoksyczne pałeczki Escherichia coli (STEC/VTEC), które ze względu na kliniczny przebieg choroby nazywane także enterokrwotocznymi pałeczkami E.coli (EHEC), począwszy od początku lat 80-tych ubiegłego wieku są najczęstszą przyczyną krwotocznego zapalenia okrężnicy u ludzi w większości krajów europejskich i drugą co do częstości po pałeczkach czerwonki przyczyną krwawej biegunki w Ameryce Płd. (6,11). Ze względu na fakt, iż w stosowanym w różnych krajach nazewnictwie tych drobnoustrojów ciągle brak jest unifikacji, dla potrzeb niniejszej pracy przyjęto posługiwanie się określeniem VTEC. Należy je rozumieć jako synonim wymienianych w różnych publikacjach naukowych, raportach i doniesieniach mediów skrótów STEC lub EHEC. Zakażenia werotoksycznymi pałeczkami E. coli należą do chorób zakaźnych stanowiących istotne zagrożenie zdrowia publicznego i decyzją Komisji Europejskiej Nr 2000/96/ EC z dnia 22 grudnia 1999 r. w sprawie stopniowego obejmowania chorób zakaźnych siecią wspólnotową, zgodnie z decyzją nr 2119/98/WE Parlamentu Europejskiego i Rady Europy z dnia 24 września 1998 r. zakażenia te podlegają sieci nadzoru i kontroli epidemiologicznej w krajach Wspólnoty. Rozporządzeniem (WE) nr 851/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady Europy z dnia 21 kwietnia 2004 r. ustanowiono Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób (European Centre for Disease Control and Prevention - ECDC) i określono jego zadania. Zadaniem ECDC jest zwiększenie zdolności Wspólnoty oraz Państw Członkowskich w zakresie ochrony zdrowia ludzkiego poprzez zapobieganie i kontrolę

288 A. Januszkiewicz i inni Nr 4 chorób człowieka, poprzez nadzór epidemiologiczny nad chorobami zakaźnymi i innymi poważnymi chorobami zagrażającymi życiu mieszkańców Europy. Zadania te są realizowane między innymi poprzez integrację współpracy laboratoriów mikrobiologicznych (networking of laboratories), prowadzenie systemu wczesnego ostrzegania i udzielania informacji, wykonywanie ekspertyz naukowych a także współpracę techniczną. Pracownia Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Przewodu Pokarmowego Zakładu Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny (NIZP-PZH) na podstawie rekomendacji Krajowego Specjalisty ds. Mikrobiologii pełni rolę krajowego laboratorium referencyjnego dla zakażeń VTEC, działającego w ramach sieci Foodborne and Waterborne Diseases (FWD) ECDC. Werotoksyczne pałeczki E. coli wytwarzają shigatoksyny (ST, Stx) nazywane też werotoksynami (VT), które u niektórych zakażonych osób mogą wywołać nie tylko krwawą biegunkę ale również groźny, zagrażający życiu chorego zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS) (26). Pałeczki VTEC należą do klasycznych patogenów odzwierzęcych więc zakażenia przez nie wywoływane szerzą się głównie wskutek spożycia skażonej tymi bakteriami żywności pochodzenia zwierzęcego, a także innej żywności lub wody wtórnie zanieczyszczonej odchodami zwierząt. Do zakażenia VTEC może również dojść na drodze fekalno oralnej, zwykle wskutek nie przestrzegania zasad higieny przy bezpośrednim kontakcie z wydalającym zarazki zwierzęciem lub człowiekiem (26). Zakażenia VTEC mają charakter zakażeń sporadycznych, ale bardzo często przebiegają też w postaci ognisk zatrucia pokarmowego, obejmujących niekiedy setki a nawet tysiące osób. Wśród pałeczek okrężnicy wytwarzających werotoksyny wykryto szczepy należące do ponad 100 grup serologicznych, jednak najczęściej wśród VTEC wykrywa się izolaty należące do grupy serologicznej O157 nieco rzadziej do O26, O91, O103, O111, O113, O145 (14,20,28). W okresie od 1 maja do 26 lipca 2011 roku w Niemczech wystąpiło ognisko krwotocznego zapalenia okrężnicy i zespołu hemolityczno - mocznicowego wywołane przez werotoksyczny szczep E. coli O104:H4 (VTEC O104:H4), które objęło swoim zasięgiem 14 krajów europejskich, w tym Polskę, a także Kanadę i USA (25). Oprócz terenu Niemiec i przypadków osób które uległy zakażeniu w Niemczech, a zachorowały w innych krajach lub uległy objawowemu zakażeniu w następstwie kontaktu z chorymi przybywającymi z Niemiec w drugiej połowie czerwca, wystąpiły zachorowania w południowo-zachodniej Francji, w okolicach Bordeaux, gdzie jak się okazało miała miejsce druga lokalizacja (tzw. cluster) ogniska. Według danych Instytutu im. Roberta Kocha w ognisku do 25.07. 2011 r. zarejestrowano w Niemczech ogółem zakażenie VTEC O104:H4 u 4321 osób, spośród których u 852 wystąpił zespół hemolityczno mocznicowy. W wyniku zakażenia 50 osób zmarło, w tym 32 osoby w wyniku HUS. Według danych ECDC do 22 lipca 2011 r. w innych krajach europejskich zarejestrowano 76 przypadków zachorowań, w tym 49 przypadków HUS i jeden zgon (http://www.rki.de/ cln_110/nn_217400/en/home/pm EHEC.html). Przytoczone liczby chorych i zgonów oraz zasięg ogniska pozwalają na stwierdzenie, iż było to największe ognisko HUS na świecie i największe ognisko zakażeń VTEC w Europie. Celem pracy był opis tego ogniska ze szczególnym uwzględnieniem działań podjętych w Pracowni Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Przewodu Pokarmowego Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH, w związku z wystąpieniem zachorowań w naszym kraju oraz przedstawienie wyników badań laboratoryjnych wykonanych u osób z podejrzeniem zakażenia

Nr 4 Laboratoryjna diagnostyka E. coli O104:H4 289 VTEC O104:H4 oraz wyników porównania izolatów od polskich pacjentów ze szczepem epidemicznym. Opis ogniska. Pierwsze zachorowania na krwotoczne zapalenie okrężnicy wywołane zakażeniem VTEC O104:H4 miały miejsce w północnych landach Niemiec, w pierwszych dniach maja 2011 r. Około 9 maja zaobserwowano wyraźny wzrost liczby przypadków krwawej biegunki i HUS. Mimo to, informacja o nietypowym wzroście zachorowań z poziomu lokalnego do centralnego dotarła dopiero w dniu 18.05.2011 r. a do Instytutu im Roberta Kocha (http://www.rki.de/cln_110/nn_217400/en/home/pm EHEC.html) jeszcze o jeden dzień później, wraz z informacją o hospitalizacji w szpitalu w Hamburgu trzech osób z objawami HUS. W tym czasie, jak się okazało, rejestrowano w poszczególnych landach już ogółem około 100 nowych zachorowań na krwotoczne zapalenie okrężnicy i kilkadziesiąt przypadków HUS dziennie. W związku z tym stało się jasnym, że zachorowania mają charakter ogniska i wymagają wszczęcia określonych prawem procedur. W dniu 22 maja 2011r. Niemcy poinformowały drogą Systemu Wczesnego Ostrzegania i Reagowania (EWRS) inne kraje UE o wybuchu ogniska, a w dniu 24 maja uznając wykrytą przez krajowy system nadzoru epidemię za mającą bardzo poważny wpływ na zdrowie publiczne także w aspekcie międzynarodowym, zgłoszono ją, zgodnie z międzynarodowymi przepisami zdrowotnymi (International Health Regulations IHR) do WHO. Od tego momentu Instytut im. Roberta Kocha codziennie przesyłał informacje o zmieniającej się sytuacji do EWRS, platformy EPIS (Epidemic Intelligence Information System) działającej w ramach ECDC oraz WHO (EFSA FAQ). Szczyt zachorowań wystąpił 22 maja, po tym dniu liczba nowych zachorowań zaczęła stopniowo w Niemczech spadać jednak w następnych dniach także inne kraje podały informację o zachorowaniach osób, które powróciły z rejonu północnych Niemiec od których wyhodowano VTEC O104:H4. Stało się jasnym, że ognisko ma zasięg międzynarodowy i stanowi istotne zagrożenie także dla Polski. W związku z tym w Pracowni Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Przewodu Pokarmowego Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH natychmiast podjęto działania aby przygotować się do wykonywania zwiększonej liczby badań w kierunku obecności werotoksycznych pałeczek E. coli, w tym VTEC O104:H4, w próbkach kału oraz identyfikacji w tym kierunku przysyłanych z innych laboratoriów izolowanych od pacjentów szczepów E. coli o nieznanej patogenności. Wraz z podjęciem badań nawiązano ścisłą współpracę z Głównym Inspektoratem Sanitarnym oraz Krajowym Punktem IHR w zakresie przekazywania informacji na temat pochodzenia próbek przyjmowanych do badań w kierunku E. coli O104:H4 oraz uzyskanych wyników badań laboratoryjnych. Nawiązano również bieżący kontakt z Europejskim Laboratorium Referencyjnym dla E. coli mieszczącym się w Istituto Superiore di Sanità w Rzymie, w którym prawie natychmiast po upublicznieniu informacji o wybuchu ogniska opracowano metodę, umożliwiającą identyfikację DNA szczepu epidemicznego w pojedynczej reakcji multipleks PCR i które oferowało swoją pomoc wszystkim krajowym laboratoriom referencyjnym w UE w zakresie wsparcia metodycznego oraz przekazania próbki dodatniej kontroli DNA VTEC O104:H4. W kilku laboratoriach europejskich niezwłocznie przystąpiono do sekwencjonowania genomu szczepu epidemicznego a uzyskanie wyników umożliwiło dokładną charakterystykę szczepu i wyjaśniło przyczyny jego podwyższonej patogenności (4,5,19,22,24). W Niemczech intensywnie poszukiwano nośnika zarazka, aby jak najszybciej przeciąć drogi szerzenia się zachorowań. Początkowo, na podstawie informacji uzyskanej z wywiadów

290 A. Januszkiewicz i inni Nr 4 przeprowadzonych wśród chorych oraz na podstawie niewystarczająco szczegółowych badań laboratoryjnych utrzymywano, że nośnikiem zarazka mogły być importowane z Hiszpanii ogórki, co miało swoje późniejsze bardzo poważne ekonomiczne konsekwencje. Gdy następnie okazało się, że te i inne warzywa sprowadzane do Niemiec nie były skażone VTEC O104:H4 ponownie przeprowadzono wywiady epidemiologiczne i rozszerzono zakres badań próbek żywności. Jednocześnie we Francji również wystąpiły przypadki zakażenia epidemicznym szczepem VTEC O104:H4 u osób nie opuszczających kraju, natomiast biorących udział we wspólnym przyjęciu podczas którego podawano m.in. zimne dania i surowe warzywa przybrane kiełkami roślin (13). Około 10 czerwca 2011 r. przekazano do wiadomości publicznej informację o wykryciu prawdopodobnego nośnika epidemicznego szczepu z zaleceniem, aby nie spożywać na surowo kiełków żadnych roślin. W ostatniej dekadzie czerwca powstała powołana przez Komisję Europejską grupa robocza kierowana przez Europejski Urząd Bezpieczeństwa EFSA (European Food Safety Authority), która miała za zadanie znaleźć nośnik zarazka w ognisku w Niemczech i we Francji. W dniu 5.07. 2011 r. EFSA oficjalnie ogłosiła, że nośnikiem VTEC O104:H4 były kiełki kozieradki, które zostały wyprodukowane z nasion tej rośliny importowanych z Egiptu (12). Ostatni nowy przypadek zachorowania na terenie Niemiec miał miejsce w dniu 4 lipca 2011 r., w związku z czym po uwzględnieniu okresu wylęgania choroby, w ostatnich dniach lipca oficjalnie ogłoszono wygaśnięcie ogniska. Opis epidemicznego szczepu. Szczep E. coli O104:H4, który wywołał ognisko został szybko scharakteryzowany, a dane dotyczące jego fenotypowych i genotypowych właściwości oraz profil DNA natychmiast przekazane drogą elektroniczną do wiadomości krajowych laboratoriów referencyjnych na drodze EPIS oraz opublikowane przez zespół naukowców w dostępnym on-line czasopiśmie Eurosurveillance (25). Były to informacje bardzo istotne dla rutynowej diagnostyki zakażeń oraz badań żywności, ponieważ w pierwszym przypadku umożliwiło zastosowanie skriningu przy badaniach próbek kału osób podejrzanych o zakażenie, wykonywanych w laboratoriach szpitalnych oraz ukierunkowanie dalszych badań izolowanych szczepów na poziomie referencyjnym a w drugim zastosowanie metody Real-time PCR, zwalidowanej w Europejskim Laboratorium Referencyjnym dla E. coli, do wykrywania epidemicznego szczepu w badanej żywności. Z kolei opublikowanie w bazie EPIS wyników rozdziału metodą elektroforezy pulsacyjnej genomowego DNA poddanego cięciu enzymami XbaI oraz BlnI umożliwiło porównanie profilu DNA izolatów wyhodowanych od chorych w innych krajach ze szczepem epidemicznym. Zgodnie z opublikowanymi danymi epidemiczny szczep E. coli O104:H4 charakteryzował się typowymi dla gatunku właściwościami biochemicznymi, nie pozwalającymi na ich podstawie na odróżnienie go od niepatogennych pałeczek okrężnicy, tj. fermentował laktozę i sorbitol oraz wytwarzał β-glukuronidazę. Określenie jego lekowrażliwości wykazało, że szczep był oporny na ampicylinę, amoksycylinę z kwasem klawulanowym, cefuroksym, cefotaksym, cetfazydym, aztreonam, cefadroksyl, streptomycynę, tetracyklinę, kwas nalidyksowy oraz kotrimoksazol natomiast wrażliwy na gentamycynę, kanamycynę, ciprofloksacynę, nitrofurantoinę, chloramfenikol i fosfomycynę. Stwierdzono także, że szczep wytwarzał ESBL. Badanie genotypowych właściwości szczepu wykazało obecność szeregu czynników wirulencji typowych dla VTEC w tym: genu stx2a kodującego werotoksynę typu II (podtyp a), genów iha, lpfo26, and lpfo113 kodujących adhezyny, genów irp2 i fyna wchodzących

Nr 4 Laboratoryjna diagnostyka E. coli O104:H4 291 w skład systemu pobierania żelaza, opisanych pierwotnie u wysoce patogennych pałeczek Yersinia, oraz genu terd związanego z opornością na teluryn potasu. Epidemiczny szczep nie zawierał genów stx1, eae, saa i subab kodujących odpowiednio werotoksynę typu I, intyminę, adhezynę Saa oraz subtilazę, czyli innych niż werotoksyna II czynników zjadliwości które mogą występować w szczepach VTEC. Stwierdzono natomiast, że szczep posiada dodatkowo gen aggr, który jest charakterystyczny dla enteroagregacyjnych Escherichia coli (EAEC) i pełni rolę głównego regulatora transkrypcji wielu genów wirulencji szczepów EAEC. Wykazano również obecność innych markerów chorobotwórczości charakterystycznych dla EAEC jak agga i aggc warunkujących wytwarzanie fimbrii AAF/I, aap oraz aata kodujących odpowiednio białko zwane dyspersyną oraz białko transportowe dla dyspersyny jak również chromosomalnego genu aaic kodującego składnik systemu sekrecji VI typu. Produkty tych genów pełnią ważną rolę w patogenezie pałeczek EAEC, odpowiadając za ich adhezję do komórek nabłonka jelita oraz tworzenie biofilmu. W DNA epidemicznego szczepu wykryto obecność genów siga, sepa i pic kodujących autotransportery proteaz serynowych Enterobacteriaceae (SPATE) a także gen iuta kodujący receptor dla aerobaktyny, ważnego czynnika zjadliwości szczepów E. coli izolowanych z przypadków zakażeń pozajelitowych, obecnego w 80% szczepów izolowanych w przebiegu urosepsy, oraz terd związany z opornością na teluryn. Za serologiczne właściwości szczepu odpowiedzialne były gen wzx O104, kodujący antygen somatyczny i gen flic H4 kodujący antygen rzęskowy. Śledząc filogenetyczne pochodzenie szczepu E. coli O104:H4 odpowiedzialnego za wybuch epidemii w Niemczech i innych krajach ostatecznie uznano, że szczep VTEC O104:H4 był w rzeczywistości szczepem enterogregacyjnym, który nabył cechy szczepu werotoksycznego (4,5). MATERIAŁ I METODY Tok postępowania diagnostycznego. Do badań w kierunku obecności werotoksycznego szczepu E. coli O104:H4, do Laboratorium Bakteriologii w NIZP-PZH w okresie od 31 maja do 30 czerwca 2011 roku przyjęto 10 próbek kału oraz 1 wymaz z odbytu pochodzące od 11 pacjentów z objawami krwotocznej biegunki lub zespołu hemolityczno - mocznicowego oraz 1 próbkę kału od osoby zdrowej, powiązanej epidemiologicznie z ogniskiem (ojciec dziecka z HUS, który tydzień wcześniej powrócił z Niemiec i w wywiadzie podał przebycie krwawej biegunki). Ponadto do badań w kierunku VTEC O104:H4 dostarczono 183 izolaty pałeczek E. coli pochodzące od 17 osób (23 izolaty od jednej osoby pobrane w trzech terminach oraz po 10 izolatów od pozostałych pacjentów). Izolaty wyodrębnione były w laboratoriach mikrobiologicznych w kraju, od osób z objawami krwotocznej biegunki lub HUS, bądź powiązanych epidemiologicznie z trwającym ogniskiem. Próbki kału oraz wymaz z odbytu posiewano na podłoża rutynowo stosowane w bakteriologicznym badaniu kału w kierunku obecności chorobotwórczych pałeczek jelitowych rosnących w warunkach tlenowych (26). W celu ułatwienia selekcji epidemicznego szczepu VTEC O104:H4 (fenotyp ESBL+), do zestawu rutynowo stosowanych podłoży dodano przygotowane we własnym zakresie podłoże Mac Conkey a z dodatkiem cefotoksymu - MC-CTX (4mg/L). W pierwszej kolejności z podłoża MC-CTX izolowano po 10 kolonii, które przypominały pałeczki E. coli i poddawano je szczegółowym badaniom metodami

292 A. Januszkiewicz i inni Nr 4 fenotypowymi i genotypowymi. Jeżeli wśród izolatów rosnących na podłożu MC-CTX nie stwierdzono obecności werotoksycznych pałeczek E. coli, w następnej kolejności z podłoża Mac Conkey a izolowano 10 dodatkowych kolonii E. coli, które także poddawano badaniom. Otrzymane do dalszej identyfikacji izolaty także przesiewano na podłoże Mac Conkey a i MC-CTX, dalej postępowano jak opisano powyżej. Określenie biochemicznych właściwości badanych szczepów. Identyfikacja szczepów przeprowadzona została zgodnie z obowiązującymi procedurami (26). Zdolność badanego szczepu do fermentacji sorbitolu określono podczas 18 godzinnej inkubacji na podłożu Mac Conkey a z sorbitolem (SMAC) oraz w klasycznym teście probówkowym (17). Zdolność do wytwarzania enzymu β-d-glukuronidazy oznaczono w teście z 4-metyloumbelliferyl-β-Dglukuronidem (MUG), wykorzystując krążki diagnostyczne wykonane we własnym zakresie (17). Aktywność enterohemolizyny wykrywano na komercyjnym podłożu z dodatkiem 5% płukanych krwinek baranich (Oxoid), zgodnie z wytycznymi wytwórcy. Test na wytwarzanie werotoksyn. Zdolność do wytwarzania werotoksyny I (VT 1) oraz werotoksyny II (VT 2) oznaczano przy użyciu testu odwróconej biernej aglutynacji lateksowej VTEC RPLA (Oxoid), który wykonano zgodnie z zaleceniami producenta. Wykrywanie genów kodujących werotoksynę II (stx2), oporność na telluryn (terd), antygen somatyczny O104 (wzxo104) oraz antygen rzęskowy H4 (flich4) metodą Multiplex - PCR. Izolację chromosomalnego DNA przeprowadzono jednoprobówkową metodą wg. Gierczyńskiego i wsp. (15). Metodą Multiplex PCR opracowaną przez Karch z National Consulting Laboratory on HUS na uniwersytecie w Münster (http://www.ehec.org/pdf/laborinfo_01062011.pdf) potwierdzając obecność fragmentów genów stx2, terd, wzxo104, flich4, charakteryzujących epidemiczny szczep VTEC O104:H4. Jako dodatniej kontroli przeprowadzonych reakcji użyto DNA szczepu E. coli 0104:H4 nr 11 2027, pozyskanego z Europejskiego Laboratorium Referencyjnego ds. zakażeń VTEC w Rzymie. Jako ujemnej kontroli użyto DNA szczepu E. coli ATCC 25922. Określenie obecności werotoksyny I (stx1) intyminy (eae) oraz wariantu VT IIa werotoksyny II (stx2a) metodą PCR. Metodą PCR potwierdzono obecność fragmentów genów kodujących werotoksynę I oraz intyminę (eae) (17). Potwierdzenie obecności wariantu genu stx2a wykonano zgodnie z procedurą zaproponowaną przez WHO (27). Jako kontroli dodatniej i ujemnej przeprowadzonych reakcji użyto odpowiednio szczepów E. coli 0157:H7 EDL933 oraz E. coli ATCC 25922. Wykrywanie markerów genetycznych charakterystycznych dla enteroagregacyjnych pałeczek E. coli (EAEC) metodą PCR. Metodą PCR potwierdzono obecność fragmentów genów aggr, aap, aata, agga (7,8). Jako kontroli dodatniej przeprowadzonych reakcji użyto DNA pochodzącego ze szczepu E. coli 0104:H4 nr 11 2027. Kontrolę ujemną stanowił DNA szczepu E. coli ATCC 25922. Wykrywanie genetycznych markerów związanych z chorobotwórczością oraz lekoopornością badanych izolatów E. coli O104:H4 przy użyciu techniki mikromacierzy ArrayTube. Do oznaczenia panelu determinant genetycznych związanych z chorobotwórczością różnych patotypów pałeczek E. coli została zastosowana mikromacierz Array Tube (ATs) Ec03 (Alere) (1). Do oznaczenia panelu determinant genetycznych warunkujących oporność na wybrane antybiotyki u Gram-ujemnych bakterii zastosowano mikromacierz ArrayTube AMR05 (Alere) (2). Oznaczenia wykonano jak opisano uprzednio (17).

Nr 4 Laboratoryjna diagnostyka E. coli O104:H4 293 Oznaczanie lekowrażliwości badanego szczepu. Wrażliwość szczepu na 12 antybiotyków oznaczono metodą krążkowo dyfuzyjną zgodnie z zaleceniami EUCAST (10). Do badań użyto krążków (Oxoid): z ampicyliną (10μg), amoksycyliną z kwasem klawulanowym (20/10μg), cefotaksymem (5μg), ceftazydymem (10μg), imipenemem (10μg), streptomycyną (10μg), gentamycyną (10μg), kanamycyną (30 μg), tetracykliną (30μg), chloramfenikolem (30 μg), kwasem nalidyksowym (30μg), ciprofloksacyną (5μg), sulfonamidami (300μg), trimetoprimem (5μg) i kotrimoksazolem (23,75/1,25μg). Jako kontrolę stosowano szczepy E. coli ATCC 25922 oraz E. coli ATCC 35922. Wytwarzanie ESBL oznaczono w teście fenotypowym metodą dwóch krążków (16). Oznaczanie genetycznego pokrewieństwa szczepów E. coli O104:H4 metodą PFGE. Pokrewieństwo genetyczne badanych szczepów E. coli O104:H4 potwierdzano metodą PFGE z zastosowaniem enzymu XbaI oraz BlnI zgodnie z zaleceniami PulseNet (9). Uzyskane restrykcyjne wzory genomowego DNA badanych izolatów porównywano z wzorami PFGE uzyskanymi dla niemieckich szczepów VTEC O104:H4 izolowanych z ogniska, które były dostępne na stronie internetowej Instytutu Roberta Kocha (http://www. rki.de/en/home/homepage node.html.) oraz na platformie EPIS. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Z żadnej z badanych próbek kału nie wyhodowano chorobotwórczych pałeczek z rodzaju: Salmonella, Shigella, Yersinia, Aeromonas i Plesiomonas. Wzrost kolonii o wyglądzie E. coli na podłożu Mac Conkey a z dodatkiem cefotoksymu (MC-CTX) uzyskano w posiewie 3 próbek kału oraz 1 wymazu z odbytu spośród 12 próbek kału posiewanych w kierunku VTEC O104:H4. Natomiast w przypadku izolowanych kolonii E. coli, przysłanych do dalszej charakterystyki wzrost na podłożu MC-CTX. uzyskano w posiewach izolatów pochodzących od 2 pacjentów. W posiewach pozostałych próbek nie uzyskano wzrostu na podłożu z antybiotykiem. Wszystkie badane izolaty, zarówno izolowane z podłoża z cefotaksymem, jak i z podłoża bez antybiotyku, określono jako pałeczki E. coli. Szczepy były ruchliwe, wykazywały zdolność do fermentacji laktozy i sorbitolu oraz wytwarzały β-d-glukuronidazę (MUG +). Przeprowadzona metodą Multipex-PCR analiza obecności determinant genetycznych charakterystycznych dla szczepu VTEC O104:H4 izolowanego z ogniska wykazała, iż w próbkach pochodzących od trzech osób stwierdzono obecność pałeczek E. coli posiadających wszystkie cztery geny charakterystyczne dla epidemicznego szczepu: stx2 - kodujący werotoksynę II, terd - warunkujący oporność na teluryn, wzxo104 - warunkujący wytworzenie antygenu somatycznego O104 oraz flich4 - warunkujący wytworzenie antygenu rzęskowego H4 (Rycina 1). Ponadto izolaty te charakteryzowała fenotypowa zdolność do wytwarzania werotoksyny II (VT 2), przy braku zdolności do wytwarzania werotoksyny I (VT 1), co wykazano w teście VTEC RPLA. Wszystkie pozostałe izolaty E. coli, dla których uzyskano ujemny wynik reakcji M-PCR, wykazywały także ujemny wynik testu VTEC RPLA. Brak fenotypowej zdolności wszystkich badanych izolatów E. coli do wytwarzania werotoksyny I potwierdzono wynikami reakcji PCR na obecność genu stx1. Stwierdzono, że jeden ze 183 badanych izolatów E. coli, wykazywał obecność fragmentu sekwencji genu kodującego intyminę (eae). Izolat ten nie należał jednak ani do typu serologicznego O104:H4, ani do żadnej z grup antygenowych historycznie uznawanych za EPEC (26). Został on przysłany jako jedna

294 A. Januszkiewicz i inni Nr 4 z 10 kolonii E. coli wyhodowanych z posiewu kału pacjentki z HUS od której izolowano również VTEC O104:H4. Dalszej, szczegółowej charakterystyce poddano pałeczki E. coli, wyhodowane od trzech osób, nazwane dla potrzeb tej pracy polskimi izolatami epidemicznego szczepu. Były to izolaty o numerach 155/11, 158/11 oraz 170/11, dla których uzyskano dodatnie wyniki w reakcji Multipex-PCR oraz w teście fenotypowym VTEC-RPLA. Natomiast izolaty E. coli wyhodowane od pozostałych osób, ujemne w teście M-PCR oraz teście fenotypowym VTEC-RPLA określono jako niewerotoksyczne, nieenteropatogenne E. coli i wykluczono z dalszych badań. Wyniki dalszej molekularnej charakterystyki trzech izolatów VTEC O104:H4 przy użyciu reakcji PCR oraz reakcji hybrydyzacji na macierzy ATs, wykazały obecność w ich genomie determinant genetycznych charakterystycznych dla enteroagregacyjnych pałeczek E. coli jak: aggr, aap, aata, agga, siga, sepa, pic. Ponadto u badanych izolatów nie stwierdzono obecności większości markerów genetycznych charakterystycznych dla innych patotypów E. coli takich jak m.in. geny kodujące: enterohemolizynę (ehly), subtilazę (subab), adhezynę autoaglutynującą (saa), termostabilną enterotoksynę (asta), fimbrie tworzące wiązki (bfpa), oraz ciepłostałą enterotoksynę (stia, stib) (4,25). Tak więc wyniki przeprowadzonych w niniejszej pracy fenotypowych i molekularnych badań wirulencji trzech badanych izolatów E. coli pozwoliły na zaliczenie ich do enteroagregacyjnych, werotoksycznych pałeczek E. coli O104:H4, analogicznie jak szczepu izolowanego w ognisku w Niemczech (RKI) Uzyskany profil oporności na antybiotyki badanych polskich izolatów E. coli O104:H4 także odpowiadał profilowi lekooporności opisanemu dla epidemicznego szczepu VTEC O104:H4 (RKI). W antybiogramie stwierdzono ich oporność na: ampicylinę, amoksycylinę z kwasem klawulanowym, cefotaksym, ceftazydym, streptomycynę, tetracyklinę, kwas nalidyksowy i sulfonamidy, były natomiast wrażliwe na imipenem, ciprofloksacynę, gentamycynę oraz chloramfenikol. Podobnie jak szczep epidemiczny, polskie izolaty E. coli O104:H4 wytwarzały β- laktamazę typu ESBL, co zostało potwierdzone w teście dwóch krążków. Metodą hybrydyzacji na macierzy ATs AMR05 potwierdzono w izolatach obecność genów: bla TEM, bla CTX-M, stra, strb, teta, sul1, sul2 warunkujących odpowiednio oporność na: penicyliny, cefalosporyny, streptomycynę, tetracyklinę i sulfonamidy. Ponadto stwierdzono u nich obecność fragmentów genów specyficznych dla integronu klasy I (inti1). Analiza pokrewieństwa genetycznego przeprowadzona metodą PFGE wykazała, iż badane izolaty posiadały nierozróżnialne profile PFGE powstałe w wyniku cięcia restrykcyjnego całkowitego DNA bakteryjnego restryktazą BlnI (BlnI-PFGE). Podobne wyniki uzyskano w przypadku profili DNA powstałych w wyniku cięcia restryktazą XbaI (XbaI-PFGE). Wszystkie trzy badane izolaty posiadały niemal identyczne profile XbaI-PFGE (różnica w 1 prążku dla izolatu 158/11) (Rycina 2). Uzyskane profile XbaI-PFGE oraz BlnI-PFGE były identyczne jak profile uzyskane dla szczepu epidemicznego VTEC O104:H4 oraz izolatów VTEC O104:H4 wyodrębnionych od chorych w maju czerwcu 2011 w innych państwach (RKI, baza EPIS). Na uwagę zasługuje też fakt jednoczesnego wyhodowania z kału chorej z HUS enteropatogennego szczepu E. coli i VTEC O104:H4, przy czym VTEC O104:H4 izolowano od niej dwukrotnie w odstępie około 11 dni, co świadczy o dość długim okresie eliminacji patogenu z jelit tej pacjentki. Natomiast po około dwóch tygodniach od wystąpienia biegunki nie wyhodowano już VTEC O104:H4 z kału przybyłego z Niemiec ojca dziecka, które w wyniku kontaktu z nim zachorowało. U tego mężczyzny, podobnie jak i u dziecka,

Nr 4 Laboratoryjna diagnostyka E. coli O104:H4 295 stwierdzono w odczynie ELISA wysoki poziom przeciwciał klasy IgM, IgA i IgG dla antygenu O104, co pośrednio potwierdziło zakażenie ojca (W. Rastawicki informacja ustna). Podsumowując wyniki przeprowadzonych w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH badań umożliwiły laboratoryjne potwierdzenie zakażenia epidemicznym szczepem VTEC O104:H4 u trzech osób, czwartą osobę można było uznać za przypadek prawdopodobny. DYSKUSJA W pracy opisano ognisko krwotocznego zapalenia okrężnicy i zespołu hemolityczno- -mocznicowego wywołane przez rzadko spotykany enteroogregacyjny i zarazem werotoksyczny szczep E. coli O104:H4, które objęło swoim zasięgiem kilkanaście krajów Europy i Ameryki Płn. i zostało uznane za największe jak do tej pory ognisko wywołane przez VTEC - nie O157 na świecie (4,25). Choć były opisywane ogniska wywołane przez werotoksyczne szczepy E. coli nie-o157 (20) w świadomości większości osób związanych z bezpieczeństwem żywności, ale też z ochroną zdrowia, wśród szczepów VTEC to właśnie VTEC O157 pozostawały głównym i najważniejszym zagrożeniem dla zdrowia i życia ludzi. Ponieważ większość werotoksycznych szczepów E. coli O157 w przeciwieństwie do innych pałeczek okrężnicy (zarówno VTEC jak i niechorobotwórczych), ma pewne fenotypowe cechy ułatwiające ich wstępną izolację i identyfikację serologiczną (z reguły nie fermentują do 24 h sorbitolu, nie wytwarzają β-glukuronidazy, są oporne na teluryn potasu) w wielu krajach, w tym także w Polsce rutynowa, bakteriologiczna diagnostyka zakażeń wywoływanych przez te drobnoustroje została oparta o wyniki posiewu kału na selektywne podłoża zawierające odpowiednie substraty lub chromogeny i aglutynację typowo wyglądających kolonii z odczynnikiem lub surowicą dla antygenu O157 (26). To spowodowało, że w krajach, gdzie diagnostyka jest skierowana tylko na wykrywanie E. coli O157:H7 zakażenia innymi VTEC mogą pozostać nierozpoznane (14,17). Potwierdzają to wyniki ankiety przeprowadzonej w ramach sieci FWD ECDC w czerwcu 2011 r., w związku z trwającym wówczas ogniskiem, z których wynika, że tylko w 12 z 24 krajów UE, uczestniczących w ankiecie istnieją możliwości wykrywania zakażeń VTEC nie O157, przy czym w 3 z tych krajów wykonywanie takich badań jest ograniczone do kilku laboratoriów i tylko w przypadku ogniska (dane nieopublikowane). Bielaszewska i wsp. wskazali na jeszcze jeden istotny problem związany z diagnostyką w kierunku VTEC. Wyniki ich badań wykazały, że szczepy E.coli izolowane od około 5% osób z HUS, należące głównie do serogrupy: O26, O103, O145 i O157 utraciły podczas trwania infekcji profaga a tym samym - geny stx. Tak więc zakażenia pozostałyby nierozpoznane gdyby jedynym kryterium rozpoznania było określenie zdolności szczepu do wytwarzania VT (3). Tymczasem w najnowszym raporcie epidemiologicznym dotyczącym występowania w 2009 r. zoonoz w krajach UE wykazano 13% wzrost liczby zakażeń VTEC w stosunku do 2008 r (18). W latach 2004-2008, w krajach członkowskich i współpracujących z UE 53% wszystkich zarejestrowanych przypadków zakażenia VTEC stanowiły zakażenia wywołane przez VTEC O157, 11,5% zakażeń wywołały VTEC O26, O103, O91, O145 and O111, a pozostałe 35,5% VTEC należące do innych grup serologicznych. (12). Biorąc dodatkowo pod uwagę dane z krajów gdzie diagnostyka w kierunku werotoksycznych E. coli nie jest ograniczona do poszukiwania tylko O157, takich jak Niemcy, Szwecja czy Dania, gdzie odsetek zakażeń VTEC nie-o157 był znacznie wyższy niż zakażeń VTEC O157 można przypuszczać, że

296 A. Januszkiewicz i inni Nr 4 w wielu krajach, w tym także w Polsce, udział VTEC nie- O157 w zakażeniach ludzi jest w znacznym stopniu niedoceniany. W Polsce diagnostyka zakażeń werotoksycznymi szczepami E. coli została podjęta w NIZP-PZH w 1993 r., w tym samym czasie przeprowadzono też pierwsze szkolenia pracowników stacji sanitarno-epidemiologicznych, kontynuowane w kolejnych latach w ramach kształcenia podyplomowego. Zakład Bakteriologii NIZP-PZH od kilkunastu już lat przyjmuje również do reidentyfikacji wszystkie szczepy E. coli podejrzane o przynależność do VTEC wyhodowane od ludzi w laboratoriach mikrobiologicznych na terenie całego kraju. Należy jednak zaznaczyć, że zakażenia werotoksycznymi pałeczkami E. coli, w tym o przebiegu w postaci HUS, wykrywa się w Polsce bardzo rzadko, tylko kilka przypadków rocznie (17,21). Nawet przy rozpoznaniu zespołu hemolityczno mocznicowego tylko nieliczni lekarze zlecają u pacjentów bakteriologiczne badanie kału w kierunku VTEC, a jeśli już, to jest ono ograniczone do poszukiwania jedynie E. coli O157. Tymczasem regułą powinno być wykonanie posiewu kału w kierunku VTEC (uniezależniony od określenia serologicznego typu izolowanych pałeczek okrężnicy) u każdej osoby z HUS lub osoby z biegunką, gdy kliniczny przebieg choroby lub powiązanie epidemiologiczne mogą wskazywać na zakażenie szczepem werotoksycznym (4,26). Chociaż obecnie, w naszym kraju, wykonanie takiego badania jest możliwe tylko w wybranych laboratoriach to właśnie mikrobiolodzy powinni powiadomić lekarzy, że w zasadzie w każdym medycznym laboratorium mikrobiologicznym możliwe jest wyhodowanie pałeczek E. coli z kału i przesłanie izolatów do laboratorium referencyjnego w NIZP-PZH lub jednego z wybranych laboratoriów stacji sanitarno - epidemiologicznych w celu oznaczenia chorobotwórczości szczepów. Argumentem dla takiego modelu postępowania powinny być wnioski wyciągnięte z przebiegu opisywanej epidemii. Przekonano się bowiem, że biegunkotwórcze pałeczki E. coli należą do drobnoustrojów, które stanowią ogromne zagrożenie dla zdrowia publicznego, a ograniczenie zasięgu i następstw, wykrycie źródła i przerwanie dróg szerzenia się zakażenia zależy od sprawnego działania wielu podmiotów, jednak pierwszy ruch należy do lekarzy klinicystów, bo to oni stykają się z pierwszymi zakażonymi osobami. Przekonano się także po raz kolejny, że pałeczki okrężnicy mogą w istotny sposób zmieniać nie tylko swoją lekowrażliwość, ale również właściwości chorobotwórcze wskutek nabywania lub wymiany na drodze horyzontalnej materiału genetycznego z pałeczkami jelitowymi należącymi do innych gatunków i rodzajów np. Shigella, Salmonella, Yersinia ale też do innych kategorii biegunkotwórczych E. coli. Należy się więc spodziewać, że ze strony tych bakterii czeka nas w przyszłości jeszcze wiele nowych problemów. A. Januszkiewicz, A. Chróst, T. Wołkowicz, G. Madajczak, M. Wasiak, J. Szych Molecular investigation of enteroaggregative, Shiga toxin producing E. coli O104:H4 isolated in Poland during the recent international outbreak characteristic of epidemic clone SUMMARY Since early May 2011 a large food-borne outbreak caused by E. coli O104:H4 affected Germany then spread over 13 European countries, USA and Canada. The outbreak strain was found to possess

Nr 4 Laboratoryjna diagnostyka E. coli O104:H4 297 an unusual combination of enteroaggregative E. coli pathotype with StxII. In this report we described the molecular investigation of epidemic clone in Poland during the international outbreak. We confirmed three cases of E. coli O104:H4 infections. The molecular characteristics of the Polish E. coli O104:H4 isolates including virulence profile, antimicrobial resistance, PFGE and plasmids profiles were corresponded with Germany outbreak strains. PIŚMIENNICTWO 1. Anjum MF, Mafura M, Slickers P i inni. Pathotyping Escherichia coli by using miniaturized DNA microarrays. Appl Environ Microbiol 2007; 73: 5692-7. 2. Batchelor M, Hopkins KL, Liebana E i inni. Development of a miniaturised microarray-based assay for the rapid identification of antimicrobial resistance genes in Gram-negative bacteria. Int J Antimicrob Agents 2008; 31: 440-51. 3. Bielaszewska M, Köck R, Friedrich AW i inni. Shiga Toxin-Mediated Hemolytic Uremic Syndrome: Time to change the diagnostic paradigm?. 2007, PLoS ONE 2(10): e1024. doi:10.1371/ journal.pone.0001024 4. Bielaszewska M, Mellmann A, Zhang W i inni. Characterisation of the Escherichia coli strain associated with an outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, 2011: a microbiological study Lancet Infect Dis. 2011;11: 671-6. 5. Brzuszkiewicz E, Thürmer A, Schuldes J i inni. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero- Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Arch Microbiol. 2011 [DOI 10.1007/ s00203-011-0725-6] 6. CDC. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food --- Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites 1996 2010. MMWR, 2011; 60: 749-55. 7. Czeczulin, JR., Whittam, T S, Henderson, I R i inni. Phylogenetic analysis of enteroaggregative and diffusely adherent Escherichia coli. Infect Immun. 1999; 67: 2692-9. 8. Cerna, JF., Nataro JP, Estrada-Garcia TC Multiplex PCR for detection of three plasmid-borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains. J Clin Microbiol 2003; 41: 2138-40. 9. Efrain M., Ribot, MA., Fair R i inni. Standardization of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocols for the Subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease 2006, 3, 59-67. 10. EUCAST disk diffusion test for routine antimicrobial susceptibility testing http://www.eucast. org/eucast_disk_diffusion_test/ 11. European Centre for Disease Prevention and Control. Annual Epidemiological Report on Communicable Diseases in Europe 2010, Stockholm: ECDC; 2010 12. European Food Safe Autority (EFSA). Tracing seeds, in particular fenugreek (Trigonella foenum- -graecum) seeds, in relation to the Shiga toxin-producing E. coli (STEC) O104:H4 2011 Outbreaks in Germany and France. http://www.efsa.europa.eu/en/supporting/pub/176e.htm 13. Gault G, Weill F X, Mariani-Kurkdjian P. Outbreak of haemolytic uraemic syndrome and bloody diarrhoea due to Escherichia coli O104.:H4, south-west France, June 2011. http://www. eurosurveillance.org/viewarticle.aspx?articleid=19905 14. Gerber A, Karch H, Allerberger F i inni Clinical Course and the Role of Shiga Toxin Producing Escherichia coli Infection in the Hemolytic-Uremic Syndrome in Pediatric Patients,1997 2000, in Germany and Austria: A Prospective Study J Infect Dis 2002;186:493 500. 15. Gierczyński R, Szych J, Rastawicki W i inni. Molecular characterization of human clinical isolates of Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O8 in Poland: emergence and dissemination of three highly related clones. J Clin Microbiol. 2009; 47:1225-8.

298 A. Januszkiewicz i inni Nr 4 16. Gniadkowski M, Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009 http://www.korld.edu.pl/pdf/02-rek2009- -Paleczki_z_rodziny_Enterobacteriaceae.pdf 17. Januszkiewicz A, Podsiadły E, Szych J i inni. Charakterystyka fenotypowych i genotypowych właściwości werotoksycznego szczepu E.coli O111 wyizolowanego od pacjenta z zespołem hemolityczno-mocznicowym. Med Dośw Mikrobiol. 2010; 62:319-30. 18. Lahuerta A, Westrell T, Takkinen J. Zoonoses in the European Union: Origin, Distribution and Dynamics - the EFSA-ECDC Summary Report 2009 http://www.eurosurveillance.org/viewarticle.aspx?articleid=19832 19. Mellmann A, Harmsen D, Cummings CA i inni. Prospective Genomic Characterization of the German Enterohemorrhagic Escherichia coli O104:H4 Outbreak by Rapid Next Generation Sequencing Technology PLoS One. 2011;6(7):e22751 20. Monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) and identification of human pathogenic VTEC types. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards The EFSA Journal 2007; 579: 1-61 21. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny. Definicje przypadków chorób zakaźnych na potrzeby nadzoru epidemiologicznego.http://www.pzh.gov.pl/oldpage/ epimeld/inne/def_pl2_rob_1h.pdf 22. Rasko DA, Webster DR, Sahl JW i inni. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. N Engl J Med. 2011;365:709-17. 23. Robert Koch Institut (RKI). Technical Report. EHEC/HUS O104:H4 Outbreak Germany, May/ June 2011. http://www.rki.de/cln_178/nn_217400/en/home/ehec Report,templateId=raw,p roperty=publicationfile.pdf/ehec_report.pdf 24. Rohde H, Qin J, Cui Y i inni. Open-Source Genomic Analysis of Shiga-Toxin Producing E. coli O104:H4. N Engl J Med. 2011;365:718-24. 25. Scheutz F, Møller Nielsen E, Frimodt-Møller J i inni. Characteristics of the enteroaggregative shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Eurosurveillance, Vol16, Issue 24, 16 June 2011 http://www.eurosurveillance.org/viewarticle.aspx?articleid=19889 26. Szych J. Zakażenia i zatrucia wywołane przez bakterie rosnące w warunkach tlenowych w: Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych red. M. Jagielski, Fundacja Pro Pharmacia Futura, Warszawa, 2010. 27. World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Escherichia and Klebsiella. Identification of three vtx1 and seven vtx2 subtypes of Verocytotoxin encoding genes of Escherichia coli by conventional PCR amplification. Copenhagen: Statens Serum Institut. [Accessed 11 Jun 2011]. Available from: http://www.ssi.dk/english/publichealth/national%20reference%20 Laboratories/~/media/Indhold/EN%20-%20engelsk/Public%20Health/National%20 Reference%20 Laboratories/vtx%20detection%20%20subtyping%20protocol EQA-2010-11_rev4.ashx 28. The Community Summary Report on trends and Sources of Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks In the European Union in 2008. EFSA Journal 2010 8(1):1496 Otrzymano: 24 X 2011 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail: jszych@pzh.gov.pl