UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Zakład Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 7 ANALIZA JAKOŚCIOWA W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ INDEKSY RETENCJI Pracownia dyplomowa (Chemia) Gdańsk, 2013
7. Pracownia dyplomowa (Chemia) Analiza jakościowa w chromatografii gazowej 2 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Chromatografia gazowa nie jest idealnym narzędziem do identyfikacji rozdzielanych substancji, jednak daje pewne możliwości w analizie jakościowej. Podstawowym sposobem postępowania jest wykorzystywanie parametrów retencji i porównywanie ich z danymi dostępnymi w literaturze. Często stosuje się: względne czasy retencji, wyznaczane wobec określonej substancji indeksy retencji (patrz wzory 1, 2 w punkcie 1.1) Należy pamiętać, że wszelkie parametry retencji są, dla danego związku, charakterystyczne na określonej (lub bardzo podobnej) fazy stacjonarnej. W pewnym stopniu zależą też od warunków analizy, głównie od temperatury. Dokładniejsze dane na temat wykorzystania indeksów retencji oraz pewne ogólne wiadomości o tym, w jaki sposób struktura związku wpływa na jego retencję, można znaleźć w licznych książkach i artykułach. Związki organiczne należące do jednego szeregu homologicznego (szereg homologiczny tworzą związki różniące się w budowie jedynie kolejnymi grupami CH 2 ) wykazują ciekawą cechę. Zależność logarytmów ich zredukowanych czasów bądź objętości retencji od liczby atomów węgla lub temperatury wrzenia ma przebieg w przybliżeniu prostoliniowy, jak przedstawiono to na Rysunku 1. Jeśli mamy dane retencyjne dwóch związków z szeregu homologicznego, możemy w miarę dokładnie przewidzieć parametry retencyjne innych związków z tego szeregu. Rys. 1. Zależność logarytmów zredukowanych objętości retencji (lub zredukowanych czasów retencji) od liczby atomów węgla w cząsteczce dla związków z jednego szeregu homologicznego. Linia przerywana wskazuje na odchylenia od prostoliniowości tej zależności, istniejące dla pierwszych związków szeregu. Podobne odchylenia wykazują homologi o bardzo dużych masach cząsteczkowych.
7. Pracownia dyplomowa (Chemia) Analiza jakościowa w chromatografii gazowej 3 Zależność przedstawiona na Rysunku 1 ma odmienny przebieg dla każdego szeregu homologicznego, dlatego też, jeśli mamy do czynienia ze związkami o nieznanej strukturze i podejrzewamy, że mogą należeć do określonego szeregu homologicznego, celowe jest wyznaczenie dla nich zredukowanych czasów retencji i wykreślenie wspomnianej zależności. Przebieg zależności pomiędzy logarytmem ze zredukowanego czasu retencji a liczbą atomów węgla w cząsteczce dla wybranych szeregów homologicznych ilustruje Rysunek 2. Rys. 2. Zależność logarytmów zredukowanych czasów retencji od liczby atomów węgla w cząsteczce dla związków z kilku szeregów homologicznych. Stosunkowo duże możliwości daje wykorzystanie detektorów selektywnych. Użycie detektora ECD pozwala na wykrycie nawet bardzo małych ilości związków chlorowcopochodnych w mieszaninie. Podobnie detektor FPD służy do analizy związków organicznych zawierających siarkę i fosfor, a detektor termojonowy pozwala selektywnie wykrywać związki zawierające fosfor lub azot. Nieporównywalnie większe możliwości w porównaniu z wyżej wymienionymi metodami mają układy łączące chromatografię gazową z metodami spektroskopowymi. W analizie związków organicznych połączenie GC ze spektrometrią mas (GC-MS) jest obecnie rutynowo wykorzystywane we wszelkich analizach, szczególnie skomplikowanych mieszanin pochodzenia naturalnego. Możliwość zarejestrowania widm mas poszczególnych związków połączona z otrzymaniem parametrów retencyjnych substancji daje bardzo duże możliwości ustalenia struktury związku organicznego. Dodatkowe informacje, często w pełni wystarczające do identyfikacji analizowanych substancji, można otrzymać dzięki analizie różnego rodzaju pochodnych. Również
7. Pracownia dyplomowa (Chemia) Analiza jakościowa w chromatografii gazowej 4 cenne, chociaż rzadko wystarczające do pełnej identyfikacji związków, informacje daje połączenie GC-IR, które pozwala często na określenie przynależności badanych substancji do danej grupy związków organicznych. Obszerne informacje na temat połączeń GC-MS i GC-IR można znaleźć w literaturze poświęconej metodom spektroskopowym. 1.1. Indeksy retencji w chromatografii gazowej Indeks retencji Kovátsa I X wielkość charakterystyczna dla danej substancji, analizowanej na danej fazie stacjonarnej, służąca do analizy jakościowej; z definicji dla n-alkanów indeksy retencji są równe 100-krotności liczby atomów węgla w cząsteczce (np. indeks retencji dla n-heksanu wynosi 600, dla n-dekanu 1000). Indeksy retencji wyznacza się wobec dwóch n-alkanów o z oraz z+m atomach węgla w cząsteczce, z których pierwszy jest eluowany z kolumny przed badanym związkiem, a drugi po tym związku. Stosuje się wtedy wzór: I X =100z 100m gdzie: I X indeks retencji nieznanego związku log t Rx log t (1) Rz log t R z m log t Rz t Rx zredukowany czas retencji nieznanego związku t Rz zredukowany czas retencji alkanu zawierającego z atomów węgla t R(z+m) zredukowany czas retencji alkanu zawierającego z+m atomów węgla Wzór (1) można stosować w przypadku analizy w stałej temperaturze (w izotermie). Dla analiz w programowanej temperaturze stosuje się zwykle wzór Van den Doola i Kratza: I Tp =100m T Rx T Rz T R z m T Rz 100z (2) gdzie: I Tp indeks retencji nieznanego związku, T R temperatura w Kelvinach, przy której dany związek eluuje z kolumny (temperatura retencji) lub całkowity czas retencji. Pozostałe oznaczenia (indeksy x, z, m, z+m) oznaczają to samo, co we wzorze (1).
7. Pracownia dyplomowa (Chemia) Analiza jakościowa w chromatografii gazowej 5 2. WYKONANIE ĆWICZENIA 2.1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest izolacja frakcji węglowodorów pochodzenia roślinnego z ekstraktu wosków powierzchniowych oraz obliczenie indeksów retencji dla wybranych związków. Na podstawie uzyskanych wyników oraz danych z analizy GC-MS, należy zaproponować struktury węglowodorów obecnych w ekstrakcie. 2.2. Wykonanie ćwiczenia 2.2.1. Warunki analizy chromatograficznej Chromatograf Trace 2000 Series GC z detektorem FID Kolumna chromatograficzna RTX-1 30 m, 0,18 mm średnica wewnętrzna, 0,32 mm średnica wewnętrzna, 0,25 μm grubość fazy stacjonarnej Program temperaturowy: 140-320 C, narost 4 C/min Temperatura dozownika: 320 C Temperatura detektora: 320 C Dzielnik przepływu: 1:20 Gaz nośny: argon, stały przepływ 1 ml/min Powietrze: 350 kpa, wodór: 35 kpa 2.2.2. Izolacja frakcji węglowodorów chromatografia kolumnowa PODGRUPA I: a) W kolbie stożkowej o pojemności 100 ml odważyć 4 g żelu krzemionkowego, a następnie dodać 30 ml eteru naftowego. Wymieszać i pozostawić na 5-10 min. Zamocować kolumnę w statywie i zamknąć odpływ z kolumny. Umieścić na dnie kolumny małą ilość zwiniętej waty szklanej. Wprowadzić 2 ml eteru naftowego, następnie usunąć powietrze z waty szklanej naciskając bagietką. b) Uważnie wprowadzić zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny poprzez lejek, otwierając jednocześnie odpływ z kolumny. Zrobić to w taki sposób, aby uzyskać w miarę płaskie dno oraz płaski wierzch fazy stacjonarnej. Od momentu wprowadzenia do kolumny
7. Pracownia dyplomowa (Chemia) Analiza jakościowa w chromatografii gazowej 6 żelu krzemionkowego jego powierzchnia musi być stale przykryta cieczą. Jeżeli w kolumnie będą bąble powietrza, proces należy rozpocząć od początku. c) Wyrównać poziom fazy ruchomej w kolumnie do poziomu ok. 0,5 cm nad powierzchnią złoża fazy stacjonarnej. Ostrożnie wprowadzić do kolumny około 0,5 ml ekstraktu za pomocą pipety Pasteura. Wprowadzić próbkę do fazy stacjonarnej przemywając 2 ml roztworu eteru naftowego aż do momentu, gdy cała próbka znajdzie się w fazie stacjonarnej. d) Rozpocząć zbieranie frakcji do kolb okrągłodennych o pojemności 100 ml: Frakcja I: 20 ml eteru naftowego Frakcja II: 25 ml dichlorometanu e) Frakcje odparować do objętości ok. 1 ml na wyparce obrotowej i przenieść pipetą Pasteura do zakręcanej butelki o pojemności 2 ml. Frakcję II odparować do sucha w strumieniu azotu i przeprowadzić w pochodne TMSi za pomocą mieszaniny BSTFA:TMCS (99:1), zgodnie z instrukcją do ćwiczenia nr 6 (UWAGA! Nie dodajemy wzorca!!!). PODGRUPA II: a) Do umieszczonej na statywie kolumny należy wprowadzić zwitek waty szklanej, a następnie napełnić kolumnę suchym żelem krzemionkowym (4 g). Złoże należy ułożyć, przepuszczając przez nie ok. 20-30 ml eteru naftowego, przyspieszając przepływ za pomocą pompki (aż do zaniku pęcherzyków powietrza). b) Kolejne punkty wykonywać zgodnie z opisem dla podgrupy I. 2.2.3. Analiza chromatograficzna frakcji węglowodorów Uzyskaną frakcję należy analizować w warunkach podanych w punkcie 2.2.1. 3. OPRACOWANIE WYNIKÓW Na podstawie uzyskanych wyników analizy GC-MS, należy zidentyfikować obecne w próbce n-alkany. Następnie, przyjmując dla nich wartości indeksów retencji równe IR = n*100, gdzie n oznacza liczbę atomów węgla w cząsteczce, obliczyć indeksy retencji dla pozostałych związków zgodnie ze wzorem 2. Jednocześnie, należy dla wszystkich związków obecnych w próbce wykreślić zależności zredukowanych czasów retencji od liczby atomów węgla w cząsteczce (osobne wykresy dla każdej grupy związków zgodnie
7. Pracownia dyplomowa (Chemia) Analiza jakościowa w chromatografii gazowej 7 ze wskazówkami prowadzącego i analizą literatury). Na podstawie wyników analiz GC-MS i GC-FID, uzyskanych wykresów i indeksów retencji oraz zaproponowanej przez prowadzącego literatury, należy podać możliwe struktury węglowodorów obecnych w próbce. 4. SZKŁO I ODCZYNNIKI ekstrakty roślinne żel krzemionkowy eter naftowy chlorek metylenu chlorek metylenu do mycia strzykawki strzykawka do GC 10 μl 1 szt. wata szklana kolumna do LC 2 szt. (+ statywy) pompka do kolumny 2 szt. bagietka szklana 2 szt. pipety Pasteura 8 szt. smoczki do pipet kolba stożkowa 100 ml 1 szt. kolba okrągłodenna 50 ml 4 szt. butelki zakręcane o pojemności 2 ml 4 szt. lejek z szeroką nóżką 2 szt.