AUTOREFERAT Imię i nazwisko: Maria Barbara Bieniaszewska Wykaz posiadanych dyplomów i stopni naukowych oraz tytuł rozprawy doktorskiej Dyplom i specjalizacje: Dyplom ukończenia Akademii Medycznej w Gdańsku 1988 r. Specjalizacja I stopnia w zakresie chorób wewnętrznych 1992 r. Specjalizacja II stopnia w zakresie chorób wewnętrznych 1995 r. Specjalizacja w zakresie hematologii 1999 r. Specjalizacja w zakresie transplantologii klinicznej 2011 r. Tytuł rozprawy doktorskiej Stopień doktora nauk medycznych na podstawie rozprawy doktorskiej pt. Ocena stężenia białek "ostrej fazy", interleukiny-6 oraz TNF-α w procesie stymulacji i regeneracji hemopoezy u zdrowych dawców komórek progenitorowych i chorych na schorzenia limfoproliferacyjne Wydział Lekarski Akademii Medycznej w Gdańsku (1988), promotor - prof. dr hab. Andrzej Hellmann. Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych i przebiegu pracy zawodowej Swoją działalność zawodową związałam od początku z gdańską uczelnią medyczną. Pracę rozpoczęłam w roku 1988 w Katedrze i Zakładzie Fizjologii, zdobywając rozszerzoną wiedzę dotycząca procesów fizjologicznych. W roku 1989 odbyłam staż w Katedrze Farmakologii ówczesnej Akademii Medycznej w Krakowie, kierowanej przez prof. Ryszarda Gryglewskiego. W Katedrze i Zakładzie Fizjologii zdobyłam również podstawy do dalszej działalności dydaktycznej. Poznanie fizjologii było podłożem do rozwijania drugiego kierunku moich zainteresowań wiedzy o chorobach wewnętrznych. Pracę kliniczną rozpoczęłam w 1989 r. jako woluntariusz w III Klinice Chorób Wewnętrznych, gdzie ostatecznie znalazłam swoją zawodową pasję hematologię. Po utworzeniu w 1991 r. Kliniki Hematologii zostałam zatrudniona w niej jako asystent. W klinice tej pracuję do chwili obecnej. 1
W toku działalności specjalizacyjnej ukończyłam w roku 2003 w Galway kurs pod patronatem Europejskiej Szkoły Hematologii i Europejskiej Grupy ds. Transplantacji Krwi i Szpiku uzyskując certyfikat EBMT w zakresie przeszczepienia komórek krwiotwórczych. Brałam również udział w kolejnych edycjach Polskiej Szkoły Hematologii. W roku 1995 odbyłam staż na oddziale hematologii i centrum transplantacyjnym Szpitala Uniwersyteckiego w Bazylei. Równolegle do procesu kształcenia współtworzyłam gdański ośrodek transplantacyjny, a w latach 2011-2012 byłam odpowiedzialna za organizację działalności, szkolenie personelu i wyposażenie oddziału transplantacyjnego w nowej lokalizacji w Centrum Medycyny Inwazyjnej. Byłam również odpowiedzialna za stworzenie standardowych procedur operacyjnych i uzyskanie przez oddział akredytacji Ministerstwa Zdrowia. W 2010 r. dzięki współpracy nawiązanej z Oddziałem Radioterapii Gdyńskiego Centrum Onkologii przy moim współudziale wprowadzonoprocedurę napromieniowania całego ciała na terenie trójmiasta, jako postępowania przygotowawczego do alotransplantacji. Po wprowadzeniu przez ustawy transplantacyjne nowych zasad organizacji donacji komórek progenitorowych do przeszczepień alogenicznych współorganizowałam kliniczną część działalności Ośrodka Dawców Szpiku. Zajmowałam się także tworzeniem Pracowni Hemaferezy i szkoleniem personelu w zakresie donacji alogenicznych i hemaferez leczniczych. Od 2006 roku kieruję realizacją w ośrodku gdańskim Programu doskonalenia diagnostyki ostrych białaczek u dorosłych w Polsce, z dostosowaniem do zaleceń Unii Europejskiej i współpracy z European Leukemia Net finansowanego przy współudziale funduszy europejskich. Uzyskane w ramach tego programu fundusze stworzyły podstawy sprzętowe do powołania przy Klinice Hematologii i Transplantologii w Gdańsku Pracowni Badań Molekularnych. Najistotniejszą z metod diagnostyczno-badawczych, które wdrożyłam do protokołu badań naukowych prowadzonych w Klinice Hematologii i Transplantologii była ocena chimeryzmu hematopoetycznego po transplantacji komórek macierzystych. Dzięki współpracy z Katedrą i Zakładem Medycyny Sądowej nawiązanej przez prof. Andrzeja Hellmanna w 1996 roku opublikowano pierwsze w Polsce wyniki badań nad chimeryzmem poprzeszczepowym, pierwotnie opartym o ocenę hiperzmiennych tandemowych powtórzeń (VNTR). W dalszym toku współpracy wystandaryzowałam i wprowadziłam do protokołu opieki potransplantacyjnejnową metodę badania hiperzmiennych krótkich powtórzeń tandemowych (STR) badanych techniką fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej. 2
Metoda ta pozwala nie tylko na monitorowanie wszczepienia, ale stanowi również cenne narzędzie prognostyczne w transplantologii hematologicznej. Monografia: Znaczenie kliniczne monitorowania chimeryzmu hematopoetycznego u chorych poddanych alogenicznemu przeszczepieniu komórek krwiotwórczych Ann. Acad. Med. Gedan., 2013, t. 43, supl.14; PL ISSN 0303-4135 - jako osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 ustawy Mieszany chimeryzm (MC), czyli długotrwałe współwystępowanie hematopoezy biorcy i dawcy po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych jest mimo wielu lat badań przedmiotem żywego zainteresowania. Znaczenie kliniczne tego zjawiska wzbudza kontrowersje. Wprowadzenie nowych metod oceny chimeryzmu hematopoetycznego, opartych o techniki molekularne pozwoliło na stwierdzenie, że MC jest zjawiskiem częstszym, niż opisywały to wcześniej stosowane metody badania. Techniki z zastosowaniem hiperzmiennych sekwencji DNA zburzyły również pogląd, że przeszczepienie po kondycjonowaniu mieloablacyjnym prowadzi do wczesnego, całkowitego zastąpienia hematopoezy biorcy układem krwiotwórczym dawcy (całkowitego chimeryzmu CC). Efektem fenomenu MC może być rozwój mechanizmów tolerancji immunologicznej prowadzący do osłabienia kluczowego w transplantacji efektu przeszczep przeciwko białaczce, a tym samym do wzrostu ryzyka niepowodzenia terapii, czyli wznowy choroby. Drugim elementem mogącym wpływać na pożądany efekt immunologiczny przeszczepienia jest profilaktyka immunosupresyjna stosowana w celu zapobiegania chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. Jak wykazano w badaniach ankietowych intensywność i czasokres stosowania cyklosporyny są najczęściej zależne od arbitralnych decyzji transplantologa. Założenia schematu profilaktyki opierają się na historycznych podstawach uznających okres pierwszych stu dni po transplantacji za czas największego zagrożenia powikłaniami zależnymi od aktywacji układu immunologicznego. Brak jest obiektywnych przesłanek pozwalających na podjęcie decyzji o skróceniu, wydłużeniu lub odstawieniu profilaktyki immunosupresyjnej u pacjentów wolnych od objawów klinicznych GvHD. Właściwą ocenę wpływu czasu immunosupresji i statusu chimeryzmu utrudnia konieczność długotrwałego monitorowania pacjentów celem oceny skutków 3
odległych, jakim może być wznowa. Wymaga to zapewnienia wieloletniej, stałej opieki potransplantacyjnej badanym pacjentom. Uwzględniając powyższe przesłanki za cele pracy badawczej postawiono ocenę znaczenia chimeryzmu hematopoetycznego, jako czynnika prognostycznego w zakresie głównych powikłań stanowiących o niepowodzeniu transplantacji: umiarkowanej i ciężkiej postaci przewlekłej GvHD oraz wznowy choroby, a także ocenę użyteczności oceny chimeryzmu, jako obiektywnego wyznacznika czasu utrzymywania profilaktyki immunosupresyjnej. Podjęto badania mające na celu ocenę dwóch stosowanych standardów profilaktyki: wczesnego, rozpoczętego w trzecim miesiącu po transplantacji odstawiania cyklosporyny i późnego rozpoczynanego po dobie setnej. Decyzję o czasie trwania terapii podejmowano na podstawie wyniku badania chimeryzmu w dobie sześćdziesiątej. U pacjentów z MC profilaktykę skracano poprzez rozpoczęcie redukcji dawki cyklosporyny, u tych z CC utrzymywano dawki zapewniające stężenie terapeutyczne do doby setnej. Podstawą decyzji był status chimeryzmu oznaczany metodą oceny krótkich tandemowych powtórzeń DNA (STR). Metoda ta uważana obecnie za tzw. złoty standard oceny chimeryzmu była stosowana niezmiennie od 1998 roku. Celem pełnej oceny chimeryzmu podjęto także badania nad chimeryzmem erytropoetycznym wynikającym z niezgodności w zakresie grup krwi między dawcą a biorcą. Ostatecznym celem badawczym było stworzenie podstaw do konstrukcji protokołu opieki potransplantacyjnej zapewniającego minimalizację ryzyka potransplantacjnej wznowy choroby oraz występowania przewlekłej GvHD. Protokół badania był jednocześnie wersją roboczą protokołu opieki potransplantacyjnej. Zgodnie z protokołem oznaczenia chimeryzmu wykonywano do doby setnej co miesiąc, do 2 roku po przeszczepieniu co 3 miesiące, a następnie co pół roku. W pierwszych dwóch latach badano szpik i krew obwodową, następnie jedynie krew. Chimeryzm oznaczano badając amplifikowane DNA biorcy. Produkty amplifikacji, znakowane fluorescencyjnie analizowano metodą elektroforezy kapilarnej przy użyciu automatycznego sekwenatora DNA ABI PRISM 310 (Perkin-Elmer). Celem oceny półilościowej określano pole pod krzywą wybranych różnicujących pików w co najmniej 1 locus. Materiał od dawcy i biorcy pobierano do oznaczeń w okresie przedprzeszczepowym we wstępnej analizie wskazując różnicujące loci. Badania chimeryzmu erytropoetycznego prowadzono dokonując analiz grup AB0, antygenów układu Rh oraz 6 tzw. mniejszych antygenów grupowych. Oznaczano również miano izoaglutynin. 4
Grupę poddaną wstępnej analizie stanowili wszyscy chorzy (320), u których dokonano przeszczepienia komórek krwiotwórczych w ośrodku transplantacyjnym w latach 1994-2011. Ze względu na duże zróżnicowanie grupy do dalszych analiz przyjęto 240 pacjentów poddanych przeszczepieniu po kondycjonowaniu mieloablacyjnym z powodu rutynowych wskazań. Przyczynami wykluczenia było: kondycjonowanie niemieloablacyjne lub o zredukowanej toksyczności, przeszczepienie w trybie ratunkowym, syngeniczne lub wykonane w pierwszych trzech latach działalności ośrodka. Porównanie całej populacji poddanych transplantacji i grupy pacjentów przyjętych do analiz nie wykazało istotnych różnic. Celem analiz porównawczych w zakresie profilaktyki immunosupresyjnej do badanej grupy włączono zarówno pacjentów z wykonanymi, systematycznymi oznaczeniami chimeryzmu, jak i chorych bez oznaczeń. Porównanie obu podgrup nie wykazało różnic poza długością czasu obserwacji i częstością zgonów wczesnych. Ze względu na rodzaj profilaktyki immunosupresyjnej, który zależał od statusu chimeryzmu w dobie sześćdziesiątej wyodrębniono 2 podgrupy badawcze: z MC i wczesną redukcją immunosupresji (25 pacjentów) i z CC i opóźnioną redukcją immunosupresji (34 pacjentów). Grupy porównano z podgrupą chorych, u których profilaktyka była prowadzona niezależnie od oznaczeń chimeryzmu (107 pacjentów) oraz z grupą leczonych w dobie 60-tej z powodu ostrej GvHD (74 pacjentów). Przeanalizowano wyniki oznaczeń chimeryzmu we krwi obwodowej i szpiku stwierdzając istotną statystycznie korelację wykonanych badań. W związku z tym, w dalszych porównaniach ograniczono się do wyników badań krwi obwodowej. Analiza wyników oznaczeń chimeryzmu wykazała istotną korelację między mieszanym chimeryzmem stwierdzanym w kolejnych dobach oznaczeń, a częstością wznów choroby w badanej grupie. Nie stwierdzono wpływu postaci uzyskiwanego chimeryzmu w żadnym z punktów czasowych na częstość występowania ostrej i przewlekłej GvHD oraz ogólne przeżycie pacjentów. Porównanie podgrup badawczych wyłonionych na podstawie oznaczeń chimeryzmu i podgrup kontrolnych nie wykazało różnic między grupami w zakresie częstości wznów. Nie odnotowano również istotnego wzrostu częstości ostrej GvHD w żadnej z podgrup. Istotnie wyższy odsetek przewlekłej GvHD stwierdzono jedynie w podgrupie, która w dobie sześćdziesiątej była leczona z powodu ostrej GvHD. Prześledzenie szlaków zmian chimeryzmu i jego dynamiki potwierdziło, że jedynie stabilny CC koreluje z niskim ryzykiem wznowy. W podgrupie pacjentów z MC w dobie 60 stwierdzono istotną statystycznie różnicę w wystąpieniu zmiany postaci chimeryzmu pod wpływem redukcji immunosupresji, w porównaniu do grupy z CC. 5
Analiza danych dotyczących niezgodności w zakresie grup krwi nie wykazała wpływu niezgodności i jej rodzaju na dalszy przebieg potransplantacyjny. Żadna ze stwierdzonych niezgodności nie korelowała z częstością wznów, występowania ostrej i przewlekłej GvHD i ogólnym przeżyciem potransplantacyjnym. Status chimeryzmu erytropoetycznego w żadnym z punktów czasowych badania nie korelował istotnie z opisanymi wyżej powikłaniami. Również długotrwała odnowa autologiczna erytropoezy nie oznaczała większego ryzyka wznowy. Status chimeryzmu osiągniętego w pół roku po transplantacji (w czasie zbliżonym do fizjologicznego przeżycia erytrocytów) nie korelował z uzyskiwaniem niezależności od przetoczeń.zbadano także dynamikę zmian chimeryzmu erytropoetycznego oraz miana izoaglutynin, ponownie nie stwierdzając wpływu tych zjawisk na częstość wznów choroby. Rodzaj niezgodności nie wpływał istotnie na eliminację własnej erytropoezy. Dzięki oznaczeniu tzw. mniejszych antygenów grupowych badanie chimeryzmu erytropoetycznego możliwe było u 83% pacjentów. Metoda ta pozwoliła także na wyłonienie podgrupy o pełnej zgodności wszystkich badanych antygenów (17% pacjentów). W podgrupie tej stwierdzono istotnie wyższy odsetek wznów, co może wskazywać na brak efektu przeszczep przeciwko białaczce. Nie stwierdzono istotnej zależności między wynikami oznaczeń chimeryzmu metodą oceny STR i analizy niezgodności grup krwi. Szlaki eliminacji własnych erytrocytów przebiegał niezależnie od eliminacji krwinek jądrzastych. Wyniki przeprowadzonych badań potwierdzają istotne klinicznie znaczenie monitorowania chimeryzmu poprzeszczepowego metodami molekularnymi i pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków: 1. Mieszany chimeryzm oznaczony metodami molekularnymi (STR) jest czynnikiem prognostycznym wznowy choroby. Monitorowanie dynamiki chimeryzmu pozwala na wskazanie grupy pacjentów szczególnie zagrożonych wznową, u których należy podjąć działania profilaktyczne. 2. Modyfikacja profilaktyki immunosupresyjnej polegająca na skróceniu okresu stosowania cyklosporyny: a. powoduje istotne zmiany w obserwowanym rozkładzie postaci chimeryzmu (MC,CC) w porównaniu do profilaktyki standardowej, a tym samym może zmniejszać ryzyko wznowy b. nie wpływa na częstość występowania ostrej i przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi 6
3. U pacjentów ze wzrostową dynamiką chimeryzmu między dobą 30 i 60 (szczególnie z ostrymi białaczkami), przy braku cech GvHD, należy rozpocząć odstawianie immunosupresji w dobie 60. i dokonać modyfikacji protokołu opieki potransplantacyjnej polegającej na: a. zwiększeniu częstotliwości kontroli po dobie 100 b. ścisłym monitorowaniu choroby resztkowej, tam gdzie jest to możliwe c. rozważeniu bardziej radykalnej modyfikacji profilaktyki immunosupresyjnej (odstawienie immunosupresji) 4. Badanie chimeryzmu erytropoetycznego nie pozwala na prognozowanie przebiegu potransplantacyjnego w zakresie GvHD i wznowy choroby. Jednak oznaczanie rozszerzonego (ponad układ AB0 i Rh) panelu grup krwi przed przeszczepieniem jest wysoce uzasadnione. Pełna zgodność jest czynnikiem ryzyka wznowy choroby. Wyniki przeprowadzonych badań upoważniły do stworzenia protokołu opieki potransplantacyjnej u pacjentów z ostrymi białaczkami i wzrostową dynamiką chimeryzmu w dobie 30, 60. Pacjenci z tej grupy wymagają zwiększenia częstotliwości kontroli także po dobie 100, ścisłego monitorowania choroby resztkowej i modyfikacji profilaktyki immunosupresyjnej w przypadku braku objawów choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Wnikliwej obserwacji w zakresie wznowy poddawani są również pacjenci z pełną zgodnością rozszerzonego panelu antygenów grupowych krwi oznaczonego jednorazowo przed transplantacją. Działalność naukowa Jestem autorem i współautorem 47 prac pełnotekstowych, w tym 26 prac oryginalnych (8 prac oryginalnych w czasopismach zagranicznych notowanych na liście filadelfijskiej), 3 prac poglądowych, 2 listów do redakcji (czasopism z listy filadelfijskiej) oraz 7 rozdziałów w podręcznikach (w tym w podręcznikach anglojęzycznych). Łączna wartość impact factor moich publikacji oryginalnych wynosi 19,04, a wszystkich publikacji 35,46. Łączna wartość punktacji opublikowanych przeze mnie prac w czasopismach wg punktacji KBN/MNiSzW wynosi 271,5 a wg Index Copernicus: 147,46. Ponadto jestem współautorem 51 doniesień zjazdowych opublikowanych jako streszczenia, prezentowanych na zjazdach Polskiego Towarzystwa Hematologów i Transfuzjologów, Europejskiego i Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego, Europejskiej Grupy ds. 7
Transplantacji Krwi i Szpiku, Polskiego Towarzystwa Immunologicznego, Polskiego Towarzystwa Transplantacyjnego, Polskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej. Tematyka moich publikacji i zainteresowań naukowych koncentrowała się wokół czterech głównych zagadnień: 1. Diagnostyka i leczenie przewlekłych nowotworów mieloproliferacyjnych 2. Zastosowanie cytokin w terapii schorzeń hematologicznych 3. Transplantacja komórek krwiotwórczych 4. Rola komórek regulatorowych w mechanizmach związanych z chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi i zastosowanie terapeutyczne Treg Ad.1 - Diagnostyka i leczenie przewlekłych nowotworów mieloproliferacyjnych Od początku działalności naukowej moje zainteresowania wiązały się z przewlekłym nowotworami (wcześniej zespołami) mieloproliferacyjnymi (PNM), uznawanymi wówczas za choroby rzadkie. Zebrany materiał dotyczący wieloletnich obserwacji przebiegu nadpłytkowości samoistnej u chorych pozostających pod opieką ośrodka gdańskiego został opublikowany w 1994 r. w Polskim Archiwum Medycyny Wewnętrznej, w języku polskim (Bieniaszewska M., Hellmann A., Kabata J., Raszeja-Specht A.: Nadpłytkowość samoistna: analiza przebiegu klinicznego w materiale własnym. Pol. Arch. Med. Wewn., 1994, t. 92, nr 2, s.170-175). Było to jedno z pierwszych doniesień w piśmiennictwie światowym, wykazujących na podstawie długotrwałego monitorowania pacjentów, że wbrew ogólnemu przekonaniu, w nadpłytkowości samoistnej powikłania zakrzepowo-zatorowe występują częściej przy niższej liczbie płytek, a krwotoczne przy wartościach skrajnie wysokich. W pracy już wtedy postulowaliśmy mechanizm wyjaśnienia tego zjawiska polegający na zaburzeniach funkcji płytek i aktywności czynników krzepnięcia. Fenomen ten wyjaśniono, potwierdzając wysuniętą hipotezę, dopiero dekadę później. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazałam konieczność podziału chorych na grupy ryzyka powikłań, określiłam również liczbę płytek uzasadniającą włączenie terapii cytoredukcyjnej oraz wskazałam grupę chorych z wysokim ryzykiem powikłań krwotocznych po zastosowaniu aspiryny w nadpłytkowości samoistnej. Postulowane w pracy podziały i wyznaczone opcje terapeutyczne stały się w następnych dwudziestoleciu ogólnie przyjętymi standardami leczenia nadpłytkowości samoistnej opracowywanymi na podstawie metaanaliz. Konsekwencją tych obserwacji było podjęcie badań nad funkcją płytek krwi i rolą zaburzeń czynnościowych płytek w rozwoju powikłań zakrzepowo-zatorowych (Raszeja-Specht A., Skibowska A., 8
Bieniaszewska M., Szutowicz A.: Relationships between thrombohemorrhagic complications and platelet function in patients with essential thrombocythaemia. Am. J. Hematol., 2001, vol. 68, s. 32-36). W badaniach tych wykazano zaburzenia funkcji płytek u chorych z powikłaniami krwotocznymi w przebiegu nadpłytkowości samoistnej, polegające na upośledzeniu agregacji indukowanej oraz zmniejszeniu sekrecji czynnika płytkowego 4. Dopiero kilka lat później okazało się to być rezultatem wtórnego niedoboru czynnika von Wilebranda. W kolejnych analizach obserwacji chorych z PNM wskazałam na trudności diagnostyczne w początkowej fazie przebiegu tych schorzeń, płynność obrazu klinicznego, różnorodność objawów początkowych i fazy krańcowej (Bieniaszewska M., Balon J., Brożek I., Limon J., Hellmann A.: Leczenie nadpłytkowości samoistnej - doświadczenia własne. Pol. Arch. Med. Wewn., 2000, t. 103, nr 3/4, s. 179-185; Lewandowski K., Bieniaszewska M., Stachera M., Hellmann A.: Transformacja megakarioblastyczna nadpłytkowości samoistnej : opis przypadku. Acta Haematol. Pol., 2002, t. 33, nr 4, s. 503-508.Bieniaszewska M., Balon J., Hellmann A.: Nadpłytkowość samoistna przyczyną bólów głowy u młodej kobiety. Pol. Merk. Lek., 2000, t. 8, nr 49, s. 479-480). Po odkryciu w roku 2005 roli mutacji JAK2 V617F w patogenezie przewlekłych nowotworów mieloproliferacyjnych, we współpracy z Katedrą Biologii i Genetyki Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego przeprowadziłam badania polskiej populacji chorych. Wyniki badań, opisujące dwie nowe mutacje wykryte u chorych z nadpłytkowością, zostały opublikowane w 2010 r. (Siemiątkowska A., Bieniaszewska M., Hellmann A., Limon J.: JAK2 and MPL gene mutations in V617F-negative myeloproliferative neoplasms. Leuk. Res., 2010, vol. 34, nr 3, s. 387-389). Przegląd badań nad mechanizmami molekularnymi w PNM był również tematem innej publikacji w piśmiennictwie zagranicznym (Hellmann A., Bieniaszewska M.: Myeloproliferative neoplasms : classification, diagnostic and therapeutic options in the light of molecular findings. Eur. Haematol., 2009, vol. 3, nr 1, s. 57-60). W roku 2012 otrzymałam zaproszenie do współredagowania rozdziałów dotyczących molekularnego podłoża PNM w podręczniku międzynarodowym (Hellmann A., Bieniaszewska M., Prejzner W., Leszczyńska A.: Myeloproliferativeneoplasms. [W:] Molecular aspects of Hematologic malignancies : diagnostic tools and clinical applications / ed. M. Witt, M. Dawidowska, T. Szczepański. Berlin ; Heidelberg : Springer Verlag, 2012, s. 129-140; Leszczyńska A., Prejzner W., Bieniaszewska M., Hellmann A.: Molecular methods in myeloproliferative neoplasms. [W:] Molecular aspects of hematologic malignancies : diagnostic tools and clinical applications / ed. M. Witt, M. Dawidowska, T. Szczepański. Berlin ; Heidelberg : Springer Verlag, 2012, s. 451-461). W pracy tej przedstawiliśmy aktualną wiedzę na temat molekularnego podłoża PNM oraz postulowane mechanizmy prowadzące do zróżnicowania rodzaju mieloproliferacji mimo wspólnej mutacji JAK2 V617F. Zagadnienia te pozostają przedmiotem moich dalszych badań. Jestem współautorką zaleceń i standardów leczenia nadpłytkowości samoistnej, czerwienicy prawdziwej i pierwotnego włóknienia szpiku stosowanych w Polsce i ich nowelizacji w oparciu o badania molekularne (Hellmann A., Bieniaszewska M., Podolak-Dawidziak M., 9
Dmoszyńska A., Jędrzejczak W. W., Robak T., Skotnicki A. B.: Aktualne wskazania diagnostycznoterapeutyczne panelu ekspertów w nadpłytkowości samoistnej. Acta Haematol. Pol., 2008, t. 39, nr 3, s. 527-535; Bieniaszewska M.: Leczenie przewlekłych zespołów mieloproliferacyjnych Ph ujemnych. Acta Haematol. Pol., 2009, t. 40, nr 2, s. 247-255; Hellmann A., Bieniaszewska M., Prejzner W.: Nowotwory mieloproliferacyjne. [W:] Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złośliwych: 2009 rok. Cz. 2: praca zbiorowa / red. M. Krzakowski, K. Herman, J. Jassem, W. Jędrzejczak, J. R. Kowalczyk, M. Podolak-Dawidziak, M. Reinfuss. Gdańsk : Via Medica, 2009, s. 507-521; Hellmann A., Bieniaszewska M.: Nadpłytkowość samoistna. [W:] Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złośliwych u dorosłych / prac. zbior. pod red. M. Krzakowskiego. Warszawa, 2003, s. 466-467) Ad.2 - Zastosowanie cytokin w terapii schorzeń hematologicznych Kolejną dziedziną mojego zainteresowania była rola cytokin w leczeniu schorzeń hematologicznych. Po wprowadzeniu do alotransplantacji w naszym ośrodku metody poboru komórek krwiotwórczych z krwi obwodowej podjęłam badania nad rolą cytokin w przebiegu stymulacji G-CSF u dawców (rozprawa doktorska). Ta metoda donacji, wówczas nowatorska była przedmiotem powszechnych badań głównie w zakresie wpływu na przebieg transplantacji i składu uzyskiwanego przeszczepu. W badaniach własnych zwróciłam uwagę na bezpieczeństwo metody i wpływ stymulacji G-CSF na organizm dawcy. Wysuwając hipotezę, że indukowanej leukocytozie mogą towarzyszyć zmiany charakterystyczne dla przebiegu tzw. ostrej fazy obserwowanej np. w przebiegu infekcji, podjęłam badania nad stężeniem cytokin prozapalnych i innych białek ostrej fazy podczas stymulacji czynnikami wzrostu. Hipoteza ta znalazła potwierdzenie u części dawców reagujących stanami podgorączkowymi i bólami kostnymi podczas podawania G- CSF. U tej grupy pacjentów stwierdzono znamienny wzrost stężenia czynnika martwicy nowotworów oraz białka CRP pod wpływem G-CSF. Monitorowanie dawców pozwoliło na stwierdzenie, że procedura nie wywołuje efektów odległych, a obserwowane zmiany wygasają bezpowrotnie wraz z zakończeniem stymulacji. Badając bezpieczeństwo stosowania czynników wzrostu u zdrowych dawców przeprowadzono również analizę kinetyki subpopulacji limfocytów w przebiegu donacji (Trzonkowski P., Zaucha J. M., Myśliwska J., Balon J., Szmit E., Hałaburda K., Bieniaszewska M., Młotkowska M., Hellmann A., Myśliwski A.: Differences in kinetics of donor lymphoid cells in response to G-CSF administration may affect the incidence and severity of acute GvHD in respective HLA-identical sibling recipients. Med. Oncol., 2004, vol. 21, nr 1, s. 81-94) w odniesieniu do częstości i stopnia GvHD. W badaniach tych wykazano zróżnicowanie w kinetyce subpopulacji limfocytów po pierwszej dawce czynnika wzrostu, implikującą skład przeszczepu. Stwierdzono także, że u pacjentów poddanych przeszczepieniu materiału od dawców reagujących na podanie G-CSF 10
wzrostem ilości aktywowanych limfocytów T i komórek NK we krwi obwodowej, częściej rozwija się przewlekła choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi. Badania dotyczące subpopulacji limfocytów u dawców były częścią grantu naukowego KBN realizowanego we współpracy z Katedrą i Zakładem Histologii gdańskiej Akademii Medycznej w latach 2000 2002. Wyniki wieloaspektowych badań stymulacji G-CSF zdrowych dawców (klonogenności uzyskanych progenitorów, regeneracji hematopoezy biorcy, bezpieczeństwa procedury stymulacji) były przedmiotem dalszych publikacji (Zaucha J. M., Knopińska-Posłuszny W., Bieniaszewska M., Myśliwski A., Hellmann A.: The effect of short G-CSF administration on the numbers and clonogenenic efficiency of hematopoietic progenitor cells in bone marrow and peripheral blood of normal donors. Ann. Transplant., 2000, vol. 5, nr 4, s. 20-26; Zaucha J. M., Bieniaszewska M., Knopińska-Posłuszny W., Stenulewicz W., Myśliwski A., Hellmann A.: Wyniki mobilizacji komórek progenitorowych do krwi obwodowej po podaniu G-CSF zdrowym dawcom przed ich pobraniem do przeszczepu allogenicznego. Acta Haematol. Pol., 1998, vol. 29, nr 1, s. 61-68; Zaucha J. M., Knopińska-Posłuszny W., Lewandowski K., Bieniaszewska M., Hałaburda K., Hellmann A.: Allogeniczne transplantacje komórek macierzystych z krwi obwodowej : charakterystyka materiału do przeszczepu i przebieg kliniczny transplantacji. Pol. Merk. Lek., 1998, t. 4, nr 21, s. 130-133). Monitorowanie procesu donacji i jej następstw zaowocowało także nietypowymi, opublikowanymi obserwacjami klinicznymi np. zespół Klinefeltera u dawcy (Hałaburda K., Bieniaszewska M., Brożek I., Limon J., Hellmann A.: Diagnosis of Klinefelter syndrome in the donor after peripheral blood stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant., 2000, vol. 25, s. 461). Zainteresowanie cytokinami, datujące się od czasu jednego z pierwszych polskich doświadczeń z zastosowaniem erytropoetyny w szpiczaku plazmocytowym, w latach dziewięćdziesiątych, podsumowanych w 1996 r. (Ciepłuch H., Zaucha J. M., Bieniaszewska M., Knopińska-Posłuszny W., Hellmann A.: Effect of recombinant human erythropoietin on the anaemia in patients with multiple myeloma. Acta Haematol. Pol., 1996, t. 27, nr 2, s.145-150), zaowocowało włączeniem mnie do grona autorów monografii poświęconej erytropoetynie (Hellmann A., Bieniaszewska M.: Erytropoetyna w hematologii. [W:] Erytropoetyna : od odkrycia do zastosowań klinicznych / pod red. Bolesława Rutkowskiego Gdańsk: Wydawnictwo medyczne MAKmed, 2001, s. 231-240). Ad.3 - Transplantacja komórek krwiotwórczych Od momentu rozpoczęcia działalności przeszczepowej w naszym ośrodku, tj od roku 1994 główną osią moich zainteresowań naukowych stały się zagadnienia dotyczące transplantacji. Kontynuacją zainteresowań cytokinami w transplantologii było przeprowadzenie przeze mnie ośrodku gdańskim badania czynnika wzrostu keratynocytów u pacjentów z toksycznym zapaleniem błony śluzowej po kondycjonowaniu, którego wyniki stały się częścią polskiego opracowania 11
wieloośrodkowego (Nasiłowska-Adamska B., Rzepecki P., Mańko J., Czyż A., Markiewicz M., Federowicz I., Tomaszewska A., Piątkowska-Jakubas B., Wrzesień-Kuś A., Bieniaszewska M., Duda D., Szydło R., Halaburda K., Szczepiński A., Lange A., Hellmann A., Robak T., Skotnicki A., Jędrzejczak W. W., Walewski J., Hołowiecki J., Komarnicki M., Dmoszyńska A., Warzocha K., Mariańska B.: The influence of palifermin (Kepivance) on oral mucositis and acute graft versus host disease in patients with hematological diseases undergoing hematopoietic stem cell transplant. BoneMarrow Transplant., 2007, vol. 40, nr 10, s. 983-988). Toksyczne zapalenie błony śluzowej, głównie jamy ustnej jest szczególnie dokuczliwym dla pacjentów wczesnym powikłanie transplantacyjnym. Poszukiwanie metod mogących skracać czas regeneracji śluzówek i ograniczać konieczność alimentacji parenteralnej jest przedmiotem szczególnych zainteresowań. W badaniu potwierdziliśmy skuteczność paliferminy w zmniejszeniu stopnia zaawansowania zapalenia śluzówek. Byłam autorem i współautorem analiz dotyczących ośrodkowych wyników transplantacji w przewlekłej białaczce szpikowej (Hellmann A., Bieniaszewska M., Zaucha J. M., Hałaburda K., Balon J.: Allogeniczne transplantacje komórek progenitorowychhemopoezy w przewlekłej białaczce szpikowej : doświadczenia ośrodka gdańskiego. Współcz. Onkol., 2002, vol. 6, nr 10, s. 670-675), ciężkiej postaci anemii aplastycznej (Hellmann A., Bieniaszewska M.: Transplantacja allogeniczna komórek krwiotwórczych w niedokrwistości aplastycznej. Pol. Arch. Med. Wewn., 2001, t. 105, s. 163-166), czynników rokowniczych i powikłań przeszczepień (Kaniuka S., Piekarska A., Grabarczyk P., Prejzner W., Bieniaszewska M., Kisielewska J., Brojer E., Zaucha J. M.: Określenie progowej liczby kopii wirusa CMV w reakcji PCR w czasie rzeczywistym wskazującej na aktywną replikację wirusową u chorych po allogenicznej transplantacji komórek krwiotwórczych. Acta Haematol. Pol., 2009, t. 40, nr 3, s. 659-671; Mikołajczuk J., Piekarska A., Balon J., Bieniaszewska M.: Wybiórcza aplazja czerwonokrwinkowa po allogenicznym przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych : opis przypadku. Acta Haematol. Pol., 2001, t. 32, nr 2, s. 235-239) oraz okresowych podsumowań działalności przeszczepowej z analizą wyników wprowadzania nowych rodzajów transplantacji - od dawców niespokrewnionych w 2001 r. (Hałaburda K., Zaucha J. M., Bieniaszewska M., Knopińska-Posłuszny W., Hellmann A.: Pierwsza allogeniczna transplantacja szpiku kostnego od dawcy niespokrewnionego w Akademii Medycznej w Gdańsku. Ann. Acad. Med. Gedan., 2002, t. 32, s. 13-19) i nowych wskazań (Hałaburda K., Wiśniewski M., Zaucha J. M., Bieniaszewska M., Prejzner W., Hellmann A.: Allogeniczne przeszczepienie szpiku kostnego u chorego z zespołem hypereozynofilowym. Acta Haematol. Pol., 2003, t. 34, nr 2, s. 253-259). Byłam współautorem przeprowadzanych okresowo i publikowanych analiz działalności przeszczepowej z monitorowaniem wyników transplantacji (Bieniaszewska M., Prejzner W., Knopińska-Posłuszny W., Piekarska A., Moszkowska G., Taszner M., Hellmann A.: Allogeniczne transplantacje komórek progenitorowychhemopoezy w gdańskim ośrodku transplantacyjnym w latach 1994-2009. Ann. Acad. Med. Gedan., 2009, t. 39, s. 9-21; Hellmann A., Bieniaszewska M., Hałaburda K., Lewandowski K., Knopińska-Posłuszny W., Balon J.: Allogeniczne transplantacje komórek progenitorowychhemopoezy w gdańskim ośrodku transplantacyjnym w latach 1994-1999. Ann. Acad. Med. Gedan., 2000, t. 30, s. 12
15-26). Analizy te są istotną składową dobrej praktyki klinicznej, wyznaczają również kierunki dalszych badań. Badanie czynników ryzyka powikłań zwróciło moją uwagę na potencjalną rolę chimeryzmu ocenianego metodami STR jako czynnika prognostycznego. W 2004 r. opublikowaliśmy wyniki wstępnej analizy wskazującej na związek wczesnego całkowitego chimeryzmu z występowaniem przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (Bieniaszewska M., Balon J., Hałaburda K., Reichert M., Piekarska A., Pawłowski R., Hellmann A.: Kliniczne znaczenie wczesnego, całkowitego chimeryzmu po allogenicznej transplantacji komórek macierzystych hematopoezy. Acta Haematol. Pol., 2004, t. 35, nr 2, s. 217-225; Balon J., Hałaburda K., Bieniaszewska M., Reichert M., Bieniaszewski L., Piekarska A., Pawłowski R., Hellmann A.: Early complete donor hematopoietic chimerism in peripheral blood indicates the risk of extensive graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant., 2005, vol. 35, s. 1083-1088). Badając chimeryzm w określonych punktach czasowych po transplantacji stwierdziliśmy, że u pacjentów eliminujących własną hematopoezę już w 30. dobie po przeszczepieniu częściej występuje przewlekła postać choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Badania te były częściowo realizowane w ramach grantu KBN. Ad.4 - Rola komórek regulatorowych w mechanizmach związanych z chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi i zastosowanie terapeutyczne Treg Opisane powyżej badania nad ryzykiem powikłań transplantacyjnych implikowały poszukiwania skutecznych działań zapobiegawczych. To zwróciło moją uwagę na zagadnienia dotyczące mechanizmów komórkowych w rozwoju powikłań. Istotną, potencjalnie korzystną rolę przypisywano komórkom regulatorowym (Treg). Fizjologiczna rola limfocytów T regulatorowych wpisywała się w patomechanizm przewlekłej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, przypominającej w obrazie klinicznym choroby z autoagresji. Dzięki unikalnej technologii hodowli limfocytów T regulatorowych opracowanej w Zakładzie Immunologii Klinicznej i Transplantologii kierowanej przez prof. Piotra Trzonkowskiego mogliśmy podjąć współpracę w zakresie klinicznego zastosowania Treg. Na potrzeby badania podjęłam współpracę z Regionalnym Centrum Krwiodawstwa i krwiolecznictwa opracowując szczególną procedurę donacji krwi celem pozyskania materiału do dalszych hodowli (pozyskanie kożuszka leukocytarnego). Zapewniało to bezpieczeństwo dawcy, który otrzymywał powrotnie niewykorzystane w badaniu erytrocyty. Procedura gwarantowała również wysoką jakość materiału do hodowli oraz jego bezpieczeństwo. Na badanie uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej. Do pierwszej próby klinicznej wybrano 2 pacjentów z oporną na leczenie przewlekłą 13