Zastosowanie niskociśnieniowej chromatografii adsorpcyjnej do separacji barwników ze szpinaku Wstęp Celem ćwiczenia jest zastosowanie adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej do izolacji barwnych związków z ekstraktu szpinaku. Pomysł eksperymentu został zaadaptowany z Pavia D.L. et al, Introduction to Organic Laboratory Techniques: A Microscale Approach, 2005. Barwniki występujące w liściach szpinaku: chlorofile a i b, feofityny a i b, β-karoten oraz ksantofile zostaną wyekstrahowane za pomocą acetonu a następnie rozdzielone na żelu krzemionkowym. W trakcie ćwiczenia zostanie wykonana analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) ekstraktu oraz wydzielonych związków. Technika TLC zostanie również wykorzystana do dobrania odpowiedniego składu fazy ruchomej do separacji barwników metodą chromatografii kolumnowej (LC). Izolowane i analizowane związki są barwnikami, dzięki czemu można łatwo monitorować zarówno rozdział LC jak i TLC. R C 2 H 5 CH3 O R = chlorofil a H 2 C Mg H COOMe H R = CHO chlorofil b O H 3 C H O H3C H 3 C CH3 H 3 C H 3 C β-karoten Rys. 1. Wzory strukturalne chlorofilu a, chlorofilu b oraz β-karotenu. Chlorofile są barwnikami niezbędnymi w procesie fotosyntezy. W chloroplastach roślinnych występują przeważnie w dwóch formach: jako niebieskozielony chlorofil a oraz żółtozielony chlorofil b (rys. 1.). Chlorofile zawierają rdzeń porfirynowy, w którym znajduje się atom magnezu łączący się z atomami azotu każdego z pierścieni rdzenia porfirynowego. Chlorofil b różni się od chlorofilu a obecnością grupy aldehydowej w bocznym pierścieniu pirolowym zamiast grupy metylowej. Budowa strukturalna feofityny a i b jest podobna do 1
budowy chlorofilu a i b, z tym, że w miejscu jednego atomu magnezu w cząsteczce feofityny występują dwa atomy wodoru. Feofitynę można uzyskać poprzez działanie kwasem na chlorofil. Oprócz chlorofili w chloroplastach występują także karoteny, m.in. żółty β-karoten, czyli prowitamina A, oraz ksantofile. Zielony kolor chlorofili jest efektem tego, że silnie absorbują światło w czerwonej i niebieskiej części widma promieniowania widzialnego, natomiast słabo w części zielonej. Jesienią zabarwienie liści zmienia się na żółtawe ze względu na rozkład chlorofilu, co ujawnia barwę obecnych w liściach żółtych barwników. W chromatografii adsorpcyjnej kolejność elucji związków chemicznych z kolumny zależy od ich polarności. Związki o niskiej polarności eluują jako pierwsze a następnie eluują związki o większej polarności. Barwniki, izolowane z liści szpinaku, różnią się polarnością, co powoduje, że będą eluowały w następującym porządku zgodnym z ich wzrastającą polarnością (w nawiasach podane są kolory związków): 1. karoteny (intensywnie żółty kolor), 2. feofityna a (intensywnie szary), 3. feofityna b (szary, może być niewidoczny), 4. chlorofil a (niebieskozielony, bardziej intensywny niż chlorofil b), 5. chlorofil b (zielony), 6. ksantofile (żółty). W zależności od stanu próbki szpinaku oraz warunków eksperymentu mogą wystąpić pewne różnice w obserwowanych barwnikach. Mogą powstać nowe związki w wyniku reakcji utleniania, hydrolizy lub innych reakcji zachodzących pod wpływem światła, tlenu i innych czynników. Próbki szpinaku i wyizolowane barwniki należy przechowywać w ciemności, jeśli jest to możliwe. Część doświadczalna Ekstrakcja Odważyć około 1 1,4 g mrożonego szpinaku (około 1/10 części brykietu szpinaku) za pomocą wagi precyzyjnej w zlewce o V = 100 ml. Poczekać, aż szpinak się rozmrozi, dodać 1 1,4 g bezwodnego siarczanu magnezu. Wymieszać i rozetrzeć. Ekstrahować próbkę acetonem (20 ml) w łaźni ultradźwiękowej w czasie 15 min. Dodać do próbki 8 g bezwodnego siarczanu sodu, wymieszać i pozostawić na 5-10 min. Zdekantować i przesączyć ekstrakt do kolby. Pozostały osad przemyć acetonem (10 ml), zdekantować, przesączyć i 2
połączyć ekstrakty w kolbce. Odparować aceton na odparowywaczu obrotowym w temp. 30 C. Jeżeli w kolbce pozostała woda to rozpuścić ekstrakt w około 5 ml heksanu, pobrać tylko warstwę organiczną i ponownie wysuszyć ją bezwodnym siarczanem sodu. Ekstrakt zatężyć do objętości 0,5 ml. Chromatografia cienkowarstwowa TLC Analiza TLC ekstraktu ze szpinaku pozwala dobrać warunki rozdziału na kolumnie z żelem krzemionkowych. ależy wykonać analizy TLC ekstraktu ze szpinaku przy użyciu następujących faz ruchomych: - faza 1: aceton, - faza 2: eter naftowy, - faza 3: chlorek metylenu, - faza 4: eter diizopropylowy. ależy zidentyfikować badane związki na podstawie ich barw i kolejności elucji. Policzyć wartości współczynników opóźnienia (R F ) dla rozdzielanych związków oraz ich różnice ( R F ). Wybrać optymalną fazę ruchomą do rozdziału LC. Różnica współczynników rozdzielenia dla związków powinna być jak największa; zadowalające efekty uzyskuje się, gdy R F 0,15. Wybrana faza ruchoma powinna dawać R F około 0,15-0,4. Jeżeli jest to konieczne to rozważyć zastosowanie elucji gradientowej w LC. ależy zaproponować optymalne warunki rozdziału LC i porównać je z warunkami zaproponowanymi w ćwiczeniu. Dalszą część doświadczenia można wykonać według warunków zaproponowanych w ćwiczeniu (faza ruchoma: eter naftowy-aceton), albo wybrać własną propozycję. W celu sprawdzenia warunków elucji gradientowej w LC należy wykonać analizy TLC ekstraktu ze szpinaku przy użyciu następujących faz ruchomych: - faza 5: eter naftowy-aceton (9:1 v/v), - faza 6: eter naftowy-aceton (7:3 v/v). Po wykonaniu rozdziału ekstraktu ze szpinaku za pomocą chromatografii kolumnowej należy wykonać analizę TLC uzyskanych frakcji a następnie ocenić jakość rozdziału LC. Procedura analizy TLC. apełnić komorę chromatograficzną odpowiednią fazą ruchomą (V = 3 ml) i pozostawić na około 5-10 min. W tym czasie przygotować płytki TLC, czyli narysować delikatnie miękkim ołówkiem: - linię startową około 0,8 cm od dolnego brzegu płytki i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia próbek, 3
- linię końcową około 1 cm od górnego brzegu płytki. anieść na płytkę po około 3-5 µl roztworów badanych próbek, uważając, aby plamka nie miała średnicy większej niż 2 mm; im mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu. Można powtarzać nanoszenie roztworu po jego wyschnięciu na płytce. Ilość nanoszonego roztworu zależy od jego stężenia. Badane związki są barwnikami, co powoduje, że łatwo można kontrolować ilość nanoszonego roztworu. ależy nanieść taką ilość roztworu, aby uzyskać intensywne żółte, zielone lub szare zabarwienie plamki. Delikatnie, przy pomocy pęsety, wstawić płytkę TLC z naniesionymi substancjami do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory. Zamknąć komorę i rozwijać chromatogram, do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości 1 cm od górnego brzegu płytki, następnie wyjąć i wysuszyć płytkę. Zrobić zdjęcie lub zeskenować płytkę TLC i dołączyć do sprawozdania. ależy zrobić to jak najszybciej po wysuszeniu płytki, ponieważ niektóre z barwników mogą zmienić zabarwienie pod wpływem powietrza. Wyznaczyć współczynniki opóźnienia R F i zanotować zabarwienie dla wszystkich związków. Przedyskutować zasadność wyboru faz ruchomych 1 6 do rozdziału barwników ze szpinaku oceniając ich selektywność i polarność. Chromatografia niskociśnieniowa LC W kolbie Erlenmeyera (V = 100 ml) naważyć 4 g żelu krzemionkowego a następnie dodać 30 ml roztworu eter naftowy-aceton (9:1 v/v). Wymieszać i pozostawić na 5-10 min. Zamocować kolumnę w statywie i zamknąć odpływ z kolumny. Umieścić na dnie kolumny małą ilość zwiniętej waty szklanej. Wprowadzić 2 ml roztworu eter naftowy-aceton (9:1 v/v). Usunąć powietrze z waty szklanej naciskając bagietką a następnie wprowadzić krążek z bibuły. Uważnie wprowadzić zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny, za pomocą pipety z szerokim otworem wyjściowym lub poprzez lejek, otwierając jednocześnie odpływ z kolumny. Zrobić to w taki sposób, aby uzyskać w miarę płaskie dno oraz płaski wierzch fazy stacjonarnej. Od momentu wprowadzenia do kolumny żelu krzemionkowego jego powierzchnia musi być stale przykryta cieczą. Jeżeli w kolumnie będą bąble powietrza to proces rozpocząć od początku. Roztwór eter naftowy-aceton wypływający z kolumny zachować do zakończenia eksperymentu posłuży do umycia kolumny oraz pipety i kolby zabrudzonej ekstraktem ze szpinaku. IE WOLO DOPROWADZIĆ DO PRZESUSZEIA KOLUMY!! 4
Gdy wysokość złoża w kolumnie będzie stała należy ją zmierzyć i zanotować jej wymiary. Wprowadzić krążek z bibuły na wierzch kolumny. Pozostawić około 3 cm słupa cieczy nad złożem. Ostrożnie wprowadzić niewielką ilość piasku (około ¼ małej łyżki metalowej) za pomocą lejka tak, aby poziom piasku nad złożem chromatograficznym wynosił około 0,5 cm. Ważne jest, aby wierzch fazy stacjonarnej oraz wierzch warstwy piasku były idealnie płaskie. ależy wcześniej przygotować wszystkie roztwory potrzebne do elucji barwników: - roztwór A: eter naftowy-aceton (9:1 v/v), V =20 ml, - roztwór B: eter naftowy-aceton (7:3 v/v), V =20 ml, - roztwór C: aceton, V = 20 ml. Wyrównać poziom fazy ruchomej w kolumnie do poziomu warstwy piasku i zamknąć odpływ z kolumny. Ostrożnie wprowadzić do kolumny około ½ części ekstraktu ze szpinaku za pomocą pipety Pasteura i otworzyć odpływ z kolumny. OD MOMETU WPROWADZEIA PRÓBKI DO KOLUMY ROZPOCZYA SIĘ PROCES CHROMATOGRAFICZY. Wprowadzić próbkę do fazy stacjonarnej przemywając 5 razy po 0,5 ml roztworem A aż do momentu, gdy cała próbka znajdzie się w fazie stacjonarnej (zaniknie zielone zabarwienie roztworu nad powierzchnią fazy stacjonarnej). Ostrożnie wprowadzić do kolumny pozostałą część roztworu A, a następnie roztwór B oraz roztwór C. Zbierać kolejne frakcje fazy ruchomej zawierające wydzielone barwniki roślinne do kolejnych 6 cylindrów miarowych. ależy zanotować objętości uzyskanych frakcji. Frakcje: 1 bezbarwna, V = około 5 ml, 2 żółta, V = około 5 ml, 3 bezbarwna, V = około 14 ml, 4 szara, V = około 5 ml, 5 niebiesko-zielona, V = około 10 ml, 6 żółto-zielona, V = około 10 ml. Zebrane frakcje zatężyć do około 0,5 ml i pozostawić do analizy TLC. Wykonać analizę TLC uzyskanych frakcji i ekstraktu stosując jako fazę ruchomą roztwór B: eter naftowy-aceton (7:3 v/v). Zidentyfikować barwniki. Ocenić jakość rozdziału LC na podstawie wykonanych analiz TLC. 5
Literatura 1. Pałczyński A., Podbielkowski Z., Polakowski B., Botanika. PW, Warszawa, 1995. 2. Still W.C., Kahn M., Mitra A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. J. Org. Chem., 1978, 43 (14), 2923 2925. 3. Stryer L. Biochemia. PW, Warszawa, 2000. 4. Pavia D.L., Lampman G.M., Kriz G.S., Engel R.G. Introduction to organic laboratory techniques: a small scale approach. Thomson Brooks/Cole, 2005. Szkło i odczynniki Ekstrakcja: płytka + nóż do krojenia, zlewka V = 100 ml, zlewka V = 50 ml, zlewka V = 25 ml, łyżka metalowa, średni tłuczek porcelanowy, cylinder miarowy V = 25 ml, kolbka do odparowywacza V = 100 ml, reduktor do odparowywacza, lejek średni + pasujące sączki, pipeta V = 5 ml, pompka do pipet, łaźnia ultradźwiękowa, bezwodny siarczan magnezu, bezwodny siarczan sodu, aceton V = 250 ml, eter naftowy V = 250 ml, pisak do szkła, statyw do lejka TLC: płytki do TLC silica gel 60 firmy Merck, o wymiarach 4 6,5 cm oraz 2 6,5 cm, strzykawka do TLC, chlorek metylenu do mycia strzykawki V = 25 ml, 6 komór chromatograficznych do TLC, metalowa pęseta, pipeta V = 5 ml, chlorek metylenu V = 100 ml, eter diizopropylowy V = 100 ml, linijka oraz miękki ołówek LC: żel krzemionkowy LC60A 60-200 MICRO firmy DAVISIL, kolumna szklana o wymiarach 1 15 cm wraz z przedłużką, statyw do kolumny, lejek średni pasujący do kolumny z dużym otworem wyjściowym do zawiesiny żelu krzemionkowego, 3 cylindry miarowe V = 25 ml 3 cylindry miarowe V = 10 ml 3 kolbki Erlenmeyera V = 50 ml + pasujący korek szklany, 1 kolbka Erlenmeyera V = 100 ml + pasujący korek szklany, pipeta Pasteura do ekstraktu ze szpinaku, 6 kolbek do odparowywacza V = 50 ml, bagietka szklana, krążki z bibuły do kolumny, piasek, wata szklana Uwaga: ie wolno suszyć komór chromatograficznych w suszarce, ponieważ pękają! 6